第三章真菌感染实验诊断

第一节 真菌的基本特性 真菌是一大类具有典型细胞核，

不含叶绿素，不分根、茎叶的真核细胞型微生物。

一、真菌的形态特性

（一）单细胞真菌呈圆形，如酵母菌。 （二）多细胞真菌由菌丝和孢子组成， 称丝状菌或霉菌。

菌丝和孢子的形态因菌而异，是鉴定真菌的重要依据。孢子又分为多种，如叶状孢子、分生孢子和孢子囊孢子等。

二、真菌菌落特性真菌培养要求不高，常用沙氏(Sabouraud) 培养基 ( 含 1 ％蛋白胨、 4 ％葡萄糖或麦芽糖、 2 ％琼脂 ) 培养，适宜温度 22℃—28℃ ，但深部真菌为37℃ 。形成三种菌落，菌落形态是鉴别真菌的重要依据。

1 ．酵母型菌落 是单细胞真菌的菌 落，形态与细菌菌落相似，较大， 表面光滑湿润柔软、边缘整齐， 如新生隐球菌。

2. 类酵母型菌落 如白假丝酵母菌， 形成假菌丝，伸人培养基中。

3 ．霉菌型菌落 是多细胞真菌的菌 落。菌落呈棉絮状、绒毛状，并 产生不同的色素，如皮肤癣菌。

第二节 标本采集及检验程序

一、临床标本的采集 ( 一 ) 临床标本类别 1 ．皮肤的角质性物质：毛发、 指 ( 趾 ) 甲、皮屑等。

2 ．各种分泌物和排泄物：生殖道 分泌物、耳垢、痰、粪便、尿 液等。

3 ．血液和体液：体液包括胸水、 腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。 4 ．脓汁及渗出物。

( 二 )采集标本注意事项

1. 采集的标本要适宜 不同真菌感染 应采取不同的临床标本。怀疑为浅 部真菌感染如体癣，应刮取病变边 缘的痂、皮屑，发癣应取病发。深 部真菌感染应取血液、脑脊液、脓 汁等。

2 ．在用药前采集标本 一般真菌 标本须在用药前采集，对已用 药者则需停药一段时间后再采 集标本。

3 ．采集的标本量要足 血液和脑 脊液标本 5ml ，胸腔液 20ml ， 皮屑标本两块，活体组织两份 ( 一份送病理科检查，一份作 镜检和培养 ) 。

4 ．严格无菌操作 并进行消毒处理， 尤其是采集血液和脑脊液标本， 要避免污染杂菌。5 ．采集标本立即送检 深部真菌标 本最长不得超过 2h。

第三节 真菌检验 一、标本直接检查 ( 一 )显微镜检查 直接镜检对真菌病的诊断较细菌更为重要。 许多真菌标本不需染色即可直接镜检，如癣病 标本多用 KOH湿片检查法，即取病发或病损部位 皮屑、甲屑置于载玻片上，加 1滴 10 ％ -20 ％ KOH 液，然后加盖玻片并微微加热，使标本组织溶解 透明，在显微镜下可观察到真菌的孢子和菌丝。

