a gastrula-specific gene injected into

8/7/2019 a gastrula-specific gene injected into

1/9

The EMBO J o u r n a l v o l . 4 n o . 1 3 A p p . 3 4 6 3 - 3 4 7 1 , 1 9 8 5

D e v e l o p m e n t a l r e g u l a t i o n o f a g a s t r u l a - s p e c i f i c g e n e i n j e c t e d i n t of e r t i l i z e d X e n o p u s eggs

P . A . K r i e g a n d D . A . M e l t o nD e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s tr y a n d M o l e c u l a r B i o l o g y , H a r v a r d U n i v e r s i t y ,7 D i v i n i t y A v e n u e , C a m b r i d g e , MA 0 2 1 3 8 , USAC o m m u n i c a t e d b y R . C o r t e s eTo s t u d y t h e t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n o f g e n e s d u r i n g e a r l yX e n o p u s d e v e l o p m e n t , we h a v e i s o l a t e d a g e n e t h a t i s f i r s tt r a n s c r i b e d a t t h e m i d - b l a s t u l a t r a n s i t i o n . T r a n s c r i p t i o n o ft h i s g e n e , c a l l e d G S 1 7 , s t o p s a t m i d - g a s t r u l a a n d t h e mRNAi s r a p i d l y d e g r a d e d . C o n s e q u e n t l y , t r a n s c r i p t s o f G S 1 7 a r eo n l y p r e s e n t f o r a b r i e f p e r i o d , p r i m a r i l y d u r i n g g a s t r u l a -t i o n . W hen t h e G S 1 7 g e n e i s i n j e c t e d i n t o f e r t i l i z e d e g g s ,t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e i n j e c t e d DNA m i m i c s t h e e x p r e s s i o np a t t e r n o f t h e e n d o g e n o u s g e n e , i . e . , b o t h t h e s w i t c h - o n a n ds w i t c h - o f f o f t r a n s c r i p t i o n a r e c o r r e c t l y r e g u l a t e d . T h e i n -j e c t e d DNA i s n o t s i g n i f i c a n t l y a m p l i f i e d a n d r e m a i n s e x t r a -c h r o m o s o m a l . T h e c o r r e c t e x p r e s s i o n o f g e n e s i n j e c t e d i n t oX e n o p u s e g g s w i l l make i t p o s s i b l e t o i n v e s t i g a t e m a t e r n a l f a c -t o r s i n v o l v e d i n a c t i v a t i n g t h e e m b r y o n i c g e n o m e .K e y w o r d s : d e v e l o p m e n t / g a s t r u l a / e g g m i c r o i n j e c t i o n / X e n o p u sI n t r o d u c t i o nA f t e r f e r t i l i z a t i o n , t h e f r o g e g g e n t e r s a p e r i o d o f r a p i d c l e a v a g eg i v i n g r i s e t o a b l a s t u l a o f 4000- 8 0 0 0 c e l l s . T h i s e a r l y d e v e l o p -m e n t i s d i r e c t e d e n t i r e l y b y t h e m a t e r n a l g e n o m e ; a l l t h e r e q u i r e dp r o t e i n s a r e p r o v i d e d e i t h e r f r o m a m a t e r n a l s t o c k o r b y t r a n s l a -t i o n o f s t o r e d m a t e r n a l mRNAs. When t h e e m b r y o r e a c h e s t h em i d - b l a s t u l a s t a g e , c h a n g e s o c c u r i n c e l l c y c l e t i m i n g , c e l l m o t i l i -t y a n d t h e z y g o t i c g e n e s a r e t r a n s c r i b e d f o r t h e f i r s t t i m e ( S i g n o r e ta n d L e f r e s n e , 1 9 7 1 ; B r o w n a n d L i t t n a , 1 9 6 4 ; N e w p o r t a n dK i r s c h n e r , 1 9 8 2 a ) . T h e s e c h a n g e s , c a l l e d t h e m i d - b l a s t u l a t r a n -s i t i o n o r MBT ( S i g n o r e t a n d L e f r e s n e , 1 9 7 1 ; G e r h a r t , 1 9 8 0 ;N e w p o r t a n d K i r s c h n e r , 1 9 8 2 a ) c o m m e n c e - 7 h a f t e r f e r t i l i z a -t i o n . T h u s , i n t h e f r o g e m b r y o , s t u d i e s o n h o w e m b r y o n i c g e n e sa r e s e l e c t i v e l y a c t i v a t e d s h o u l d b e f a c i l i t a t e d b y t h e f a c t t h a t i ti s p o s s i b l e t o o b t a i n l a r g e n u m b e r s o f e m b r y o s b e f o r e a n d a f t e rg e n e s a r e f i r s t t r a n s c r i b e d . I n e f f e c t , e g g s a n d c l e a v a g e s t a g e e m -b r y o s c o m p r i s e a p u r e p o p u l a t i o n o f p r e c u r s o r c e l l s a n d b l a s t u l as t a g e a r e t h e i r d a u g h t e r s t h a t h a v e s e l e c t i v e l y t u r n e d o n s o m eg e n e s .To a n a l y z e t h e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n o f e m b r y o n i c g e n e s ,we r e a s o n e d t h a t i t w o u l d b e h e l p f u l t o i s o l a t e a g e n e t h a t i s t u r n e do n a t t h e MBT a n d w h o s e t r a n s c r i p t s a r e a b s e n t f r o m o o c y t e sa n d e g g s . P r e v i o u s s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t t h e v a s t m a j o r i t y o fg e n e s t r a n s c r i b e d a t t h e MBT a r e a l s o e x p r e s s e d d u r i n go o g e n e s i s , i . e . , t h e i r t r a n s c r i p t s a r e f o u n d i n t h e m a t e r n a l R NAp o o l ( D w o r k i n a n d D a w i d , 1 9 8 0 ; C o l o t a n d R o s b a s h , 1 9 8 2 ) .N o n e t h e l e s s , d i f f e r e n t i a l s c r e e n i n g o f a X e n o p u s g a s t r u l a cDNAl i b r a r y h a s e n a b l e d u s a n d o t h e r s ( S a r g e n t a n d D a w i d , 1 9 8 3 ) t os e l e c t c l o n e s t h a t a r e n o t f o u n d i n t h e m a t e r n a l RNA p o o l , b u ta r e e x p r e s s e d v e r y e a r l y w h e n t h e e m b r y o n i c g e n o m e i s a c t i v a t e d .O f t h e s e q u e n c e s i d e n t i f i e d b y t h i s m e t h o d , we h a v e c h o s e n o n e ,c a l l e d G S 1 7 , t o s t u d y i n d e t a i l f o r t w o r e a s o n s . F i r s t , G S 1 7 i s

a m o n g t h e f i r s t p r o t e i n - c o d i n g g e n e s t o b e e x p r e s s e d d u r i n gd e v e l o p m e n t a n d t h e r e f o r e c a n b e u s e d t o s t u d y t h e t r a n s c r i p -t i o n a l a c t i v a t i o n o f g e n e s a t t h e MBT. S e c o n d l y , G S 1 7 h a s t h eu n u s u a l p r o p e r t y t h a t i t s t r a n s c r i p t s a r e f o u n d o n l y a t a c r i t i c a lt i m e , p r i n c i p a l l y d u r i n g g a s t r u l a t i o n . T h i s g a s t r u l a - s p e c i f i c e x -p r e s s i o n p a t t e r n l e a d s t o t h e s u g g e s t i o n t h a t t h e GS 1 7 g e n e p r o -d u c t m a y p l a y a r o l e i n d i r e c t i n g g a s t r u l a t i o n o r d e t e r m i n i n g c e l lf a t e s .W e w o u l d l i k e t o k n o w h o w g e n e s l i k e GS 1 7 a r e t r a n s c r i p t i o n -a l l y a c t i v a t e d a t t h e MBT w h e r e a s m o s t o t h e r g e n e s a r e t u r n e do n a t a l a t e r s t a g e . I n o t h e r a n i m a l s , n o t a b l y f l i e s ( S p r a d l i n g a n dR u b i n , 1 9 8 3 ; G o l d b e r g e t a l . , 1 9 8 3 ) , s e a u r c h i n s ( D a v i d s o n , p e r -s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) a n d m i c e ( P a l m i t e r a n d B r i n s t e r , 1 9 8 5 ;K r u m l a u f e t a l . , 1 9 8 5 ) , t h e c i s - a c t i n g s i g n a l s i n v o l v e d i n t h i st y p e o f t r a n s c r i p t i o n a l c o n t r o l h a v e b e e n v e r y e f f e c t i v e l y s t u d i e db y r e - i n j e c t i n g a l t e r e d g e n e s i n t o d e v e l o p i n g e m b r y o s . To d a t et h i s a p p r o a c h h a s h a d v e r y l i m i t e d s u c c e s s i n f r o g s a n d i n n oc a s e h a s t h e c o r r e c t d e v e l o p m e n t a l e x p r e s s i o n o f a R NA p o l y -m e r a s e I I g e n e b e e n d e m o n s t r a t e d . I t i s w o r t h n o t i n g t h a t m o s tp r e v i o u s s t u d i e s w i t h d e v e l o p i n g f r o g e m b r y o s u s e d h e t e r o l o g o u sg e n e s , f r o m r a b b i t s ( R u s c o n i a n d S c h a f f n e r , 1 9 8 1 ) , s e a u r c h i n s( B e n d i g , 1 9 8 1 ; E t k i n e t a l . , 1 9 8 4 ) , D r o s o p h i l a a n d a n i m a l v i r u s e s( E t k i n e t a l . , 1 9 8 4 ; E t k i n a n d B a l c e l l s , 1 9 8 5 ) , a n d t h e s e g e n e sm a y , t h e r e f o r e , h a v e b e e n i n a p p r o p r i a t e t e s t s . I n s o m e e x -p e r i m e n t s h o m o l o g o u s X e n o p u s a d u l t a n d l a r v a l g l o b i n g e n e sw e r e i n j e c t e d ( B e n d i g a n d W i l l i a m s , 1 9 8 3 , 1 9 8 4 ) , b u t c o r r e c td e v e l o p m e n t a l r e g u l a t i o n w a s n o t o b s e r v e d p e r h a p s b e c a u s e t h e s eg e n e s a r e n o r m a l l y e x p r e s s e d i n a t i s s u e - s p e c i f i c m a n n e r r e l a t i v e -l y l a t e i n e m b r y o n i c l i f e .T h e m o s t p o s i t i v e r e s u l t s u s i n g t h e X e n o p u s e m b r y o a s a n e x -p r e s s i o n s y s t e m h a v e b e e n o b t a i n e d b y B u s b y a n d R e e d e r ( 1 9 8 3 )w h o s h o w e d t h a t g e n e s t r a n s c r i b e d b y R NA p o l y m e r a s e I , t h eX e n o p u s rRNA g e n e s , a r e t u r n e d o n a t t h e s a m e t i m e ( l a t eb l a s t u l a ) a s t h e e n d o g e n o u s r i b o s o m a l g e n e s w h e n t h e s e g e n e sa r e i n j e c t e d i n t o f e r t i l i z e d e g g s . T h e i r r e s u l t s s u g g e s t t h a t X e n o p u sg e n e s w h i c h a r e n o r m a l l y e x p r e s s e d e a r l y i n e m b r y o g e n e s i s m a ya l s o b e c o r r e c t l y r e g u l a t e d w h e n t h e y a r e r e - i n t r o d u c e d i n t o t h ed e v e l o p i n g e m b r y o . W i t h t h i s i n m i n d we h a v e i n j e c t e d c l o n e dc o p i e s o f G S 1 7 i n t o f e r t i l i z e d e g g s t o d e t e r m i n e w h e t h e r R NAp o l y m e r a s e I I g e n e s a r e c o r r e c t l y r e g u l a t e d d u r i n g s u b s e q u e n te m b r y o n i c d e v e l o p m e n t . R e s u l t s p r e s e n t e d h e r e s h o w t h a t b o t ht h e s w i t c h - o n a n d s w i t c h - o f f o f t r a n s c r i p t i o n o f i n j e c t e d G S 1 7s e q u e n c e s i s a c c u r a t e l y c o n t r o l l e d i n t h e d e v e l o p i n g e m b r y o . T h i sc o r r e c t d e v e l o p m e n t a l e x p r e s s i o n d o e s n o t r e q u i r e s p e c i a l P -e l e m e n t o r r e t r o v i r u s v e c t o r s a n d o c c u r s u s i n g s t a n d a r d p l a s m i dv e c t o r s t h a t r e m a i n e x t r a c h r o m o s o m a l .R e s u l t sI s o l a t i o n o f s e q u e n c e s e x p r e s s e d e a r l y i n d e v e l o p m e n tT h o u g h t r a n s c r i p t i o n o f t h e e m b r y o n i c g e n o m e i s f i r s t o b s e r v e da t t h e m i d - b l a s t u l a s t a g e ( B r o w n a n d L i t t n a , 1 9 6 4 ; N e w p o r t a n dK i r s c h n e r , 1 9 8 2 a ) , w e p r e p a r e d a cDNA l i b r a r y f r o m e m b r y o sa t a s l i g h t l y l a t e r s t a g e o f d e v e l o p m e n t s o t h a t ne w t r a n s c r i p t s

I R L P r e s s L i m i t e d , O x f o r d , E n g l a n d 3 4 6 3


2/9

P . A . K r i e g a n d D . A . M e l t o n

c o u l d a c c u m u l a t e t o d e t e c t a b l e l e v e l s . U s i n g p o l y ( A ) + RNAi s o l a t e d f r o m m i d - g a s t r u l a ( s t a g e 1 1 ) e m b r y o s we c o n s t r u c t e da cDNA l i b r a r y i n t h e b a c t e r i o p h a g e v e c t o r X g t l O t h a t c o n t a i n s-1 x 1 0 6 r e c o m b i n a n t s w i t h average i n s e r t s i z e o f 1 . 1 k b .

