1- 3 3 3 3 3 3 I 3 U 1 I 1 1 iI 1 I 1 4

A o m b r e

Matricula

Teléfono

/Licenctatura

/División

Unidad

Trimestre Lectlvo

/Nombre del Proyecto

Lugar de Reallzaclón

Fecha de lnlclo

/echa de termlnaclón

Clave de Registro

/Asesor Interno

Asesor Externo

México D.F. a 19 de octubre de 1998

De los Reyes Guerrero Jorge Ricardo

87326129

6 79 62 O0

Ingeniería Bioquimica Industrial

Cienclas Biológicas y de la Salud

iztapalapa

4 64 25 24

98-0

Inmovilizaclón de Células Bacterianas en Matrices Pollmérlcas pare la Eiimlnación de Azufre en Derivados de Petróleo.

Departamento de Bioprocesos adscrito a la División de Tecnologla de Control, perteneciente a la Gerencia de Control Ambiental y Sustentabilldad de la Subdirección de ProleccMn Ambiental del Instituto Mexicano del Petróleo.

28 de noviembre de 1997

28 de mayo de 1998 2 IBI.073.97

Dr. Gerard0 Saucedo Castaileda. Jefe del Departamento de Blotecnologia, UAM Iztapalapa.

M en C: Diego Zaragoza Contreras. lnvestlgador del Departamento de Bloprocesos perteneciente a la Gerencia de Control Ambiental y Sustentabilidad de la Subdirección de Protección Ambiental del Instituto Mexicano del Petróleo.

Jorge Ricardo de los Reyes Guerrero

IS

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD SERVICIO SOCIAL

A QUIEN CORRESPONDA:

Por medio de la presente se hace constar que el (la): DR. GERARD0 SAUCEDO CASTAfiEDA

del Departamento de BIOTECNOLOG/A de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesor6 el siguiente Servicio Social:

TITULO Inmovilización de Células Bacterianas en Matrices Poliméricas para la Eliminación de Azufre en Derivados de Petróleo. De los Reyes Guerrero Jorge Ricardo ALUMNO

MATRICULA 87326129 LICENCIATURA Ingeniería Bioquimica Industrial PERIODO

Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, en la Ciudad de México, D.F. a veinticinco de Noviembre de mil novecientos noventa y ocho.

A T E N T A M E N T E "Casa Abierta al Tiempo"

Noviembre 28, 1997 a Octubre 19, 1998

SECRETARIO ACADÉMICO

UNIDAD IZTAPALAPA Av Michoachn y La Purlsima lztapalapa 09340. México. D F A P 55-535 Fax: (5)812-80-83 Tels 724-46-81 y 85

CasalbstsdtE3W

UWERSIDAD AüTONOMA METROPOUTANA

México, D.F. a 19 de octubre de 1998

Dr. José Luis Afredondo Director de la Divisi611 de CBS P R E S E N T E

Por medio de la presente, hago de su conocimiento que el alumno: DE LOS REYES GUERRERO JORGE RICARDO, con número de matricula 87326129 de la L i w en INGENlERlA BlOQU¡MlCA INDUSTRIAL, conduy6 satisfactorlamente con su trebejo de Servldo Sodel. dentro del proyecto: "lnmovilizacl6n de Células Bacterianas en Matrlces PolimBiiceo pars le Ellmlnaci6n d e ' h f r e en Derivados del Petr6leo".

Fecha de Inicio: 28 de noviembre de 1997

Fecha de terminación: 28 de mayo de 1998

Datos del asesor interno: Dr. Gerard0 Saucedo Castañeda. Profesor - Investigador del Departamento de Biotecnologia, UAM Iztapalepa.

ATENTAMENTE:

UNIDAD IITAPALAPA Av. Miichoiicln y La Pudsima. Col. Vicsntina. 09340 MBxico, D.F. Tel.: 724-4800 WEFAX: (5) 612 0885 a

u a a

INSTITUTO MEXICANO DEL PETROLEO

México, D.F. a 19 de octubre de 1998

Dr. JOS4 Luis Arredondo Director de la División de CBS P R E S E N T E

Por medio de la presente, hago de su conocimiento que el alumno: DE LOS REYES GUERRERO JORGE RICARDO, con numero de matricula 87326129 de la Licenciatura en INGENIERiA BIOQUiMICA INDUSTRIAL, concluyó satisfactoriamente con su trabajo de Servicio Social. dentro del proyecto: "Inmovilización de Células Bacterianas en Matrices Polimbricas para la Eliminación de Azufre en Derivados del Petróleo".

