AGRONOMSKI FAKULTET SVEUILITA U ZAGREBU

Biljna virologija i fitopatogene bakterije

skripta

19.5.2009

Skripta je sastavljena od predavanja dr. sc. Edyte ermi i odabranih sadraja iz fitopatoloke literature. Sadri poglavlja o opoj i specijalnoj biljnoj virologiji i bakteriologiji.

2

3

Sadraj Laboratorijske tehnike i uvjeti rada ........................................................................................................................ 5

Uvod: osnovne laboratorijske tehnike ................................................................................................................ 5

Opa virologija ........................................................................................................................................................ 6

Morfologija virusa ............................................................................................................................................... 6

Klasifikacija i nomenklatura ................................................................................................................................ 9

Imenovanje kriprogramom ............................................................................................................................. 9

Suvremena klasifikacija ................................................................................................................................. 10

Baltimoreova podjela .................................................................................................................................... 10

Vegetativni ciklus i umnoavanje (replikacija) virusa ........................................................................................ 11

Umnoavanje virusa s jednolananom (+)RNA (IV. grupa po Baltimoreu) .................................................... 12

Prijenos virusa ................................................................................................................................................... 13

Prijenos virusa vektorima .............................................................................................................................. 13

Nastanak infekcije i fiziologija inficiranih biljaka ............................................................................................... 15

Fizioloke promjene na inficiranoj biljci ........................................................................................................ 16

Simptomi ........................................................................................................................................................... 17

Dokazivanje , identifikacija i suzbijanje virusa .................................................................................................. 19

Dokazivanje i identifikacija ............................................................................................................................ 19

Suzbijanje virusa ............................................................................................................................................ 24

Subviralni patogeni ........................................................................................................................................... 26

Specijalna virologija .............................................................................................................................................. 27

uta patuljavost jema ...................................................................................................................................... 27

Rizomanija ......................................................................................................................................................... 28

arka ljive ......................................................................................................................................................... 29

Mozaina bolest duhana ................................................................................................................................... 31

Mozaiana bolest krastavca .............................................................................................................................. 32

Bolest ljutenja kore stabla agruma .................................................................................................................. 33

Prokariotski biljni patogeni- opi dio .................................................................................................................... 34

Morfologija i fiziologija fitopatogenih bakterija ................................................................................................ 34

Graa bakterija ............................................................................................................................................. 34

Fiziologija bakterija ....................................................................................................................................... 35

Sistematika fitopatogenih prokariota ............................................................................................................... 35

Mikoplazmama slini organizmi .................................................................................................................... 36

Rikecije .......................................................................................................................................................... 38

Simptomi bakterioza ......................................................................................................................................... 39

4

Rad s bakterijama- stvaranje istih kultura ....................................................................................................... 40

Identifikacija bakterija i principi suzbijanja fitopatogenih bakterija ................................................................ 41

Metode identifikacije bakterija ..................................................................................................................... 41

Principi suzbijanja fitopatogenih bakterija .................................................................................................... 43

Specijalna bakteriologija ....................................................................................................................................... 44

Pseudomonas .................................................................................................................................................... 44

Pseudomonas syringae pv. phaseolicola ....................................................................................................... 44

Pseudomonas syringae pv. lachrymans ........................................................................................................ 45

Pseudomonas syringae pv. glycinea .............................................................................................................. 45

Pseudomonas syringae pv. tomato ............................................................................................................... 45

Xanthomonas .................................................................................................................................................... 46

Xanthomonas campestris pv. campestris ..................................................................................................... 46

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria ...................................................................................................... 46

Xanthomonas campestris pv. juglandis ......................................................................................................... 47

Agrobacterium .................................................................................................................................................. 47

Agrobacterium radiobacter pv. tumefaciens ................................................................................................ 47

Agrobacterium radiobacter pv. rhizogenes ................................................................................................... 47

Agrobacterium radiobacter ........................................................................................................................... 47

Corynebacterium michiganense pv. michiganense ....................................................................................... 48

Erwinia ............................................................................................................................................................... 48

Erwinia carotovora pv. atroseptica .............................................................................................................. 48

Erwinia carotovora pv. carotovora ............................................................................................................... 49

Erwinia amylovora ......................................................................................................................................... 49

Prognoza bakterijske palei u vonjaku ............................................................................................................ 51

Ekologija i epidemiologija bakterijske palei u vonjaku. ............................................................................. 51

Prognozni model Maryblyt ............................................................................................................................ 52

Prognozni model BIS ..................................................................................................................................... 54

Napomene: .................................................................................................................................................... 55

Dodatak ................................................................................................................................................................. 56

Izvod iz liste karantenskih tetoinja- virusi i bakterije ................................................................................. 56

Bibliografija ........................................................................................................................................................... 59

5

Laboratorijske tehnike i uvjeti rada

Sve biljne patogene dijelimo na stanine (imaju staninu grau)- to su gljive i bakterije i bezstanine patogene- viruse i subviralne patogene.

Uvod: osnovne laboratorijske tehnike

Prilikom laboratorijskog rada s biljnim patogenima vano je odravanje sterilnosti i pravilno skladitenje kemikalija. U laboratoriju se koriste laboratorijski pribor te stakleno i plastino posue. Dio posua i pribora nije mogue koristiti viekratno te se ono nakon upotrebe odbacuje, a ako je kontaminirano (kemijski ili

bioloki), sprema se na posebno odlagalite.

Kako bi se odrali sterilni uvjeti, provodi se sterilizacija posua, pribora i hranidbenih podloga.

Po potrebi, neke radnje se vre u laminaru.

Laminar je radni ormar s protokom sterilnog zraka.

Sterilizacijom se unitavaju vegetativni i sporogeni

mikroorganizmi i virusi. Od fizikih metoda sterilizacije provode se suha sterilizacija i

autoklaviranje. Autoklaviranje predstavlja metodu

vlane sterilizacija pregrijanom vodenom parom.

Provodi se u hermetiki zatvorenom ureaju

autoklavu, najee pri temperaturi 121C i tlaku

1bar.

Od kemijskih sredstava za dezinfekciju se najee

koriste NaOH i deterdenti.

Odreene tehnike zahtijevaju provoenje pokusa za koje je potrebno osigurati i laboratorij, ali i

uzgajalite biljaka.

Slika 1: laminar

Slika 2: autoklav

Opa virologija

Morfologija virusa

Budui da virusi nemaju staninu grau, njihovo tijelo zovemo esticom.

Virusi

Kako im je veliina manja od valne duljine svjetlosti kojom ih se promatra, nisu vidljivi svjetlosnim, ve samo elektronskim mikroskopom.

su nukleoproteinske submikroskopske infektivne estice (makromolekule) tj. genetiki elementi koji mogu egzistirati i izvan stanice, ali za replikaciju moraju biti u ivoj stanici domaina. Obligatni su stanini

paraziti.

Trenutno je poznato oko dvije tisue virusa, od ega

gotovo polovica uzrokuje bolesti bilja.1

Virusnu esticu sposobnu za ostvarivanje infekcije

nazivamo

virion, tj. virion je infektivna virusna estica. Sve virusne estice nisu virioni.

Graa: virusna estica sastoji se od proteinskog omotaa

kapside i nukleinske kiseline koja ini sr. Zajedno ih

nazivamo nukleokapsida. Osim ova dva glavna dijela,

virusne estice mogu sadravati jo i: lipoproteinsku

ovojnicu (peplos ili toga) na kojoj se nalaze nastavci

(peplomere) to je kod biljnih virusa rijetka pojava (npr.

virus bronavosti rajice

Kapsida se sastoji od velikog broja proteinskih podjedinica koje se kod poliedrinih virusa udruuju u kapsomere. Moe biti graena od jednog ili nekoliko proteina. Peplos nastaje od dijelova stanine membrane

stanice domaina.

ima peplos),molekule vode i ione.

Vano je naglasiti da se prema morfologiji ne moe

identificirati biljni virus.

Nukleinska kiselina ini 5-40% grae virusne estice, dok ostatak od 60-95% ide na proteine. Anizometrini virusi imaju nii udio nukleinske kiseline u svojoj grai prema izometrinima. Virusi mogu imati i RNA i DNA, ali uvijek samo jedan tip molekule.

1 Agrios, G (2004). Plant Pathology 5th edition, str. 724

Slika 3: Osnovni oblici i graa biljnih virusa: a) nitasti, b) tapiasti, b-1 i b-2) pogled na grau kapside i sri i c i c-1)

baciliformni, d i d-1) izometrini (okruglasti oblici) i e) estica geminivirusa od dvije spojene estice, NK- kukleinska

kiselina, PP- proteinska podjedinica

7

Po grai razlikujemo etiri tipa virusnih estica (slika 3): a) anizometrini (izdueni, filamentozni). Postoje tri tipa ovakvih virusa: tapiasti. Npr: virus mozaika duhana (TMV) 300x18 nm nitasti (vijugavi). Npr: virus mozaine patuljavosti kukuruza baciliformni, zaobljeni na oba kraja, ili samo na jednom (tada kaemo da lie na puano zrno).

Npr: virus nekrotskog uenja brokule

b) izometrini (sferini, kuglasti, poliedrini). Obino su ikozaedri.2

manji, promjera 20-35 nm. Npr: virus mozaika krastavca (CMV)

Veliina im se izraava promjerom. Oko 80% ovih virusa ima promjer oko 30 nm. Razlikujemo dva tipa:

vei, promjera 60-110 nm. Npr: virus bronavosti rajice (TSWV)

c) multikomponentni (Slika 4) (mogu biti anizometrini i izometrini). To su virusi kod kojih je genom podijeljen na dijelove koji su pakirani u zasebne estice. Npr. virus mozaika krastavca(CMV), virus utavosti duhana (TRV), virus mozaika vigne, v. mozaika lucerne,...). Podijeljenost genoma je prednost jer omoguuje nastanak novih virusnih sojeva. Olakano je fenotipsko mijeanje razliitih virusnih sojeva, manje nukleinske kiseline i manje virusne estice su stabilnije od velikih

. Oko 30% biljnih RNA virusa ima podijeljeni genom.

Slika 4: podijeljeni genom virusa mozaika krastavca (CMV), mikrografija, shema i elektroforetsko oitovanje

Neke estice multikomponentnih virusa mogu biti prazne. Treba napomenuti da se podijeljena RNA moe nalaziti u vie estica, ili pak kod nekih virusa samo u jednoj. Razliite estice multikomponentnih virusa mogu se odvojiti metodom centrifugiranja u gradijentu gustoe.

