中国组织工程研究 第 18卷 第 24期 2014–06–11出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research June 11, 2014 Vol.18, No.24

ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 3821

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余灏涛，男，1987年生，广东省广州市人，汉族，

中山大学附属第三医院毕

业，硕士，目前从事椎间

盘退变相关研究。 通讯作者：徐义春，博士。

中山大学附属第三医院脊

柱外科，广东省广州市 510630 doi:10.3969/j.issn.2095-4344.

2014.24.009

[http://www.crter.org]

中图分类号:R318

文献标识码:A

文章编号:2095-4344

(2014)24-03821-08

稿件接受：2014-05-16

Yu Hao-tao, Master,

Department of Spinal Surgery,

the Third Affiliated Hospital of

Sun Yat-sen University,

Guangzhou 510630,

Guangdong Province, China

Corresponding author: Xu

Yi-chun, M.D., Department of

Spiny Surgery, the Third

Affiliated Hospital of Sun

Yat-sen University, Guangzhou

510630, Guangdong Province,

China

Accepted: 2014-05-16

骨形态发生蛋白7通过PI3K/Akt通路可抑制人髓核细胞的凋亡 余灏涛，徐义春，王其友，欧定强，周 葳(中山大学附属第三医院脊柱外科，广东省广州市 510630)

文章亮点： 1 虽然国外亦有学者发现骨形态发生蛋白 7 可能在人类髓核细胞中通过抗凋亡过程，维持椎间盘细胞正常生理环境。但其以人类退变椎间盘组织作为样本，并且未对其退变程度加以分析，致使骨形态发生蛋白 7 抗凋亡效果一直未令人十分信服。另外，骨形态发生蛋白 7如何抗凋亡的分子机制从未被阐释。 2 实验结合一般情况、疾病特点及影像学评估选择获取人椎间盘组织，从而较大量地得到基本生理状态均一性较强的人类髓核细胞，为人类髓核细胞相关研究的开展提供了新的思路。 3 实验对血清饥饿诱导凋亡的髓核细胞予以不同剂量的骨形态发生蛋白 7 以及 PI3K/Akt 通路抑制剂LY294002 的处理，分析细胞凋亡率以及 Akt 通路蛋白表达量的变化，证实了骨形态发生蛋白 7 通过激活PI3K/Akt通路发挥其抗凋亡作用，并进一步表明其与 BAD-Caspase 9凋亡途径有着密切的关系。 关键词： 组织构建；骨组织工程；组织工程基础实验；骨形态发生蛋白 7；PI3K/Akt通路；人髓核细胞；凋亡；无血清；p-Akt；BAD蛋白；Caspase 9；流式细胞术；蛋白印迹法 主题词： 细胞凋亡；骨形态发生蛋白 7；蛋白激酶类；血清 基金资助： 广东省科技攻关项目(2009B030801095，2007A0300005) 摘要 背景：骨形态发生蛋白 7 可促进人髓核细胞的细胞外基质合成，减缓椎间盘退变。近年来，有学者提出其可能通过对抗髓核细胞凋亡从而发挥上述作用，但其进一步的分子机制一直未被详细阐明。 目的：观察骨形态发生蛋白 7对无血清诱导下发生凋亡的人髓核细胞产生的作用及其对PI3K/Akt通路的影响，分析并探讨骨形态发生蛋白 7抑制人髓核细胞凋亡的分子机制。 方法：通过改良 Pfirrmann分级及相关条件选取 12例患者获取椎间盘组织，采用酶消化法获取人髓核细胞后分组实验，以含体积分数 15%胎牛血清的培养基正常培养的髓核细胞设为空白组；使用无血清培养基培养 48 h 诱导凋亡作为阳性对照组；在无血清条件下，通过加入不同剂量的骨形态发生蛋白 7 以及同时添加PI3K/Akt通路拮抗剂 LY294002形成处理组和拮抗组。使用流式细胞术检测各组细胞凋亡率；免疫荧光观察p-Akt表达；蛋白印迹法检测 Akt，p-Akt，BAD和 Caspase 9等通路蛋白的表达变化。 结果与结论：无血清凋亡诱导下，流式细胞术结果显示，随着骨形态发生蛋白 7处理浓度上升，髓核细胞凋亡率明显下降，加入 LY294002共同作用后细胞凋亡率再次升高(P < 0.05)。p-Akt免疫荧光和蛋白印迹法检测结果进一步表明，与凋亡阳性对照组相比，加入骨形态发生蛋白 7 的实验组中，p-Akt 表达明显增加，其下游凋亡相关蛋白BAD、Caspase 9蛋白表达减少(P < 0.05)，而在同时加入Akt通路拮抗剂 LY294002后，p-Akt蛋白表达下降而凋亡相关蛋白的表达又恢复到相对较高的水平(P < 0.05)。结果证明，骨形态发生蛋白 7在无血清诱导的人类髓核细胞凋亡中通过激活PI3K/Akt通路，拮抗了BAD-Caspase 9相关的细胞凋亡过程，抑制了髓核细胞的退变。 余灏涛，徐义春，王其友，欧定强，周葳.骨形态发生蛋白 7通过 PI3K/Akt通路可抑制人髓核细胞的凋亡[J].中国组织工程研究，2014，18(24):3821-3828.

