2. 细菌学诊断法
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2. 细菌学诊断法是发现牛结核传染源的重要手段和途径,主要包括细菌涂片镜
检、细菌培养试验:
细菌涂片镜检:材料、设备简单,操作方法简便;特异性较差、易出现假阴性
细菌培养试验:周期长,易受杂菌污染
一般只作为牛结核病诊断的辅助方法。
结核菌培养及片段扩增结核菌培养及片段扩增
相关工作
牛 PBMC 细胞形态检测结果
肺泡巨噬细胞抗酸染色结果
• 结果显示,有牛分枝杆菌侵入的肺泡巨噬细胞比例为 7.9% ,胞内出现 5 个以内牛分枝杆菌的肺泡巨噬细胞比例为 5.8% ,出现5-10 个的占 4.6% ,出现 10 个以上的占 1.2% 。
3. 免疫学诊断法 是牛结核诊断方法中应用最广泛,也是目前国内外研究最
多的一类方法。
主要包括:迟发型变态反应、酶联免疫吸附试验 ( ELISA)、 γ- 干扰素试验、免疫层析法(免疫胶体金技术)等。
免疫学诊断法 1. 迟发型变态反应法 目前临床上应用最广泛的方法,也是国际规定测定牛结核病的标
准方法。主要通过两种途径:皮内(为主)和点眼(为辅)。• 优点:方法简单,操作容易,且检出率较高• 缺点:①特异性较差(禽分支、 BCG) ;②滞后效应; ③ 只能用于活体;④假阴性(病情严重)
需要找出一种特异性较高的诊断方法取代 或者辅助该方法的诊断。
结核菌素点眼检查
免疫学诊断法 2. 酶联免疫吸附试验 ( ELISA) 优点:①操作简单,价格低廉,诊断快速 ②对检出重症结核病牛有特殊作用 ③ 可降低非典型分枝杆菌非特异性干扰 ④可避免皮试检测时人为造假影响 ⑤ 方便对野生动物进行结核病的普查 用于 ELISA 的主要诊断抗原: PPD 、 CFP-10 、 ESAT-6 、 MPB70 、 MPB8
3 、 Mce4E 、 RpfC 。使用不同抗原的 ELISA ,其检测的特异性和敏感性不同。
将两种或者两种以上特异性抗原融合蛋白作为牛结核病诊断抗原,在保持高特异性的基础上能大大提高 ELISA 检测牛结核的敏感性。 Aagaard 等使用不同诊断抗原对不同地区的不同牛群检测发现, ESAT-6 与 CFP-10 联合使用在敏感性和特异性上都优于单独使用任一抗原。
抗原 PPDCFP-10
ESAT-6
MPB83
MPB70
CFP-10+ESAT-
6
MPB83+MPB70
特异性%
83.3
100 100 66.7 100 100 83.3
敏感性%
36.4
9.1 9.1 18.2 0 63.6 27.3
迟发型变态反应法与 ELISA 诊断法的比较分析
诊断方法
诊断抗原 基本原理 检出率 特异性
迟发型变态反
应
牛 PPD 主要检测的是机体细胞免疫中的抗
体
在结核病初期和非疫区检出率较高
容易受其他非特异性结核分支杆菌的干扰
ELISA诊断法
ESAT-6 等高特异性蛋白或多种抗原的融合
蛋白
主要检测的是机体体液免疫中的抗
体
在疾病发展的中后期和疫区检出率
高
随着诊断抗原的不断发展,特异性较高
免疫学诊断法
ELISA 与迟发型变态反应相辅相成。在当前实际检疫工作中,采用迟发型变态反应和 ELISA 相结合的方法进行结核病诊断,既有助于提高结核检疫的特异性,又可以大大提高阳性牛的检出率(细胞免疫和体液免疫均可检测)
ELISA 与迟发型变态反应相辅相成。在当前实际检疫工作中,采用迟发型变态反应和 ELISA 相结合的方法进行结核病诊断,既有助于提高结核检疫的特异性,又可以大大提高阳性牛的检出率(细胞免疫和体液免疫均可检测)
免疫学诊断法
原理:致敏的外周血淋巴细胞( PBL )在体外培养的条件下,受特异抗原 (如 PPD 或 ESAT-6) 刺激后被活化,并经 16-24 小时的孵育表达并分泌 γ-干扰素,通过一定的技术手段 (ELISA) 对培养上清中的 γ-干扰素进行检测。