2 geometrijsko tijelo ija se povrina sastoji od 20 istostraninih trokuta

8

d) bakteriofagi. Specifinog su oblika. Najee su graeni od glave i repa, no ima ih i

graenih samo od glave tako da izgledaju

kao izometrini virusi. Obino im je genom

dlDNA. U glavi se nalazi nukleinska kiselina koju ubacuju u bakterijsku stanicu. Imaju litiki i lizogeni3

uvjetima.

ciklus. Litiki je onaj kod kojeg odmah nakon umnoavanja virusa

dolazi do lize stanice. Kod lizogenog se

ciklusa genom faga ugrauje u genom

bakterije (profag) i replicira se s njim u

diobama bakterijske stanice. Do lize dolazi

nakon dueg vremena i to u odreenim

Fizikalna svojstva virusa:

a) hidrodinamika svojstva- ponaanje virusa u tekuini b) elektroforetska svojstva c) optika svojstva- neki virusi apsorbiraju svjetlost d) biofizika svojstva:

krajnja toka razrjeenja razrjeenje pri kojem nestaje infektivnost trajanje infektivnosti in vitro- eli li se produljiti, mogue je viruse liofilizirati4

termalna toka inaktivacije- temperatura koja nepovratno inaktivira infektivnost virusne estice (mogue ju je odrediti za svaki virus)

Filogenija i srodstveni odnosi virusa nisu potpuno jasni. Tri su hipoteze o nastanku virusa: a) regresivnom evolucijom od bakterija ili mikoplazmi b) virusi su porijeklom iz doba nastanka ivota t.j. kemijske evolucije, prije nego su se pojavili sloeniji

ivotni oblici c) virusi su nastali iz dijelova stanice domaina- to su fragmenti kukleinske kiseline,lutajui geni koji su

izbjegli kontroli stanice i poeli se autonomno razmnoavati- ovo je danas najprihvaenija hipoteza

3 Lizogeni ciklus (tip infekcije) je naziv za virogeni ciklus bakteriofaga 4 Liofilizacijom inficiranog biljnog tkiva, organa ili proienog virusa, moe se izvriti konzervacija virusa

Slika 5: bakteriofag

9

Klasifikacija i nomenklatura Pri sistematizaciji i imenovanju virusa ne koristi se standardna binarna nomenklatura. Jo uvijek postoji nekoliko razliitih sistematizacija u upotrebi. Zbog specifinosti svojstava virusa (graa i aktivnost) za njih se ne mogu primijeniti kriteriji koji vrijede za biljni i ivotinjski svijet. Meu virolozima postoje nesuglasja s

obzirom na klasifikaciju i nomenklaturu virusa. Uobiajeno je da virusi dobivaju opisna imena po simptomima

koje uzrokuju na domainu na kojem je virus prvi puta opisan. Ovaj naziv se (najee) s engleskog prevodi na hrvatski. Slubeno se koriste akronimi engleskih naziva, npr. za virus mozaika duhana, akronim je TMV od eng.

tobacco mosaic virus. Vie sistematske jedinice (rodovi, porodice) dobivaju naziv po glavnom predstavniku skupine uz nastavke za

pojedine sistematske grupe.

Nastavci za formiranje imena sistematskih jedinica u virologiji ()virales red ()viridae porodica ()virinae podporodica ()virus rod

Imenovanje kriprogramom Osobine virusa mogu se prikazati i kriprogramom pri emu se dogovorenim kraticama prikazuju najbitnija

svojstva pojedinih virusa.

Znaenje kriptograma: prema shemi: (1/2:3/4:5/6:7/8)

1 - vrsta NK: R = RNA; D = DNA 2 - broj lanaca NK: 1 = jednolanana; 2 = dvolanana 3 - molekularna masa NK (u Daltonima, =106) 4 - % NK u infektivnoj estici - ako se dijelovi genoma nalaze u razliitim esticama, onda se za svaki tip estice posebno navodi ova vrijednost, a odvojene su znakom "+". 5 - vanjski oblik virusne estice: S - sferian (izometrian); E - izduen s nezaokruenim krajevima; U - izduen sa zaokruenim krajevima; X - kompleksna ili razliita od gore navedenih 6 - oblik nukleokapside (NK + protein): iste oznake kao u 5 7 - vrste domaina: A aktinomicete, B bakterije, M fitoplazme, F gljive, P paprati, S cvjetnice, I beskraljenjaci, V kraljenjaci 8 - vrste vektora: Ac - grinje (Acarina); Al - titasti moljci(Aleurodidae); Ap - lisne ui (Aphididae); Cc -titaste ui (Coccidae); Cl kornjai (Coleoptera); Di - muhe (Diptera); Fu gljive (Fungi); Gy - mreaste; stjenice (Gymnocerata); Ne - nematode (Nematoda); Ps - lisne buhe (Psyllidae); Si buhe (Siphonoptera); Th tripsi (Thysanoptera); Ve - neki drugi vektori; O - prenoenje bez vektora (mehaniki); * - nepoznato svojstvo virusa; () -podatak je sumnjiv ili nepotvren; [] -kriptogram se odnosi na jednu grupu virusa

10

Suvremena klasifikacija se provodi sukladno grai virusa (tipu genoma i postojanju peplosa). Prema sustavu VAC

(eng. vernancular name and cryptogram, narodni naziv i kriptogram) virusi se imenuju prema simptomima i prema domainu (na engleskom jeziku) uz dodatak kriptograma.

Npr. TMV - Tobacco mosaic virus ( R/1:2/5:E/E:S/0 ) Baltimoreova podjela (1970.) svih virusa (ne samo biljnih) dijeli ih na est skupina na temelju naina sinteze njihove mRNA. Obzirom na tip nukleinske kiseline, razlikujemo DNA i RNA viruse. Kako ove molekule mogu biti jednolanane i

dvolanane, imamo sljedee tipove nukleinskih kiselina u virusima:

hrvatski naziv engleski naziv (ee se koristi) jlRNK (jednolanana RNK) ssRNA (single-stranded RNA) dlRNK (dvolanana RNK) dsRNA (double-stranded RNA)

jlDNK (jednolanana DNK) ssDNA (single-stranded DNA) dlDNK (dvolanana DNK) dsDNA (double-stranded DNA)

Baltimore je mRNA oznaio kao (+)RNA, a sve virusne

nukleinske kiseline koje su joj komplementarne oznaene su znakom (-).

Slika 6: Baltimoreova klasifikacija virusa

I: dlDNA-virusi- animalni virusi, neki biljni virusi, npr. vir. mozaika cvjetae (= dobar prirodni vektor za

ubacivanje strane, rekombinantne DNA u genom biljaka. II: jlDNA-virusi- ova pojava postoji samo kod virusa, npr. geminivirus III: dlRNA-virusi- npr. virus mozaika salate IV: (+)jlRNA-virusi - veina biljnih virusaV: (-)jlRNA-virusi - npr. virus bjesnoe, gripe, neki biljni virusi

VI: jlRNA- retrovirusi (od biljnih samo virus mozaika cvjetae)

11

Vegetativni ciklus i umnoavanje (replikacija) virusa

Viruse smatramo ivima zbog replikacije, a neivima zbog kristalizacije.

Dva su osnovna naela (koncepta) izgradnje virusnih estica: a) jednostavnost grae: kapsida se sastoji od mnogobrojnih istovrsnih dijelova(proteinske podjedinice)

koje se udruuju u komplekse (kapsomere) od po 5 ili 6 podjedinica. Te vee morfoloke jedinice, nazivaju se prema tom broju pentamere, heksamere i sl.

b) za sintezu dijelova virusne estice potrebna je minimalna koliina gena (nukleinskih kiselina) i troi se minimalna energija za njihovo slaganje u funkcionalnu virusnu esticu (slau se spontano gotovo bez

utroka energije)

Faze vegetativnog ciklusa virusa: a) adsorbcija prihvaanje virusnih estica na stanicu domaina. To je selektivna faza ciklusa odreuje

da li e virus napasti neku stanicu ili ne. Kod biljnih virusa najee nema ove faze

b) penetracija ulazak virusne estice u stanicu domaina gdje se potpuno razgradi ili u stanicu ulazi samo nukleinska kiselina virusa. Kod biljnih virusa omoguena je npr. ozljedom (rana). Kada virus doe

do stanine membrane, dolazi do deproteinizacije. Virusna nukleinska kiselina ulazi svojim 5-krajem (5 prim) u citoplazmu stanice.

je nema specifinih receptora na povrini biljnih stanica. Selektivnost biljnih virusa je esto odreena prijenosom putem

razliitih vektora (hrane se na odreenim domainskim biljkama).

c) multiplikacija umnoavanje virusnih estica. Nakon to virusna nukleinska kiselina dospije u citoplazmu stanice, dogaa se replikacija nukl. kiseline i sinteza virusnih proteina.

d) konstituiranje novih virusnih estica - kod biljnih virusa konstituiranje novih virusnih estica ide spontano (bez sudjelovanja enzima). Npr. TMV nukl. kis. se uvije tako da savreno odgovara segmentu kapside (inicijacijski kompleks, 1.-34. proteinska podjedinica = 2 diska) Na taj kompleks se naslanjaju slijedea 2 diska proteinskih podjedinica i u njih se pakira nastavak RNA, itd

e) izlaenje virusnih estica iz stanice- biljni virusi najee izlaze plazmodezmijama, a samo kod virusa bronavosti rajice izlaze pupanjem (tako virus bronavosti rajice

dobiva peplos).

Specifine osobine umnoavanja virusnih estica: a) razgradnja virusnih estica b) dijelovi straih virusnih estica ne ulaze u sastav novih c) za umnoavanje virusi koriste izmjenu tvari i energije (metabolizam) stanica biljke.

Replikacija je prilino kompliciran proces. Mehanizam tog procesa ovisi o tipu virusa tj. njegove nukleinske kiseline. Virus uvijek u estici ima samo 1 tip nukl. kiseline (samo RNA ili samo DNA; obje mogu biti jl ili dl). Za detalje v. Baltimoreovu podjelu. Neki virusi kodiraju i vlastite enzime za translaciju, meutim najee stanica biljke osigurava te enzime

(polimeraze, nukleaze, ligaze), kao i energiju, prekursore za sintezu nukl. kiselina i proteina te cijeli sustav za

sintezu proteina. Prisustvo virusa u stanici i sinteza virusnih dijelova djelomino inhibira sintezu staninih nukl. kiselina i proteina.

12

Umnoavanje virusa s jednolananom (+)RNA (IV. grupa po Baltimoreu)5

Najvei broj biljnih virusa ima genom u obliku (+)jlRNA koja je ujedno i virusna mRNA. Proces umnoavanja zapoinje oslobaanjem nukleinske kiseline iz kapside. RNA virusa nosi zapis za stvaranja RNA-polimeraze

(Slika 7) i to su prvi geni do ije translacije dolazi s virusne molekule. Ostaje otvoreno pitanje koliku ulogu u prijepisu genskog zapisa ima RNA-polimeraza domaina, a koliku samog virusa. Replikacija virusne (+)RNA sastoji se od dvaju temeljnih koraka:

na osnovi (+)RNA stvara se komplementarna (-)RNA, a potom na osnovu nje nastaje nova virusna (+)RNA

Tijekom ovog procesa nastaju i dva meuprodukta:

replikativni intermedijer koji se sastoji od potpunog (-) lanca na kojem se nalazi nekoliko (+) lanaca razliite duljine i

replikativna forma (oblik) koja je dvolanani kompleks sastavljen od (-) lanca i (+) lanca Ovi nusprodukti koriste se u dijagnostici pri identifikaciji

Veina djelomino dvolananih intermedijera replikacije se razdvoji na (-) i (+) lance RNA.

biljnih virusa s (+)jlRNA genomom pri emu ih se izolira, a zatim analizira nakon elektroforetskog razdvajanja pri emu se utvrdi njihova molekularna masa. Ova tehnika je vrlo znaajna i u dijagnostici multikomponentnih virusa!