Fecha de Inicio: 28 de noviembre de 1997

Fecha de terminación: 28 de mayo de 1998

Datos del asesor externo: M en C. Diego Zaragoza Conlreras. . Investigador del Departamenlo de Bioprocesos perteneciente a la Gerencia de Control Ambiental y Sustentabilidad de la Subdirección de Proteccl6n Ambiental del Instituto Mexicano del Petróleo.

ATENTAMENTE:

\

EIL ( LNIRAL LAZAR« CARDENAS No. IS2 * APARTADO POSTAL 14-11f15

TAX 5117-1111-47 * TEl.EX 017-71.116 - DIRECCION CAüLECRAilCA "IMEPEi" 117í i i i MEXICO. D.F. - CONMUTADUR JW-59-11. 368.93-1.3 Y m - i y . 7 7

INFORME FINAL

INTRODUCCION

En las ultimas décadas varias especies de bacterias capaces de catallzar la conversión de organosulfurados han sido aisladas y patentadas. El Thiobacillus famxidans junto con el Sulfolobus sp. fueron los primeros rnicroorganismos estudiados con capacidad desuifuradora. En alios reclentes surgieron cepas como el cultlvo mixto catalogado IGTS7. el Rhodococcus rhodochmus IGTSB. Bacillus sphaencus IGTSS. Pseudomonas sp y Connebacianum sp que también han sido capaces de metabolizar azufre para su crecimiento a partir de substratos orgánicos como el petróleo sin romper los enlaces carbono - carbono. Los compuestos azufrados presentes en fracciones de petróleo. como son los destilados medios, se encuentran principalmente en forma de mercaptanos, sulfuros. disulfuros. tiofenos, benzotlofenos y dibenzotiofenos. siendo este Siltimo compuesto el de mayor proporci6n. de aquí que el dibenzotlofeno (DBT) ha sido seleccionado como compuesto modelo para muchos estudios de biodesulfuraci6n microbiana.

Tradicionalmente, se han usado enzlmas y células bacterianas en dispersiones homogéneas para convertir substratos en productos. Esto significa que una enzima puede estar disuelta en la solución de substrato o que las células vivas están libremente suspendidas en el medio de cultivo. Estas técnicas son muy directas y siempre tendrán su lugar en el laboratorio y plantas industriales, no obstante. en estos procesos homogéneos el biocatalizador puede no expresar su potencial total. y el control del proceso tlende a ser diflcil y de baja intensidad. Además, es frecuente ver que el biocatalizador es destruido en el subsecuente drenado después de haber completado su función, as1 la actividad enzimática se pierde. Para lograr el máxlmo aprovechamiento de la actividad enzimática surge como una alternative la inmovilización de células y en algunos casos la Inmovilización de la propia enzima.

La lnmovillzaclón puede ser definida como la unión flsica o química de células o enzimas a un soporte biológicamente inerte, el cual dará a las células ciertas caracterlsticas deseables dentro de un proceso biocatalitico.

OBJETIVO GENERAL

Contribuir al desarrollo de un proceso de biodesulfuraclón de alto rendlmiento que sea competitivo con las tecnologías actuales de desulfuración (procesos HDS).

OBJETIVOS PARTICULARES

o Desarrollar una matriz polimérica que cumpla con las expectativas requeridas por nuestro sistema biocatalitlco y que provoque el rninimo de perturbaciones que puedan afectar la capacidad desulfuradora de las células.

o Adecuar la técnica de preparación de criogeles para obtener un soporte con caracterlsticas físicas y qulmicas apropiadas para la inmovilización de Rhodococcus ~odochmus.