Bone morphogenetic protein-7 inhibits apoptosis of human nucleus pulposus cells through activation of PI3K/Akt pathway

Yu Hao-tao, Xu Yi-chun, Wang Qi-you, Ou Ding-qiang, Zhou Wei (Department of Spinal Surgery, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China)

Abstract BACKGROUND: Bone morphogenetic protein 7 (BMP-7) can promote extracellular matrix synthesis of human nucleus pulposus cells, and delay intervertebral disk degeneration. Recently scholars proposed that the above effects can be achieved through anti-apoaptosis, but further molecular mechanism remains poorly understood. OBJECTIVE: To observe the effects of BMP-7 on the apoptotic human nucleus pulposus cells under serum-free induction and the PI3K/Akt pathway, investigate the molecular mechanism underlying the anti-apoptosis effect of BMP-7. METHODS: Human nucleus pulposus tissue were harvested from 12 patients according to the modified Pfirrmann classification, and human nucleus pulposus cells were obtained from digestion of herniated nucleus pulposus tissue. The collected nucleus pulposus cells were divided into four groups. Blank group: cells were

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cultured in normal culture medium containing 15% feral bovine serum; positive control group: cells were induced to apoptosis in the serum-free culture medium for 48 hours; treated group: cells were induced to apoptosis in the serum-free culture medium containing different dosages of BMP-7; antagonism group: cells were induced to apoptosis in the serum-free culture medium containing different dosages of BMP-7 and LY294002, an PI3K/Akt pathway inhibitor. Cellular apoptosis rate was quantified by flow cytometry. Immunoflurorescence was performed to observe p-Akt expressions. Changes of Akt, p-Akt, BAD, and Caspase 9 expression were detected with western blot analysis. RESULTS AND CONCLUSION: Results from flow cytometry showed that, the apoptosis rate of nucleus pulposus cells was significantly decreased as the increase of BMP-7 concentration, under the serum-free induction; after the cells were induced with LY294002, the apoptosis rate was increased again (P < 0.05). The p-Akt immunoflurorescence and western blot analysis demonstrated that, compared with positive control group, the p-Akt expression was significantly increased, while the expression of downstream apoptosis-related proteins such as BAD and Caspase 9, was significantly decreased in the cells treated with BMP-7 (P < 0.05). Furthermore, in the group treated with BMP-7 and LY294002, the p-Akt expression was decreased, while the expression of apoptosis-related proteins was recovered to high levels (P < 0.05). BMP-7 activates the PI3K/Akt pathway, suppresses the downstream BAD and Caspase 9 signaling, and inhibits the apoptosis of human nucleus pulposus cells induced by serum-free situation. Subject headings: apoptosis; bone morphogenetic protein-7; protein kinase; serum Funding: Science and Technology Program of Guangdong Province, No. 2009B030801095, 2007A0300005 Yu HT, Xu YC, Wang QY, Ou DQ, Zhou W. Bone morphogenetic protein-7 inhibits apoptosis of human nucleus pulposus cells through activation of PI3K/Akt pathway. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(24):3821-3828.