(+)RNA su novi virusni genomi koji se pakiraju u proteinske omotae, kapside). (+)RNA je prvo posluila kao mRNA za sintezu enzima (RNApolimeraza), a zatim za kodiranje u sintezi proteina (za izgradnju kapside).

Iskljuivo nove molekule kapsidnog proteina se spontano slau jedna do druge uz nove (+)RNA i nastaju nove virusne estice.

Slika 7: Nukleotid virusa mozaika duhana, TMV. etiri gena se prevode (dolazi do translacije) i stvaraju proteine molekularne mase 126, 183, 30 i 17,6K. Dva najvea proteina imaju funkciju RNA-polimeraze, protein od 30K omoguava kretanje virusa od stanice do stanice, a protein od 17,6K gradi kapsidu. Brojevi na molekuli RNA oznaavaju nukleotide.

Umnoavanje retrovirusa ((+)RNA) i nekih DNA-virusa: Neki izazivaju nastanak tumora; tu se ubraja i HIV (2 molekule dlRNA). Replikacija reverznom transkripcijom (na osnovu (+)RNA sintetizira se uz enzim reverznu transkriptazu (-)DNA lanac. Na (-)DNA se sintetizira (+)DNA lanac (tada egzistira u obliku dlDNA koja se moe ugraditi u genom domaina) ili (+)RNA (= novi virusni genom). Npr. virus mozaika cvjetae (dlDNA) ili virus hepatitis B (dlDNA).

5 Prema Jureti, N (2002). Osnove biljne virilogije, str. 151

13

Virusi se umnaanjem vrlo brzo genetski mijenjaju. Nove varijante mogu nastati spontano i eksperimentalno .

Za varijante koje nastaju spontano (prirodno) rabi se naziv soj.6

Novi sojevi mogu nastati mutacijom, rekombinacijom (kombiniranjem gena dvaju ili vie srodnih virusa), pseudorekombinacijom (razmjenom dijelova genetskog materijala srodnih multikomponentnih virusa) i komplementacijom (virus uzima jedan ili

vie proteina od drugog soja ili drugog virusa- ovo nije nasljedna promjena). Pri umnaanju virusa mogu nastati i defektne varijante.

Virusi u domainu mogu uzrokovati dva tipa (ciklusa) infekcijea) vegetativni tip- virusna nukleinska kiselina se ne ugrauje u DNA domaina. postoje dva podtipa

vegetativnog tipa:

:

litiki (agresivne varijante)- nakon umnaanja nastale virusne estice razaraju stanicu domaina. Ovom tipu pripadaju brojni bakteriofagi te neki animalni virusi.

perzistentni (blage forme)- stanica domaina se ne unitava, ve se nastavlja umnoavati i otputati nove viruse. Ovakav ciklus ima veina biljnih virusa te neki animalni (hepatitis B)

b) latentni (virogeni) tip7

Prijenos virusa

- virus svoj genom ugrauje u genom domainske stanice. Susreemo ga kod bakteriofaga i animalnih virusa, npr. HIV.

Biljni virusi mogu biljke zaraziti na 3 osnovna naina:

a) mehanikidodirom biljaka, oruem i namjerno sokom zaraene biljke (Slika 11) b) vektorom ivotinjskm (insekti, nematode, grinje), gljivicama ili biljnim organizmima (parazitske

cvjetnjae) c) vegetativnim umnoavanjem, cijepljenjem, sjemenom i peludom, dodirom korijena...

Prijenos virusa vektorima a) Prijenos gljivama- fungihorija

Ovim se nainom prenosi tridesetak virusa. Neki od ovih virusa prenose se unutar stanica gljivice, dok se neki

nalaze na povrini trajnih spora ili zoospora. Nakon gljivine infekcija biljke moe doi do karakteristinih simptoma viroze.8

Vektor

Primjer Chytridiales, Olpidium spp. Olpidium brassicae-virus nekroze

duhana i njegov satelitni virus Plasmodiophorales, Polymyxa spp. i Spongospora spp.

Polymyxa betae- virus rizomanije eerna repa

b) Prijenos obliima (nematodama)- nematohorija Oko dvadeset biljnih virusa prenose tri roda ektoparazitskih nematoda. Virusi se ne mogu prenijeti preko stadija jaja. Oblii su kao vektori osobito opasni u trajnim nasadima (vinogradi i vonjaci).

Vektor Tip virusa Primjer Trichodorus spp. Tobravirusi v. utavosti duhana Xiphinema spp. Nepovirusi v. prstenaste pjegavosti duhana i

v. prstenaste pjegavosti rajice Longidorus spp. Nepovirusi v. crnih prstenova rajice

6 Prema Jureti, N (2002). Osnove biljne virilogije, str. 187 7 Kod bakteriofaga ovaj tip infekcije zovemo lizogeni 8 Agrios, G (2004). Plant Pathology 5th edition, str. 743

14

c) Prijenos kukcima- entomohorija Kukci su najznaajniji vektori virusa. Oko 93% svih animalnih virusnih vektora predstavljaju kukci. Vie od 70%

kukaca koji prenose biljne viruse pripada redu jednakokrilaca (Homoptera) u kojem je porodica lisnih ui

(Aphididae) koje su najznaajniji prenosioci biljnih virusa. Najznaajnije skupine kukaca vektora virusa:

red jednakokrilci (Homopteraporodica

) lisne ui (Aphididaecvrci (Cicadellidae i Delphacidae)

)

red kornjai (Coleoptera) i red resiari (Thysanoptera)

Kod perzistentnog naina prijenosa biljnih virusa lisnim uima vrijeme akvizicije9 je due a vrijeme latencije10

iznosi od vie sati do nekoliko dana.

Kod neperzistentnog naina prijenosa biljnih virusa lisnim uima, vrijeme akvizicije je kratko a presvlaenjem lisne ui najee gube sposobnost prijenosa virusa (retencija11 je kratka).

Semiperzistentan prijenos: neperzistentan je po tome to virus ne cirkulira unutar vektora, no retencija je ipak

duga (3-4 mjeseca).

Suzbijanje se preporuuje kod perzistentnih vektora, odnosno virusa.

Obzirom na mogunost umnoavanja virusa u kukcu razlikujemo cirkulativni prijenos (virus se usie i ponovo izluuje slinom), propagativni (isto kao cirk., ali se virus jo i umnoava u vektoru) i transovarijalni prijenos

(virus se prenosi i na jaja vektora).

d) od ostalih naina prijenosa treba osobitu pozornost obratiti na mogunost prijenosa vegetativnim razmnoavanjem (gomoljima, lukovicama...) i cijepljenjem. Sjemenom se prenosi stotinjak virusa.

9 Vrijeme sisanja insekta na biljci potrebno da primi virusne estice 10 Razdoblje tijekom kojeg kukac ne moe prenijeti virus na biljku 11 Vremenski period tijekom kojega je vektor sposoban inficirati novog domaina

Glavne karakteristike neperzistentnogi perzistentnognaina prijenosa virusa lisnim uima

neperzistentni perzistentni

smjetaj virusa u biljci epiderma provodno stanije akvizicija kratka duga

gladovanje prije akvizicije utjee ne utjee latencija kratka duga

inokulacija kratka duga retencija kratka duga

15

Nastanak infekcije i fiziologija inficiranih biljaka

Biljni virusi mogu ui u stanice kroz rane nastale mehanikim oteenjima (u prirodi kroz ranice na vanjskoj

stijenci epidermalnih stanica ili kroz ektodezmije12), vektorima ili preko inficiranog sjemena. Proces ulaska virusa u biljne stanice nazivamo

Virusi se mogu iriti unutar biljke na dva osnovna naina:

inokulacija.

a. meustanino - strujanjem plazme putem plazmodezmija b. provodnim elementima - najpodesniji je floem, ali moe i ksilem. Veina biljnih virusa

najee se ne umnoava u provodnim elementima. To je bri nain irenja.

U stanicama parenhima lista, virus se kree brzinom od 1 mm, odnosno 8-10 stanica po danu.

Ovisno o kompatibilnom ili inkompatibilnom odnosu izmeu patogena i domaina razlikujemo lokalnu i

sisteminu zarazu. Lokalna - virusne estice ire se samo u odreeni broj stanica u blizini inficirane stanice (zbog hipersenzitivnosti13

domaina). Najee se pojavljuju male smee nekrotizirane tokice. Sistemina - virus se nesmetano umnoava i iri po cijelom biljnom organizmu.

Slika 8: irenje virusa u biljci nakon mehanike inokulacije

12Ektodezmije su pore na kutikuli, analogne plazmodezmijama 13 Hipersenzitivnost ili preosjetljivost: tkivo u kojem je dolo do prvotne infekcije vrlo brzo ugine

16

Unato sisteminoj zarazi, ipak postoje biljni dijelovi koji najee nisu zaraeni (meritum i sjeme). Meristem se koristi u. kulturi meristema za dobivanje biljaka osloboenih od virusa.14

Fizioloke promjene na inficiranoj biljci

Meristem je tkivo koje intenzivno raste pa postoji jaka konkurencija izmeu same biljne stanice i virusa za sve prekursore potrebne za umnoavanje. Meristem, takoer, nema provodnog stanija to onemoguuje dolazak virusa u meristem iz drugih dijelova biljnog organizma.

Sama prisutnost virusne nukleinske kiseline u biljci, ili pak virusa, ak i u velikoj koliini ne uzrokuje uvijek simptome zaraze. Tako, na primjer, neke biljke mogu sadravati puno vie koncentracije virusa od drugih, a pokazivati slabije izraene simptome ili ak biti bez izraenih simptoma. Ovo pokazuje da nije nedostatak hranjiva (gradivnih metabolita) nastao sintezom virusa glavni uzronik promjena na inficiranoj biljci nego je rije

o neizravnom utjecaju metabolita nastalih djelovanjem virusa (npr. enzima) na metabolizam domaina.15

Inficirane biljke pokazuju sljedee fizioloke promjene (razliitog intenziteta):

a) smanjenu fotosintezu b) smanjenu sintezu proteina i c) pojaano disanje (najjae u fazi promjene simptoma)

Promjene koje nastaju virusnim infekcijama u konanici uzrokuju tete u uzgoju bilja. Virusi tako utjeu na koliinu i na kakvou uroda. Ne postoje toni podaci o tetama koje uzrokuju virusi, no oni su svakako najznaajniji uzronici biljnih bolesti nakon gljivica. Vei je problem na viegodinjim kulturama jer jednom inficirane, ostaju trajno zaraene, a simptomi ovise od godine do godine. Ako su simptomi izrazito jaki,

napadnuta stabla se odstranjuju. Intenzitet pojave viroza na jednogodinjim kulturama ovisi o postotku

zaraenog sjemena i veliini populacije vektora koji prenosi virus. Osobito velika opasnost od irenja virusa

prijeti kod vegetativnog razmnoavanja jer e cjelokupno potomstvo (klonovi) zaraene biljke takoer biti zaraeno.

