Transcripción Diferencias eucariotas - procariotas

Diferencias eucariotas - procariotas Característica Procariota Eucariota

Promotor Cajas y zona operadora Solo cajas

Cistrón Policistrones Monocistrones

RNA polimerasa

una sola, con 5 subunidades distintas

3 ARN polimerasas.

EstabilizaciónEl ARN recién transcrito, no tiene.

Contiene, al comienzo de la cadena, 7-metil-guanosina o CAP, y al final de la cadena, una secuencia poli A.

Comienzo ARN pol, se autoacopla al promotor

ARN pol, necesita la presencia de proteínas de iniciación, que se unan antes que ella al ADN.

Intrones No tiene Tiene y se eliminan mediante splicing (corte y empalme).

ARN polimerasa en eucariotas

•El núcleo de las células eucariotas posee 3 ARN polimerasas:

• RNA polimerasa I se encuentra en el nucléolo (transcribe genes que codifican para RNA ribosómicos.

• RNA polimerasa II y III se localizan en el nucleoplasma.

RNA Polimerasa

Localización Producto Sensibilidad a -amanitina

RNA Pol I Nucléolo rRNAs 28S, 18S, 5.8S

insensible

RNA Pol II Nucleoplasma mRNAs,miRNAssnRNA

Muy sensible

RNA Pol III Nucleoplasma tRNAs, rRNA 5S, algunos

snRNAs

Sensibilidad intermedia

Comparación de las estructuras tridimensionales de las RNA polimerasas eucariotas y bacterianas

Comparación esquemática de la estructura de las RNA polimerasas eucariotas y bacterianas

El extremo carboxilo terminal de la subunidad más grande de la RNA pol II (RPB1) contiene un segmento repetido de 7 aminoácidos (CTD).La fosforilación de CTD es importante para la transcripción y el procesamiento del ARN.

Promotores reconocidos por la RNA polimerasa II

Promotor mínimoRegión comprendida a ambos lados del sitio de inicio de la transcripción. Se une el aparato de transcripción basal. Caja TATA (-25-30) (TATAAA); inicio de la transcripción (YYYAN(T/A)YY). Determina una transcripción basal

BRE: Elemento Reconocedor de TFIIB

DCE: Elementos del Promotor Mínimo ubicados Corriente Abajo

Promotores reconocidos por la RNA polimerasa IIPromotor reguladorRegión comprendida corriente arriba al promotor mínimo (-200 pb o más lejos). A estas secuencias se unen factores de transcripción específicos que determinan una transcripción eficiente y regulada del gen. La localización y organización de estos módulos es variable.

Caja CG: Factor de transcripción Sp1.Caja CCAATT: CTF

Promotores reconocidos por la RNA polimerasa II

CpG island

approx. -100 to -1

Promotor reconocido por la RNA polimerasa I

Los promotores de los genes transcriptos por RNA pol I no están tan bien conservados en su secuencia entre diferentes especies. Pero su arquitectura general sí está bien conservada.Consiste en dos elementos: un elemento central que contiene al sitio de inicio de la transcripción.

Un elemento corriente arriba (UPE), aproximadamente -100 pb más alejado. La distancia entre estos dos elementos es importante para el reconocimiento por los factores de transcripción.

Promotores reconocidos por la RNA polimerasa IIIExisten tres clases de promotores diferentes en los genes transcriptos por RNA pol III. Dos de éstos se encuentran en el interior de la secuencia transcripta.

Genes con promotores internos:El promotor del gen del rRNA 5S contiene tres regiones: Caja A; un elemento intermedio corto; una Caja C.

Los promotores de los genes de los tRNAs poseen dos partes: Caja A y Caja B.

Genes con promotores localizados corriente arriba:El promotor del gen que codifica a snRNA U6 es similar a los promotores reconocidos por la RNA pol II. Tienen secuencia TATA y una secuencia de unión a el factor SNAP.

Secuencias Activadoras y represoras de la Transcripción que no forman parte del promotor

El primer enhancer fue descubierto en la región 5´del gen de expresión temprana del virus SV40

Las secuencias estimuladoras o enhancers son secuencias que se encuentran distantes del promotor e incrementan la transcripción de los genes a los que se encuentran asociados.

Pueden localizarse a 5’ o 3’ del gen, o incluso dentro del mismo.Su efecto no depende de su orientación.Tienen una estructura modular, con diferentes secuencias cortas de ADN.Regulan la expresión génica especifica tisular y temporal.Actúan a distancia mediante la unión de factores de transcripción específicos. Algunos pueden actuar como represores cuando son reconocidas por proteínas represoras.

Las tres RNA polimerasas eucariotas necesitan de otras proteínas para iniciar la transcripción

Factores de transcripción basales o generales: se unen al promotor mínimo para iniciar la transcripción.