0 引言 Introduction 椎间盘退行性变 (intervertebral disc degeneration,

IVDD)作为椎间盘退行性疾病的病理基础，目前对其病理变化的研究向人们揭示了椎间盘受到体内外刺激因素导致髓

核细胞在多种细胞因子作用下，细胞外基质合成减少，Ⅱ型

胶原变性，水分丢失的过程[1-5]。而在对椎间盘退变进一步的

机制研究中，细胞凋亡这一有序的死亡调控过程一直被公认

为椎间盘退行性变病理机制中最重要的组分之一[6]。

近年来，陆续有报道证实椎间盘细胞通过死亡受体途

径、线粒体途径等经典凋亡信号通路促发凋亡并与椎间盘

退变有着密不可分的关系[7-10]。而很多关于信号转导途径的

研究揭示了椎间盘细胞可能与包括Akt通路、Wnt通路、MAPK通路等的交联，通过更多、更复杂的途径转导凋亡，引发椎间盘退变

[11-14]，为实验从体外和体内多种途径调控

椎间盘退变开辟了新的思路。 在这些互相交联、影响、反馈的信号转导通路中，

PI3K/Akt通路因其与线粒体途径的紧密联系及近年发现其与骨形态发生蛋白的相互作用而引起了作者的关注。有学

者发现骨形态发生蛋白在椎间盘细胞中能对细胞外基质合

成发挥显著促进作用并通过多种动物模型及人类退变椎间

盘细胞中的研究予以证实，而骨形态发生蛋白7是其中作用最显著的因子之一

[15-18]。但是，骨形态发生蛋白7究竟通过

何种方式促进细胞外基质合成一直未被清楚阐释。 实验将通过流式技术、免疫荧光等方法验证骨形态发生

蛋白7对人类髓核细胞凋亡的抑制作用，并将进一步探讨其在人类髓核细胞中是否通过与PI3K/Akt通路相关的信号转导机制发挥抗凋亡作用，以完善髓核细胞凋亡通路的研究。

1 材料和方法 Materials and methods 设计：细胞学体外实验。 时间及地点：于2012年11月至2014年3月在中山大学

附属第三医院中心实验室完成。

材料：人体髓核组织的获取来源于2012年11月至2013年11月间，中山大学附属第三医院脊柱外科腰椎间盘突出症行手术治疗的患者12例。 纳入标准：①18-30岁男性。②术前症状、体征及影

像学均明确诊断腰椎间盘突出症，经保守治疗无效，具

备手术指征。③手术节段椎间盘影像学改良Pfirrmann分级Ⅱ-Ⅲ级

[19]。

排除标准：①患者伴有高血压、糖尿病等基础疾病或

精神类疾病。②发现伴有脊柱滑脱、椎管狭窄、先天性或

继发性侧凸或后凸畸形。③发现伴有脊柱肿瘤或脊柱感染

性疾病。④患者嗜好吸烟，每日吸烟支数×吸烟年数>200。⑤患者因经济情况或其他原因拒绝进行手术治疗。 实验获得中山大学附属第三医院伦理学审查批准，所

有标本获取均在对病患予以详尽的告知，签署知情同意后

进行。

骨形态发生蛋白7通过PI3K/Akt通路抑制人髓核细胞凋亡实验相关试剂及仪器：

试剂及仪器 来源

DMEM/F12培养液，胎牛血清 Hyclone公司，美国

Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(含/不含 EDTA) Gibco公司，美国

骨形态发生蛋白7 PROSPEC公司，以色列

LY294002 江苏碧云天公司

兔抗人Akt，p-Akt，BAD，Caspase 9，GADPH 多克隆抗体；羊抗兔IgG

武汉谷歌生物公司

兔抗人Ⅱ型胶原单抗，SABC试剂盒 博士德公司，武汉

全蛋白提取试剂盒，BCA蛋白定量试剂盒，ECL超敏发光试剂盒，Annexin-V FITC/PI双染试剂盒

南京凯基公司

荧光显微镜 德国Leica公司

流式细胞仪 美国BD公司

电泳仪 北京六一公司

冷冻离心机 美国Beckman Coulter公司

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方法：

人髓核细胞的分离及培养：自手术中取出的髓核组织

装入预先盛有4 ℃无菌PBS的离心管中，15 min内带入超净台，无菌条件下洗涤并清除杂质，用眼科剪将剩余髓核

组织剪碎成约1 mm×1 mm×1 mm小块。使用体积分数0.1%的Ⅱ型胶原酶，37 ℃温箱中过夜消化(12 h)。200目不锈钢滤网过滤并离心收集细胞后，加入适当配置好的含

体积分数15%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬，即获得原代髓核细胞。其他细胞调整浓度为约1×108 L-1