METODOLOGIA

La metodología empleada consistió en el trabajo por etapas programado para lograr alcanzar los objetivos trazados para el desarrollo del trabajo de desarrollo de la matriz polimérica. Dichas etapas consistieron de los siguientes puntos:

o Revisión bibliográfica o Aprender el manejo de Rhodococcus rhodochmus. o Buscar condiciones para conservar la actividad metabóiica sin crecimiento del microorganismo. o Preparación de polimeros de poiiviniialcohoi (PVA) de acuerdo a la bibliografía. o Adecuación de la preparación de polimeros de acuerdo a las condiciones de nuestro

laboratorio. o Preparación de diferentes pollmeros de PVA, a diferentes concentraciones, para obtener el

mejor soporte poiimérico. o Preparación de soportes poliméricos para la inmovilización de Rhodococcus rhodochmus. o Realización de pruebas mecánicas a los poilmeros. preparados con y sin biomasa. o Pruebas de actividad en sistemas inmovilizados.

ACTIVIDADES REALIZADAS

o Revisión bibliográfica o Aprendizaje del manejo de Rhodococcus rhodochmus. o Búsqueda de condiciones para conservar la actividad metabólica sin crecimiento del

microorganismo. o Preparación de soportes poiiméricos para la inmoviiización de Rhodococcus rhodochmus. o Pruebas de actividad en sistemas inmovilizados.

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS

De entrada podemos decir que los objetivos particulares se lograron realizar, sobre todo la adecuación de la técnica de preparación de criogeies con caracteristicas físicas y quimicas apropiadas para la inmovilizaci6n de Rhodococcus rhodochrous. ya que en la bibliografla el metodo propuesto no se adecua a las condiciones de equipo que se tienen en el laboratorio, por lo que fue necesario modificar la técnica de preparación de los criogeies. El resultado fue que se obtuvieron los poiímeros adecuados para la inmovilización. En cuanto ai primer objetivo, que fue desarrollar una matriz polimérica que cumpla con las expectativas requeridas por nuestro sistema biocaialltlco. tambibn se logró el objethro. ai encontrar una concentración adecuada y un tipo da pollmero (probamos varios, de diferentes pesos moiecuiares) con los cuales adquiere las condiciones que se buscan para una matriz de este tipo.

Respecto del objetivo general, los trabajos de investigación y desarrollo continuarhn, siendo este un objetivo de mas largo plazo que lo que puede abarcar el desarrollo de un trabajo de servicio social, sin embargo se ha contribuido para el desarrollo de dicho objetivo.

I m i r I

n

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

El trabajo consistió básicamente en dos partes, que es la parte microbiol6gica y la parte polimérica, siendo esta ultima a la que estuvo enfocado el trabajo realizado durante el servicio social.

Pruebas con PVA (pollvlnllalcohol) de Diferente Peso Molecular.

Una de las primeras pruebas que se realizaron fue la preparaci6n de criogeles de PVA utilizando polimeros de diferente peso molecular. Se trabaj6 con PVA de 115 000, 126 O00 y una mezcla de PVA con un rango de 124 O00 - 186 O00 gimol. Se prepararon por triplicado soluciones con concentraciones al 4, 5, 7 y 8% de cada uno de los polimeros. La preparaci6n de los criogeles se realizó en cajas petri y se sometieron a 1 , 3, 5 y 7 ciclos. Cada ciclo consiste en una etapa de 24 horas a - 6 O T y otra de 24 horas a temperatura ambiente. Los resultados obtenidos se muestran a continuación. Polimero de PVA de peso molecular 1 1 5 O00 + Este polimero form6 geles desde el primer ciclo para las concentraciones de 7 y 8%, no asi

para las de 4 y 5%. que además no lograron formar el gel en los sucesivos ciclos. Los polimeros de 7 y 8% no lograron retener su calidad de gel en un cien por cien, ya que parte de ellos se volvla liquido en la etapa a temperatura ambiente para todos los ciclos.

Polimero de PVA de rango de peso molecular 124 O00 - 186 O00 4 Este polimero nunca llegó a formar geles para ninguna de las concentraciones realizadas. pues

después de la etapa de congelamiento el pollmero volvia a tomar su forma liqukia. Fue sometido hasta a siate ciclos, sin observarse cambios en su comportamiento.