Se requieren 6 TFII para que la RNA polimerasa II inicie la transcripción.Al menos in vitro, se unen en un orden específico para formar el complejo de preiniciación

TFIIA

No es tan importante, al menos para la transcripción in vitro.

Quizás ayude a la unión de otros factores al complejo de iniciación.

TFIID

TFIID se compone de TBP (proteína de unión a caja TATA )Reconoce al promotor

Recluta a TFIIBAdemás está formado por otros 13 polipéptidos denominados TAF (Factores Asociados a TBP)

TBP es un Factor de Transcripción universal ya que también es requerida para la transcripción de genes transcriptos por las otras RNA polimerasas.

La unión de TBP al ADN induce una curvatura en el mismo

TFIID puede reconocer promotores que no tienen caja TATA

TFIIB

TFIIB actúa como puente entre la RNA polimerasa II y TBP.Ayuda a que la RNA pol II seleccione el sitio de inicio de la transcripción

Recluta al complejo TFIIF-PoI II.Bajo ciertas condiciones (presencia de BRE en el promotor), la RNA pol II junto a TFIID y TFIIB pueden formar un complejo de iniciación mínimo. Para la mayoría de los promotores, sin embargo, se necesitan de TFIIE,

TFIIF y TFIIH.

TFIIF

Recluta a RNA polimerasa II Posiciona a la RNA Polimerasa II sobre el sitio de inicio de la

transcripción

TFIIE

TFIIE es un heterotetrámero(a2b2)

Crea un sitio de anclaje para el próximo Factor de

Transcripción (TFIIH).-Modula la actividad enzimática

de TFIIH. Favorece la apertura del

promotor.

TFIIH

TFIIH es una proteína multimérica compuesta de 9 subunidades, algunas de ellas con distintas actividades enzimáticas.

Posee actividad helicasa, que desenrrolla el duplex de ADN en el sitio de inicio permitiendo que la RNA polimerasa II interaccione con la hebra

molde.Posee actividad de quinasa, fosforilando al CTD de la RNA Pol II al inicio

de la enlongación.

La fosforilación de la RNA polimerasa II en CTD permite que escape del promotor.

Los factores de Transcripción Generales son liberados.

Inicio de la Transcripción (Complejo de Preiniciación) en genes cuyos promotores no poseen Cajas TATA

Unión de la RNA polimerasa III a promotores Internos

El Complejo Mediador y la RNA polimerasa II

La RNA polimerasa II no añade nucleótidos de manera eficaz por si sola. Para que esto ocurra se requieren de Factores de EnlongaciónExisten secuencias llamadas sitios de pausa, en los que la RNA Pol II se detiene.Los Factores de Enlongación:

TFIIF limita la pausa que producen estas secuencias evitando la disociación de la RNA Pol II.

TFIIS se inserta en el sitio activo de la RNA Pol II y activa una actividad de RNAasa en la RNA Pol II, que corta al extremo 3´ del RNA

FACTORES DE ENLONGACION

Proteínas reguladoras

• La expresión génica es controlada por proteínas activadoras o represoras que se unen de manera específica a secuencias del DNA.

• Generalmente se unen como dímeros y reconocen secuencias específicas mediante la inserción de una hélice a en el surco mayor, a través del cual tienen acceso a las bases del DNA .

Surcomenor

Surcomayor

Proteínas reguladoras

• Las proteínas reguladoras presentan dos Dominios proteicos:

• Dominio de unión al ADN

• Dominio de Activación de la Transcripción

Proteínas reguladoras

• Dominio de unión al ADN• Se encuentran en este dominio, diferentes

motivos de unión al ADN.

Motivo hélice giro héliceMotivo de homeodominio

Motivo de dedos de Zinc Motivo en cremallera de leucinaMotivo en hélice bucle hélice

Motivo de homeodominio

Las proteínas con homeodominio están en todos los eucariotas, incluso en levaduras.Consiste en tres a hélices; la segunda y la tercera forman una estructura semejante a el motivo hélice-giro-hélice.La hélice 3 es la de reconocimiento, que interacciona con la bases a través del surco mayor.En la mayoría, el extremo N-terminal interactúa con el ADN a través del surco menor.

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Motivos que contienen Zinc

Hay varios motivos, en los dominios de fijación al ADN, que contienen Zinc:Dedos de Zinc clásicos (TFIIIA y Sp1)Módulos de Zinc (Receptor de glucocorticoides y receptores nucleares)Módulos que contiene dos iones Zinc y 6 Cisteínas (Proteína activadora Gal 4

en levaduras)El Zinc cumple un papel estructural indispensable para mantener la integridad del motivo, llamado “dedo”.El ADN es reconocido por una hélice a que interacciona con el surco mayor.