，加入 25 cm2

透气细胞培养瓶中贴壁单层培养。 细胞培养至70%-80%融合后予体积分数0.25%胰酶

消化，1∶3传代。传1代后部分于6孔板中培养以进行细胞鉴定实验。 人髓核细胞的鉴定：倒置显微镜下隔天换液后观察并

摄影，记录髓核细胞生长形态。对生长至50%-60%的传1代髓核细胞，吸去6孔板中培养液，加入40 g/L多聚甲醛固定，加入体积分数30%过氧化氢与甲醇1∶50配成的混合液灭活内源性过氧化物酶。然后滴加体积分数5%BSA进行血清封闭。血清封闭后，加入兔抗人Ⅱ型胶原单抗，对照

组加入PBS，4 ℃避光过夜孵育。完成并洗涤后各孔加入羊抗兔IgG二抗37 ℃温箱孵育1 h，使用SABC试剂盒作用，DAB显色检测。 髓核细胞凋亡诱导及处理：取传1代髓核细胞生长至约

70%进行实验，除空白组外的实验组换液时经PBS冲洗后改用无血清DMEM/F12培养液培养，并分别加入不同浓度骨形态发生蛋白7以及LY294002处理。

具体分组方法及干预步骤：

流式细胞术Annexin-V双标检测细胞凋亡情况：经无血

清诱导凋亡及各种处理48 h后的髓核细胞使用不含EDTA的胰酶消化收集并经PBS洗涤后，以缓冲液重悬，依次加入FITC和PI，避光反应15 min后使用Annexin-V FITC/PI双染试剂盒通过FACS Calibur流式细胞仪检测凋亡率的变化情况。早期凋亡细胞为(Annexin V+

，PI-)，晚期凋亡细胞为(Annexin V+

，PI+)，统计各组凋亡率时对早、晚期凋亡共同计数。

p-Akt免疫荧光染色：在6孔板中培养的传1代髓核细

胞，在细胞生长达到浓度约70%融合时，按上述实验分组中空白对照组、阳性对照组、中剂量骨形态发生蛋白7组和LY294002拮抗组共4组方式进行处理，48 h处理完成后进行实验。加入40 g/L多聚甲醛固定，加入体积分数30%过氧化氢与甲醇1∶50配成的混合液灭活内源性过氧化物酶。然后滴加体积分数5%BSA进行血清封闭。每孔加入兔抗人p-Akt一抗，用锡纸包裹6孔板，4 ℃冰箱避光过夜孵育。完成后各孔均加入羊抗兔IgG荧光二抗，37 ℃温箱孵育1 h。DAPI工作液染核10 min，予PBS洗去后，于荧光显微镜下进行各分组细胞内p-Akt蛋白荧光表达检测并拍照保存。 细胞总蛋白提取以及Western blot检测：凋亡诱导48 h

及加入相应处理后的各组细胞，使用PBS洗涤后加入全蛋白提取试剂盒中已预冷好含磷酸酶抑制剂及蛋白酶抑制剂

的的细胞裂解液冰上裂解，用细胞刮收集碎裂细胞及蛋白，

转移至离心管中4 ℃高速离心提取总蛋白。用BCA 蛋白含量检测试剂盒进行各组蛋白质含量的测定。向蛋白质样品

中加入上样缓冲液并煮沸10 min使之变性，各组平衡蛋白量上样后，使用10%的分离胶和5%浓缩胶进行SDS-PAGE电泳分离，再电转至PVDF膜上。除磷酸化抗体检测的膜使用TBST加5%BSA外，其他用TBST加体积分数5%脱脂奶粉对膜进行封闭1 h、洗涤。以β-actin作为内参，分别加入下述相应多克隆抗体(1∶1 000)，兔抗人Akt、p-Akt(pS 473)、BAD、Caspase 9、β-actin抗体4 ℃过夜孵育。TBST洗涤3次后加入以TBST浓度1∶3 000稀释的羊抗兔IgG室温下孵育30 min。ECL超敏型检测试剂盒进行发光。暗室显影。胶片扫描后使用Alpha软件处理系统分析目标带的吸光度值。 主要观察指标：人髓核细胞光镜下生长形态；免疫组

织化学鉴定Ⅱ型胶原表达；免疫荧光检测细胞内p-Akt表达；流式细胞术Annexin V-FITC双标法检测细胞凋亡率；蛋白印迹法检测相关凋亡通路蛋白的表达。 统计学分析：计量资料以x

_

±s表示，使用SPSS 17.0软件进行数据统计分析，各组间数据显著性采用单因素方

差分析及Bonferroni法两两比较检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果 Results 2.1 人髓核细胞生长形态变化 低浓度胶原酶过夜消化获取的原代髓核细胞基本可于培养3 d内完成贴壁。原代细胞起初贴壁时呈类圆形或多角形，后细胞突起逐渐伸长，