C l o n e s c o r r e s p o n d i n g t o mRNAs t r a n s c r i b e d s t a r t i n g a t t h e MBTw e r e s e l e c t e d f r o m t h i s g a s t r u l a l i b r a r y b y d i f f e r e n t i a l screen-i n g . S i n c e t h e e g g c o n t a i n s a l a r g e amount o f mRNA a n d mosto f t h e s e m a t e r n a l s equences ar e s t a b l e t h r o u g h o u t e a r l y d e v e l o p -m e n t , o n l y a s m a l l p e r c e n t a g e o f t h e r e c o m b i n a n t s i n t h e g a s t r u l al i b r a r y ar e d e r i v e d f r o m n e w l y t r a n s c r i b e d mRNAs ( C o l o t a n dR o s b a s h , 1 9 8 2 ; D w o r k i n a n d D a w i d , 1 9 8 0 ; S a r g e n t a n d D a w i d ,1 9 8 3 ) . T o d e t e c t t h i s s m a l l n u m b e r o f new sequences, r e p l i c af i l t e r s c o n t a i n i n g a t o t a l o f 2 0 0 0 0 r e c o m b i n a n t b a c t e r i o p h a g ew e r e p r o b e d w i t h [ 3 2 P ] c D N A p r e p a r e d e i t h e r f r o m d e f o l l i c u l a t e do o c y t e p o l y ( A ) + R NA or f r o m g a s t r u l a s t a g e e m b r y o p o l y ( A ) +RNA. T h o s e c l o n e s t h a t gave a w e a k or u n d e t e c t a b l e re sponsew i t h o o c y t e cDNA b u t w e r e s t r o n g l y p o s i t i v e f o r g a s t r u l a cDNAw e r e p u r i f i e d a n d s u b j e c t e d t o f u r t h e r c h a r a c t e r i z a t i o n . Of t h e1 0 1 r e c o m b i n a n t s s e l e c t e d , 5 3 w e r e f o u n d t o c o n t a i n m i t o c h o n d -r i a l s equences b y h y b r i d i z a t i o n w i t h p r o b e p r e p a r e d f r o mX e n o p u s m i t o c h o n d r i a l DNA ( R a s t l a n d D a w i d , 1 9 7 9 ) . T h e s ec l o n e s w e r e p r o b a b l y i d e n t i f i e d b e c a u s e t h e m i t o c h o n d r i a lg e n o m e i s t r a n s c r i p t i o n a l l y a c t i v e d u r i n g t h e c l e a v a g e s t a g e s o fd e v e l o p m e n t ( C h a s e a n d D a w i d , 1 9 7 2 ; Y o u n g a n d Z i m m e r m a n ,1 9 7 3 ) .T h e 4 8 r e m a i n i n g cDNA s e q u e n c e s were f u r t h e r c h a r a c t e r i z -e d i n R NA b l o t t i n g e x p e r i m e n t s . cDNA i n s e r t s f r o m e a c h o f t h eX g t l O r e c o m b i n a n t s w e r e e x c i s e d , l a b e l l e d b y n i c k t r a n s l a t i o na n d u s e d a s p r o b e a g a i n s t e i t h e r oocyte o r g a s t r u l a p o l y ( A ) +R NA i n a N o r t h e r n b l o t . U n d e r t h e s e s e n s i t i v e s c r e e n i n g c o n d i -t i o n s m o s t o f t h e s equences t h a t were a p p a r e n t l y a b s e n t f r o mo o c y t e s b y t h e p l a q u e - s c r e e n i n g c r i t e r i o n , c o u l d b e d e t e c t e d i np o l y ( A ) + RNA o o c y t e RNA, a l t h o u g h g e n e r a l l y a t a very l o wl e v e l ( d a t a n o t s h o w n ) . M o s t o f t h e 4 8 cDNA c l o n e s c o r r e s p o n dt o RNAs t h a t are 1 0 - t o 2 0 - f o l d more a b u n d a n t i n g a s t r u l a com-p a r e d w i t h o o c y t e s . W e d e t e c t e d o n l y a s i n g l e cDNA s e q u e n c e ,G S 1 7 , t h a t i s p r e s e n t i n g a s t r u l a R NA a n d c o m p l e t e l y a b s e n t f r o mo o c y t e RNA.A s n o t e d i n p r e v i o u s e x p e r i m e n t s w h e r e l i b r a r i e s o f X e n o p u so o c y t e or e m b r y o mRNA sequ ence s h a v e b e e n s c r e e n e d , o n l ya p r o p o r t i o n o f t h e t o t a l n u m b e r o f r e c o m b i n a n t s e x a m i n e d ared e t e c t a b l e w h e n p r o b e d w i t h h o m o l o g o u s cDNA ( G o l d e n e t a l . ,1 9 8 0 ; D w o r k i n a n d D a w i d , 1 9 8 0 ) . I n o ur case, o n l y 35 - 4 0%o f t h e c l o n e s ( a t o t a l o f 7000- 8 0 0 0 p l a q u e s ) , were d e t e c t e d a f t e ra 3 - d a y a u t o r a d i o g r a p h i c exposure, i n d i c a t i n g t h a t t h e m a j o r i t yo f sequences p r e s e n t i n t h e l i b r a r y r e p r e s e n t very rare mRNAs.T h e r e f o r e , a l t h o u g h GS 1 7 i s t h e o n l y s e q u e nc e we i s o l a t e d t h a ti s p r e s e n t i n g a s t r u l a b u t a b s e n t f r o m t h e o o c y t e , we are awaret h a t many o t h e r mRNAs may b e s i m i l a r l y e x p r e s s e d b u t w o u l dn o t b e d e t e c t e d b y o ur s c r e e n i n g p r o c e d u r e .E x p r e s s i o n o f G S J 7 d u r i n g e m b r y o n i c d e v e l o p m e n tTo e x a m i n e t h e e x p r e s s i o n o f t h e GS 1 7 gene d u r i n g em-b r y o g e n e s i s , N o r t h e r n b l o t s w e r e p e r f o r m e d w i t h RNA i s o l a t e df r o m a s e r i e s o f d e v e l o p m e n t a l s t a g e s r a n g i n g f r o m t h e f e r t i l i z -e d e gg t o t h e t a i l b u d s t a g e ( F i g u r e 1 ) . T h e GS 1 7 p r o b e h y b r i d i z e st o an R NA t r a n s c r i p t -750 b a s e s i n l e n g t h . W h i l e no G S 1 7mRNA i s o b s e r v e d a t any d e v e l o p m e n t a l s t a g e up t o a n d i n -c l u d i n g s t a g e 8 , i t i s a l r e a d y a b u n d a n t b y s t a g e 1 0 , e a r l y i ng a s t r u l a t i o n . T h e amount o f G S 1 7 RNA r e m a i n s c o n s t a n t u n t i ll a t e i n g a s t r u l a t i o n ( s t a g e 1 2 ) , a n d t h e n d i m i n i s h e s r a p i d l y u n t i lnone i s v i s i b l e a t a n y d e v e l o p m e n t a l stage a f t e r n e u r u l a t i o n h a so c c u r e d . T h e s t a g e 2 8 t a i l b u d e m b r y o c o n t a i n s many f u l l y d i f -f e r e n t i a t e d c e l l t y p e s i n c l u d i n g b l o o d , m u s c l e , nerve a n d s k i n ,3 4 6 4

A 4rIr 4 6 f -8 1 0 1 2 115 18 28

4 . 3 -3 . 0 -1 . 6 -

GS17 R N A - 0 .0 . 5 2 -

BF i b r o n e c t i n - - _ _ _ _

F i g . l . N o r t h e r n b l o t a n a l y s i s o f G S 1 7 RNA d u r i n g e a r l y f r o g d e v e l o p m e n t .E a c h t r a c k c o n t a i n s t h e t o t a l RNA f r o m f i v e e m b r y o s , f r a c t i o n a t e d o n a1 . 2 % f o r m a l d e h y d e a g a r o s e g e l . T h e e m b r y o n i c s t a g e f r o m w h i c h t h e R NAw a s i s o l a t e d i s i n d i c a t e d a t t h e t o p o f e a c h t r a c k . A : s h o w s a 1 2 - h e x p o s u r eo f a n a u t o r a d i o g r a m o f t h e f i l t e r p r o b e d w i t h 3 2 P - l a b e l l e d i n s e r t o f t h e G S 1 7cDNA c l o n e . T h e a r r o w i n d i c a t e s t h e u n s p l i c e d R NA ( s e e t e x t ) . T h i s f i l t e rw a s w a s h e d t o r e m o v e b o u n d p r o b e a n d r e h y b r i d i z e d w i t h a 3 2 P - l a b e l l e di n s e r t o f a X e n o p u s f i b r o n e c t i n cDNA c l o n e . An 8 - h e x p o s u r e i s s h o w n i nB . B o t h cDNA i n s e r t s w e r e n i c k - t r a n s l a t e d t o a s p e c i f i c a c t i v i t y o f 6 x 1 0 8c . p . m . / 1 t g . DNA s i z e m a r k e r s a r e i n d i c a t e d i n A . T h e s i z e o f t h ef i b r o n e c t i n R NA i s > 6 k b .n o n e o f w h i c h a p p e a r t o c o n t a i n G S 1 7 RNA. I n a d d i t i o n t o t h e7 5 0 - b a s e t r a n s c r i p t , a f a i n t b a n d c o r r e s p o n d i n g t o a t r a n s c r i p to f 1 2 0 0 b a s e s i s e v i d e n t o n l y a t s t a g e 1 0 ( F i g u r e 1 ) . T h e s i z eo f t h i s t r a n s c r i p t s u g g e s t s t h a t i t i s t h e u n s p l i c e d p r e - m R N A ( s e eb e l o w ) . T h e s e r e s u l t s s h o w t h a t GS 1 7 i s o n l y t r a n s i e n t l y e x p r e s s -e d d u r i n g e m b r y o g e n e s i s , i t s t r a n s c r i p t s f o u n d p r i m a r i l y d u r i n gg a s t r u l a t i o n .

E v i d e n t l y t w o f a c t o r s c o n t r i b u t e t o t h e t r a n s i e n t a p p e a r a n c eo f GS 1 7 mRNA. F i r s t , a s j u d g e d b y t h e a c c u m u l a t i o n o f s t a b l eRNA, t h e G S 1 7 g e n e i s t r a n s c r i p t i o n a l l y a c t i v e o n l y f r o m m i d -b l a s t u l a t o m i d - g a s t r u l a , a p e r i o d o f - 5 h . T h e f a c t t h a t t h e G S 1 7p r e - m R N A i s f o u n d o n l y a t s t a g e 1 0 s u p p o r t s t h i s a r g u m e n t .S e c o n d l y , G S 1 7 mRNA r a p i d l y d i s a p p e a r s s u g g e s t i n g t h a t , u n l i k em o s t mRNAs p r e s e n t i n t h e d e v e l o p i n g e m b r y o , G S 1 7 mRNAi s q u i t e u n s t a b l e . W e e s t i m a t e t h a t i t i s d e g r a d e d w i t h a h a l f - l i f eo f 3- 4 h .I n a d d i t i o n t o t h e e x p r e s s i o n p a t t e r n f o r GS 1 7 , F i g u r e 1 s h o w st h e d e v e l o p m e n t a l e x p r e s s i o n o f a t y p i c a l m a t e r n a l mRNA, i nt h i s c a s e c e l l u l a r f i b r o n e c t i n . T h e c o m p a r i s o n o f t h e e x p r e s s i o np r o f i l e s o f GS 1 7 a n d f i b r o n e c t i n mRNAs s h o w s t h a t t h e d r a m a t i cc h a n g e s i n GS 1 7 mRNA l e v e l s a r e n o t d u e t o v a r i a b l e r e c o v e r y


3/9

C o r r e c t e x p r e s s i o n o f an i n j e c t e d X e n o p u s g a s t r u l a g e n e

B M 5 67891011

A 567891011MI I __-31 1 -

-2 1 9U 1 , 2 RNA

. . . - - 1 6 2 J

- _.]-, 5'end_ - - 1 2 4

N.M. 0 co w

z-92

:III-_ItRNAs

Pv Em . i _

352 L F u l l ength p r o b e

1 1 5 1 2 1 - P r o t e c t e d p r o b e

F i g . 2 . O n s e t o f GSl7 t r a n s c r i p t i o n . ( A ) I n v i v o l a b e l l i n g o f n e w l y t r a n s c r i b e d RNAs. E g g s w e r e i n j e c t e d w i t h 1 A C i o f [ 3 2 P ] U T P a t f i r s t c l e a v a g e a n d t o t a lRNA was e x t r a c t e d a t v a ri o us t i m e s a n d f r a c t i o n a t e d i n a 6 % a c r y l a m i d e - 8 . 3 M urea g e l . E a c h t r a c k c o n t a i n s t h e RNA f r o m t h r e e e m b r y o s . T h e t i m e ( h )a f t e r f e r t i l i z a t i o n a t w h i c h t h e RNA w a s i s o l a t e d i s i n d i c a t e d a t t h e t o p o f e a c h t r a c k . T h e p o s i t i o n s o f some a b u n d a n t l a b e l l e d RNA s p e c i e s ar e i n d i c a t e d . A tt h i s t e m p e r a t u r e ( 1 8 C ) new t r a n s c r i p t s ar e f i r s t d e t e c t e d a t 9 h p o s t - f e r t i l i z a t i o n . ( B ) D e t e c t i o n o f GS17 t r a n s c r i p t s b y RNase m a p p i n g . P o r t i o n s o f t h e sameRNA s a m p l e s a n a l y z e d i n A a b o v e w er e a s s a y e d f o r t h e presence o f GS17 RNA u s i n g a s i n g l e - s t r a n d e d S P 6 RNA p r o b e . The RNA f r o m o ne e m b r y oe q u i v a l e n t was t e s t e d f o r e a c h t i m e p o i n t a n d t h e p r o t e c t e d RNA f r a g m e n t s w e r e f r a c t i o n a t e d o n a 6 % a c r y l a m i d e - 8 . 3 M urea g e l . The c o n t i n u o u s l y l a b e l l e dRNA p r o b e a n d t h e p r e d i c t e d RNase p r o t e c t i o n f r a g m e n t s ar e s h o w n i n t h e d i a g r a m b e l o w t h e a u t o r a d i o g r a m . M: s i z e m a r k e r s , l a b e l l e d H p a I I f r a g m e n t s o fp B R 3 2 2 DNA.o f RNA f r o m t h e d i f f e r e n t e m b r y o n i c s t a g e s s i n c e t h e f i b r o n e c -t i n RNA r e m a i n s r e l a t i v e l y c o n s t a n t a t t h e e a r l y s t a g e s whenG S 1 7 mRNA f i r s t a p p e a r s . S e c o n d l y , w h i l e a m a j o r i n c r e a s e i nt h e amount o f GS 1 7 mRNA occurs b y s t a g e 1 0 , no i n c r e a s e i ss een i n t h e amount o f f i b r o n e c t i n mRNA u n t i l s t a g e 1 2 , a t l e a s t3 h l a t e r . T h e r e f o r e , a l t h o u gh t h e two g e n e s b o t h b e c o m e t r a n s -c r i p t i o n a l l y a c t i v e e a r l y i n d e v e l o p m e n t , t h e y d o n o t appear t ob e a c t i v a t e d s i m u l t a n e o u s l y . T h i s o b s e r v a t i o n i m p l i e s t h a t GS 1 7a n d f i b r o n e c t i n are s u b j e c t t o d i f f e r e n t m e c h a n i s m s o f c o n t r o la n d ar e n o t m e r e l y a c t i v a t e d b y some g e n e r a l d e r e p r e s s i o nm e c h a n i s m t h a t may occur a t t h e MBT ( N e w p o r t a n d K i r s c h n e r ,1 9 8 2 a , 1 9 8 2 b ) .