Dakle, tete od biljnih virusa mogu biti: a) kvantitativne- smanjen prinos (prirod) b) kvalitativne- smanjena kakvoa proizvoda. Npr: eerna repa zaraena rizomanijom daje manje eera

14 Kolokvijalno se esto koristi naziv virus free, ili VF-biljke 15 Agrios, G (2004). Plant Pathology 5th edition, str. 737

17

Simptomi Promjene do kojih dolazi u zaraenim biljkama mogu se oitovati kao specifini znakovi infekcije, simptomi. Skup svih simptoma jedne bolesti nazivamo sindromom. Ako su simptomi za neki virus dovoljno specifini,

mogu posluiti kao prvi korak u njegovoj identifikaciji. Gotovo sve virusne bolesti uzrokuju u odreenoj mjeri

pojavu patuljavosti ili prestanka rasta i smanjenje prinosa. Takoer, inficirane biljke obino ive krae, iako

virusne bolesti rijetko kada brzo ubijaju biljke.

Vanjski (vidljivi) simptomi viroza: a) lokalni simptomi (esto su primarni) klorotine lokalne lezije nekrotine lokalne lezije prstenaste lokalne lezije (klorotini ili nekrotini prsten unutar kojega je normalno zeleno tkivo)

b) sistemini simptomi (esto su sekundarni) (Slike 9 i 10) prosvjetljavanje nervature (ok simptomi) iaranost : mozaik - granice su esto otre

arenilo utica pjege prstenasta pjegavost

poremeaji u rastu: kovranje - abnormalan rast parenhima izmeu nervature mjehuravost - abnorm. rast i parenhima i nervature nitavost (perunavost) lista - lisno tkivo raste samo u uskom pojasu uz ile (neki sojevi CMV na rajici; x-virus krumpira na rajici) enacije - izrasline na naliju lista uz ile tumori skraivanje internodija

nekroze arenilo cvijeta (tulipan) zastoj u rastu (patuljavost, krljavost)

c) latentne zaraze - neke biljke, iako sistemino zaraene virusom, ne pokazuju simptome (skrivene

zaraze). Ova pojava je vana u proizvodnji viegodinjih vrsta.

d) fitocidne zaraze - smrtonosne, ali vrlo rijetke. Npr. u dolini Neretve 90-ih godina se pojavila epidemija bolesti letalnih nekroza rajice (virus mozaika krastavca sa pridruenom satelitnom nekrogenom RNA).

Unutarnji simptomi predstavljaju promjene nastale u tkivu biljke. Najznaajnije su nakupine virusa koje

nazivamo virusne stanine uklopine ili inkluzije. Inkluzije mogu biti amorfne i kristaline.

18

Slika 9: prikaz nekih sisteminih simptoma

Slika 10: ostali sistemini simptomi

19

Dokazivanje , identifikacija i suzbijanje virusa

Dokazivanje i identifikacija Dokazivanju virusa pristupamo ako biljka pokazuje simptome napada (a elimo dokazati da je inficirana),ako

elimo proizvesti biljke osloboene od virusa ili iz bilo kojeg drugog razloga provjeriti da li je biljka inficirana.

U veini pokusa s virusima koriste se i pokusne biljke koje slue za razmnoavanje virusa, istraivanje kruga

domaina i vladanja virusa in vivo.

Dokazivanje virusa moemo vriti: 1) biotestovima 2) metodama bojanja 3) serolokim metodama 4) molekularnim metodama 5) elektronskom mikroskopijom 6) elektroforezom 7) utvrivanjem prisutnosti dlRNA

1) dokazivanje biotestovima koristi indikatorske biljke, odnosno biljke koje reagiraju specifinim

simptomima kako bi se barem priblino mogao identificirati virus. Pokusne biljke mogu se upotrebljavati i za odravanje virusa u kulturi. Dva su tipa biotestova: a) mehanika inokulacija koja se koristi na zeljastim biljkama (Slika 11). Inokulum, odnosno biljni sok

iz zaraenog biljnog organa (ili vie organ, tada se uzorak prvo homognizira) priprema se s

puferom ili vodom. List pokusne biljke se oteuje abrazivom (silicijevim karbidom) i zaraava

Slika 11: mehaniki prijenos biljnih virusa koristi se za dokazivanje virusa biotestovima

20

b) indeksiranje je metoda koja se koristi na drvenastim biljkama. Virus se na zdrave domaine prenosi cijepljenjem. Simptomima treba puno vremena da se razviju (vie mjeseci ili godina).

2) dokazivanje virusa metodama bojanja moe se primjeniti kao nespecifian test na gomoljima

krumpira. Bojanjem rezorcin-modrilom utvruju se posljedice zaraze virusima. Kalusna tkiva koja nastaju uslijed infekcije boje se plavo.

3) seroloke metode su najvanije i najupotrebljavanije metode dokazivanja i identifikacije virusa. Ovim metodama se mogu identificirati pojedini virusi, virusni sojevi, ali i bakterije. Zasnivaju se na reakciji koju antigen (bilo koji strani protein kao, na primjer virusni protein) pobuuje u sisavcu ili ptici. Ovi organizmi na antigene reagiraju stvaranjem antitijela

. Kako antitijelo reagira na specifinu toku raspoznavanja na antigenu, a virus ima nekoliko ovakvih toaka, u organizmu nastaje mjeavina antitijela. Ovakva antitijela zovemo poliklonska antitijela, a njihov serum poliklonski antiserum. Za preciznije utvrivanje serolokih razlika danas se koriste monoklonski antiserumi (posjeduju

specifinost samo za jedno mjesto na antigenu).

Slika 12: priprema antiseruma

Najee koritene seroloke metode su metode imunodifuzije i seroloka analiza pomou vezanog enzima

(ELISA). Postoje jednostruka i dvostruka radijalna imunodifuzija u agarskom gelu.

a) dvostruka radijalna imunodifuzija (Slika 13) u agarskom gelu DRID; provodi se tako da se tekui agar razlije po stakalcu (dovoljno je mikroskopsko predmetno stakalce). Nakon to se agar ukruti, u njemu

treba napraviti dvije udubine udaljene 4-5 milimetara. U jednu se stavlja serum, a u drugu virusni uzorak.16 Virusi i antitijela difundiraju u agaru. Kada se sretnu kompatibilna

vie udubina. U sredinju ide serum, a u ostale virusni uzorci.

antitijela i antigeni, veu se i dolazi do stvaranja imunoprecipitacijske linije. eli li se ispitati vie uzoraka, potrebno je nainiti

16 Moe se upotrijebiti sirovi ili proien biljni sok, ili pak purificirani virus.

Slika 13: DRID, As = antiserum

21

b) jednostruka radijalna imunodifuzija u agarskom gelu JRID; razlikuje se od DRIDa po tome to se antitijela nalaze u gelu. Antiserum se dodaje u ohlaeni, ali jo tekui agar. Nakon to se agar ukruti, u

njemu treba napraviti udubinu u koju se stavlja virusni uzorak. Nastale precipitacijske linije su u obliku kruga. Ova metoda je bra i deset puta osjetljivija od DRIDa. Rezultati se vide za 30-60 min.

c) seroloka analiza pomou vezanog enzima ELISA

(od eng. enzyme-linked immunosorbent assay). Postoji nekoliko verzija ove metode. Najee se koristi dvostruka protutijelna sendvi-metoda, odnosno DAS- ELISA (od eng. double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay). Provodi se u mikrotitarskim ploicama od polistirena.

Slika 14: shematski prikaz metode ELISA

Prvo se u bazen ulijeva otopina antitijela (Slika

14, A). Ostavlja ih se da inkubiraju. Antitijela se veu za stijenke bazena. Slijedi ispiranje ploice (da se ukloni viak antitijela). Dodaju se virusni uzorci. Virusi se veu s antitijelima (Slika 14, B). Ponovo se provodi ispiranje (ispiru se nevezani virusi). Dodaju se antitijela s enzimima (Slika 14, C). Ispiranjem se odstranjuju nevezana antitijela. Naposlijetku se dodaje enzimatski supstrat

i dolazi do promjene boje. Sama promjena boje moe se

utvrditi vizualno ili se intenzitet promjene boje

moe utvrditi kalorimetrijski.

ELISA daje kvalitativne i kvantitativne podatke o virusu i omoguuje provjeru velikog broja uzoraka.

Slika 15: rezultat metode ELISA

22

4) od molekularnih ili genetikih metoda dokazivanja virusa koriste se: 1) lanana reakcija polimerazom- PCR

Koraci u PCRu:

(eng. polymerase chain reaction). PCR je cikliki proces umnoavanja molekule DNA. Broj dobivenih DNA se uveava geometrijskom progresijom, a ciklus se ponavlja

nekoliko desetaka puta (obino 30-40).

1. denaturacija:dvostruka molekula DNA se denaturira visokom temperaturom

30 sek. na 94C

2. sparivanje: poetnice nalijeu na 3' krajeva ciljanog segmenta DNA

30 sek. na 55C

3. ekstenzija: DNA polimeraza katalizira produkciju novih komplementarnih lanaca

90 sek. na 72C

Komponente potrebne za PCR:

DNA koja slui kao predloak (nekoliko ng) dvije razliite poetnice (primera)17

etiri razliita deoksiribonukleozid trifosfata (dNTP, N= A, T , C, G)

Taq polimeraza (DNA polimeraza dobivena iz bakterije Thermus aquaticus otporna na visoke temperature)

pufer u kojem se odvije reakcija i kofaktor za polimerazu (Mg2+)

Budui da su potrebne specifine poetnice za svaku molekulu DNA, potrebno je znati ili o kojoj se molekuli

radi, ili izvriti DNA- sekvencioniranje.18

Kako je veina biljnih virusa (+)jlRNA tipa, a PCR se moe provoditi samo za molekule DNA, za takve je viruse

potrebno prvo izvriti reverznu transkripciju molekule RNA u molekulu DNA.

Poetnice se mogu nabaviti (kupiti) ili sintetizirati.

Plateau-efekt

(1) iscrpljivanja supstrata (dNTP i klica),

javlja se tijekom kasnih ciklusa PCR-reakcije. Brzina akumulacije produkta pada ispod teoretskog maksimuma zbog:

(2) nedostupnosti aktivnog mjesta na enzimu, (3) nestabilnosti enzima ili supstrata, (4) inhibicije konanim produktom (5) kompeticije nespecifinih produkata (dimeri klica) (6) nepotpune denaturacije pri visokoj koncentraciji produkta

Problemi koji mogu nastati u PCR-reakciji

kontaminacije: prisutnost i najmanje koliine nepoeljne DNA moe uzrokovati probleme. Izvori DNA i nukleaza: ruke, odjea, izluine tijela (slina, znoj), laboratorijsko posue (pipete, epruvete), itd.

nespecifina amplifikacija nema amplifikacije (DNA je prljava, klice nisu optimalne, reagensi su loi ili uniteni) koritenje pogrene temperature u fazi sparivanja

17 DNA sekvence koje su komplementarne regijama na 5 i 3kraju dijela DNA koji nas zanima 18 Potrebno je znati sekvencu od oko 20 nukleotida na krajevina DNA fragmenta koji elimo sekvencionirati

Slika 16: termocikler, aparat u kojem se odvija PCR

23

Tehnika PCR se moe upotrijebiti za kloniranje ciljanih nukleinskih sekvenci,

detekciju sekvenci (dijagnostika u fitopatologiji), sekvencioniranje genoma...

Kada imamo dovoljnu koliinu DNA, mogue je izvriti identifikaciju elektroforezom (Slika 17).

Elektroforeza na gelu: nakon bojanja etidijevim bromidom gel se pregledava na UV-svjetlu pri emu se vide nukleinske kiseline, pa tako i produkti umnoavanja tj. PCR-reakcije. Mogu se vidjeti nespecifini produkti umnoavanja. Dimeri klica brzo putuju pa se nalaze na dnu gela1.