细胞形态主要变为短梭形，伴有少量突起较多的树形细胞。

至瓶内细胞达到60%-70%融合，产生接触抑制时，短梭形细胞逐渐融合，其排列有一定方向性呈漩涡状或火焰状排

列。传1代细胞生长更迅速，培养6 h内即基本完成贴壁，细胞内仍有丰富胞浆，其形态仍为短梭形，但较原代相比

更细长，排列失去方向性，略显紊乱。以上各期各形态髓

核细胞均胞浆丰富，细胞核清晰可见，见图1，符合以往文献报道的人髓核细胞的形态

[20-21]。

空白对照组：正常换入含体积分数15%胎牛血清培养液培养48 h。

阳性对照组：换液时予PBS洗涤2次后加入不含血清的DMEM/F12培养液，培养48 h。

低剂量骨形态发生蛋白7组：同阳性对照组处理并加入不含血清DMEM/F12同时加入骨形态发生蛋白7使其终浓度达到50 μg/L，培养48 h。

中剂量骨形态发生蛋白7组：同阳性对照组处理并加入不含血清DMEM/F12同时加入骨形态发生蛋白7使其终浓度达到100 μg/L，培养48 h。

高剂量骨形态发生蛋白7组：同阳性对照组处理并加入不含血清DMEM/F12同时加入骨形态发生蛋白7使其终浓度达到200 μg/L，培养48 h。

LY294002拮抗组：同中剂量骨形态发生蛋白7组处理方法，同时加入LY294002使其终浓度达到50 μmol/L，培养48 h。

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2.2 Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定 Ⅱ型胶原染色可见实验组短梭形髓核细胞核周棕黄色染色明显，提示Ⅱ型

胶原表达，符合髓核细胞特征。同时，以磷酸盐缓冲液(PBS)作为阴性对照组，细胞内透明无任何染色。见图2。 2.3 流式细胞术Annexin V-FITC双标法检测细胞凋亡率 实验组经骨形态发生蛋白7处理后在无血清环境下，随着骨形态发生蛋白7剂量增加，细胞凋亡率对应下降幅度增加 (P < 0.05)。并且在加入PI3K/Akt通路拮抗剂LY294002后，

骨形态发生蛋白7的抗凋亡效果减弱(与低剂量骨形态发生蛋白7组比，P < 0.05)。将12例髓核标本检测结果进行统计学分析，对比分析各组凋亡率，通过Bonferroni法两两比较，组间差异有显著性意义(P < 0.05)。选取其中一组的流式凋亡结果附于图3，12例样本统计结果陈列于表1及图4。 2.4 p-Akt免疫荧光染色结果 空白对照组与阳性对照组中p-Akt荧光表达极弱甚至不可见。而在骨形态发生蛋白7处理的中剂量骨形态发生蛋白7组细胞中则明显可见p-Akt荧光表达，这种表达随着LY294002拮抗组Akt通路拮抗剂LY294002的加入而受到明显抑制。见图4。 2.5 Western blot结果 Western blot结果进一步验证了无血清诱导凋亡下p-Akt信号蛋白的表达量改变，见图5A。各组内参β-actin以及Akt表达水平基本相等的前提下，对比阳性对照组，低中高剂量骨形态发生蛋白7组中随着骨形态发生蛋白7剂量增加，PI3K/Akt通路蛋白p-Akt表达增加(P < 0.05)，其下游凋亡相关蛋白BAD、Caspase 9蛋白表达减少(P < 0.05)，而在LY294002拮抗组加入Akt通路拮抗剂LY294002后，p-Akt表达下降而BAD、Caspase 9表达又恢复到相对较高水平(P < 0.05)。见图5B-D。

图 1 培养的人髓核细胞的形态(光学显微镜) Figure 1 Morphology of human nucleus pulposus cells (optical microscope) 图注：图中 A，B为原代培养第 5天人髓核细胞形态；图中 C，D为原代培养第 9天人髓核细胞形态；图中 E，F为传 1代培养第 5天人髓核细胞形态；图中 G，H为传 1代培养第 9天人髓核细胞形态。以上各期各形态髓核细胞均胞浆丰富，细胞核清晰可见。