T h e o n s e t o f G S J 7 t r a n s c r i p t i o nG e n e s t h a t are t h e f i r s t t o b e t r a n s c r i p t i o n a l l y a c t i v a t e d , p r e c i s e -l y a t t h e MBT, are more l i k e l y t o b e c o n t r o l l e d b y m a t e r n a l f a c -

t o r s t h a n t h o s e g en e s t h a t ar e a c t i v a t e d l a t e r i n d e v e l o p m e n t .W h i l e i t i s c l e a r t h a t tRNAs a n d snRNAs ar e some o f t h e f i r s tsequences t o b e t r a n s c r i b e d a n d t h a t new t r a n s c r i p t i o n o f mRNAh a s o c c u r r e d b y m i d - g a s t r u l a ( S a r g e n t a n d D a w i d , 1 9 8 3 ) , i t i sn o t known i f any m RNA s ar e t r a n s c r i b e d a t t h e MBT. A l o n g e rexposure o f t h e b l o t s h o w n i n F i g u r e 1 s u g g e s t e d t h a t GS 1 7 t r a n s -c r i p t s appear b e f o r e s t a g e 1 0 , a t s t a g e 8 . We t h e r e f o r e d e c i d e dt o d e t e r m i n e e x a c t l y when GS17 t r a n s c r i p t s appear r e l a t i v e t ot h e MBT a n d t h e o n s e t o f g e n e r a l t r a n s c r i p t i o n .T o d e t e r m i n e t h e t i m e a t w h i c h t h e MBT o c c u r s , a l l new t r a n s -c r i p t s i n t h e d e v e l o p i n g e m b r y o w e r e l a b e l l e d b y m i c r o i n j e c t i o no f [ 3 2 P ] U T P d i r e c t l y i n t o t h e f e r t i l i z e d e g g ( N e w p o r t a n dK i r s c h n e r , 1 9 8 2 a ) . S t a r t i n g a t t h e l a t e c l e a v a g e s t a t e , b e f o r e t h eMBT, groups o f e m b r y o s w e r e c o l l e c t e d a t 1 - h i n t e r v a l s a n d t o t a lRNA was e x t r a c t e d . A s a m p l e o f t h e l a b e l l e d RNA was f r a c -t i o n a t e d o n a d e n a t u r i n g a c r y l a m i d e g e l f o r d i r e c t v i s u a l i z a t i o no f n e w l y l a b e l l e d RNA s p e c i e s a n d a n o t h e r p o r t i o n o f t h e RNA

3 4 6 5

2 19- *

1 6 2 - *

1 2 4 - %


4/9


G A A T T C G T T r G C T C r T C T C A G C A G C A G A AA T C G C G A T A AA A G AA A C A GA C T C C A G T T A T G 60H e tT C C C AG A A T T T G G A T T T C T T G G C C T T G OC T G G C C G T G G A GG T C C T C AT T AT G C C AGT C C A 1 2 0S o r G l n A sn L o u A s p P h e L o u Al a L o u A la G ly A rg G ly G l y P r o H i s T y r A l a S e r P r oA C T T C A AG G C A T C C C T C A C C A A A G GT T T OG A A T T C A A C A C C A C C T T C C C T T GAA A G G GG A 1 8 0T h r S e r A r g Hi s P r o Se r P r o Ly s V a l T r p As n S e r T h r P r o P r o S e r Lo u Gl u A r g G l yC C T T C A G A G A G A C A A AT C A G T C C C A C C C C A GA T C A G T A C A C C A A C C C C AAC A G G C O G T C O G 2 4 0Pro S e r G l u Arg G l n I l e S o r P ro T h r P r o A s p Gl n T y r Th r A s n P ro A a n A r g A rg A r gC A G C C A T G G A A A GA C T G G T C T C C A G G C A G A T G G C A A C T G C T T C AA A A C C AG A G A C A A AG C 3 0 0G l n P r o T rp L ys A s p T r p S e r P r o G l y A r g Tr p Gl n L o u L o u Gl n A n n G l n A r g G l n S w rT G G G G C T T n A G T C C T A C A G C T C C C A C T C G A C A T A A A C O T A C T C C A G A A C C C A A A C C A T T C 3 6 0T r p G l y L e u S e r P ro T h r A l a P ro T h r A r g H i s Ly s Arg T h r P r o Gl u P r o L y s P r o P h eT T C A G A C A A C C A A G A G G C G O T G C T A C A C A A GT T T A C G G T A A T C A C C A G C C A GG A A G C T A C 4 2 0P h e A r g Gl n P r o A r g Gl y G l y A l a T h r G l n V a l T y r G l y A s n H i s Gl n P r o G l y S o r T y rA G A GA C AT C AG T C A T T A T T AC AG T C C A T C T AT G C T A G AG G AC C C A T O G C C A CC A T T G C A A 4 8 0A r g A sp I l e S o r H i s Ty r T y r S w r P r o S o r H e t L o u G l u A s p P r o T r p Al a A l a L o u Gl nG C C G A G G C C C A A T A C A G A T A G A C T A C A A T AT C A A C C A T G A AA T C A A AC C T G T G C T C A A G C T C C A T G C A AC A A 5 5 2A l a G l u Al a G l n T y r A r g --C C C G G G G G A A A G C A G C O G C C C T A A G G O T G G T A T A T T T T T A C T G T A T G A G A T T T T A A C A C T A G C C T T T G T M GA G C C T G G C A 6 31C A A T G C G G G C A C T T A T A T A A T A T A T T G AG C C A A T A A A C T A C A A G A C A T M A A C A C A T A A A A A A A A A A A C G O A A T T C 7 0 6

F i g . 3 . N u c l e o t i d e s e q u e n c e o f G S 1 7 cDNA c l o n e a n d t h e d e d u c e d a m i n oa c i d s e q u e n c e o f t h e p r o t e i n p r o d u c t . V e r t i c a l a r r o w a t p o s i t i o n 3 5 i n d i c a t e st h e p o i n t o f d i v e r g e n c e b e t w e e n t h e cDNA c l o n e a n d t h e g e n o m i c c l o n e .T h i s s i t e a l s o r e p r e s e n t s t h e 5 ' - t e r m i n a l n u c l e o t i d e o f t h e l o n g e r s p e c i e s o fG S 1 7 m RNA d e t e c t e d i n 5 ' m a p p i n g e x p e r i m e n t s . T h e c o n s e r v e d p o l y ( A )a d d i t i o n s i t e , AATAAA i s u n d e r l i n e d . T h e s e d a t a g i v e a f u l l l e n g t h f o r t h emRNA o f 6 5 2 b a s e s , n o t i n c l u d i n g a p o l y ( A ) t a i l , 2 3 b a s e s o f w h i c h a r e 5 'u n t r a n s l a t e d s e q u e n c e s a n d 1 8 9 b a s e s o f w h i c h a r e 3 ' t r a i l i n g s e q u e n c e s .T h e p r e d i c t e d p r o t e i n i s 1 4 6 a m i n o a c i d s l o n g .s a m p l e w a s r e t a i n e d f o r a s s a y s o f G S 1 7 s e q u e n c e s . T h e r e s u l t sp r e s e n t e d i n F i g u r e 2A s h o w t h a t t h e n e w t r a n s c r i p t s b e c o m ec l e a r l y d e t e c t a b l e a t 9 h a f t e r f e r t i l i z a t i o n , a b l a s t u l a s t a g e i n t h i se x p e r i m e n t . T h i s r e s u l t i s i n c o m p l e t e a g r e e m e n t w i t h p r e v i o u ss t u d i e s w h i c h s h o w e d t h a t t h e g e n e r a l o n s e t o f t r a n s c r i p t i o n o c -c u r s a t t h i s s t a g e a n d t h a t t h e m a j o r i t y o f t h e i d e n t i f i a b l e s e q u e n c e st r a n s c r i b e d a r e t R N A s a n d s n R N A s ( N e w p o r t a n d K i r s c h n e r ,1 9 8 2 a ; B u s b y a n d R e e d e r , 1 9 8 3 ) . G S 1 7 m RNA w a s d e t e c t e db y 5 ' e n d m a p p i n g w i t h a h i g h l y l a b e l l e d R NA p r o b e . T h e r e s u l t s( F i g u r e 2 B ) s h o w t h a t G S 1 7 s e q u e n c e s a r e f i r s t d e t e c t e d i n t o t a lR NA e x t r a c t e d f r o m 9 - h e m b r y o s , p r e c i s e l y t h e s a m e s a m p l ei n w h i c h n e w l y s y n t h e s i z e d R NA w a s f i r s t o b s e r v e d . We c o n -c l u d e , t h e r e f o r e , t h a t t h e GS 1 7 g e n e i s t r a n s c r i b e d a t t h e MBTa n d i s a m o n g t h e v e r y f i r s t mRNAs t o b e t r a n s c r i b e d i n e a r l ye m b r y o n i c d e v e l o p m e n t .N u c l e o t i d e s e q u e n c e o f a f u l l - l e n g t h G S J 7 cDNA c l o n eT h e G S 1 7 cDNA c l o n e w a s s e q u e n c e d t o c h a r a c t e r i z e f u r t h e rt h e g e n e a n d w i t h t h e h o p e t h a t t h e d e d u c e d a m i n o a c i d s e q u e n c em i g h t p r o v i d e s o m e i n s i g h t i n t o t h e p r o p e r t i e s o r f u n c t i o n o f t h ep r o t e i n . R NA b l o t t i n g e x p e r i m e n t s ( F i g u r e 1 ) s h o w t h a t G S 1 7w a s - 7 5 0 b a s e s l o n g a n d t h e t o t a l l e n g t h o f G S 1 7 s e q u e n c e se x c i s e d f r o m t h e X g t l O r e c o m b i n a n t w a s - 7 0 0 b a s e s , n e a r l y af u l l - l e n g t h c o p y o f t h e mRNA. T h e n u c l e o t i d e s e q u e n c e a n dd e d u c e d a m i n o a c i d s e q u e n c e o f t h e X e n o p u s GS 1 7 cDNA c l o n ea r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 3 . T h e p r o t e i n c o n s i s t s o f 1 4 6 a m i n o a c i d sa n d h a s a p r e d i c t e d m a s s o f 1 7 0 0 0 d a l t o n s , h e n c e t h e n a m eG S 1 7 . A c o m p u t e r s e a r c h o f t h e NI H p r o t e i n s e q u e n c e d a t a b a s ef a i l e d t o i d e n t i f y a n y s i g n i f i c a n t r e g i o n s o f h o m o l o g y b e t w e e nGS 1 7 a n d o t h e r k n o w n p r o t e i n s e q u e n c e s . Two n o t a b l e f e a t u r e so f t h e p r o t e i n s e q u e n c e a r e a l a r g e n e t b a s i c c h a r g e ( + 1 4 ) a n da n u n u s u a l l y h i g h p r o l i n e c o n t e n t ( 2 1 o f 1 4 6 a m i n o a c i d s ) .I s o l a t i o n o f a g e n o m i c c l o n e f o r G S 1 7S o u t h e r n b l o t s p e r f o r m e d . u n d e r h i g h s t r i n g e n c y c o n d i t i o n s i n -d i c a t e t h a t a s i n g l e c o p y o f t h e GS 1 7 g e n e i s p r e s e n t i n t h e3 4 6 6