Polimero de PVA de peso molecular 126 O00 + Este polimero formó el gel desde la primera etapa de congelamiento para las concentraciones

de 5, 7 y 8%. sin embargo la concentración al 5% perdla gran parte de su forma de gel después de someterlo a la etapa a temperatura ambiente. Los polimeros preparados ai 7 y 8% conservaron casi en su totalidad su forma de gel ai someterlos a la etapa a temperatura ambiente. la cantidad de gel que se volvía liquida fue minima. La concentraci6n al 4% nunca form6 el gel.

Después de estas primeras pruebas, se determinó que la concentración más adecuada para preparar las soluciones de polimeros era de 7.5% debido a la enorme dificultad que representa disolver el polimero a concentraciones mayores y debido también a que los mejores resultados se obtuvieron a concentraciones de 7 y 8%. De unas segundas pruebas con los polimeros preparados todos a concentración de 7.5% y 1 , 3, 5 y 7 ciclos (por triplicado) se obtuvieron los siguientes resultados:

Polimero de PVA de peso molecular 11 5 O00 6 Este polimero form6 el gel desde la primera etapa de congelamiento. sin embargo parte del gel

perdia su forma despues de la etapa a temperatura ambiente. Durante las siguientes etapas se repetía este comportamlento inclusive hasta los siete ciclos.

Polimero de PVA de rango de peso molecular 124 O00 - 186 O00 + Este pollmero no form6 geles. ya que despues de la etapa de congelamiento, se volvla liquido

nuevamente. Se someti6 hasta a cinco ciclos sin observarse cambio de comportamiento.

Poiimero de PVA de peso molecular 126 O00 + Este polimero formó el gel desde la primera etapa y consew6 su forma de gel casi en su

totalidad después de la etapa a temperatura ambiente. Durante las subsiguientes etapas se

De los resultados anteriores puede verse claramente que el pollmero de peso molecular 126 O00 es el más adecuado por formar los geles de mayor estabilidad

Preparación de Perlas de PVA

Una vez seleccionado el peso molecular del pollmero se procedió a preparar "perlas" Estas perlas son pequefias esferas de PVA que tienen normalmente 5mm de didmetro. y es en ellas donde se piensa inmovilizar al Rhodococcus rhodochrous para trabajar con él a nivel de reactor

Las perlas se prepararon con solución de PVA al 7 5% a temperatura ambiente por goteo con pipeta Pasteur en cloruro de metileno a -60% El cloruro de metileno es un solvente orgánico inmiscible con el agua y con un punto de congelamiento de -95.14*C AI contacto con el cloruro de metileno, las gotas se congelan y forman las perlas, las cuales se retiran del solvente para luego ser sometidas a los tratamientos de frlo - calor descritos anteriormente y que sirven para la formación del gel

Pruebas Mecdnicas

Con el objeto de tener un marco de referencia que nos permlta evaluar el efecto del número de ciclos sobre la resistencia del material se llevaron a cabo pruebas de compresión. Estas pruebas se llevaron a cabo en un equipo INSTRON, con celda de 500N y punz6n de 2mm de diámetro.

Los especlmenes para esta prueba se prepararon en vasos de precipitado de 100m1, adlclonando a cada uno una cantidad de 40ml de solución de PVA (126 000) al 7.5% en peso. Las soluciones se wmetieron a los tratamientos criogénicos con etapas de congelamiento de 24 horas a -60% y etapas de calentamiento de 1 hora a temperatura ambiente Las muestras se sometieron a ciclos deda $1 hasta 6 por duplicado, as1 mismo se prepararon muestras con y sin biomasa. El número de muestras analizadas fue de 24 (12 con biomasa y 12 sin biomasa) y el número de pruebas por muestra fue de 4. De cada prueba se obtuvieron datos como fuerza máxima de compresión, esfuerzo a la cedencia y energía a la cedencia En las siguientes gráficas podemos observar la influencia del número de ciclos y la presencia o no de biomasa en la resistencia del materlal a la fuerza y energla de compresión y al desplazamiento Los datos completos se muestran en el anexo I .