A B C D

E F G H

×200 ×400 ×100 ×400

×200 ×400 ×100 ×400

图 2 传 1代人髓核细胞中Ⅱ型胶原的表达(免疫组织化学染色) Figure 2 Collagen type II expression in subcultured human nucleus pulposus cells (immunocytochemical staining) 图注：图中 A，B为人髓核细胞中Ⅱ型胶原免疫组织化学染色光镜观察结果，短梭形髓核细胞核周棕黄色染色明显；图中 C，D为磷酸盐缓冲液阴性对照组染色光镜观察结果，细胞内透明无任何染色。

A B C D

×100 ×400 ×100 ×400

表 1 流式细胞术测定各组凋亡率变化 Table 1 Apoptotic rate in each group as detected by flow cytometry (x

_

±s)

表注：各组凋亡率经过 Bonferroni 法进行两两比较检验，差异有显著性意义

(P < 0.05)。

组别 凋亡率(%)

空白对照组 阳性对照组 低剂量骨形态发生蛋白 7组 中剂量骨形态发生蛋白 7组 高剂量骨形态发生蛋白 7组 LY294002拮抗组

4.43±3.27 61.83±7.78 45.49±4.55 39.85±7.35 28.34±6.60 52.21±9.62

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Quad % Gated % Total X Mean Y MeanUL 2.03 1.51 9.60 61.57UR 5.03 3.73 211.13 107.38LL 91.83 68.05 3.06 4.81LR 1.11 0.82 91.10 10.60

Quad % Gated % Total X Mean Y MeanUL 0.88 0.21 9.00 65.52UR 52.21 12.14 250.33 106.07LL 37.29 8.67 6.27 7.39LR 9.62 2.24 176.97 18.89

Quad % Gated % Total X Mean Y MeanUL 0.65 0.19 10.02 63.87UR 21.85 6.25 264.93 87.80LL 70.15 20.07 5.55 6.27LR 7.35 2.10 177.25 17.03

Quad % Gated % Total X Mean Y MeanUL 0.11 0.02 13.46 34.29UR 31.61 6.38 486.82 76.72LL 45.63 9.22 7.27 6.91LR 22.65 4.57 387.21 13.15

Quad % Gated % Total X Mean Y MeanUL 1.27 0.37 10.78 71.93UR 35.98 10.39 135.79 89.55LL 54.26 15.67 5.50 7.45LR 8.49 2.45 112.96 19.60

Quad % Gated % Total X Mean Y MeanUL 0.80 0.26 9.95 65.25UR 32.09 10.31 209.01 94.42LL 59.33 19.07 5.97 6.18LR 7.78 2.50 127.15 15.87

A B C

D E F

图 3 流式细胞术凋亡率检测无血清诱导凋亡处理下骨形态发生蛋白 7对人髓核细胞的影响 Figure 3 Flow cytometry results of the anti-apoptosis effect of bone morphogenetic protein-7 in serum-free induced human nucleus pulposus cells图注：流式结果图以 PI表达为纵坐标，FITC表达为横坐标。早期凋亡细胞(PI-)及晚期凋亡细胞(PI+)分别位于右上象限(UR)和右下象限(LR)。凋亡率的统计结果为早期凋亡百分比+晚期凋亡百分比。图中 A-F分别为空白对照组，阳性对照组，低、中、高剂量骨形态发生蛋白 7组(50，100，200 μg/L)和 LY294002拮抗组细胞凋亡情况，上述 6组细胞凋亡率均差异有显著性意义。

图 4 免疫荧光检测骨形态发生蛋白 7处理无血清诱导人髓核细胞凋亡后 p-Akt表达(×200) Figure 4 Immunofluorescence results of p-Akt expression in bone morphogenetic protein-7 treated apoptotic human nucleus pulposus cells induced under serum-free condition (×200) 图注：图中 A为 DAPI染核；B为 p-Akt荧光；C为 DAPI和 p-Akt叠加荧光染色。实验使用兔抗人多克隆 p-Akt及羊抗兔 IgG-FITC进行 p-Akt绿色荧光标记，DAPI染核(蓝染)明确细胞位置。相较于空白对照组、阳性对照组以及拮抗组，加入骨形态发生蛋白 7的处理组中细胞内 p-Akt蛋白表达明显(红色箭头所示)。

A1 A2 A3 A4

B1 B2 B3 B4

C1 C2 C3 C4

空白对照组

空白对照组

空白对照组

阳性对照组

阳性对照组

阳性对照组

中剂量骨形态发生蛋白 7组

中剂量骨形态发生蛋白 7组

中剂量骨形态发生蛋白 7组

LY294002拮抗组

LY294002拮抗组

LY294002拮抗组

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3 讨论 Discussion 对于人类髓核细胞体外培养的研究一直面临样本齐同