B X

B

P v S c P v E N X B N E N S BN

I \ \V ' ' \I ' . \ N

E P v

pGS17 5

H]21 pGS7X

pGS17 X ( 3

200bp

F i g . 4 . S t r u c t u r e o f t h e GS 1 7 g e n e a n d p l a s m i d c o n s t r u c t i o n s u s e d f o ri n j e c t i o n s t u d i e s . A 4 - k b g e n o m i c f r a g m e n t i s o l a t e d f r o m a r e c o m b i n a n t Xp h a g e i s s h o w n a t t h e t o p a n d t h e s p l i c e d cDNA c l o n e i s s h o w n b e l o w .E x o n s a r e s h o w n b y h a t c h e d b o x e s a n d t h e s i n g l e i n t r o n b y an o pe n b o x .p G S 1 7 5 ' c o n t a i n s 2 k b o f 5 ' - f l a n k i n g r e g i o n a n d 1 1 5 b p o f t h e f i r s t exono f G S 1 7 . T h e b l a c k b o x r e p r e s e n t s e x t r a n e o u s s e q u e n c e s i n s e r t e d t o m a r kt h e g e n e a n d d i s t i n g u i s h i t s t r a n s c r i p t s f r o m t h o s e o f t h e e n d o g e n o u s g e n e ./ v \ r e p r e s e n t s p S P 6 4 p l a s m i d s e q u e n c e s . T h e X e n o p u s 3 - g l o b i n g e n e i ss h o w n w i t h s t i p p l e d b o x e s a s e x o n s , o p e n b o x e s f o r i n t r o n s , a n d a d o u b l el i n e f o r f l a n k i n g r e g i o n s . T h e G S 1 7 / f - g l o b i n f u s i o n i s s h o w n b e l o w . B ,B a m H I , E , E c o R I , N , N c o I ; P v , P v u I I ; S , S n a I . ; S c , S a c l ; X , X b a I .X e n o p u s g e n o m e ( d a t a n o t s h o w n ) . A l i b r a r y o f X e n o p u s g e n o m i cs e q u e n c e s w a s c o n s t r u c t e d b y c l o n i n g p a r t i a l M b o I r e s t r i c t i o nf r a g m e n t s o f h i g h m o l . w t . X e n o p u s DNA i n t o t h e v e c t o r EMBL4 ( F r i s c h a u f e t a l . , 1 9 8 3 ) a n d sequences c o m p l e m e n t a r y t o t h eGS 1 7 cDNA c l o n e w ere i s o l a t e d b y s t a n d a r d t e c h n i q u e s ( s e eM a t e r i a l s a n d m e t h o d s ) . A p a r t i a l r e s t r i c t i o n map o f t h e r e g i o ns u r r o u n d i n g t h e G S 1 7 gene i s s h o w n i n F i g u r e 4 .T h e i n j e c t e d G S J 7 gene i s c o r r e c t l y e x p r e s s e d d u r i n g d e v e l o p m e n tA p l a s m i d c o n s t r u c t i o n , p G S 1 7 5 ' ( s e e F i g u r e 4 ) , c o n t a i n i n g 1 1 5b a s e s o f t h e f i r s t e x o n o f t h e GS 1 7 g en e a n d a f u r t h e r 2 k b o f5 ' - f l a n k i n g sequences w as i n j e c t e d i n t o d e v e l o p i n g e m b r y o s a tt h e t i m e o f t h e f i r s t c e l l d i v i s i o n . T h e i n j e c t e d g en e w a s m a r k e dw i t h a 4 5 - b a s e f r a g m e n t o f f o r e i g n DNA so t h a t t r a n s c r i p t s c o u l db e d i s t i n g u i s h e d f r o m t h o s e o f t h e e n d o g e n o u s ( c h r o m o s o m a l )G S 1 7 g e n e s . A f t e r i n j e c t i o n t h e e m b r y o s wer e a l l o w e d t o d e v e l o pa n d g r o u p s o f e m b r y o s wer e s a m p l e d a t v a r i o u s s t a g e s o f d e v e l o p -ment i n o r d e r t o f o l l o w t h e appearance o f t r a n s c r i p t s f r o m t h eGS 1 7 p r o m o t e r . T o t a l R NA w a s e x t r a c t e d f r o m e m b r y o s a t f i v ed e v e l o p m e n t a l s t a g e s r a n g i n g f r o m e a r l y b l a s t u l a t h r o u g h t o t a i l -b u d t a d p o l e a n d t r a n s c r i p t s i n i t i a t e d a t t h e c o r r e c t 5 ' e n d s o f b o t ht h e m a r k e d i n j e c t e d g e ne a n d t h e e n d o g e n o u s G S 1 7 g en e w e r ed e t e c t e d b y R N a s e m a p p i n g ( F i g u r e 5 ) . I n i t i a t i o n f r o m t h e e n -d o g e n o u s gene p r o t e c t s t w o R NA f r a g m e n t s , 1 1 5 a n d 1 2 1 b a s e sl o n g . T h i s d o u b l e t p r o b a b l y c o r r e s p o n d s t o tw o t r a n s c r i p t i o n i n -i t i a t i o n s i t e s , t h o u g h we h a v e n o t r u l e d o u t p r o c e s s i n g o f t h e R NAt r a n s c r i p t s . T r a n s c r i p t s f r o m t h e m a r k e d g en e a l s o p r o t e c t tw oR N A s , 1 6 0 a nd 1 6 6 b a s e s l o n g .T h e r e s u l t s p r e s e n t e d i n F i g u r e 5 s h o w t h a t p r i o r t o m i d - b l a s t u l ano t r a n s c r i p t i o n i s o b s e r v e d f r o m e i t h e r t h e e n d o g e n o u s GS 1 7p r o m o t e r or f r o m t h e i n j e c t e d GS 1 7 5 ' DNA. A t s u b s e q u e n ts t a g e s o f d e v e l o p m e n t t h e e x p r e s s i o n o f t h e m a r k e d gene p a r a l l e l st h e e x p r e s s i o n o f t h e e n d o g e n o u s GS 1 7 g e n e . I n b o t h c a s e s , t r a n s -c r i p t s b e g i n t o a c c u m u l a t e a t m i d - b l a s t u l a a n d r e a c h p e a k l e v e l sa t t h e m i d - g a s t r u l a s t a g e . T h o u g h t h e s e assays d o n o t d i r e c t l yt e s t t r a n s c r i p t i o n r a t e s , t h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t b o t h t h e i n j e c t e da n d t h e e n d o g e n o u s GS 1 7 p r o m o t e r s ar e o n l y t r a n s c r i p t i o n a l l y

irL U - ]

E N P v


5/9

C o r r e c t e x p r e s s i o n o f a n i n j e c t e d X e n o p u s g a s t r u l a g e n eM 7 8 1 0 1 2 1 7

4 0 6 -S -Full l e n g t h p r o b e

2199

2 j I n j e c t e d1 6 2 -1 49-

1 2 4 - 7 E n d o g e n o u s

P v E

352 i F u l e n g f h p r o b e1 6 0 1 6 6--I n e e d g e n e1 1 5 1 2 1 En. . e r - O u s g e n e

F i g . 5 . E x p r e s s i o n o f G S 1 7 DNA i n i n j e c t e d e m b r y o s . 5 0 p g o f s u p e r c o i l e dG S 1 7 5 ' DNA w a s i n j e c t e d i n t o f e r t i l i z e d e g g s a s t h e f i r s t c l e av a ge b e ga n .I n j e c t e d e g g s w e r e a l l o w e d t o d e v e l o p t o t h e s t a g e i n d i c a t e d a t t h e t o p o fe a c h t r a c k a n d t o t a l R NA w a s e x t r a c t e d . T r a n s c r i p t s f r o m t h e e n d o g e n o u sa n d i n j e c t e d G S 1 7 s e q u e n c e s w e r e d e t e c t e d b y R N a s e m a p p i n g w i t h t h es a m e s i n g l e - s t r a n d e d S P 6 R NA p r o b e . T h i s c o n t i n u o u s l y 3 2 P - l a b e l l e d R NAp r o b e a n d t h e R N a s e - p r o t e c t e d f r a g m e n t s t h a t map t h e 5 ' e n d s o f G S 1 7RNAs a r e s h o w n b e l o w t h e a u t o r a d i o g r a m . T o t a l RNA f r o m o n e e m b r y oe q u i v a l e n t w a s a s s a y e d a n d t h e p r o t e c t e d f r a g m e n t s w e r e f r a c t i o n a t e d i n a6% a c r y l a m i d e - 8 . 3 M u r e a g e l . T h e s t r u c t u r e o f t h e p G S 1 7 5 ' g e n e i ss h o w n m o r e c o m p l e t e l y i n F i g u r e 4 . T h e s i z e m a r k e r s , M, a r e H p a I If r a g m e n t s o f p B R 3 2 2 .a c t i v e f r o m t h e m i d - b l a s t u l a t r a n s i t i o n u n t i l a b o u t m i d w a y t h r o u g hg a s t r u l a t i o n . T h e r e a f t e r , t r a n s c r i p t s f r o m b o t h t h e i n j e c t e d a n dt h e c h r o m o s o m a l GS 1 7 g e n e s d i s a p p e a r a n d a r e a b s e n t a f t e rn e u r u l a t i o n .

T h i s a n d o t h e r e x p e r i m e n t s h a v e s h o w n t h a t w h i l e t r a n s c r i p t sf r o m t h e i n j e c t e d G S 1 7 DNA d i s a p p e a r d u r i n g n e u r u l a t i o n , t h e yd o s o m o r e s l o w l y t h a n t h e i r n a t u r a l c o u n t e r p a r t . A s d i s c u s s e de a r l i e r , t h e d i s a p p e a r a n c e o f n a t u r a l G S 1 7 m R N A f r o m e m b r y o ss u g g e s t s t h a t t h e m RNA i s s p e c i f i c a l l y d e g r a d e d d u r i n g n e u r u l a -

t i o n . I t i s n o t o b v i o u s w h y t r a n s c r i p t s f r o m t h e m a r k e d GS 1 7g e n e s s h o u l d a l s o d i s a p p e a r . H o w e v e r , s i n c e p G S 1 7 5 ' d o e s n o tc o n t a i n t h e c o m p l e t e g e n o m i c s e q u e n c e o f GS 1 7 , t h e t r a n s c r i p t sw i l l t e r m i n a t e a t s e q u e n c e s i n t h e p l a s m i d v e c t o r a n d t h e r e f o r el a c k a p r o p e r 3 ' e n d w i t h a p o l y ( A ) t a i l . T h e s e t r a n s c r i p t s , c o n -t a i n i n g h e t e r o g e n e o u s 3 ' p o r t i o n s o f b a c t e r i a l s e q u e n c e s , a r e a p -p a r e n t l y u n s t a b l e i n t h e d e v e l o p i n g f r o g e m b r y o . I f a s t a b l et r a n s c r i p t h a d b e e n p r o d u c e d f r o m t h e m a r k e d g e n e we w o u l dh a v e e x p e c t e d t o o b s e r v e a n i n c r e a s e i n t h e a m o u n t o f t r a n s c r i p tw h i l e t h e GS 1 7 p r o m o t e r w a s a c t i v e a n d t h e n a c o n s t a n t h i g hl e v e l o f R NA a t s u b s e q u e n t d e v e l o p m e n t a l s t a g e s . An e x a m p l eo f t h i s t y p e i s p r e s e n t e d i n t h e GS 1 7 / 3 - g l o b i n f u s i o n e x p e r i m e n t sd e s c r i b e d b e l o w .F i n a l l y , w e n o t e t h a t RNAs c o r r e s p o n d i n g t o t h e f u l l - l e n g t hp r o b e a r e p r o t e c t e d i n t h i s e x p e r i m e n t . W h i l e w e h a v e n o t m a p -p e d t h e 5 ' e n d s o f t h e RNAs t h a t g i v e r i s e t o t h e s e p r o t e c t e df r a g m e n t s , t h e y c a n b e e x p l a i n e d b y t r a n s c r i p t s t h a t i n i t i a t e a tt h e i n j e c t e d G S 1 7 p r o m o t e r a nd r e a d a l l t h e w a y a r o u n d t h ep l a s m i d . T h i s i s n o t u n e x p e c t e d i n l i g h t o f t h e f a c t t h a t t h i s c o n -s t r u c t i o n l a c k s a e u c a r y o t i c t e r m i n a t i o n o r 3 ' p r o c e s s i n g s i g n a l .T h i s t y p e o f c o n t i n u o u s t r a n s c r i p t h a s p r e v i o u s l y b e e n o b se r v e dw i t h c i r c u l a r SV40 t r a n s c r i p t s i n j e c t e d i n t o o o c y t e s ( W i c k e n s a n dG u r d o n , 1 9 8 3 ) .F a t e o f i n j e c t e d G S J 7 DNAP r e v i o u s e x p e r i m e n t s i n w h i c h p l a s m i d DNA w a s i n j e c t e d i n t od e v e l o p i n g e m b r y o s s h o w e d v a r y i n g d e g r e e s o f a m p l i f i c a t i o n o ft h e i n j e c t e d DNA. T h i s w a s f i r s t s t u d i e d b y H a rl a nd a n d L a s k e y( 1 9 8 0 ) w h o s h o w e d t h a t a s m a l l p o r t i o n o f DNA i n j e c t e d i n t of e r t i l i z e d e g g s i s c o r r e c t l y r e p l i c a t e d t h r o u g h t h e f i r s t f e w c e l ld i v i s i o n s . S e v e r a l g r o u p s h a v e i n v e s t i g a t e d t h e p e r s i s t e n c e o f t h ei n j e c t e d DNA t h r o u g h l a t e r d e v e l o p m e n t a l s t a g e s . F o r e x a m p l e ,X e n o p u s a n d r a b b i t g l o b i n g e n e s a n d s e a u r c h i n h i s t o n e g e n e sw e r e a m p l i f i e d 5 0 - t o 2 0 0 - f o l d f o l l o w i n g i n j e c t i o n ( B e n d i g a n dW i l l i a m s , 1 9 8 3 ; R u s c o n i a nd S c h a f f n e r , 1 9 8 1 ; E t k i n e t a l . ,1 9 8 4 ) . I n t h e s e c a s e s , t h e i n j e c t e d p l a s m i d DNA r e a c h e d p e a kl e v e l s a t l a t e b l a s t u l a t o m i d - g a s t r u l a a n d t h e n m o s t ( u p t o 9 5 % )o f t h e DNA d i s a p p e a r e d b y t h e t a d p o l e s t a g e . I n c o n t r a s t , i n -j e c t e d y e a s t tRNA g e n e s ( N e w p o r t a n d K i r s c h n e r , 1 9 8 2 b ) a n dX e n o p u s rRNA g e n e s ( B us b y a n d R e e d e r , 1 9 8 3 ) w e r e n o ta m p l i f i e d a t a l l , a n d i n j e c t e d S V 4 0 - C A T g e n e s w e r e o n l ya m p l i f i e d - 5 - f o l d ( E t k i n e t a l . , 1 9 8 4 ) .T h e d e g r e e t o w h i c h t h e i n j e c t e d GS 1 7 DNA i s a m p l i f i e d i ss i g n i f i c a n t f o r t w o r e a s o n s . F i r s t , a l a r g e a m p l i f i c a t i o n f a c t o rg r e a t l y i n c r e a s e s t h e a m o u n t o f t r a n s c r i p t i o n t e m p l a t e p r e s e n t i nt h e e m b r y o . S e c o n d l y , d r a m a t i c c h a n g e s i n t h e a m o u n t o f DNAt e m p l a t e w o u l d a f f e c t t h e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e e x p r e s s i o n p a t -t e r n o f t h e i n j e c t e d g e n e s . I n p r i n c i p l e , a r a p i d i n c r e a s e i nt e m p l a t e DNA u p t o m i d - g a s t r u l a f o l l o w e d b y a r a p i d d e c r e a s ei n t e m p l a t e DNA l e v e l s a s d e v e l o p m e n t p r o g r e s s e d c o u l d a c c o u n tf o r t h e e x p r e s s i o n p r o f i l e s h o w n i n F i g u r e 5 . T o t e s t t h i s p o s s i b i l i -t y , w e d e t e r m i n e d t h e e x t e n t t o w h i c h i n j e c t e d GS 1 7 DNA i sa m p l i f i e d . T o t a l n u c l e i c a c i d f r o m t h e e q u i v a l e n t o f o n e i n j e c t e de m b r y o w a s d i g e s t e d w i t h E c o R I a n d u s e d f o r a S o u t h e r n b l o t .T h e r e s u l t s ( F i g u r e 6 ) s h o w t h a t t h e a m o u n t o f i n j e c t e d DNAr e m a i n s c o n s t a n t f r o m t h e f e r t i l i z e d e g g t h r o u g h n e u r u l a , t h ep e r i o d d u r i n g w h i c h GS 1 7 i s e x p r e s s e d . A f t e r n e u r u l a t i o n , t h e r ei s a d e c r e a s e i n t h e a m o u n t o f i n j e c t e d DNA, b u t t h i s i s l o n ga f t e r G S 1 7 e x p r e s s i o n h a s s t o p p e d . T h e r e f o r e , c h a n g e s i n t h ea m o u n t o f GS 1 7 t e m p l a t e c a n n o t a c c o u n t f o r t h e e x p r e s s i o n p r o -f i l e o b s e r v e d i n F i g u r e 5 .I n a p a r a l l e l s e r i e s o f e x p e r i m e n t w e h a v e a s s a y e d t h e s t a t eo f t h e i n j e c t e d DNA u s i n g S o u t h e r n b l o t s . W e f i n d t h a t t h e i n -