目前, IFN-γ 检测方法在许多国家推广使用,且已有检测试剂盒出售。
3. γ- 干扰素诊断法3. γ- 干扰素诊断法
免疫学诊断法3. γ- 干扰素诊断方法3. γ- 干扰素诊断方法
结 果牛结核 PPD 检疫及 IFN-γ 试剂
盒检测结果检疫省区 检测头数 PPD 阳性牛头数( 头 )
PPD 阳性率( % )
IFN-γ 检测阳性头数(头)
IFN-γ 阳性牛比例( % )
IFN-γ 阳性牛占 PPD
阳性牛比例( % )
山东 856 7 0.81 4 0.46 57
宁夏 1063 6 0.56 3 0.28 50
黑龙江 770 3 0.38 2 0.26 66.7
Total 2589 16 - 9 - -
利用建立的牛 γ- 干扰素双抗体夹心 ELISA 技术,建立牛结核 γ- 干扰素检测方法。
这种方法既可以作为特异性强的早期诊断方法,还可以作为自然感染与 BCG 免疫的鉴别诊断方法,从而为高危牛群接种疫苗免疫的可能性奠定技术基础。
免疫学诊断法 判断标准: 阴性结果:在试纸条上只出现一条紫红色的
条带(对照带)(图 A) 阳性结果:试纸条上出现两条紫红色的条带
(检测带和对照带)(图 B) 无效结果:在胶体金试纸条的对照带处不出
现紫红色的条带(图 C)
A B C
免疫胶体金结果示意图
4. 免疫胶体金技术4. 免疫胶体金技术
免疫学诊断法诊断方法 优点 缺点
γ-干扰素诊断法
简单快速,灵敏度和特异性高
成本较高 ;检测过程复杂、对样品的要求也高;假阳性率高
免疫胶体金技术
简便快速,特异性强、敏感性高,肉眼判读,实验结果易保存,无需特殊仪器设备和试剂
起步较晚,胶体金相关的临床诊断试剂盒开发应用的还比较少
PCR 诊断技术 反应灵敏,特异性强
对技术技术质量要求很高;容易受污染出现假阳性;受标本中抑制物质的影响又会出现假阴性;试剂盒缺乏规范化、标准化
γ- 干扰素诊断法、免疫胶体金技术、 PCR 诊断法的优缺点分析γ- 干扰素诊断法、免疫胶体金技术、 PCR 诊断法的优缺点分析
三种方法都有简便快速,特异性强、敏感性高等优点,有很好的应用前景,但技术还不够成熟,试剂盒缺乏规范化、标准化,还需要对这些技术做进一步的研究和完善,并加快试剂盒的研制。
三种方法都有简便快速,特异性强、敏感性高等优点,有很好的应用前景,但技术还不够成熟,试剂盒缺乏规范化、标准化,还需要对这些技术做进一步的研究和完善,并加快试剂盒的研制。
4. 分子生物学检测
• 4.1 牛分枝杆菌基因片段扩增
• 4.2 特异性重组蛋白表达分析
• 4.3 结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌复合群成员的鉴定
利用分子克隆技术,以牛结核分支杆菌标准菌株全基因组为模板体外扩增基因。利用分子克隆技术,以牛结核分支杆菌标准菌株全基因组为模板体外扩增基因。
582bp
MPB70 基因的 PCR 扩增MPB70 基因的 PCR 扩增
2000 bp
750 bp
500 bp
200 bp
100 bp
1 M
1000 bp
MPB83 基因的 PCR 扩增MPB83 基因的 PCR 扩增
600bp600bp
4.1 牛分枝杆菌基因片段扩增
牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的 PCR分型鉴定结果
• M.tb 、 M.bovis 占双阳性牛分离率分别为 22.2% 、 55.6% ;在检测牛中, M.tb 、 M.bovis 的平均分离率分别为 0.073 % 、 0.19% 。
结核菌基因多态性分析
图 5.1 H37Rv 24 个串联重复序列位点分布电泳图M 为 100bpMarker ,其余泳道从左到右依次为 H37Rv 中 24 个 VNTR 位点 PCR 产物的分布情况
结核菌基因多态性分析