直接镜检的意义

直接镜检阳性表示：①有诊断意义，如浅部真菌病等；②看到的就是真菌的形态，可确定某 些致病性真菌的属或种 , 如假丝酵 母菌的厚膜孢子等；

③ 判断某些真菌种的致病性等 ,如

皮肤癣菌、曲霉等。

直接镜检也有局限性：①阴性结果不能排除真菌感染；②有假阳性结果。 因此，对直接镜检可疑结果应 作复查或用其他检验方法鉴定。

( 二 )抗原检测

常用的方法有胶乳凝集试验、ELISA、半定量放射免疫法。均应设对照，防止发生假阳性和假阴性。

用胶乳凝集试验检测标本中的白假丝酵母菌甘露聚糖抗原。 用胶乳凝集试验和 ELISA检测血清和脑脊液中的隐球菌多糖荚膜抗原，在治疗前检测非常敏感特异。

用半定量放射免疫法检测血清、 尿液和脑脊液中荚膜组织胞浆菌循 环多糖抗原，可快速诊断。

二、真菌的分离培养

真菌培养是目前鉴定真菌的惟一方法。培养真菌的温度为 28℃ ，但深部真菌为 37℃ 。菌落是鉴别真菌的方法。注意以下几点：

①菌落性质：酵母菌还是霉菌；②菌落大小，病原性真菌菌落小， 而条件致病性真菌菌落大；

③菌落颜色 病原性真菌颜色淡， 污染真菌颜色深；④致病性真菌菌落下沉，有时使 培养基开裂；污染性真菌菌落 不下沉 ,很少引起开裂。

三、真菌的生化反应

用于主要深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等。1. 糖 (醇 ) 类发酵试验 37℃孵育， 观察糖发酵情况。

2. 同化碳源试验 含菌生理盐水 与已融化的固体同化碳源培养 基 (45℃)混合，然后在培养基 上分别加糖，置 25℃孵育观察 结果。若 24h后无变化可重复 加糖。如能同化周围有生长圈， 否则无生长。

3. 同化氮源试验 同化碳源试 验相同，但需用无氮源的培 养基，不要加糖类，而加入 硝酸钾。

四、动物实验

实验的目的是分离病原性真菌、 确定真菌菌种的致病性、研究药物 对真菌的作用等。如假丝酵母菌接 种家兔或小白鼠，肾脏明显肿胀， 肾皮质部位有白色脓疡。

五、核酸检测 医学真菌的鉴定手段引入了分子生物学的鉴定方法，从核酸碱基 G+C mol ％分析、限制性片段长度多态性 (RFLP) 、 Southern印迹分析到脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 、 PCR指纹、随机扩增多态性 DNA(RAPD)以及 DNA特殊片段测序等。

（一 )G+Cmol ％分类鉴定法

常用热变性温度法。原理是 DNA加热变性使碱基氢键被打开，双链螺旋变成单链，导致核苷酸碱基在 260nm紫外吸收明显增加，完全变成单链后，紫外吸收增加停止。紫外吸收增加的中点值温度为热变性温度（ Tm ）。若真菌 DNA中 G+C碱基对含量多， Tm值就高。可直接反映G +C碱基对的绝对含量。计算公式为： G+Cmol ％ =(Tm-53.9)×2.44

( 二 )真菌核型的脉冲电泳分析

脉冲凝胶电泳技术 (PFGE)解决了真菌大分子 DNA的分离技术难题。

原理： PFGE有两个方向的电场在设定的脉冲时间里交替变换，使大分子 DNA在移动中不断改变自己的形状及迁移方向，从而绕过细小的凝胶孔隙而得以分离。较大的 DNA分子泳动慢些，较小的快些，有许多因素影响电泳带型，分离真菌等大分子量的DNA宜用较低电压和较长脉冲时间。

用 PFGE分析真菌核型，可直接比较其遗传背景 , 从电泳核型差异中进行分类鉴定 ,又能取得基因结构的基本数据，构建出大尺度物理图谱。

( 三 )随机扩增多态性 DNA(RAPD) 分析

RAPD分析是一种利用随机合成的单个寡核苷酸引物，通过PCR扩增靶细胞DNA，扩增产物凝胶电泳，分析DNA片段大小和数量的多态性，从而比较靶基因差异的一种技术。由于病原性真菌基因组庞大， RAPD分析适用于真菌的鉴定与分类。

六、真菌毒素的检测真菌产生有毒的代谢产物，可引起急慢性真菌中毒症，引起消化道中毒症状，而且可进入人体内引起病变，如引起肝脏损伤的黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素；引起肾脏损害的桔青霉素；引起中枢神经系统损害的黄绿青霉素等。甚至有的毒素具有致癌性，如黄曲霉毒素与肝癌发生有关。

检测真菌毒素有许多方法，如检测黄曲霉毒素有生物学方法和 ELISA法等。生物学方法主要用于检测真菌毒素的毒性，如用鸡胚、小白鼠作毒性试验，观察动物中毒死亡或出现肿瘤。 ELISA法操作简便，并具有安全快速高效、费用低，适用于大批量标本的筛选。