3 4 6 7


6/9


F i g . 6 . P e r s i s t e n c e o f i n j e c t e d DNA d u r i n g e a r l y d e v e l o p m e n t . F e r t i l i z e de g g s w e r e i n j e c t e d w i t h 5 0 p g o f s u p e r c o i l e d p G S 1 7 5 ' DNA ( F i g u r e 4 ) a n da l l o w e d t o d e v e l o p t o t h e s t a g e i n d i c a t e d a t t h e t o p o f e a c h t r a c k . T o t a ln u c l e i c a c i d w a s e x t r a c t e d a n d t h e DNA f r o m o n e e m b r y o e q u i v a l e n t w a sd i g e s t e d w i t h E c o R I , f r a c t i o n a t e d i n a 0 . 8 % a g a r o s e g e l a n d b l o t t e d t on i t r o c e l l u l o s e . T h e f i l t e r w a s h y b r i d i z e d w i t h 3 2 P - l a b e l l e d v e c t o r DNA. T h et i m e 0 t r a c k c o n t a i n s DNA e x t r a c t e d f r o m e m b r y o s i m m e d i a t e l y f o l l o w i n gi n j e c t i o n . E c o R I d i g e s t e d , u n i n j e c t e d DNA s t a n d a r d s o f p G S 1 7 5 ' DN Aw e r e i n c l u d e d i n t h e g e l t o e s t i m a t e t h e d e g r e e t o w h i c h t h e i n j e c t e d DNAsw e r e a m p l i f i e d .j e c t e d DNA r e m a i n s e x t r a c h r o m o s o m a l i n a s u p e r c o i l e d f o r m ,i . e . , t h e r e i s n o i n d i c a t i o n t h a t t h e G S 1 7 DNA i n t e g r a t e s i n t ot h e h o s t c h r o m o s o m e u p u n t i l t h e t a i l b u d s t a g e ( d a t a n o t s h o w n ) .W e c a n n o t r u l e o u t a v e r y l o w l e v e l o f i n t e g r a t i o n , b u t o u r r e s u l t ss h o w t h a t > 9 9 % o f t h e i n j e c t e d t e m p l a t e i s e x t r a c h r o m o s o m a l .W e c o n c l u d e t h a t t h e a m o u n t o f i n j e c t e d G S 1 7 t e m p l a t e r e -m a i n s c o n s t a n t t h r o u g h o u t e a r l y d e v e l o p m e n t a n d t h a t t h e t r a n -s i e n t e x p r e s s i o n o f t h e i n j e c t e d DNA ( F i g u r e 5 ) r e f l e c t s c h a n g e si n t h e a c t i v i t y o f t h e G S 1 7 p r o m o t e r . M o r e o v e r , we f i n d t h a tm o s t o f t h e i n j e c t e d DNA i s n o t i n t e g r a t e d i n t o t h e h o s t g e n o m ea n d p e r s i s t s a s a n e x t r a c h r o m o s o m a l e l e m e n t .T r a n s c r i p t i o n o f i n j e c t e d X e n o p u s g l o b i n a n d G S J 7 / g l o b i n f u -s i o n g e n e s i n e m b r y o sA s n o t e d i n t h e I n t r o d u c t i o n , s e v e r a l e x p e r i m e n t s h a v e e x a m i n -e d t h e e x p r e s s i o n o f g e n e s i n j e c t e d i n t o X e n o p u s e m b r y o s a n di n s o m e c a s e s a l o w l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n h a s b e e n s h o w n t o s t a r ts o o n a f t e r t h e MBT ( B e n d i g , 1 9 8 1 ; R u s c o n i a n d S h a f f n e r , 1 9 8 1 ;B e n d i n g a n d W i l l i a m s , 1 9 8 3 , 1 9 8 4 ; E t k i n e t a l . , 1 9 8 4 ; E t k i na n d B a l c e l l s , 1 9 8 5 ) . I n t h e l i g h t o f t h e s e r e s u l t s , how c a n w eb e s u r e t h a t t r a n s c r i p t i o n o f i n j e c t e d GS 1 7 g e n e s i s n o t a s i m i l a rn o n - s p e c i f i c e v e n t ? T o a d d r e s s t h i s i s s u e we h a v e c o m p a r e d t h e

e x p r e s s i o n o f t h e i n j e c t e d GS 1 7 p r o m o t e r w i t h t h e e x p r e s s i o no f a n o t h e r p r o m o t e r , t h e X e n o p u s a d u l t 3 - g l o b i n g e n e , p r e v i o u s l ys h o w n t o g i v e a l o w l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n f o l l o w i n g t h e MBT( B e n d i g a n d W i l l i a m s , 1 9 8 3 ) . S i n c e i t i s n o t p r a c t i c a l t o d i r e c t l ym e a s u r e t h e r a t e o f t r a n s c r i p t i o n o f a n i n j e c t e d p r o m o t e r , i n -f e r e n c e s a b o u t p r o m o t e r a c t i v i t y a r e m a d e b y m e a s u r i ng t h e a c -c u m u l a t i o n o f s t a b l e RNA. I n t h e c a s e o f GS 1 7 t h i s i s n o ts t r a i g h t f o w a r d b e c a u s e t h e mRNA i s u n s t a b l e . T h e r e f o r e , weh a v e f u s e d t h e GS 1 7 p r o m o t e r t o a s e q u e n c e c o d i n g f o r a s t a b l et r a n s c r i p t , a g l o b i n mRNA ( G u r d o n e t a l . , 1 9 7 4 ; B e n d i g a n dW i l l i a m s , 1 9 8 3 , 1 9 8 4 ) . T h e s t r u c t u r e o f t h e X e n o p u s 3 - g l o b i ng e n e a n d t h e GS 1 7 / g l o b i n f u s i o n a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 4 . N o t et h a t t h e G S 1 7 ' p r o m o t e r ' f r a g m e n t c o n t a i n s 2 . 0 k b o f 5 ' - f l a n k i n gr e g i o n a n d 1 1 5 b p o f t h e f i r s t e x o n .

A s p r e v i o u s l y s h o w n b y B e n d i g a n d W i l l i a m s ( 1 9 8 3 ) , w e f i n d al o w l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e i n j e c t e d 3 - g l o b i n g e n e a f t e r t h eMBT. T h i s l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n i s m u c h l o w e r t h a n t h a t o b s e r v e df o r i n j e c t e d GS 1 7 a n d r e q u i r e s a 7 - d a y e x p o s u r e o f t h e g e l f o rd e t e c t i o n ( F i g u r e 7 A ) . F a i n t b a n d s c o r r e s p o n d i n g t h e 5 ' e n d o fg l o b i n m R N A a r e f i r s t d e t e c t e d a t s t a g e 1 0 a n d t h e s e c o n t i n u et o a c c u m u l a t e t h r o u g h o u t t h e c o u r s e o f t h e e x p e r i m e n t , i n d i c a t i n gt h a t t h e g l o b i n p r o m o t e r i s n o t t u r n e d o f f . T h i s p a t t e r n o f e x -p r e s s i o n a g r e e s w i t h p r e v i o u s o b s e r v a t i o n s ( B e n d i g a n d W i l l i a m s ,1 9 8 3 ) , e x c e p t t h a t we o b s e r v e l e s s g l o b i n R N A , p r o b a b l y b e c a u s ewe d o n o t f i n d t h e 5 0 - t o 1 0 0 - f o l d a m p l i f i c a t i o n o f t h e i n j e c t e dt e m p l a t e t h a t t h e y o b s e r v e d i n t h e i r e x p e r i m e n t s . T h u s , t h e t r a n s -c r i p t i o n o f i n j e c t e d , B - g l o b i n DNA s e e m s t o d i f f e r f r o m t h a t o fGS 1 7 DNA i n b o t h t h e a m o u n t a n d p a t t e m o f e x p r e s s i o n . A d i r e c tc o m p a r i s o n o f t h e t w o p r o m o t e r s i s p r o v i d e d b y t h e r e s u l t s s h o w ni n F i g u r e 7 B .T h e G S 1 7 / g l o b i n DNA d i r e c t s t h e s y n t h e s i s o f h i g h l e v e l s o ft r a n s c r i p t s i n i n j e c t e d e m b r y o s ( F i g u r e 7 B ) . A 6 - h e x p o s u r es h o w s a c o n s p i c u o u s b a n d a t a s i z e p r e d i c t e d f o r t h e 5 ' e n d o ft h e f u s i o n t r a n s c r i p t . T r a n s c r i p t s a r e n o t d e t e c t e d p r i o r t o t h em i d - b l a s t u l a t r a n s i t i o n , b u t b y s t a g e 1 0 t h e y a r e a b u n d a n t a n db y s t a g e 1 2 , m i d - g a s t r u l a , t h e t r a n s c r i p t s h a v e a c c u m u l a t e d t op e a k l e v e l s . A f t e r m i d - g a s t r u l a t h e f u s i o n t r a n s c r i p t p e r s i s t s a ta n a p p r o x i m a t e l y c o n s t a n t l e v e l t h r o u g h o u t t h e d e v e l o p m e n t a ls t a g e s t e s t e d . I n m a r k e d c o n t r a s t , t r a n s c r i p t s f r o m t h e f - g l o b i ng e n e a r e b e l o w t h e l e v e l o f d e t e c t i o n i n a 6 - h e x p o s u r e ( F i g u r e7 B ) .T h e e x p r e s s i o n p a t t e r n o b s e r v e d f r o m t h e f u s i o n g e n e i s e x -p e c t e d f o r a G S 1 7 p r o m o t e r t h a t i s t r a n s i e n t l y a c t i v e f r o m t h em i d - b l a s t u l a t o m i d - g a s t r u l a s t a g e a n d t h a t d i r e c t s t h e s y n t h e s i so f a s t a b l e t r a n s c r i p t . U n l i k e t h e n a t u r a l c a s e w h e r e GS 1 7 mRNAr a p i d l y d i s a p p e a r s , t h e f u s i o n t r a n s c r i p t p e r s i s t s t h r o u g h l a t e rd e v e l o p m e n t , p r o b a b l y b e c a u s e i t c o n t a i n s X e n o p u s f 3 - g l o b i nmRNA s e q u e n c e s t h a t a r e q u i t e s t a b l e i n i n j e c t e d e m b r y o s . I ft h e i n j e c t e d GS 1 7 p r o m o t e r r e m a i n e d t r a n s c r i p t i o n a l l y a c t i v e d u r -i n g l a t e s t a g e s , o n e w o u l d h a v e e x p e c t e d t o s e e a c o n t i n u o u s i n -c r e a s e i n t h e a m o u n t o f t h e f u s i o n t r a n s c r i p t . S i n c e t h a t i s n o to b s e r v e d , t h i s f u s i o n e x p e r i m e n t s u p p o r t s t h e c o n c l u s i o n d r a w nf r o m i n j e c t i n g GS 1 7 5 ' DNA ( F i g u r e 5 ) , n a m e l y t h a t t h e i n j e c t e dG S 1 7 p r o m o t e r i s t u r n e d o n a n d o f f d u r i n g e a r l y d e v e l o p m e n t .A s a c o n t r o l , t h e a m o u n t o f t e m p l a t e w a s a s s a y e d a s b e f o r e( F i g u r e 6 ) a n d t h e r e s u l t s ( n o t s h o w n ) r e v e a l t h a t e q u a l a m o u n t so f b o t h t e m p l a t e s w e r e p r e s e n t a t e a c h d e v e l o p m e n t a l s t a g e . I nt h i s c a s e , b o t h t e m p l a t e s w e r e a m p l i f i e d 3 - t o 5 - f o l d , t h o u g h i no t h e r e x p e r i m e n t s u s i n g t h e s a m e t e m p l a t e s a m p l i f i c a t i o n wasn o t o b s e r v e d . T h e i m p o r t a n t p o i n t i s t h a t t h e i n j e c t e d g l o b i n a n df u s i o n t e m p l a t e s a r e p r e s e n t i n e q u a l a m o u n t s s o t h a t t h e r e l a t i v ea c t i v i t i e s o f t h e tw o p r o m o t e r s i s d i r e c t l y c o m p a r a b l e .Q u a n t i t a t i o n o f t h e r e s u l t s p r e s e n t e d i n F i g u r e 7 B s h o w s t h a t

3 4 6 8


7/9

C o r r e c t e x p r e s s i o n o f a n i n j e c t e d X e n o p u s g a s t r u l a g e n e

M 7 10 1 2 1 8 2 5

1 1 2 - -

BM 7 9 1 0 1 2 1 9 2 6

1 6 2 - -- _. . . . .