性的问题。王大武等[16, 22]

通过完好椎间盘组织与退变椎间

盘组织进行体外培养对比，无论是细胞生长形态，抑或蛋

白多糖、Ⅱ型胶原等细胞外基质成分均有差别，说明了椎

间盘组织状态和退变程度不同，其体外培养的初始状态即

存在差异。也许正是因此，Wei等[23]的研究亦由于其并未

对获取的各例人椎间盘组织退变程度予以分析并分组，虽

然观察到骨形态发生蛋白7在人类退变椎间盘获取的髓核细胞中显著的抗凋亡效果，其结果依然是未能十分令人信

服。 为了克服完好椎间盘组织获取困难与研究需要较大量

同一性较佳样本之间的矛盾，作者尝试通过对人类椎间盘

退变的标本选择进行了严格的限制，除却病例年龄、性别、

疾病情况、吸烟等一般情况，更通过改良Pfirrmann影像学分级在纳入实验前对患者所需行切除术的椎间盘进行分级

评估，选取椎间盘退变程度轻而较为一致的Ⅱ-Ⅲ级水平作

为准入条件，尽量在实验前保证样本的齐同性。有研究曾

论证Piffirrmann分级虽然仅从MRI进行影像学评估划分，但通过对应样本体外培养分析证实其与椎间盘组织的生物

学特性有着良好的对应关系[24-25]。 事实证明实验对样本的限制是可行而有效的，无论是

各例标本细胞的生长形态、速度还是Ⅱ型胶原的表达均呈

现出较好的一致性。因此，实验也相信在这种前提下，通

过流式细胞术对各实验组细胞凋亡率的检测结果更具说服

力。实验的结果确实地反映了在无血清条件诱导凋亡的实

验组中，使用骨形态发生蛋白7后髓核细胞的凋亡率随着骨形态发生蛋白7剂量的增加而逐渐下降，这种变化具有显著的统计学差异。 通过流式细胞术确证了骨形态发生蛋白7在人髓核细

胞中的抗凋亡作用后，希望进一步思考并探讨骨形态发生

蛋白7抗凋亡的具体分子机制，这不仅是对其抗凋亡作用的有力补充，更是更深层次对其作用原理的研究。虽然一直

没有文献报道骨形态发生蛋白7在与髓核细胞凋亡信号通

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1 2 3 4 5 6

吸光度值

(p-A

kt/β

-Act

in)

B

0 0.1

0.2

0.30.4

0.5

0.60.7

0.8

0.9

1.0

1 2 3 4 5 6

吸光度值

(BAD

/β-A

ctin

)

C

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1 2 3 4 5 6

吸光度值

(Cas

pase

9/β

-Act

in)

D

图 5 无血清诱导人髓核细胞凋亡各组蛋白印迹法检测各组相关凋亡蛋白结果 Figure 5 Apoptotic relative protein expressions in serum-free induced human nucleus pulposus cells detected by western blot assay 图注：图中 A 为无血清诱导人髓核细胞凋亡各组蛋白印迹法检测各组相关凋亡蛋白结果；图中 B-D 为各实验组 p-Akt/BAD/Caspase 9 蛋白印

迹结果扫描吸光度数据与内参 β-actin 之比变化。对比阳性对照组，低中高剂量骨形态发生蛋白 7 组中随着骨形态发生蛋白 7 剂量增加，PI3K/Akt通路蛋白 p-Akt 表达增加(P < 0.05)，其下游凋亡相关蛋白 BAD、Caspase 9蛋白表达减少(P < 0.05)，而在 LY294002拮抗组加入 Akt通路拮抗剂 LY294002后，p-Akt表达下降而 BAD、Caspase 9的表达又恢复到相对较高的水平(P < 0.05)。图中 1-6分别为空白对照组、阳性对照组、低、中、高剂量骨形态发生蛋白 7组、LY294002拮抗组。