FIGURA 1

Gráfica de la Fuerza de Compresión VS. No. de Ciclos (SBiomasa)

3 5 2.5 -

::9 - 2

u g g p. 1.5

1 o 0.5

O O 2 4 6 8

No. de Ciclos

FIGURA 2

i '. O 6 -

E

a 8 g 4 - . U

Gráfica de Energía de Compresión VS. No. de Ciclos (Siüiomasa)

- ',.*

/

/ /

0.025 0 0.02 .o .E <9 - 0.015 F e c h 0.01

3 0.005 O

~~ . . . . . . . . . . . .

O 2 4 6 8 No. de Clcbs

FIGURA 3

Gráfico de Fuerza a la Cedencia VS No. de Ciclos (CIBiomasa)

I O 2 4 6 0 No. de Ciclos

FiGURA 4

Grdfica de Energía de Cedencia VS. No. de Ciclos (Ciüiomasa)

... " ..................... . . . . . . . . .

f / / I

I I

J / 1 i 07

O 2 4 6 8 No. de Ckbs

FiGURA 5

m - ; E 2.1 -’

;:;- o O

Gráfica de Desplazamiento en el Punto d6 Cedencia VS. No. de Ciclos(C/Biomasa)

:

- 1 i c

I

O 2 4 6 8 I No. de Clclos

Paralelamente a los tratamientos criogénicos se realizaron pruebas de viabilidad, mediante frotaciones en cajas de petri de los criogeles con biomasa. Diariamente se revisaron las siembras y se observó crecimiento de bacterias en todos los casos

Cohclusiones

El polimero de PVA con las mejores propiedades para formar criogeles es el que tiene un peso molecular de 126 000. Los criogeles de PVA se pueden preparar con tiempos de calentamiento de 1 hora y aún asl presentar una gran resislencia Los materiales con más de cinco ciclos presentan una marcada diferencia en resistencia a la compresión que los materiales con menos ciclos La biomasa incrementa en gran medida la resistencia a la compresión, lo cuál puede ser benéfico para el material. La viabilidad del Rhodococcus rhodochrous se mantuvo inclusive hasla los 7 ciclos.

RECOMENDACIONES

Una de las causas que mas retrasan este proyecto es la continua contaminaclón de las cepas de Rhodococcus rhodochmus. a pesar de que aparentemente se toman todas las precauciones para mantener la cepa pura. Una de las fuentes de contaminación precisamente podría ser la campana de flujo laminar, ya que aunque diariamente se limpia supefílcialmente. las limplezas a fondo se realizan de manera esporádica, sin haber un programa de mantenimiento. además de que el fiitro tampoco se cambia periódicamente. Mi recomendación es que se lnslaure un programa de limpieza a fondo todos los dlas. ya que durante las horas que no se usa y está apagada se contamina con el aire del medioambiental.

o Kevin A. Gray, OS. Pcgrebinsky. G.T. Mrachko. "Molecular mechanisms of biocatalylic desulfurization of fossil fuels", Nature Biofechnology, vol. 14 pgs 1705-1709, december (1996).

o T.O. Bozdemir, T. Durusoy. E. Erincin. "Biodesulfurization of Turkish lignites", Fuel, vol. 75. pgs 1 596- 1600 (1 996).

o John J. Kilbane. Barbara A. Bielaga, "Toward sulfur free fuels",Chem?eech. pgs 747-751, december (1990).

o E. Castillo, M. Rodríguez, R. Quintero, "Design of two lnrnovilized cell catalyst by entrapment on gelatin: Internal diffusion aspects" Enzyme Microb. Techno/. , vol 13, pgs 127-133, (1991).