7 9 1 0 1 2 1 9 2 6 M

a 1 6 2F u s i o n gene5 e n d

- / 3 - g l o b i n 5 end

/ 3 - g l o b i n -5 end

3 0 3-3-- - - --14 6 -5 2

p--Ie-q-:2 7 0 . F , j l l e n o , g ;:r

73 - - - MP *r f c : r - . c x -

F i g . 7 . E x p r e s s i o n o f 3 - g l o b i n a n d G S l 7 / 3 - g l o b i n f u s i o n g e n e s i n i n j e c t e d e m b r y o s . 5 0 pg o f s u p e r c o i l e d DNA was i n j e c t e d i n t o f e r t i l i z e d e g g s a t t h e f i r s tc l e a v a g e . T h e s t r u c t u r e s o f t h e i n j e c t e d DNAs ar e s h o w n more c o m p l e t e l y i n F i g u r e 4 . I n j e c t e d e g g s w e r e a l l o w e d t o d e v e l o p t o t h e s t a g e i n d i c a t e d a t t h e t o po f e a c h t r a c k a n d t o t a l R NA was e x t r a c t e d . R N a s e m a p p i n g o f t h e 5 ' e n d s o f t h e t r a n s c r i p t s was p e r f o r m e d w i t h R NA f r o m o n e e m b r y o e q u i v a l e n t u s i n g t h es i n g l e - s t r a n d e d S P 6 RNA p r o b e s s h o w n b e l o w e a c h a u t o ra d io gr a m . T h e p r o t e c t e d f r a g m e n t s w e r e f r a c t i o n a t e d i n a 6 % a c r y l a m i d e - 8 . 3 M urea g e l . ( A) 7 -d aya u t o r a d i o g r a p h i c exposure o f p r o b e p r o t e c t e d b y R NA e x t r a c t e d f r o m e m b r y o s i n j e c t e d w i t h X e n o p u s , B - g l o b i n ge ne . ( B ) 6 h a u t o r a d i o g r a p h i c exposure o fp r o b e p r o t e c t e d b y RNA e x t r a c t e d f r o m e m b r y o s i n j e c t e d w i t h e i t h e r G S 1 7 / , 3 - g l o b i n f u s i o n g e n e o r t h e , B - g l o b i n g e n e a l o n e .t h e i n j e c t e d GS 1 7 p r o m o t e r i s - 2 0 0 - t o 5 0 0 - f o l d more a c t i v et h a n t h e i n j e c t e d g l o b i n gene p r o m o t e r i n i n j e c t e d e m b r y o s . Wec o n c l u d e t h a t t r a n s c r i p t i o n o f t h e i n j e c t e d GS 1 7 g e ne i s c o r r e c t -l y r e g u l a t e d a n d i s n o t t h e r e s u l t o f a n o n - s p e c i f i c t r a n s c r i p t i o no f i n j e c t e d DNA. M o r e o v e r , i n c o n j u c t i o n w i t h t h e r e s u l t s s h o w ni n F i g u r e 5 , t h e s e e x p e r i m e n t s s u g g e s t t h a t t h e c i s - a c t i n g s i g n a l st h a t d i r e c t RNA s y n t h e s i s o f GS 1 7 d u r i n g g a s t r u l a t i o n ar e con-t a i n e d w i t h i n t h e 5 ' r e g i o n o f t h e GS17 gene.D i s c u s s i o nW e s h o w h e r e t h a t GS 1 7 i s among t h e very f i r s t g e n e s t o b ee x p r e s s e d b y t h e e m b r y o n i c g e n o m e , e x a c t l y a t t h e MBT. G S 1 7t r a n s c r i p t s appear a t t h e same t i m e as new tRNA a n d snRNAt r a n s c r i p t s a n d c o n s i d e r a b l y e a r l i e r t h a n r R N A s ( S h i o k a w a e t a l . ,1 9 8 1 ; B u s b y a n d R e e d e r , 1 9 8 3 ) o r mRNAs s u c h as m u s c l e ac-t i n ( M o h u n e t a l . , 1 9 8 4 ) or f i b r o n e c t i n ( t h i s p a p e r ) . I t i s n o tu n d e r s t o o d how s e l e c t i v e g e ne t r a n s c r i p t i o n a t t h e m i d - b l a s t u l at r a n s i t i o n i s a c c o m p l i s h e d , b u t t h e very f i r s t genes t o b e t r a n s c r i b -e d ar e p r o b a b l y c o n t r o l l e d b y m a t e r n a l f a c t o r s . A d e p e n d e n c eon c o n t r o l l i n g f a c t o r s e x p r e s s e d b y t h e m a t e r n a l genome d u r i n go o g e n e s i s i s i n f e r r e d f r o m t h e f a c t t h a t t h e e m b r y o n i c g e n o m ei s t r a n s c r i p t i o n a l l y i n a c t i v e p r i o r t o t h e MBT. T h u s , i f p r o t e i n s

ar e i n v o l v e d i n t h e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n o f genes a t t h e MBT,t h o s e p r o t e i n s must b e p r o v i d e d d i r e c t l y f r o m a m a t e r n a l p o o lo r i n d i r e c t l y b y t r a n s l a t i o n o f m a t e r n a l mRNAs. I n l i n e w i t h t h i sr e a s o n i n g , we a s s u m e t h a t a l l t h e f a c t o r s i n v o l v e d i n r e g u l a t i n gt h e t r a n s c r i p t i o n o f a g ene l i k e GS 1 7 must b e p r e s e n t , i n an ac-t i v e o r i n a c t i v e f o r m , i n t h e e g g . I t i s p e r h a p s w o r t h n o t i n g t h a tt h i s may b e q u i t e d i f f e r e n t f r o m t h e s i t u a t i o n i n t e r m i n a l l y d i f -f e r e n t i a t e d c e l l s . I n t h i s l a t t e r case t h e a c t i v a t i o n o f a gene m ayb e t h e e n d r e s u l t o f a l o n g s e r i e s o f r e g u l a t o r y e v e n t s w i t h m a n yo f t h e k e y f a c t o r s p r e s e n t o n l y i n precursor c e l l s t h a t ar e d i f -f i c u l t o r i m p o s s i b l e t o o b t a i n .An i n t r i g u i n g p r o p e r t y o f GS 1 7 e x p r e s s i o n i s t h e f a c t t h a t i t st r a n s c r i p t s ar e f o u n d o n ly d ur i ng a b r i e f p e r i o d o f d e v e l o p m e n t ,p r i n c i p a l l y t h r o u g h g a s t r u l a t i o n . S a r g e n t a n d D a w i d ( 1 9 8 3 ) h a v ea l s o i d e n t i f i e d genes t h a t ar e e x p r e s s e d e a r l y , a t g a s t r u l a t i o n , a n dsome o f t h e s e ar e n o t e x p r e s s e d a t l a t e r e m b r y o n i c s t a g e s . I nt h e case o f GS 1 7 , o ur s t u d i e s i n d i c a t e t h a t t h e t r a n s i e n t e x p r e s -s i o n o f t h e gene i s t h e r e s u l t o f a l i m i t e d p e r i o d o f t r a n s c r i p t i o nc o u p l e d w i t h t h e i n s t a b i l i t y o f t h e t r a n s c r i p t . T h e l e v e l o f GS 1 7mRNA r e a c h e s i t s maximum o n l y 2 h a f t e r t r a n s c r i p t i o n i s i n -i t i a t e d a n d t h e u n p r o c e s s e d pre-mRNA i s o b s e r v e d o n l y a t s t a g e10 g a s t r u l a . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e GS 1 7p r o m o t e r s t o p s 4 - 5 h a f t e r i t i s f i r s t i n i t i a t e d . U n l i k e most

3 4 6 9

92-*. 1 2 4 --

6 9 9

92 - - -

- - - 1 2 4

6 7 - - -

270 --------.73 ;-. .?e.

- 6 7


8/9


mRNAs i n t h e d e v e l o p i n g e m b r y o w h i c h a r e e x t r e m e l y s t a b l e( C o l o t a n d R o s b a s h , 1 9 8 2 ) , t h e G S 1 7 m R N A d i s a p p e a r s w i t ha h a l f - l i f e o f -3- 4 h . I t i s f o r m a l l y p o s s i b l e t h a t t h e d i s a p -p e a r a n c e o f GS 1 7 m R N A a f t e r g a s t r u l a t i o n i s t h e r e s u l t o f c o n -t i n u o u s t r a n s c r i p t i o n c o m b i n e d w i t h a n i n c r e a s e d r a t e o f m R N Ad e g r a d a t i o n . H o w e v e r , w e b e l i e v e t h e s i m p l e s t i n t e r p r e t a t i o n o fo u r r e s u l t s i s t h e G S 1 7 p r o m o t e r i s a c t i v e t r a n s i e n t l y a n d t h a tb y n e u r u l a t i o n t h e m R N A i s d e g r a d e d .T o b e g i n a n i n v e s t i g a t i o n o f t h i s t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n , w eh a v e s h o w n h e r e t h a t GS 1 7 g e n e s a r e c o r r e c t l y e x p r e s s e d w h e ni n j e c t e d i n t o d e v e l o p i n g e g g s . P r e v i o u s a t t e m p t s t o o b t a i n c o r -r e c t r e g u l a t i o n o f g e n e s i n j e c t e d i n t o d e v e l o p i n g f r o g e g g s h a v eg i v e n v a r i a b l e r e s u l t s . G e n e s t r a n s c r i b e d b y R NA p o l y m e r s e I( r R N A s , B u s b y a n d R e e d e r , 1 9 8 3 ) a n d I I I ( t R N A s , N e w p o r t a n dK i r s c h n e r , 1 9 8 2 b ) a r e t u r n e d o n a t t h e p r o p e r t i m e w h e n i n j e c t e di n t o f e r t i l i z e d e g g s . H o w e v e r , o t h e r s t u d i e s , i n p a r t i c u l a r t h o s eu s i n g g e n e s t h a t c o d e f r o m mRNAs, h a v e m e t w i t h l e s s s u c c e s s( s e e I n t r o d u c t i o n ) . D e s p i t e t h e u s e o f h o m o l o g o u s X e n o p u s g e n e s ,B e n d i g a n d W i l l i a m s ( 1 9 8 3 , 1 9 8 4 ) d i d n o t o b s e r v e c o r r e c td e v e l o p m e n t a l e x p r e s s i o n o f e i t h e r t a d p o l e o r a d u l t g l o b i n g e n e s .S e v e r a l s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t t r a n s c r i p t s c a n b e d e t e c t e d a tg a s t r u l a t i o n f r o m P o l H g e n e s i n j e c t e d i n t o f e r t i l i z e d e g g s .H o w e v e r , i t i s d i f f i c u l t t o a s s e s s t h e s i g n i f i c a n c e o f t h e s e o b s e r -v a t i o n s b e c a u s e o f t h e v e r y l o w l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n o b s e r v e da n d t h e f a c t t h a t i n j e c t e d g e n e s w e r e f r o m f o r e i g n s p e c i e s ( s e au r c h i n s , r a b b i t s , f l i e s ) a n d / o r v i r u s e s ( a d e n o v i r u s , S V 4 0 ) t h a ta r e n e v e r n o r m al l y e x p r e s s e d d u r i n g f r o g e m b r y o g e n e s i s . T h eo n e c o n c l u s i o n t h a t c a n b e d r a w n f r o m t h e s e s t u d i e s i s t h a t t h e r ec a n b e a l o w l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n a f t e r t h e MBT a n d t h a t t h i sl o w l e v e l m a y c o n t i n u e t h r o u g h o u t e m b r y o g e n e s i s a s i f t h e r e w e r es o m e ' l e a k a g e ' d u e t o t h e v a s t a m o u n t s o f DNA i n j e c t e d .I n t h e l i g h t o f t h e s e p r e v i o u s r e s u l t s , i t i s i m p o r t a n t t o s h o wt h a t t h e e x p r e s s i o n p a t t e r n o f t h e i n j e c t e d g e n e r e f l e c t s n o r m a ld e v e l o p m e n t a l r e g u l a t i o n . W i t h r e s p e c t t o t h e t r a n s c r i p t i o n a l a c -t i v a t i o n o f t h e i n j e c t e d DNA, s e v e r a l r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h i s s t e pi s c o r r e c t l y r e g u l a t e d . F i r s t , t r a n s c r i p t s f r o m t h e i n j e c t e d G S 1 7DNA b e g i n t o a c c u m u l a t e a t t h e s a m e t i m e a s t h o s e f r o m t h ee n d o g e n o u s g e n e , s h o r t l y a f t e r t h e MBT. S e c o n d l y , w e n o t e t h a tt h e a m o u n t o f t r a n s c r i p t s y n t h e s i z e d f r o m t h e i n j e c t e d DNA i sa b o u t t h e s a m e a s t h e e n d o g e n o u s G S 1 7 mRNA. T h i r d l y , w eh a v e c o m p a r e d t h e a c t i v i t y o f t h e G S 1 7 p r o m o t e r w i t h t h a t o ft h e X e n o p u s f - g l o b i n g e n e a n d f i n d t h a t t h e G S 1 7 p r o m o t e r i s200-500 t i m e s m o r e a c t i v e t h a n t h e g l o b i n p r o m o t e r a t t h eMBT. T h u s , t h e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n o f i n j e c t e d GS 1 7 DNAi s n o t m e r e l y t h e r e s u l t o f s o m e g e n e r a l l o w l e v e l o f t r a n s c r i p -t i o n t h a t o c c u r s o n a l l i n j e c t e d D N A s .O u r r e s u l t s a l s o s u g g e s t t h a t t h e G S 1 7 p r o m o t e r i s t u r n e d o f fd u r i n g g a s t r u l a t i o n . T r a n s c r i p t s f r o m t h e i n j e c t e d G S 1 7 DNAd i s a p p e a r d u r i n g n e u r u l a t i o n l i k e t h o s e o f t h e e n d o g e n o u s g e n e .I f t h e i n j e c t e d DNA r e m a i n e d t r a n s c r i p t i o n a l l y a c t i v e a f t e rg a s t r u l a t i o n w e s h o u l d h a v e o b s e r v e d a c o n t i n u a l i n c r e a s e i n t h ea m o u n t o f GS 1 7 t r a n s c r i p t s . M o r e o v e r , w h e n t h e GS 1 7 p r o m o t e re l e m e n t s a r e f u s e d t o t h e b o d y o f a f 3 - g l o b i n g e n e i n o r d e r t od i r e c t t h e s y n t h e s i s o f a s t a b l e RNA, t h i s f u s i o n t r a n s c r i p t d o e sn o t c o n t i n u a l l y i n c r e a s e i n a m o u n t d u r i n g l a t e r d e v e l o p m e n t a ls t a g e s . I n c o n t r a s t , s o m e i n j e c t e d DNAs ( e . g . , , B - g l o b i n , F i g u r e7 a ) a r e t u r n e d o n a n d r e m a i n o n s o t h a t t h e r e i s a s t e a d y i n c r e a s ei n t h e a m o u n t o f t r a n s c r i p t a c c u m u l a t e d . T o g e t h e r , t h e s e r e s u l t sa n d t h o s e o b t a i n e d w i t h P o l I a n d I I I g e n e s ( B u s b y a n d R e e d e r ,1 9 8 3 ; N e w p o r t a n d K i r s c h n e r , 1 9 8 2 b ) s u g g e s t t h a t g e n e s t h a ta r e n o r m a l l y e x p r e s s e d e a r l y i n e m b r y o n i c d e v e l o p m e n t m a y b ec o r r e c t l y r e g u l a t e d w h e n i n j e c t e d i n t o f e r t i l i z e d e g g s .I n m o s t o f o u r e x p e r i m e n t s t h e i n j e c t e d DNA i s n o t d e t e c t a b l y3 4 7 0