2) Druga molekularna metoda koja se koristi je hibridizacija nukleinskih kiselina

. Ovom metodom mogue je otkriti i identificirati cijeli genom virusa ili samo njegov dio. Upotrebljiva je za RNA-viruse, DNA-viruse i viroide. Prvi korak je da se na temelju virusne nukleinse kiseline izradi komplementarna DNA (cDNA) koja se obiljeava tricijem 3H ili radioaktivnim fosforom 32P i dodaje se virusnim uzorcima gdje dolazi do vezanja.

U praksi se kupuju gotove cDNA-probe koje omoguuju vrlo brzo analiziranje velikog broja uzoraka.

5) Elektronska mikroskopija vie se koristi u istraivake svrhe nego u dijagnostici. Daje podatke o izgledu virusnih estica.

6) Elektroforetska istraivanja virusa (Slike 17 i 18): sve elektroforetske metode temelje se na kretanju

elektrino nabijenih estica u istosmjernom

elektrinom polju prema jednoj od elektroda. Virusi se zbog kapside u elektroforezi ponaaju kao

bjelanevine. Kreu se u elektrinom polju jer su molekule bjelanevina u suspenziji odreene pH-vrijednosti elektriki nabijene. Nakon elektroforetskog

putovanja virusi se bojaju i oitavaju se rezultati.

Metoda je dobra za identifikaciju virusa i otkrivanje mijeanih infekcija. Slui i za odvajanje virusnih

proteina i nukleinskih kiselina.

7) Utvrivanje prisutnosti dlRNA odnosno replikativne forme (v. str. 11) koristi se iskljuivo kod virusa iji je genom (+)jlRNA. Ovi virusi tijekom svog umnaanja produciraju replikativne forme koje nemaju

utvrenu bioloku ulogu, no dlRNA je stabilnija i lake ju je izolirati. Nakon izolacije (purifikacije)vri se elektroforetska analiza dlRNA. Usporedbom elektroforograma s podacima iz literature dobiva se

nepogreiva dijagnoza bolesti. Metoda je naroito pogodna za multikomponentne viruse.

Slika 18: ureaj za elektroforezu

Slika 17: agarozni gel obojan etidijevim bromidom

24

Suzbijanje virusa Da bi se suzbila neka virusna bolest, odnosno odluilo koje e se metode suzbijanja virusa upotrijebiti, potrebnoje poznavati ekologiju uzronika, kao i epidemiologiju same bolesti. Najvaniji, i meudjelovanjem povezani,

imbenici koji utjeu na irenje virusnih bolesti su:

a) izvori virusne infekcije kultivirane biljke u usjevu korovne biljke u usjevu divlja vegetacija u okolici prezimljeni vektori ostalo: zemlja, voda, ovjek (orue, plodored...)

b) svojstva virusa i prisutnost sojeva c) prijenos vektorima d) svojstva biljke domaina (genotip, starost...) e) ekoloki uvjeti- utjeu na sve imbenike u irenju biljnih bolesti

Metode suzbijanja virusa dijelimo na preventivne, kojima spreavamo zarazu i kurativne, kojima kojima

nastojimo eliminirati virus iz biljke, odnosno ublaiti uinak bolesti. U proizvodnoj praksi upotrebljavamo

preventivne mjere. Kurativne su, za sada neuinkovite (primjena kemijskih sredstava)19

ili nepraktine (djelovanje povienom temperaturom).

a) preventivne mjere obuhvaaju:

proizvodnju zdravog sadnog i sjemenog materijala spreavanje naknadnih zaraza tog materijala koritenje bezvirusnih biljaka, odnosno biljaka osloboenih od virusa (udomaen je naziv VF-

biljke od eng. virus free). Komercijalno dobavljive bezvirusne biljke su virusno provjerene

biljke (eng. virus tested) to znai da je biljka osloboena odreenog virusa. To ne znai da

ista biljka nema virus ija se nazonos nije niti pokuala utvrditi.

kontrolu vektora i domaina virusa dobru agrotehniku tla (sklanjanje biljnih ostataka, obrada) dezinfekciju alata izbor parcele pri sjetvi vegetativnu zatitu kod koje vegetativna podloga pozitivno djeluje na ozdravljenje virotine

plemke. Npr. arka ljive na podlozi Prunus mahaleb

izazivanje premuniteta namjernim izazivanjem blage virusne infekcije kako bi se biljka zatitila od napada agresivnijeg soja virusa. Npr. zatita rajice u Kini

karantensku slubu. Vanjsku i unutarnju. (v. dodatak na kraju skripte) koritenje sorata otpornih na viruse20

Veliku mogunost spreavanju virusnih infekcija prua stvaranje otpornih transgenetikih biljaka. Jo uvijek ne

postoje komercijalno razvijene ovakve biljke.

19 Protuvirusna kemijska sredstva su fitotoksina. Kako virus koristi za svoje umnoavanje metabolizam domaina, protuvirusno djelovanje ubija i stanicu(e) domaina. 20 Za vie informacija pogledati: Jureti, N (2002). Osnove biljne virilogije, str. 217

25

b) kurativne mjere: koritenje protuvirusnih kemijskih spojeva. Jo ne postoje kemijski spojevi koji bi uspjeno otklonili

viruse iz biljaka. Ribovirin konkurira virusnoj bazi i nakon ugradnje zaustavlja sintezu nukleinske kiseline. Ovaj spoj teti i biljci domainu. Neki fungicidi smanjuju simptome viroza tako to spreavaju raspadanje kloroplasta.

toplinski postupak. Ova metoda uspjeno eliminira samo neke viruse (uglavnom izometrine) i mikoplazme

. Primjenjena temperatura ovisi o mogunosti preivljavanja biljke i osjetljivosti virusa. Ako su biljke nieg habitusa (ili mlade i jo malene, mogue ih je vijele podvrgnuti termoterapiji. Kod

drvenastih kultura esto se najprije plemka cijepi na mladu podlogu, potom tretira temperaturom 37-38C oko mjesec dana nakon ega se izolira pup (potencijalno osloboen virusa) i cijepi na bezvirusnu

podlogu. Kod tretmana cijelih biljaka nee se cijela biljka osloboditi virusa, nego najee samo pupovi.

Primjer: izoliramo vegetacijski vrak vinove loze (ne sam meristem jer nebi preivio) i

tretiramo ga in vitro21

s 35C 20ak dana. Nakon toga ga razmnoavamo mikropropagacijom.

kultura meristema. Jo 30-ih godina prolog stoljea uoeno je da se koncentracija virusnih estica smanjuje prema vrku korijena ili prema vegetativnom vrku, a da sam meristem nema virusa. Kasnije

je utvreno da meristem ponekad ipak moe sadravati viruse. Ovo

se svojstvo meristema koristi za oslobaanje biljaka od virusa. U meristemu nema virusa zbog odsutnosti provodnih elemenata kao i

plazmodezmi. Takoer, smatra se i da postoji kompeticija virusnih

estica i meristemskih stanica u stvaranju nukleinskih kiselina na

tetu virusa. Postoji i mogunost postojanja prirodnih inhibitora

umnoavanja virusa. Toan uzrok ovoj pojavi jo nije poznat.

Postupak se zasniva na kulturi vegetacijskog vrka najmanjih moguih

dimenzija koje mogu rasti u kulturi i davati izdanak.

Slika 20: shematski prikaz koraka u proizvodnji bezvirusnih biljaka

21 Biljke in vivo ne bi preivjele ovu temperaturu.

virusom inficirana biljka (toplinski

postupak)

kultura meristema (testiranje na

viruse)

prijenos biljaka u zemlju (testiranje

na viruse)

matinjak- elitne bezvirusne

matine biljke

daljnje razmnoavanje

bezvirusnih biljaka

Slika 19: kultura meristema

26

toplinski postupak i kultura meristema. Najee se upotrebljava kod mijeanih

infekcija.

mikrocijepljenje. Ovo je postupak cijepljenja meristema na zdrav klijanac in

vitro. Metoda je vana za drvenaste kulture

(citruse, vinovu lozu, jabuku, kruku...)

Mikrocijepljenje se provodi i in vivo u proizvodnji sadnica jabuka.

Biljke osloboene od virusa kadkada se fenotipski

razlikuju od zaraenih. Do ove pojave dolazi ili zbog

eliminacije virusa ili zbog mikromutacija nastalih

samim postupkom oslobaanja. Za mnoge zeljaste vrste za oslobaanje od virusa koriste se metode uzgoja u kulturi biljnog tkiva. (v. skriptu iz

Osnova biljne biotehnologije)

Subviralni patogeni

Subviralni patogeni su virusni sateliti i viroidi.

Satelitni virusi kodiraju proteine svog omotaa, ali ne repliciraju se sami. Mala ovisna virusna estica je satelitni virus npr. nekroza duhana.Veliki virus se naziva virus pomaga

npr. satelitni virus virusa nekroze duhana

.

Satelitne RNA

npr. satRNA virusa mozaika krastavca

su linearne RNA molekulekoje ne kodiraju proteine omotaa i ne mogu formirati svoj omota, upakiravaju se u kapside svojih virusa pomagaa, ne mogu se niti samostalno replicirati. Dolaze u sklopu drugih virusa, a mogu modificirati simptome virusnih zaraza (najee umanjuju jainu simptoma).

Viroidi

Prvi otkriveni viroid je viroid vretenastog gomolja krumpira (Potato Spindle Tuber Viroid, PSTV).

su samostalne, infektivne, krune (prstenaste) molekule RNA. U prirodi podsjeaju na tapie. Nukleotidi se u takvim molekulama veinom sparuju zbog komplementarnosti (>50%) veui se vodikovim vezama (nisu kovalentne!) kao u dvo lananoj DNA. Kada se viroidi postupno podvrgnu temperaturi od 60-90C te se veze kidaju, a denaturirana (razmotana) viroidna RNA je prsten. Inae, RNA je vrlo nestabilna, ali s velikim postotkom sparenih nukleotida je vrlo stabilna. Viroidi su oko 30 puta manji od najmanjeg virusnog genoma. Ovi tapii su jo i dodatno uvijeni u trodimenzionalnu strukturu. Ranije su simptomi viroida pripisivani virusima jer su dosta slini.

Na vinovoj lozi takoer dolaze viroidi. Oni uzrokuju diskretne simptome, klorotine prstenie. Neki istraivai tvrde da vina proizvedena od groa s tih trsova imaju poseban bouquet. Za sada na lozi uzrokuju samo manje tete.

Razlike viroida u odnosu na satelitsku RNA: viroidi su sasvim samostalni patogeni. Oni ne trebaju pomo virusa pomagaa, dok je satRNA trebaju.