O S. Johnson, C Olfield. D. Monticello. "Symposium on microbial degradation and modiiication of hydrocarbons" 208Ih National Meeting ACS. Washington D.C.. August ( I 994).

a K. Moshbach "Inmovllized enzimes". Methods enzymol., vol 44 (1976). o Libro "The Explotatlon of Microbies". capitulo 7 Cell and enzirne lrnrnovillzation. o J. Walker, E. Gingold. "Molecular Biology B Biotechnology", cap 12 lmmovillzed biocatalysts.

pgs 235-258

Nombre Matricula Llcenclatura Titulo del Proyecto

Fecha de registro Fecha de entrega Asesor Interno

Asesor Externo

De los Reyes Guerrero Jorge Ricardo 87326129 Ingenierla üioqulniica Industrial INMOVILIZACIÓN DE CCLULAS BACTERIANAS EN MATRICES POLIMCRICAS PARA LA ELIMINACI6N DE AZUFRE EN DERIVADOS DEL PETR6LEO. 3 de noviembre de 1997 16 de octubre de 1998 Dr. Gerard0 Saucedo Castañeda. Prolesor - Invesligador del Deparlamento de üiotecnologfa. UAM Iztapalapa. M en C. Diego Zaragoza Contreras. Invesligador del Departamento de üioprocesos pertenecienle a la Gerencia de Control Ambiental y Suslentabilidad de la Subdirección de Protección Ambiental del lnstiluto Mexicano del Petróleo.

RESUMEN

En las ultimas décadas varias especies de bacterias capaces de calalizar la conversión de compuestos organosulfurados han sido aisladas y patentadas. En anos recientes han surgido cepas como Rhodococcus rhodochrous lGTS8 capaces de metabolizar azufre para su crecimiento a partir de substralos orgánicos como el petróleo sin romper los enlaces carbono - carbono. Para lograr el máximo aprovechamiento de la actividad enzimática surge como una alternativa la inmovilización de células y en algunos casos la inmovilizacibn de la propia enzima.

Para este lrabajo especifico se ulilizó el polfmero PVA (polivinilalcohoi) para la inmovilización del Rhodococcus rhodochrous. el cual forma una disolución transparente y espesa, la cual se somete a periodos de congeiamiento por 24 horas a teniperalura de -60% seguido de periodos de calor que pueden ser de 1 y 24 horas a temperatura ambiente. para formar un gel (criogel). que es una substancia parecida al caucho y de color blanco. Un ciclo es un periodo de congelamiento seguido de un periodo de calentamiento.

Objetivo General: Contribuir al desarrollo de un proceso de biodesulfuración de alto rendimiento que sea competitivo con las tecnologias actuales de desulfuración. Objetivos Especificos: Desarrollar una matriz polimérica que cumpla con las expeclativas requeridas por nuestro sistema biocatalitico y que provoque el minimo de perturbaciones que puedan afectar la capacidad desulfuradora de la cepa (Rhodococcus rhodochrous). además de adecuar la técnica de preparacien de criogeles a las condiciones propias de nuestro proyecto.

Después de probar con diferentes polimeros de PVA de pesos moleculares 11 5 000, 126 O00 y una mezcla de polimeros de rango 124 O00 - 186 O00 sometiéndolos a tratamientos de 1, 3, 5. y 7 ciclos. se lleg6 a la conclusion de que el pollmero de peso molecular 126 O00 es el más Indicado para preparar los criogeles para la inmovilización del Rhodococcus rhodochrous, ya que formó geles resistentes desde el primer ciclo de tratamiento. Se prepararon geles con y sin biomasa. siendo los geles con biomasa los que mayor resistencia a la compresión presenlaron (71.3% de compresión promedio VS. 80%, respectivamente), además de que los geles con más de cinco ciclos presentaron una marcada diferencia en resistencia a la compresión (2.6 N promedio para 6 ciclos VS. 2.15 N para 5 ciclos, sin biomasa y 5.9 N para 6 ciclos VS. 2.93 N para 5 ciclos, con biomasa) que los materiales con menos ciclos.

Tambien se efectuaron pruebas para comprobar la viabilidad del Rhodococcus a traves de todos los ciclos de tratamiento, mediante frotaciones en cajas de petri, obteniendose resultados positivos para las muestras obteridas desde uno hasta siete ciclos.

.

D U U

- - c cG, $$!y

MenC. Diego Zaragoza Contrcras

$: erardo Saucedo Castaiieda

Asesor Interno Asesor Externo

&hq? - /'

< , ' _'_ --_

Jorge Ricardo de los Reyes Guerrero