1 2 3 4 5 6 A

Caspase 9

BAD

p-Akt

AKT

β-Actin

Mr

47 000

23 000

60 000

59 000

42 000

余灏涛，等. 骨形态发生蛋白 7通过 PI3K/Akt通路可抑制人髓核细胞的凋亡

ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 3827

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路相关的研究，但陆续有学者发现了其在包括颗粒细胞、

多种上皮细胞及肿瘤细胞在内的全身多种细胞的增殖、分

化、凋亡均发挥作用[26-31]。Shimizu等[32]对骨形态发生蛋白

7在颗粒细胞凋亡的完善研究证实了骨形态发生蛋白4和骨形态发生蛋白7都能激活PI3K途径但却通过不同下游因子调控凋亡，其中骨形态发生蛋白4调控的是PKC，而骨形态发生蛋白7调控的正是Akt，提示了其可能与PI3K/Akt通路有着密切的联系。

以此为研究方向，作者在实验的设计中加入了拮抗

组进行对比，通过将PI3K/Akt通路抑制剂LY294002与骨形态发生蛋白7共同作用，观察其对骨形态发生蛋白7抗凋亡作用的影响。实验结果证实了 LY294002抑制PI3K/Akt通路后骨形态发生蛋白7的抗凋亡效果受到了明显的抑制。为了验证骨形态发生蛋白7对髓核细胞凋亡的抑制通过PI3K/Akt通路发挥作用，实验通过免疫荧光以及Western blot对PI3K/Akt通路标志信号蛋白p-Akt进行了检测。结果显示在加入骨形态发生蛋白7的实验组中，p-Akt的表达水平确实升高了，证实了骨形态发生蛋白7具有磷酸化激活Akt，调控下游凋亡蛋白通路的能力，那么Akt激活后又通过哪些凋亡蛋白引起了整个凋亡连锁反应呢？对于椎间盘细胞凋亡通路的研究以往普遍集

中于传统的死亡受体途径、线粒体途径，而近年来学者

对于包括MAKP，ERK，AKT，WNT途径等介导交联于传统凋亡途径之间的“中介”信号途径的研究，尤其是

AKT与线粒体途径间的密切关系，为实验进一步明确椎间盘细胞凋亡调控给予了更清晰的思路[12, 33-34]。 实验选取了线粒体途径中的标志凋亡蛋白-B细胞淋

巴瘤/白血病-2(B cell leukemia-2, Bcl-2)家族蛋白中经典的促凋亡前体BAD以及天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族蛋白中的Caspase 9蛋白[35-36]，通过蛋白印

迹法进一步探索骨形态发生蛋白7磷酸化激活Akt后对下游凋亡蛋白的影响。结果发现当p-Akt增加后，BAD以Caspase 9两者表达量皆出现了一定程度的下降，说明髓核细胞凋亡的抑制与其相关。骨形态发生蛋白7在激活PI3K/Akt通路后对BAD-Caspase 9相关的线粒体途径产生了抑制作用。然而，因为各方面的原因，实验并未对线粒

体途径的其他标志蛋白抑或其他途径的凋亡相关蛋白进行

检测，本课题组将在下一步的研究工作中予以完善，以试

图更清晰地揭示人类髓核细胞凋亡的分子机制以及骨形态

发生蛋白7在抗凋亡，抗退变中发挥的作用。 总之，骨形态发生蛋白7在无血清诱导的人类髓核细

胞凋亡过程中能发挥确实的抗凋亡作用。流式细胞术的结

果反映了细胞凋亡率与骨形态发生蛋白7的处理剂量有着相关性，而且PI3K/Akt通路抑制剂LY294002的应用对骨形态发生蛋白7抗凋亡效果的抑制提示了其可能通过此通路发挥作用。p-Akt免疫荧光和多种信号蛋白的Western Blot检测则更进一步验证了骨形态发生蛋白7处理后，

p-Akt表达上升，下游BAD、Caspase 9等凋亡相关蛋白表达下降，揭示了骨形态发生蛋白7可能通过磷酸化Akt蛋白，激活PI3K/Akt通路，抑制BAD-Caspase 9线粒体途径相关凋亡通路，拮抗了细胞凋亡过程，抑制了髓核细胞

的退变。 作者贡献：文章全部作者均参与了实验的设计、实施及评估。

利益冲突：文章及内容不涉及相关利益冲突。

伦理要求：实验伦理学审查得到中山大学附属第三医院伦理

委员会审批通过。

学术术语：骨形态发生蛋白-与胚胎骨骼形成有关的蛋白质，

在骨形成的数个阶段均起作用，由形态发生的早期阶段开始，并

延续至出生后。在中枢神经的发生中也起着关键作用。

作者声明：文章为原创作品，无抄袭剽窃，无泄密及署名和

专利争议，内容及数据真实，文责自负。

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