a m p l i f i e d , t h o u g h i n s o m e c a s e s w e d o o b s e r v e a l o w l e v e l( < 5 - f o l d ) o f a m p l i f i c a t i o n . P r e v i o u s r e p o r t s r e v e a l a w i d e r a n g ei n t h e d e g r e e t o w h i c h i n j e c t e d DNAs a r e a m p l i f i e d , f r o m p r a c -t i c a l l y n o n e ( B u s b y a n d R e e d e r , 1 9 8 3 ; N e w p o r t a n d K i r s c h n e r ,1 9 8 2 b ; E t k i n e t a l . , 1 9 8 4 ) t o 5 0 - t o 2 0 0 - f o l d ( R u s c o n i a n d S c h a f f -n e r , 1 9 8 1 ; B e n d i g a n d W i l l i a m s , 1 9 8 3 ; E t k i n e t a l . , 1 9 8 4 ) .W h e t h e r t h i s v a r i a t i o n c a n b e a t t r i b u t e d t o t h e d i f f e r e n t t e m p l a t e su s e d o r t o t h e a m o u n t s o f DNA i n j e c t e d r e m a i n s a n o p e n q u e s -t i o n . I n o u r e x p e r i m e n t s , - 5 0 p g o r 3 x 1 0 7 c o p i e s o f GS 1 7w e r e i n j e c t e d , w h i c h i s a n - 1 0 3 - f o l d e x c e s s c o m p a r e d w i t h t h ec a l c u l a t e d n u m b e r o f e n d o g e n o u s GS 1 7 c o p i e s p r e s e n t a t t h eMBT. I n t h i s l i g h t i t i s s o m e w h a t s u r p r i s i n g t h a t a p p r o x i m a t e l ye q u a l a m o u n t s o f t r a n s c r i p t a r e p r o d u c e d f r o m t h e i n j e c t e d a n de n d o g e n o u s t e m p l a t e s ( F i g u r e 5 ) . T h i s m a y i n d i c a t e t h a t o n l ya s m a l l p r o p o r t i o n o f t h e i n j e c t e d GS 1 7 t e m p l a t e s a r e a c t i v e i nt r a n s c r i p t i o n .F i n a l l y , i t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t t h e i n j e c t e d GS 1 7 DNA,w h i c h c o n t a i n s - 2 k b o f DNA f l a n k i n g t h e 5 ' e n d o f t h e g e n e ,h a s t h e c i s - a c t i n g e l e m e n t s s u f f i c i e n t f o r b o t h t h e c o r r e c t s w i t c h -o n a n d s w i t c h - o f f o f t r a n s c r i p t i o n . I n o t h e r c a s e s , s u c h a s t h er i b o s o m a l g e n e s a n d t h e tRNA g e n e s , t h e g e n e s a r e a c t i v a t e dp e r m a n e n t l y . F u r t h e r d i s s e c t i o n o f t h i s r e g i o n s h o u l d a l l o w u st o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e o n a n d o f f s i g n a l s a r e s e p a r a b l e . I na d d i t i o n , w e m a y b e a b l e t o i d e n t i f y a n d i s o l a t e m a t e r n a l c o m -p o n e n t s f r o m e g g s t h a t f u n c t i o n a s t r a n s - a c t i n g f a c t o r s i nr e g u l a t i n g GS 1 7 e x p r e s s i o n .M a t e r i a l s a n d m e t h o d sM a t e r i a l sX . l a e v i s w e r e p u r c h se d f r o m X e n o p u s I , An n A r b o r , MI a n d f e d c h o p p e d l i v e rt w i c e p e r w e e k . R a d i o n u c l e o t i d e s w e r e p u r c h a s e d f r o m A m e r s h a m , AMV r e v e r s et r a n s c r i p t a s e f r o m L i f e S c i e n c e s , I n c . , S P 6 R NA p o l y m e r a s e f r o m P r o m e g a B i o t e ca n d a l l r e s t r i c t i o n e n z y m e s f r o m P r o m e g a B i o t e c a n d Ne w E n g l a n d B i o l a b s .I n j e c t i o n o f f e r t i l i z e d e g g sE g g s w e r e o b t a i n e d b y i n j e c t i n g X e n o p u s f e m a l e s w i t h m a r e s e r u m g o n a d o t r o p i n( 5 0 0 u n i t s ) f o l l o w e d 2 -5 d a y s l a t e r b y t h e i n j e c t i o n o f h u m a n c h o r i o n i cg o n a d o t r o p i n ( 1 0 0 0 u n i t s ) . E g g s w e r e l a i d i n H SB ( 1 2 0 mM N a C l , 2 0 mM T r i s -H C I , pH 7 . 6 , 1 mM K C 1 , 1 mM M g S O 4 , 2 mM N a H C O 3 ) a n d f e r t i l i z e d b y t h ea d d i t i o n o f s p e r m f r o m m a c e r a t e d t e s t i s i n t a p w a t e r . A b o u t 2 0 m i n a f t e r f e r -t i l i z a t i o n e g g s w e r e d e j e l l i e d i n 3% c y s t e i n e ( p H 7 . 5 ) a n d t r a n s f e r r e d t o 0 . 1 XMSBH ( G u r d o n , 1 9 7 6 ) , 5% F i c o l l ( r e c o m m e n d e d b y J . G e r h a r d t ) . I n j e c t i o n so f 2 0 n l i n t o t h e v e g e t a l h e m i sp h e r e w e r e p e r f o r m e d a s t h e f i r s t c l e a v a g e f u r r o wa p p e a r e d a t t h e a n i m a l p o l e . E gg s w e r e i n c u b a t e d i n 0 . 1 X MBSH, 5% F i c o l le i t h e r a t r o o m t e m p e r a t u r e o r a t 1 8 C . A l l e m b r y o n i c s t a g e s g i v e n a r e a c c o r -d i n g t o N i e u w k o o p a n d F a b e r ( 1 9 6 7 ) .C o n s t r u c t i o n a n d s c r e e n i n g o f a X e n o p u s g a s t r u l a cDNA l i b r a r yA cDNA l i b r a r y w a s c o n s t r u c t e d i n X g t l O ( H u y n h e t a l . , 1 9 8 5 ) , u s i n g p o l y ( A ) +R NA i s o l a t e d f r o m s t a g e 1 1 g a s t r u l a e m b r y o s . T h e d e t a i l s o f cDNA s y n t h e s i sa n d i n s e r t i o n i n t o t h e v e c t o r a r e d e s c r i b e d e l s e w h e r e ( R e b a g l i a t i e t a l . , 1 9 8 5 ) .T h e l i b r a r y c o n t a i n s - 1 0 6 i n d e p e n d e n t r e c o m b i n a n t s w i t h a n a v e r a g e i n s e r t s i z eo f 1 . 1 k b .T h e g a s t r u l a cDNA l i b r a r y w a s p l a t e d o n E s c h e r i c h i a c o l i C 6 0 0 / h f l a t a d e n -s i t y o f 2000- 3 0 0 0 p l a q u e s p e r 1 5 cm p l a t e . R e c o m b i n a n t s w e r e t r a n s f e r r e d t on i t r o c e l l u l o s e f i l t e r s i n d u p l i c a t e ( B e n t o n a n d D a v i s , 1 9 7 7 ) , d e n a t u r e d i n s i t u b ya u t o c l a v i n g ( G . S t r u h l , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ; W e e k s e t a l . , 1 9 8 5 ) , b a k e d f o rh i n v a c u o a t 8 0 C a n d p r e - h y b r i d i z e d i n 5 0 % f o r m a m i d e a t 4 2 C a s d e s c r i b -e d ( M a n i a t i s e t a l . , 1 9 8 2 ) . H y b r i d i z a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t i n t h e s a m e b u f f e rw i t h 9 x 1 0 6 c . p . m . p e r f i l t e r u s i n g 3 2 P - l a b e l l e d cDNA p r e p a r e d f r o m e i t h e rd e f o l l i c u l a t e d o o c y t e o r s t a g e 1 1 p o l y ( A ) + R N A . T h e f i l t e r s w e r e w a s h e d i n 2x S S C , 0 . 1 % SDS a t 6 5 C a n d e x po s e d w i t h i n t e n s i f y i n g s c r e e n s a t - 7 0 Cf o r 3 d a y s .

C l o n e s y i e l d i n g a d i f f e r e n t i a l r e s p o n s e w e r e p u r i f i e d a n d s u b j e c t e d t o t w o f u r -t h e r t e s t s . F i r s t , a l a r g e n u m b e r o f t h e d i f f e r e n t i a l c l o n e s w e r e f o u n d t o c o n t a i nm i t o c h o n d r i a l s e q u e n c e s a s j u d g e d b y h y b r i d i z a t i o n t o a X e n o p u s m i t o c h o n d r i a lDNA c l o n e ( R a s t l a n d D a w i d , 1 9 7 9 ) . B o n a f i d e d i f f e r e n t i a l c l o n e s w e r e s e l e c t e df r o m t h e r e m a i n i n g c a n d i d a t e s b y N or t h e rn b l o t t e s t s . 1 j s g o f p o l y ( A ) + RNAf r o m d e f o l l i c u l a t e d o o c y t e s a n d s t a g e 1 1 e m b r y o s w a s f r a c t i o n a t e d i n a d j a c e n tt r a c k s o n a d e n a t u r i n g a g a r o s e g e l , t r a n s f e r r e d t o n i t r o c e l l u l o s e , a n d h y b r i d i z e dw i t h 3 2 P - l a b e l l e d i n s e r t i s o l a t e d f r o m p u t a t i v e d i f f e r e n t i a l c l o n e s . T h e s e N o r t h e r n


9/9

C o r r e c t e x p r e s s i o n o f a n i n j e c t e d X e n o p u s g a s t r u l a g e n eb l o t s p r o v i d e d a s e n s i t i v e t e s t f o r s e q u e n c e s e n t i r e l y a b s e n t f r o m o o c y t e R N A ,b u t p r e s e n t i n g a s t r u l a RNA.I s o l a t i o n o f X e i o p u s f i b r o n e c t i n (DNA c l o n e s8 x 1 0 5 X g t l O r e c o m b i n a n t s f r o m a n o o c y t e cDNA l i b r a r y ( R e b a g l i a t i e t a l . ,1 9 8 5 ) w e r e s c r e e n e d u n d e r l o w s t r i n g e n c y h y b r i d i z a t i o n c o n d i t i o n s ( M c G i n n i se t a l . , 1 9 8 4 ) f o r s e q u e n c e s h o m o l o g o u s t o r a t f i b r o n e c t i n u s i n g 3 2 P - l a b e l l e d r l f 1( S c h w a r z b a u e r e t a l . , 1 9 8 3 ) . T h e 4 8 p o s i t i v e c l o n e s w e r e a s s a y e d f o r i n s e r t s i z e .T h e l o n g e s t cDNA i n s e r t c o n t a i n s t w o E c o R I f r a g m e n t s , 2 . 6 a n d 0 . 4 k b i n l e n g t h ,a n d t h e s e w e r e s u b c l o n e d i n t o p S P 6 5 t o g e n e r a t e pXFA a n d p X F B , r e s p e c t i v e -l y . DNA s e q u e n c i n g o f a 4 5 0 - b p r e g i o n n e a r t h e 5 ' e n d o f pXFA p r e d i c t s a na m i n o a c i d s e q u e n c e t h a t i s 65% h o m o l o g o u s t o t h e r a t p l a s m a f i b r o n e c t i n s e -q u e n c e , b e t w e e n n u c l e o t i d e s 3 1 6 a n d 7 9 8 a s r e p o r t e d b y S c h w a r z b a u e r e t a l .( 1 9 8 3 ) . S e q u e n c e c o m p a r i s o n s s u g g e s t t h a t t h i s X e n o p u s c l o n e e n c o d e s a c e l l u l a rf i b r o n e c t i n ( R . H y n e s , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . pXFB c o n t a i n s s e q u e n c e s e x -t e n d i n g f u r t h e r t o w a r d s t h e 5 ' e n d o f t h e mRNA.C ' o o s t r u c t i o n a n i d s c r e e n i n g o f a X e n i o p u s g e n o t n i c l i b r a r YDNA w a s i s o l a t e d f r o m s t 3 3 e m b r y o s o b t a i n e d f r o m t w o s e p a r a t e m a t i n g s . T h eDNA f r a g m e n t s r e s u l t i n g f r o m M b o I p a r t i a l d i g e s t i o n w e r e f r a c t i o n a t e d b y s u c r o s ed e n s i t y g r a d i e n t s a n d p u r i f i e d b e f o r e i n s e r t i o n i n t o t h e BamHI s i t e o f XEMBL4( F r i s c h a u f e t a l . , 1 9 8 3 ) . A f t e r i n v i t r o p a c k a g i n g , 1 0 6 r e c o m b i n a n t s w e r e p l a t e do n E . c o l i K 8 0 2 a n d a m p l i f i e d . D i g e s t i o n o f 1 8 r a n d o m l y s e l e c t e d c l o n e s w i t hE c o R l s h o w s t h a t t h e a v e r a g e i n s e r t s i z e i s - 1 6 k b .To i s o l a t e a g e n o m i c c o p y o f G S 1 7 DNA, 8 x 1 0 5 r e c o m b i n a n t s f r o m t h i sl i b r a r y w e r e s c r e e n e d w i t h 3 2 P - l a b e l l e d i n s e r t f r o m t h e G S 1 7 cDNA. 2 4h o m o l o g o u s c l o n e s w e r e i d e n t i f i e d a n d t h e p a r t i a l r e s t r i c t i o n map o f o n e c l o n e ,X X G S 1 7 . 1 i s s h o w n i n F i g u r e 4 . R e s t r i c t i o n f r a g m e n t s o f t h e g e n o m i c c l o n ew e r e s u b c l o n e d i n t o p S P 6 4 ( M e l t o n e t a l . , 1 9 8 4 ) f o r f u r t h e r a n a l y s i s .DNA s e q u e n c i n gT h e DNA s e q u e n c e o f t h e G S 1 7 cDNA c l o n e a n d p o r t i o n s o f t h e f i b r o n e c t i ncDNA c l o n e w e r e o b t a i n e d u s i n g t h e c h a i n t e r m i n a t i o n m e t h o d o f S a n g e r e t a l .( 1 9 7 7 ) . R e s t r i c t i o n f r a g m e n t s w e r e c l o n e d i n t o M 1 3 v e c t o r s ( M e s si n g a n d V i e i r a ,1 9 8 2 ) a n d i n a l l c a s e s t h e s e q u e n c e o f b o t h s t r a n d s w a s d e t e r m i n e d .P l a s , n i d c - o n s t r u c t i o l l sF o r i n j e c t i o n s t u d i e s , i t i s n e c e s s a r y t o d i s t i n g u i s h t r a n s c r i p t s o f t h e i n j e c t e d G S 1 7DNA f r o m t h o s e o f t h e e n d o g e n o u s g e n e . A m a r k e d GS 1 7 g e n e t h a t c o n t a i n sm o s t o f t h e 5 ' - f l a n k i n g r e g i o n w a s c o n s t r u c t e d a s f o l l o w s . T h e 2 . 6 - k b B a m H If r a g m e n t o f t h e g e n o m i c G S 1 7 DNA w a s s u b c l o n e d i n t o B a m H I - c u t p S P 6 4 . D i g e s -t i o n o f t h i s DNA w i t h E c o R I y i e l d s a 2 . 1 - k b f r a g m e n t w h i c h w a s c l o n e d i n t oE c o R I - c u t p S P 6 4 t o g i v e p G S 1 7 5 ' ( s e e F i g u r e 4 ) . T h e p o l y l i n k e r s e q u e n c e sd o w n s t r e a m f r o m t h e E c o R I s i t e i n t h e f i r s t e x o n o f GS 1 7 a c t a s t h e m a r k e r s e -q u e n c e , s h o w n a s a b l a c k b o x i n F i g u r e 4 .