Motivo en Cremallera de Leucina

Leucina

Este motivo combina superficies de dimerización y de unión al ADN en una sola unidad estructural.Las dos hélices a largas, una en cada monómero, forman un dímero a través de una región rica en leucinas (aminoácido hidrófobo). Los dímeros pueden ser homo o heterodímeros.Cada hélice a se inserta en el surco mayor.

Motivo en Hélice Bucle Hélice

Al igual que en la cremallera de leucina, una región en hélice a de cada monómero se inserta en el surco mayor del ADN.La región de dimerización está formada por otra hélice a separada de la anterior por un bucle flexible.

Ejemplo: Factor de Transcripción MyoD

Proteínas reguladoras

• Dominio de activación de la transcripción A diferencia de los dominios de fijación, las regiones

activadoras no siempre poseen estructuras bien definidas. Se agrupan según el contenido de aminoácidos en:

Región activadora acídica (Gal 4)Región activadora ricas en glutamina (Sp1)Región activadora ricas en Prolina (CTF1)

Receptores Nucleares

• Contienen dodos de Zinc en el Dominio de Unión al ADN

Además del dominio de Activación deben tener otro Dominio que le permita unirse a una hormona. Así se convierten en Proteínas Activadoras que pueden unirse a un enhancer o a un Elemento de Respuesta a Hormona HRE).

Receptores Tipo IInactivos en el citoplasma (Receptor de Glucocorticoide)

Receptores Tipo II Inactivos en el núcleo (Receptor de hormona tiroidea)

Receptores Tipo III (Receptores Huerfanos)

El Receptor de Glucocorticoides se encuentra inactivo en el citoplasma unido a una proteína Hsp90. Cuando se une a la hormona, se produce un

cambio conformacional; se disocia de Hsp90.

Las interacciones entre Factores de Transcripción incrementan las opciones del

Control en la Expresión Génica

Posibles combinaciones entre 3 Factores de Transcripción que pueden formar Dímeros

Las secuencias amplificadoras suelen tener una longitud de 50 a 200 pares de bases e incluye sitios de unión para varios Factores de Transcripción.La unión de los activadores es cooperativa porque:

-Interactúan entre sí-La proteína HMG-1 se une al amplificador contribuyendo a la unión

de los activadores mediante el arqueado del ADN para facilitar las interacciones entre ellos.

Modelo del “amplificosoma” que se forma sobre el amplificador del gen que codifica para Interferón b. Este complejo entra en contacto con la maquinaria de transcripción, activando la transcripción de este gen.

La Transcripción puede reprimirse de diferentes maneras

La Transcripción puede reprimirse de diferentes maneras

Aisladores: estas secuencias de ADN controlan las acciones de los activadores. Actúan bloqueando la “comunicación” entre las proteínas activadoras y la

maquinaria de transcripción.

La Transcripción puede reprimirse de diferentes maneras

Represión por el reclutamiento de modificadores de las histonas

Modificación de la estructura de la cromatina

Proteínas HGM (de gran movilidad)HGMAHMGBHMGN

Modificaciones de las histonas

Reorganización de nucleosomas

Modificaciones covalentes en las colas de las Histonas

Lusser Curr Opin Plant Biol 5:437;2002Turner, BM Cell 2002

Regulación de la expresión génica mediante modificaciones en la estructura de la cromatina

Las proteínas activadoras también pueden reclutar, además de la maquinaria de transcripción, a los Factores remodeladores de la cromatina (SWI/SNF). Estos tienen

homología a helicasas. Permitirían que los nucleosomas se disocien del ADN y se deslicen, facilitando la unión de Factores de Transcripción al ADN.

Metilación del ADN

La metilación del ADN es otro mecanismo general que controla la transcripción en eucariotas

El ADN es metilado específicamente en las C que preceden a las G en el ADN.La metilación está asociada a la represión de la transcripción.

Los patrones de metilación se mantienen después de la replicación del ADN

Impresión o imprinting genómico

Controla la expresión de genes implicados en el desarrollo embrionario

La Metilación del ADN y la desacetilación de

Histonas están asociadas

Esquema general del control de la

expresión génica a nivel

Postranscripcional de genes

codificantes de proteínas

BindingDomain

ActivationDomain

Yeast 2-hybrid systemBindingDomain

ActivationDomain

Transcription factor

Cómo estudiar si dos proteínas pueden interactuar entre ellas

BindingDomain

ActivationDomain

BindingDomain

Prot1 ActivationDomain

Prot2

Yeast 2-hybrid systemBindingDomain

ActivationDomain

Transcription factor

BindingDomain

ActivationDomain

BindingDomain

Prot1 ActivationDomain

Prot2

Reporter GenePromoter Region

BindingDomain

Prot1Activation

Domain

Prot2 mRNA

Yeast 2-hybrid system

If Prot1 and Prot2 interact:

BindingDomain

ActivationDomain

Transcription factor