Slika 21: rast jabuke nakon mikrocijepljenja

27

Specijalna virologija

uta patuljavost jema

PATOGEN: Virus ute patuljavost i jema, BYDV (Barley yellow dwarf virus) (+)jlRNA izometrini virus (IV skupina po Baltimoreu) DOMAINI: virus napada oko sto vrsta porodice trava (Poaceae) , a meu njima su jeam, penica, zob, ra, tritikale, kukuruz i mnogi travnati korovi. SIMPTOMI: Simptomi ute patuljavosti jema ovise o domainu,

razvojnoj fazi inficirane biljke, uvjetima okoline (temperatura, svjetlo) i

virulentnosti soja virusa. Tipini znaci bolesti su zastoj u rastu

(patuljavost) i promjena boje listova. Sline simptome mogu izazvati i abiotski faktori (niske temperature, viak ili manjak vode u tlu),

nedostatak hranjiva (N i S) i oteenja od herbicida. Na pojavu bolesti

povoljno djeluju temperature 10-18C. Pri niim temperaturama uz manjak sunevog svjetla (oblano), kao i pri temperaturapa preko 30C

simptomi vezani uz promjenu boje nestaju.

Simptomi na jemu (Slika 22): Dolazi do zastoja u rastu, a listovi poprimaju zlatnoutu boju uz pojavu gljiva aavica. Poetno uenje javlja se na vrhovima listova irei se prema osnovi plojke. Ako je zaraza nastupila u jesen, mlado lie uz promjenu boje postaje deblje, vre i stoji uspravno. Rano zaraene biljke obino ne klasaju ili su im klasvi manji, esto sterilni. Rast korijena je slab. Promjene mogu zahvatiti pojedine skupine biljaka, a pri jakom napadu, itavo polje moe biti zaraeno.

Simptomi na penici (Slika 23): Poetni znak bolesti je uenje listova, koji kasnije poprime crvenkastu boju. Pri zarazama u ranim fazama razvoja, biljke dostiu samo treinu do polovine svoje normalne visine. U tim sluajevima klasanje je rijetko, a prinosi zrna su bitno smanjeni. Ako zaraza nastupi kasnije, simptomi su blai, vide se klorotine pruge izmeu ila srednjih listova, a gornji listovi pocrvene.

Simptomi na kukuruzu (Slika 24):

Simptomi se javljaju na donjim listovima koji postaju tamnocrveni do ljubiasti poeci od vrha ili ruba plojke.

Promjena boje postupno zahvaa i gornje listove.

Simptomi na zobi (Slika 24): Prvo se na vrhu plojke javljaju nejasne utozelene pjege, nakon ega lie dobiva uspravan sabljast poloaj i mijenja boju.

Obino dolazi do sterilnosti metlice, a posljedica je znatno

smanjenje uroda. Kod kasne infekcije oboljeli listovi imaju

crvenilo na rubu plojke, a gubici uroda su proporcionalno

manji.

Slika 22: simptomi na jemu

Slika 23: simptomi na penici

Slika 24: simptomi na kukuruzu i zobi

28

IZVOR ZARAZE I NAIN PRENOENJA BOLESTI: Najvaniji izvor zaraze su viegodinji travni korovi. Uz trave vaan domain je i kukuruz koji ljeti predstavlja most za prijenos ovog virusa izmeu etve i sjetve ozimih itarica. Uzronika (virus) prenose lisne ui (Rhophalosiphum padi, Rhophalosiphum maidis, Sitobion avenae, Schizaphis graminum). Prijenos je perzistentan. Kod ozimih usjeva najvee su tete kod jesenske zaraze. Bolest se ne prenosi mehaniki (dodirom biljaka), a nije sigurno prenosi li se sjemenom. SUZBIJANJE BOLESTI:

Neizravne mjere: Otpornih sorata na ovu bolest na naem tritu nema. Preporua se kasnija jesenska

i ranija proljetna sjetva. Jarine treba sijati dalje od ozimih usjeva. Ne pretjerivati s duinom gnojidbom. Nuno je suzbijati korove koji su mogui izvor zaraze.

Izravne mjere: od nicanja svaki tjedan treba pratiti pojavu lisnih ui. U sluaju jaeg napada (obino u fazi 2 do 4 lista) provesti zatitu sredstvima koja imaju dozvolu u RH za tu namjenu, kao npr: Beta- Baythroid EC 025, Chromgor 40, Decis, Direkt 10 SC, Dursban E 48, Enduro 258 EC, Fastac 10 SC, Hostaquick EC 50, Karate Zeon, Metasystox EC 250, Pirifos EC, Pirimor 50 WG, Radotion E-50, Rogor 40. Prednost imaju insekticidi sa sisteminim i brzim inicijalnim djelovanjem.

Rizomanija

PATOGEN: virus nekrotinog uenja listova eerne repe, BNYVV (Beet necrotic yellow vein virus) 4 (+)jlRNA tapiasti virus (multikomponentni virus od 4 estice) (IV skupina po Baltimoreu) Najvea koncentracija virusa je u korjenovim dlaicama i tankim korjeniima. Virus se rijetko nalazi u

nadzemnim organima biljke i nije naen u sjemenkama. Virus se najake detektira testom ELISA u homogenatu korijena. DOMAINI: sve kultivirane forme vrste Beta vulgaris (repa, eerna repa...) i pinat. Nije pronaeno da su korovi na

poljima zaraeni ovim virusom iako se lobodnjae njime

mogu zaraziti mehanikim putem.

SIMPTOMI: koji mogu uputiti na rizomaniju su proliferacija lateralnih korjenia (bradatost korijena), gubitak turgora,

zaostatak u porastu korijena, uspravno i svijetlo lie te potamnjeli provodni snopovi na presjeku korijena. Iako virus uzronik rizomanije nosi naziv virus nekrotinog utila ila eerne repe, simptome nekrotinog utila na ilama zaraenih listova u praksi je teko uoiti. Simpromi se po polju javljaju lokalno, po aritima (fokusi). Ponekad se, iako rijetko (zabiljeeno je u Japanu i po tome je bolest i dobila ime) nakon uenja razvijaju nekroze du

provodnih ila. Gdje god je prisutna, rizomanija uzrokuje znaajne gugitke prinosa za ak 50-70% teine korijena i za 2-4% sadraja eera.

Slika 25: utjecaj roka sjetve na pojavu bolesti

Slika 26: simptomi rizomanije

29

IZVOR ZARAZE I NAIN PRENOENJA BOLESTI: Prenosi se putem gljivice Polymyxa betae koja parazitira na korijenu lobodnjaa kojih gotovo uvijek ima na poljima eerne repe. Virus je pronaen u zoosporama ove gljive. Bolesti pogoduju vlana, neutralna do blago lunata tla te niska podruja. EPIDEMIOLOGIJA: Naena je 50-ih godina prolog stoljea u Italiji. 70-ih i 80-ih ova bolest se proirila u niz zemalja srednje i istone Europe. Sporadino se javlja i u Hrvatskoj te u veini zemalja u kojima se uzgaja eerna repa. Ima je i u S. Americi i Aziji. Nalazi se na EPPO A2 karantenskoj listi.

SUZBIJANJE BOLESTI: Kemijsko suzbijanje vektora metil bromidom je ili preskupo ili nedjelotvorno , a i otrovno je.Potrebno je koristiti nove, barem djelomino otporne sorte (imaju gubitke manje do 15% na jako inficiranim

tlima). Vano je i sprijeiti prijenos tla s polja sa zarazom.

arka ljive

PATOGEN: virus arke ljive, PPV (Plum pox potyvirus, Sharka virus) (+)jlRNA nitasti virus (IV skupina po Baltimoreu) U citoplazmi stanica zaraenih listova pregledom elektronskim mikroskopom mogu se uoiti virusne uklopine

propelerskog tipa. Virus je vrlo postojan.

DOMAINI: vrlo irok krug domaina roda Prunus. Uz ljivu zaraava i marelicu i breskvu, ali i divlje vrste. Smatra se da trenja i vinja nisu dobri domaini ovom virusu.

SIMPTOMI (Slika 27): Simptomi se javljaju na listovima i plodovima. Na listovima se pojavljuju svijetle koncentrine pjege, a nervatura postaje svjetlija. Ako su oteenja velika, moe doi do defolijacije. Na plodu se

prvo razvijaju pjege, a kasnije se smeura i deformira. Meso ploda je tamno, a okus mu je gorak. Kotica

takoer ima svijetle prstene. Sastav tvari u takvim plodovima je takoer promijenjen, a cijeli plod je

nekvalitetan. Kod nekih sorti moe doi do otpadanja nezrelih plodova. Plodovi zaraenih marelica su esto deformirani. Inficirana ljiva sorte Bistrica pokazuje jake simptome. Na nekim drugim sortama simptomi se

javljaju samo na listovima. Ako se zaraena ljiva sorte Bistrica cijepi na crni trn (Prunus spinosa) dolazi do

povlaenja simptoma i oni su na kraju ublaeni (vegetativna zatita). Postoji vie sojeva ovog virusa. Jedna od najznaajnijih viroza uope. Gubici prinosa mogu biti i 100%.

IZVOR ZARAZE I NAIN PRENOENJA BOLESTI: Divlje vrste roda Prunus prirodan su izvor zaraze. Vektori su lisne ui. Prijenos je neperzistentan. Lako se prenosi i mehaniki, dok se sjemenom ne prenosi.

EPIDEMIOLOGIJA: Virus arke proirio se iz Bugarske. arka na bugarskom znai arenilo. Danas zadvaa dobar dio Europe i Mediterana, Indiju, ile i SAD.

SUZBIJANJE BOLESTI: Osnovna mjera zatite je koritenje zdravog (testiranog ) sadnog materijala, cjepnog materijala te suzbijanje lisnih uiju.

Razliite sorte su razliito otporne na ovaj virus. Tolerantna sorta je Stanley.

Nove metode dobivanja dobivanja otpornih sorti usmjerene su tehnologiji rekombinantne DNA (transgene

biljke). Takoer, vre se istraivanja izazivanja premuniteta namjernim izazivanjem virusne infekcije blagim

sojevima.

30

Slika 27: simptomi arke- A) mozaik na listovima ljive, B) svijetle koncentrine pjege i svjetlija nervatura, C) smeuranost ploda ljice, D i E) pjege na plodovima breskve, F) pjege i deformiranost ploda marelice i G) svijetli prsteni na koticama marelice

31

Mozaina bolest duhana

PATOGEN: virus mozaika duhana, TMV (Tobacco mosaic virus) (+)jlRNA tapiasti virus (IV skupina po Baltimoreu) Ovaj virus ima u biologiji vrlo velik znaaj jer su uz pomo njega obavljena mnoga velika otkria u strukturnoj

biologiji, virologiji kao i strukturi i funkciji genskog koda. Virus je vrlo stabilan i ima velik broj sojeva. U inficiranim stanicama mogu se nai virusne uklopine u obliku x-tijela, igliastih parakristala i pravih kristala oblika heksagonalne prizme. DOMAINI: Duhan i veina pomonica (Solanaceae), ali i krastavac, pinat i mnoge druge biljke.

SIMPTOMI: Na listovima bolesnih biljaka pojavljuje se izrazit mozaik. Ako se virus mehanikom inokulacijom prenese na listove duhana, na njima

se obino ne pojavljuju lokalne lezije. Samo se pri viim temperaturama i

jakom svjetlu pojavljuju na okuliranim listovima sitne klorotine pjege. Prvi simptomi sistemine infekcije su posvjetljavanje nervature na

najmlaim listovima. Ubrzo dolazi do pojave mozaika i lisne deformacije.

IZVOR ZARAZE I NAIN PRENOENJA BOLESTI: Ovaj virus nema vektore koji bi ga prenosili. Najvjerojatnije u biljku ulazi kroz rane na povrini, a

ne kroz ektodezmije. Sjemenom i peludom se slabo prenosi. Danas ga

najvie prenose ovjek i agrotehnika orua. Moe se prenositi i tlom

preko rana na korijenu.