图 5.2 临床分离株 FC 24 个串联重复序列位点分布电泳图M 为 100bpMarker ,其余泳道从左到右依次为临床分离株 FC 中 24 个 VNTR 位点 PCR 产物的分布
情况
结核菌基因多态性分析
对临床株基因组 DNA 样品进行 VNTR 的 12 个位点的扩增、琼脂糖电泳,电泳结果反应了临床株在各位点的特异性片段大小。
图 5-8 某临床株 12 个 VNTR 位点扩增图谱, M 为 DL100 的 Marker , 1-12 所对应的位点以此为 ETR-C 、 ETR-B 、MIRU-26 、 QUB-26 、 Mtub04 、 MIRU-31 、 MIRU-23 、 MIRU-20 、 QUB-11b 、 MIRU-4 、 MIRU-40 、 Mtub21
M 1 2 3 4 5 6 7 M 8 9 10 11 12
MPB70 重组蛋白 Western-Blot 分析 MPB83 重组蛋白 Western-Blot 分析
利用基因重组技术表达牛结核分枝杆菌 Mce4A 、 Mce4E 蛋白和 Rpf 蛋白,并对这三个蛋白进行 Ni-NTA镍柱纯化、透析复性,在体外获得Mce4A 、 Mce4E 蛋白和 Rpf 蛋白。
利用基因重组技术表达牛结核分枝杆菌 Mce4A 、 Mce4E 蛋白和 Rpf 蛋白,并对这三个蛋白进行 Ni-NTA镍柱纯化、透析复性,在体外获得Mce4A 、 Mce4E 蛋白和 Rpf 蛋白。
97.4 kDa
66.2 kDa
43.0 kDa
31.0 kDa
20.1 kDa
M 1 2 3
29KD29KD
26KD26KD
4.2 特异性重组蛋白表达分析
三、 牛结核的防控
• 1. 国外防控措施
• 2. 我国防控现状
1. 国外防控措施
•消灭或控制牛结核病的国家和地区,大多采取检疫、隔离、扑杀相结合的防控策略。
•国外也开展疫苗(主要用于动物)的研发工作。
澳大利亚从上世纪 70年代正式开始牛结核的根除工作,现 已基本根除了牛结核。根除过程中使用的技术措施主要包括:
对“无疫区”、“暂时无疫区”等地区状况和疑似、感染等畜群状况进行了规定,并制定了不同地区间的迁移标准;
检疫过程中主要使用尾根皮肤试验和比较变态反应试验,官方兽医机构对未感染结核病的奶牛颁发合格证;
建立完善的屠宰场检疫体系和动物标识追踪体系;
完善的实验室工作,主要利用细菌培养验证检疫出来的阳性样品。
2. 我国防控现状
•目前主要采取检疫净化(检-淘)的措施。–2000-2007年全国动物结核病防治共检疫监测牛2123.3万头(次),其中奶牛1703.99万头(次),扑杀病畜 4.9万头,其中奶牛4.7万头。
•该防控措施的实施为牛结核病疫情的控制发挥了重要作用。
参加了北京市密云县的结核病牛净化工作。
具体实施方案
健康牛群 :平时加强防疫、检疫和消毒措施,防止疾病传入。
污染牛群 :反复进行多次检疫,不断出现阳性病畜,则应淘汰污染群的开放性病畜及生产性能不好、利用价值不高的结核菌素阳性反应病畜。
结核菌素反应阳性牛群: 应定期与经常地进行临诊检查,必要时进行细菌学检查,发现开放性病牛立即淘汰。
最好对结核菌素阳性牛及时处理,不予保留饲养,根绝传染源。
病牛所产犊牛出生后只吃3~5天初乳,以后则由检疫无病的母牛供养或喂消毒乳。
犊牛应在出生后 1月龄、 3~ 4月龄、6月龄进行 3次检疫,凡呈阳性者必须淘汰处理。如果三次检疫都呈阴性反应,且无任何可疑临诊症状,可放入假定健康牛群中培育。
假定健康牛群:为向健康牛群过渡的畜群,应在第一年每隔 3 个月进行一次检疫,直到没有一头阳性牛出现为止。然后再在一年至一年半的时间内连续进行 3次检疫。如果 3次均为阴性反应即可称为健康牛群。
•防治人结核病的主要措施是早期发现,严格隔离,彻底治疗。牛乳应煮沸后饮用;婴儿普遍注射卡介苗。治疗人结核病有多种有效药物,以异烟肼、链霉素和对氨基水杨酸钠等最为常用。
祝大家工作顺利 !节日快乐!
谢谢大家!