T h e X e n o p u s 3 - g l o b i n g e n e , p X f , c o n s i s t s o f t h e 2 . 4 - k b E c o R I t o H i n d I I f r a g -m e n t o f t h e m a j o r a d u l t 4 - g l o b i n g e n e ( P a t i e n t e t a l . , 1 9 8 0 ) , i n s e r t e d i n t o p S P 6 4 .T h e f u s i o n g e n e , pG S I 7 / X , w a s c o n s t r u c t e d a s f o l l o w s . p X , B DNA w a s c l e a v e da t t h e u n i q u e N c o I s i t e l o c a t e d a t t h e i n i t i a t i o n c o d o n i n t h e f i r s t e x o n o f t h e g l o b i ng e n e . T h e o v e r h a n g i n g e n d s w e r e f i l l e d i n w i t h r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e a n d a n E c o R I1 2 - m e r l i n k e r w a s l i g a t e d t o t h e b l u n t e n d . F o l l o w i n g d i g e s t i o n w i t h E c o R I , t h e2 . 1 - k b G S 1 7 p r o m o t e r f r a g m e n t o f p G S 1 7 5 ' w a s i n s e r t e d i n t o t h e p l a s m i d i np l a c e o f t h e , B - g l o b i n p r o m o t e r . T h e 1 2 - m e r E c o R I l i n k e r w a s u s e d t o c r e a t e t h ef u s i o n g e n e s o t h a t a n o p e n r e a d i n g f r a m e w o u l d b e r e t a i n e d i n t h e R NA t r a n s c r i p t s .

A n a l Y s i s o f t r a n s c r i p t sRNAs w e r e i s o l a t e d f r o m e g g s a n d e m b r y o s b y p r o t e i n a s e K d i g e s t i o n , p h e n o l :c h l o r o f o r m e x t r a c t i o n , a n d e t h a n o l p r e c i p i t a t i o n a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( M e l t o na n d C o r t e s e , 1 9 8 1 ) . T h e 5 ' e n d s o f g e n e t r a n s c r i p t s w e r e m a p p e d w i t h a n R N a s ep r o t e c t i o n a s s a y u s i n g S P 6 s i n g l e - s t r a n d e d R NA p r o b e s a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y( Z i n n e t a l . , 1 9 8 3 ; M e l t o n e t a l . , 1 9 8 4 ) . I n e a c h c a s e , a p p r o p r i a t e r e s t r i c t i o n sf r a g m e n t s s p a n n i n g t h e 5 ' e n d o f t h e g e n e w e r e c l o n e d d o w n s t r e a m f r o m a n S P 6p r o m o t e r i n p S P 6 4 o r p S P 6 5 . U n i f o r m l y l a b e l l e d R NA p r o b e s ( 6 x 1 0 8 c . p . m . / j t g )w e r e s y n t h e s i z e d f r o m l i n e a r t e m p l a t e s u s i n g S P 6 R NA p o l y m e r a s e w i t h[ a - 3 2 P ] U T P a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( M e l t o n e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h e s i z e s o f f u l l - l e n g t hp r o b e a n d t h e e x p e c t e d R N a s e A a n d T 1 p r o t e c t e d f r a g m e n t s a r e s h o w n i n e a c hf i g u r e .

R e f e r e n c e sB e n d i g M . M . ( 1 9 8 1 ) N a t u r e , 2 9 2 . 6 5 - 6 7 .B e n d i g , M . M . a n d W i l l i a m s , J . G . ( 1 9 8 3 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A , 8 0 ,

6 1 9 7 - 6 2 0 1 .B e n d i g , M . M . a n d W i l l i a m s , J . G . ( 1 9 8 4 ) M o l . C e l l . B i o l . , 4 , 5 6 7 - 5 7 0 .B e n t o n , W . D . a n d D a v i s , R . W . ( 1 9 7 7 ) S c i e n c e ( W a s h . ) , 1 % , 1 8 0 - 1 8 2 .B r o w n . D . D . a n d L i t t n a , E . ( 1 9 6 4 ) J . M o l . B i o l . , 8 , 6 6 9 - 6 8 7 .B u s b y , S . J . a n d R e e d e r , R . H . ( 1 9 8 3 ) C e l l , 3 4 , 9 8 9 - 9 9 6 .C h a s e , J . W . a n d D a w i d , I . ( 1 9 7 2 ) D e v . B i o l . , 2 7 , 5 0 4 - 5 1 8 .C o l o t , H . V . a n d R o s b a s h , M . ( 1 9 8 2 ) D e ' . B i o l . , 9 4 , 7 9 - 8 6 .D w o r k i n , M . B . a n d D a w i d I . ( 1 9 8 0 ) D e v ' . B i o l . , 7 6 , 4 4 9 4 6 4 .E t k i n , L . D . a n d B a l c e l l s , S . ( 1 9 8 5 ) D e v ' . B i o l . , 1 0 8 , 1 7 3 - 1 7 8 .E t k i n , L . D . , P e a r m e n , B . , R o b e r t s , M . a n d B e k t e s h , S . L . ( 1 9 8 4 ) D i f f e r e n t i a t i o n ,2 6 , 1 9 4 - 2 0 2 .F r i s c h a u f , A . , L e h r a c h , H . , P o u s t k a , A . a n d M u r r a y , N . ( 1 9 8 3 ) J . M o l . B i o l . , 1 7 0 ,8 2 7 - 8 4 2 .G e r h a r t . J . C . ( 1 9 8 0 ) i n G o l d b e r g e r , R . ( e d . ) , B i o l o g i c a l R e g u l a t i o n a n d D e v e l o p -m e n t , V o l . 2 , P l e n u m P r e s s , N Y , p p . 1 3 3 - 3 1 6 .G o l d b e r g , D . A . , P o s a k o n y , J . a n d M a n i a t i s , T . ( 1 9 8 3 ) C e l l , 3 4 , 5 9 - 7 3 .G u r d o n , J . B . ( 1 9 7 6 ) J . E r n b r v o l . E x p . M o r p h o l . , 3 6 , 5 2 3 - 5 4 0 .G u r d o n , J . B . , W o o d l a n d , H . R . a n d L i n g r e l , J . B . ( 1 9 7 4 ) D e v . B i o l . , 3 9 , 1 2 5 - 1 3 3 .H a r l a n d , R . M . a n d L a s k e y , R . A . ( 1 9 8 0 ) C e l l , 2 1 , 7 6 1 - 7 7 1 .H u y n h , T . , Y o u n g , R . A . a n d D a v i s , R . W . ( 1 9 8 5 ) i n G l o v e r , D . M . ( e d . ) , DNA C l o n -i n g , A P r a c t i c a l A p p r o a c h , I R L P r e s s , O x f o r d a n d W a s h i n g t o n , D C , p p . 4 9 - 7 8 .K r u m l a u f , R . , H a m m e r R . E . , T i l g h m a n , S . M . a n d B r i n s t e r , R . L . ( 1 9 8 5 ) M o l . C e l l .B i o l . , 5 , 1 6 3 9 - 1 6 4 8 .M a n i a t i s , T . , F r i t s c h , E . F . a n d S a m b r o o k , J . ( 1 9 8 2 ) M o l e c u l a r C l o n i n g . A

L a b o r a t o r v M a n u a l , p u b l i s h e d b y C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , N Y .M c G i n n i s, W . , L ev i ne , M . , H a f e n , E . , K u r o i w a , A . a n d G e h r i n g , W . J . ( 1 9 8 4 )N a t u r e , 3 0 8 , 4 2 8 4 3 3 .M e s s i n g , J . a n d V i e i r a , J . ( 1 9 8 2 ) G e n e , 1 9 , 2 6 9 - 2 7 2 .M e l t o n , D . A . , K r i e g , P . A . , R e b a g l i a t i , M . R . , M a n i a t i s , T . , Z i n n , K . a n dG r e e n , M . R . ( 1 9 8 4 ) N u c l e i c A c i d s R e s . , 1 2 , 7 0 3 5 - 7 0 5 6 .M o h u n , T . J . , B r e n n a n , S . , D a t h a n , N . , F a i r m a n , S . a n d G u r d o n , J . B . ( 1 9 8 4 ) N a t u r e ,3 1 1 , 7 1 6 - 7 2 1 .N e w p o r t , J . a n d K i r s h n e r , M . ( 1 9 8 2 a ) C e l l , 3 0 , 6 7 5 - 6 8 6 .N e w p o r t , J . a n d K i r s h n e r , M . ( 1 9 8 2 b ) C e l l , 3 0 , 6 8 7 - 6 9 6 .N i e u w k w o o p , P . D . a n d F a b e r , J . ( 1 9 6 7 ) N o r m a l T a b l e o f X e n o p u s l a e v i s ( D a u d i n ) ,p u b l i s h e d b y N o r t h H o l l a n d , A m s t e r d a m .P a l m i t e r , R . D . a n d B r i n s t e r , R . L . ( 1 9 8 5 ) C e l l , 4 1 , 3 4 3 - 3 4 5 .P a t i e n t , R . K . , E l k i n g t o n , J . A . , K a y , R . M . a n d W i l l i a m s , J . G . ( 1 9 8 0 ) C e l l , 2 1 ,5 6 5 - 5 7 3 .R a s t l E . a n d D a w i d , I . B . ( 1 9 7 9 ) C e l l , 1 8 , 5 0 1 - 5 1 0 .R e b a g l i a t i , M . R . , W e e k s , D . L . , H a r v e y , R . P . a n d M e l t o n , D . A . ( 1 9 8 5 ) C e l l , 4 2 ,

7 6 9 - 7 7 7 .S a n g e r , F . , N i c k l e n , S . a n d C o u l s o n , A . R . ( 1 9 7 7 ) P r o c . n a t l . A c a d . S c i . U S A , 7 4 ,5 4 3 6 - 5 4 6 7 .S a r g e n t , T . D . a n d D a w i d , I . B . ( 1 9 8 3 ) S c i e n c e ( W a s h . ) , 2 2 2 , 1 3 5 - 1 3 9 .S c h w a r z b a u e r , J . E . , T a m k u n , J . W . , L e m i s c h k a , I . a n d H y n e s , R . O . ( 1 9 8 3 ) C e l l ,3 5 , 4 2 1 4 3 1 .

S h i o k a w a , K . , M i s u m i , Y . a n d Y a m a n a , K . ( 1 9 8 1 ) D e s . G r o w t h D i f f e r . , 2 3 ,5 7 9 - 5 8 7 .S i g n o r e t , J . a n d L e f r e s n e , J . ( 1 9 7 1 ) A n n . E m b r v o g e n . M o r p h o g e n . , 4 , 1 1 3 - 1 2 3 .S p r a d l i n g , A . C . a n d R u b i n , G . M . ( 1 9 8 3 ) C e l l , 3 4 , 4 7 - 5 7 ;Y o u n g , P . G . a n d Z i m m e r m a n , A . M . ( 1 9 7 3 ) D e v . B i o l . , 3 3 , 1 9 6 - 2 0 5 .W i c k e n s , M . P . a n d G u r d o n , J . B . ( 1 9 8 3 ) J . M o l . B i o l . , 1 6 3 , 1 - 2 6 .

Z i n n , K . , D i M a i o , D . a n d M a n i a t i s , T . ( 1 9 8 3 ) C e l l , 3 4 , 8 6 5 - 8 7 9 .R e c e i v e d o n 9 O c t o b e r 1 9 8 5

A c k n o w l e d g e m e n t sW e t h a n k C . K i n t n e r , R . M y e r s , T . M a n i a t i s a n d G . S t r u h l f o r comments ont h e m a n u s c r i p t s a n d K . B r e a k e y f o r p r e p a r i n g f i g u r e s . We t h a n k J . Tankum a n dR . H y n e s f o r s h a r i n g c l o n e s a n d i n f o r m a t i o n a b o u t r a t f i b r o n e c t i n g e n e s . P . K .g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e s s u p p o r t f r o m t h e CSIR O a n d t h e F o g a r t y I n t e r n a t i o n a lC e n t e r . T h i s w o r k was s u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m t h e NI H a n d t h e S e a r l e S c h o l a r sP r o g r a m .

3 4 7 1

a gastrula-specific gene injected into

Documents

Transcript of a gastrula-specific gene injected into