SUZBIJANJE BOLESTI22

: u kontroli ovog virusa koristimo se agrotehnikim sanitarnim mjerama i upotrebom rezistentnih sorata. Pod agrotehnikim mjerama podrazumjeva se uklanjanje zaraenog biljnog materijala uz naknadno pranje ruku sapunom i izbjegavanje sjetve/sadnje kultura koje bi virus mogao napasti naredne dvije godine. Vre se istaivanja s koritenjem transgenih biljaka u borbi protiv

TMVa.

22 prema: Agrios, G (2004). Plant Pathology 5th edition, str. 758

Slika 28: simptomi mozaine bolesti duhana na biljci duhana

32

Mozaiana bolest krastavca

PATOGEN: virus mozaika krastavca, CMV (Cucumber mosaic virus) Multikomponentni virus. Ima tri molekule (+)jlRNA pakirane u tri estice iste veliine. Treoj estici je

pridruena je jo jedna malena, etvrta RNA. Dvije dulje molekule RNA kodiraju proteine za replikaciju RNA,

trea kodira protein zaduen za meustanino kretanje virusa, a etvrta, subgenomska, kodira kapsidu. U stanicama domaina moe formirati esterokutne inkluzije. CMV napada vie biljnih vrsta od bilo kojeg

drugog virusa. Ima oko 800 domaina. Uz papriku i rajicu, napada i krastavce, dinje, tikvice, pinat, repe,

krucifere... U povrtlarskoj proizvodnji najvee tete radi na paprici. Na rajici u plantanoj proizvodnji rijetko

kada je zaraeno preko 10% biljaka. Ovaj virus ima velik broj sojeva, a moe sadravati i satelitsku RNA koja

moe utjecati na tip i jainu simptoma na biljci domainu. Tako se u dolini Neretve devedesetih godina prolog stoljea pojavila epidemija bolesti letalnih nekroza rajice

SIMPTOMI(Slike 29 i 30): Na zaraenim biljkama javljaju se simptomi mozaika, patuljavog rasta, deformacije lista (nitavost) i deformacije ploda. Stupanj izraenosti simptoma ovisi o virulentnosti soja virusa, kultivaru,

stadiju razvoja napadnute biljke i uvjetima okoline.

koju je uzrokovao virus mozaika krastavca s pridruenom satelitnom nekrogenom RNA.

Na paprici se prvo pojavljuje blagi klorotini mozaik, a kasnije i izraene ute pjege. Mogua je i pojava nitavosti lista. Zbog

izoblienja cvjetova i sterilnosti polena dolazi do formiranja

malog broja plodova koji su izoblieni s estim nekrozama.

Mogua je i pojava nekrotinih crtica na stabljikama. Dolazi do patuljavog i metliavog rasta.

Na rajici

IZVOR ZARAZE I NAIN PRENOENJA BOLESTI: Virus mozaika krastavca najveim se dijelom iti lisnim uima i to

neperzistentnim prijenosom. Izvor virusa su korovne, ali i neke kultivirane vrste bilja koje rastu u blizini

uzgajalita. U odreenoj mjeri moe se prenositi i sjemenom (kod nekih vrsta biljaka). Mogue je i mehaniko

irenje do kojeg moe doi rukovanjem biljkama u rasadniku i na polju, a virus se prenosi zaostalim zaraenim biljnim ostacima u tlu.

(Slika 29)se u poetku zaraze javlja blagi mozaik na listovima koji prelazi u nitavost. Dolazi do promjena u rastu

biljke, a virulentni sojevi uzrokuju pojavu nekroza na stabljici i

du lisne nervature.

SUZBIJANJE BOLESTI: Suzbijanje je najbolje provoditi kombinacijom nekoliko mjera. Svakako se preporuuje

koritenje otpornih sorti. Za proizvodnju treba koristiti iskljuivo zdrav sadni materijal. Rasad i biljke u

zatvorenom prostoru proizvoditi na novom supstratu bez zaraenih bijnih ostataka. U rasadu i zatvorenom

prostoru unitavati sve zaraene biljke. Za proizvodnju u polju primjeniti plodored sa predkulturama koje nisu

osjetljive prema virusu (penica, jeam i dr.). Unitavanje korova u usjevima neophodna je mjera jer su neki od

njih mogui izvori zaraza. Kemijsko suzbijanje vektorskih ui moe biti korisna mjera samo kod uzgoja na

velikim povrinama, izoliranim od drugih osjetljivih usjeva. Mogue je i sprijeiti pristup uima koritenjem

prozirne folije.

Slika 29: lijevo- zdrav list rajice i desno- nitavost zaraenog lista

33

Slika 30: simptomi mozaine bolesti krastavca: A) i B) mozaik na listu paprike, C) patuljavost na paprici i D) mozaik na listu tikvice

Bolest ljutenja kore stabla agruma

PATOGEN: Citrus exocortis viroid, CEV

Radi velike tete u SAD-u (Kalifornija i Florida). Vrlo je zarazan viroid.

DOMAINI: citrusi (limun, grejp, narana, mandarina).

SIMPTOMI: pucanje kore uz spoj podloga-plemka. Zaraena stabla su krljava, plodovi su manji i karakteristinog stanjenog oblika. Velike tete u SAD-u (Kalifornija i Florida). U Dalmaciji je veina citrusa na osjetljivim podlogama. Za nekoliko godina od zaraze (do 5) moe biti nuno krenje plantae s ciljem sprjeavanja irenja zaraze.

NAIN PRENOENJA BOLESTI: Prenosi se rukama i poljodjelskim alatom. Slika 31: simptom CEVa- pucanje kore

uz spoj podloga-plemka

34

Prokariotski biljni patogeni- opi dio

Prokariotski patogeni su fitopatogene bakterije, rikecije, fitoplazme i spiroplazme.

Poznato je oko 1600 vrsta bakterija. Veinom su saprofitski organizmi. Biljne bolesti uzrokuje oko 100 vrsta,

odnossno 300 sojeva bakterija. U usporedbi s brojem fitopatogenih gljiva ovo je malen broj no to ne umanjuje njihov znaaj jer se one vrlo teko suzbijaju pa mogu nanijeti ak i vee tete od gljiva.

Pasteur i Koch (Francuska) 1876. g. otkrili su da bolest bedrenicu (antraks) uzrokuje bakterija. Ovo je prva otkrivena bakterioza. Burrill (SAD) 1878. g. otkrio prvu bakteriozu biljaka, bakterijsku pale jabuke i kruke (Erwinia amylovora). Erwin F. Smith (SAD) je otkrio neke druge bakterioze biljaka a 1890. g. i tumor vrata korijena (Agrobacterium tumefaciens) iji mehanizam nastanka simptoma je razjanjen tek 1980. g. Mnoge fitopatogene bakterije prodiru u sjeme i zaraavaju ga, kao npr. crna trule kupusa (Xanthomonas campestris).

Morfologija i fiziologija fitopatogenih bakterija

Graa bakterija

Bakterije su heterotrofni jednostanini prokariotski organizmi. Graa njihove stanine stijenke je sloena (vie tipova; fitopatogene bakterije su preteno Gram negativne), a sastoji se od proteina, lipida i polisaharida. U stanici nemaju membranama ograenih struktura. Nemaju jezgru ali imaju nukleoid (DNA koju ne omeuje jezgrina membrana). U citoplazmi se nalaze ribosomi (maleni- 70S) i ekstrakromosomske nukleinske kiseline- plazmidi. Kromosomska nukleinska kiselina slui kao kontrolni centar bakterijske stanice. Nosi genetsku uputu za stvaranje nekoliko tisua enzima i drugih proteina. Ima sposobnost samoreplikacije, to omoguuje staninu diobu i upravlja svim staninim aktivnostima. Rezervna tvar im je preteno glikogen.

Slika 32: Slika 33: elektronska mikrografija najeih fitopatogenih bakterija: A) Agrobacterium, B) Erwinia, C) Pseudomonas , D) Xantomonas

35

Flagele su bievi koje mogu imati (najee)

tapiaste bakterije. Slue za pokretanje.23

atriha

Graene su od bjelanevine flagelina. Raspored i broj flagela

koriste se u identifikaciji. Podjela po rasporedu bieva:

monotriha lofotriha amfitriha (Pseudomonas) peritriha (Erwinia)

Pili (fimbrije) su kratki, njeni (tanji od flagela), kruti izdanci na povrini gram-negativnih bakterijski stanica. Graeni od proteina pilina.. Izrastaju iz citoplazme i prolaze kroz staninu stijenku. Omoguuju prihvaanje (priljubljivanje, adherenciju) bakterija na stanicu domaina. Posebna tip su spolni pili odgovorni za prijenos genetikog materijala iz bakterije u bakteriju prilikom konjugacije.

Fitopatogene bakterije su asporogene i tapiaste. Izuzetak je Streptomyces koji je filamentozan. Aktinomicete formiraju viestanine niti, ostale se mogu udruivati u kolonije. Iako su paraziti, mogu

Fiziologija bakterija

se uzgajati na hranjivim podlogama. Unutar vrste postoje sojevi- patotipovi.

Bakterije se razmnoavaju diobom, a ponekad i pupanjem. Pod povoljnim uvjetima bakterija se moe podijeliti

svakih 20-50minuta to rezultira vrlo velikim poveanjem broja ovih organizama. Prijenos genetikog materijala iz jedne u drugu bakteriju dogaa se u procesu konjugacije (podsjea na spolno razmnoavanje).

Bakterije su paraziti intercelulara. U biljku ne prodiru aktivno, ve kroz prodorne otvore (pui, hidatode, nektarije...) i rane. Zbog toga se preporua sterilizacija koritenog alata ili/i orezivanje biljnih dijelova za koje se

sumlja da su zaraeni.

Bakterije mogu proizvoditi pektolitike i celulolitike enzime te toksine, no u pravilu ne prodiru duboko u tkivo- pojavljuju se lokalno. ire se dijeljenjem ili strujom tekuine u kojoj se nalaze

.

Sistematika fitopatogenih prokariota

Pojednostavljena taksonomija bakterija na osnovi osobina stanine stjenke na 4 koljena24

Gracilicutes (tanka stanicna stjenka, tipicni gram-negativni organizami). Ukljuuje rodove: Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Agrobacterium i Xylella(spada u rikecije!)

:

Firmicutes (debela stanina stjenka, gram-pozitivni organizami). Ukljuuje rodove: Streptomyces i Clavibacter (sin. Corynebacterium), Bacillus, Clostridium, Arthrobacter, Rhodococcus, Curtobacterium Tenericutes25

Mendosicutes (prokarioti sa stanicnom stjenkom koja ne sadri peptidoglikan)

(meka, savitljiva stanicna stjenka ili bez stanicne stjenke): razred Mollicutes. Ukljuuje rodove: Spiroplasma i Phytoplasma,

23 Prema: Volner Z (2003). Opa medicinska mikrobiologija s epidemiologijom i imunologijom, str. 29 24 Prema: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 25 U daljnjem tekstu tretiraju se po tradicionalnijoj podjeli kao samostalan razred, odvojen od bakterija

Slika 34: : raspored bieva bakterija: A) atriha, B) monotriha , C) lofotriha, D) amfitriha i E) peritriha

36

U praksi se koristi podjela na gram pozitivne, gram negativne bakterije te rikecije, fitoplazme i spiroplazme.

Subcpecijalne sistematske jedinice u bekteriologiji zovemo patogene varijatet ili patovar.

Evolucija fitopatogenih bakterija i porijeklo parazitizma. Npr. bakterije roda Erwinia su evoluirale iz koliformnih bakterija. Na to ukazuje slinost sekvence DNA. Predpostavlja se da je razvoj tekao preko saprofita koji ive u

tlu te da se istovremeno razvijala patogenost prema biljkama i ivotinjama

Mikoplazmama slini organizmi Ovu grupu prokariota predstavlja razred Mollicutes koji obuhvaa prokariote koji imaju samo staninu membranu, a ne i staninu stijenku.

Kada su ovi mikroorganizmi otkriveni 1967. godine, prvo se mislilo da su virusi. Kasnije su nazvani

mikoplazmama slini organizmi. Kasnije se dokazalo da nisu mikoplazme pa su svrstani u vlastiti red

Mycoplasmatales.

Sistematika: Red: Mycoplasmatales

Porodica: Mycoplasmataceae Rod: Phytoplasma

Porodica: Spiroplasmataceae Rod: Spiroplasma

Rod broj vrsta reakcija po gramu boja kolonija

Pseudomonas 7 G- sivobijela (fluorescira zeleno)

Xantomonas 5 G- uta

Agrobactetium 4 G- bijela

Erwinia 12 G- bijela

Corynebacterium 12 G+ krem

Streptomyces 1 G+

Slika 35: vani fitopatogeni rodovi

37

1) Spiroplazme

1972. g. su u oboljelim naranama i kukuruzu naeni

prokarioti osobitog oblika, dugake spiralne niti (podsjeaju na razvuene opruge). Spiroplazme su pokretljive (zmijoliko se kreu ako se nalaze u tekuem mediju).

MORFOLOGIJA: Svim lanovima porodice Spiroplasmateceae svojstveno je da poprimaju spiralan oblik ako se uzgajaju u tekuem mediju (za razliku od

mikoplazmi). U krutom mediju spiroplazme su kuglaste kao i mikoplazme.

Spiroplazme imaju veliinu od oko 250 x 12 000 nm. Detaljno je prouena samo Spiroplasma citri

SIMPTOMI: Javlja se uenje listova, skraenje stabljike (internodiji se skrauju), zastoj u rastu, prekida se normalna faza mirovanja biljke i pojavljuju se dodatni izbojci (proliferacija) na stabljici i korijenu. Pretpostavlja se da spiroplazme mijenjaju metabolizam giberelina.

koja je naena u narani.

VEKTORI su cvrci. Oni su im i sekundarni domaini pa se u njima spiroplazme i umnoavaju.

Neke teorije govore o tome da su spiroplazme najprije parazitirale na kukcima, a zatim da su poele zaraavati i biljke. Osim biljaka i beskraljenjaka spiroplazme mogu zaraziti i nie kraljenjake (npr. mia i hrka) kod kojih uzrokuju kataraktu (zamuenje onih lea) i kroninu infekciju mozga.

2) Fitoplazme

MORFOLOGIJA: graom najvie slie bakterijama; jednostanini prokatioti, razmnoavaju se diobom ili pupanjem. Pleomorfne su, dakle neodreenog oblika.

Nalaze se u floemu. Osjetljive su na antibiotike tipa tetraciklina, ali ne na penicilinske antibiotike.

SIMPTOMI: izgledaju kao simptomi viroza (utice), a uzrokuju i proliferacije.

Zlatna utica vinove loze, FD (franc. Flavescence Dore)

Kod nas nije utvrena, a gdje se pojavljuje, ekonomski je vrlo znaajna fitoplazmoza.

PATOGEN: Candidatus Phytoplasma vitis

SIMPTOMI: Krajem svibnja i u lipnju za topla vremena dolazi do smanjenog rasta loze, skrauju se internodiji, uvijaju se rubovi listova prema dolje. Tipini znakovi bolesti vidljivi su u jesen. Lie bijelih kultivara pouti, a prema suncu ima zlatni sjaj. Rubovi listova su jako svinuti prema dolje. Lie je kruto. Kod crvenih kultivara listovi poprime crvenkastu

VEKTOR: u Hrvatskoj i Sloveniji najvaniji vektor je cikada Scaphoideus littoralis.

boju, a ile posmee. Lie je kruto, rubovi uvijeni. Pri ranoj zarazi grozdovi se mogu osuiti, inae su bobe smeurane. Mladice slabo drvene pa tijekom zime smrznu.

Slika 37: simptomi zlatne utice vinove loze

Slika 36: Spiroplasma citri, lijevo je zdravo drvo, a desno zaraeno

38

Rikecije Pronaene su 1970-ih godina uz pomo elektronskog mikroskopa naeni u ksilemskim provodnim elementima

vinove loze sa simptomima Piercove bolesti. Razlikuju se od

fitoplazmi po tome to imaju staninu stijenku i osjetljive su na penicilin.Uzrokuju simptome sline virusima. Najee ope uenje biljke. Ne mogu se uzgajati na umjetnim podlogama u laboratoriju. Ne prenose se mehaniki inokulacijom

Predstavnik je Xylella fastidiosa koja uzrokuje Pierceovu bolest vinove loze. Mikroorganizam se nalazi u ksilemskim provodnim elementima.

, nego samo kukcima.

Slika 38: Xylella fastidiosa- kloroza na citrusu

39

Simptomi bakterioza

1) Gnjiloa ili mokra trule nastaje maceracijom biljnog tkiva djelovanjem pektolitikih enzima. Tkivo je rahlo, stanice su odvojene, dijelom su i razorene te iz njih izlazi sadraj. Karakteristino za organe koji sadre

puno vode (lukovice, gomolji, ). esto na uskladitenim gomoljima i plodovima. 2) Pjege. Sitne vodenaste (masne pjege) se proiruju i postaju smee (nekrotiziraju). Toksini uzrokuju

nastanak klorotinog prstena oko pjege (halo). esto na grahu, duhanu, kukuruzu, begoniji (Pseudomonas

3) Pale. Napadnuti organ ili njegov dio naglo posmei ili pocrveni i sasui se (npr. ).

E. amylovora

4) Venue nasteja zbog zaepljenja provodnih elemenata, npr.

na kruci, jabuci ili dunji, ponekad se javlja i eksudat).

Erwinia carotovora

5) Izrasline (hipertrofije, tumori) nastaju mnogostrukim diobama stanica tvornog tkiva (parenhimskog i ilnog), npr. Agrobacterium tumefaciens koji uzrokuje tumor vrata korijena velikog broja biljnih vrsta (polifagna bakterija).

na krumpiru (crna noga) ili venue rajice.

Slika 39: simptomi bakterioza

40

Rad s bakterijama- stvaranje istih kultura Fitopatogene bakterije (osim rikecija) mogu se uzgajati in vitro. Bakterije rastu na hranjivim podlogama u uvjetima koje najvie odgovaraju pojedinom vrstama. Hranjive podloge su sastavom prilagoene odreenim vrstama baktrija. Priprema hranjivih supstrata za odreivanje glavnih rodova i vrsta fitopatogenih bakterija:

odvaga sastojaka mijeanje sastojaka (ili upotreba ve pripremljenih trino dobavljivih formulacija) mjerenje i podeavanje pH vrijednosti sterilizacija podloge u autoklavu izlijevanje podloge u petrijevke (dodavanje agara) i suenje nacjepljivanje bakterija inkubacija u termostatu

iste kulture su kulture s bakterijama samo jedne vrste. Postupak dobivanja istih kultura (Slika 40):

uzima se uzorak od zaraenog dijela biljke uzorak se povrinski sterilizira nateijevim hipokloritom ili etanolom biljno tkivo se ispire i sui papirom (koristiti sterilno posue i orue) u epruvetu sa sterilnom vodom stavljamo uzorak biljnog tkiva otopinu biljnog tkiva razreujemo do tisuu puta otopine razliite gustoe stavljamo na hranjivu podlogu i ekamo da se razviju kolonije iz odabrane kolonije prenosimo bakterije na novu petrijevku i dobivamo istu kulturu

Slika 40: dobivanje iste kulture

41

Bakterisjke kulture uvaju se na hranjivim podlogama. Mogu se zamrznuti u glicerolu na -18 ili -20C, ili liofilizirati.

Identifikacija bakterija i principi suzbijanja fitopatogenih bakterija

Metode identifikacije bakterija Da bi se utvrdio uzronik neke bolesti, moraju se ispotovati Kochovi postulati:

1) uzronik mora biti dokazan za svaki sluaj iste bolesti (mora se pronai mikroskopom u oboljelom tkivu)

2) uzronik se mora izolirati iz domaina i uzgojiti in vitro 3) bolest se mora reproducirati inokulacijom uzgojenog uzronika u zdravog domaina 4) isti uzronik se mora dobiti iz domaina inokuliranog u pokusu i izvornog domaina

U praksi se na osnovu jasnih simptoma pristupa ciljanom utvrivanju uzronika.

Identifikaciju moemo vriti sljedeim metodama:

1) Mikroskopiranjem 2) Odereivanjem morfolokih osobina hranidbenih podloga (izgled, boja i oblik kolonija) 3) Ispitivanjem biokemijskih osobina 4) Serolokim metode (ELISA) v. poglavlje Dokazivanje , identifikacija i suzbijanje virusa, str. 19 5) Imunoflorescencijom (cijela bakterija sjaji ako su prisutna specifina protutijela) 6) Bakteriofagnim svojstvima (osjetljivost na odreene fage) 7) Lananom reakcijom polimerazom (PCR) v. poglavlje Dokazivanje , identifikacija i suzbijanje virusa,

str. 21 8) Biolokim metodama

1. Mikroskopija nam moe da ti okvirne podatke kojoj skupini pripada ispitivana bakterija 2. Uzgoj bakterija na hranjivim podlogama moe se koristiti u identifikaciji jer pojedine bakterije

produciraju kolonije specifinih osobina. Takoer, mogu se koristiti selektivne podloge koje inhibiraju rast neeljenih vrsta, antibiogram 26

26antibiogram je rezultat in vitro ispitivanja osetljivosti izolovanog bakterijskog soja na razliite antibiotike i hemoterapeutike

Slika 41: Kolonije bakterija E. amylovora (desno) i Pseudomonas syringae pv. syringae (lijevo)

42

3. Ispitivanje biokemijskih osobina. Mogu se koristiti reakcija po gramu i KOH-test 5. Imunoflorescencija (Slika 41): cijela bakterija sjaji ako su prisutna specifina protutijela. Kod bakterije

P. syringae na UV-svjetlu kolonije i hranjivi medij s difuzibilnim pigmentom fluoresciraju 8. Bioloke metode:

Hipersenzitivnoa reakcija (HR) na duhanu. Prireuje se ista kultura patogena, vri suspenzija u sterilnoj vodi i inficiranje lista duhana. Pozitivna reakcija je pojava simptoma

(nekroza na listu) .

Zaraza nezrelih plodova (Slika 42) Na umjetno zaraenim nezrelim plodovima kruke nakon inkubacije u vlanoj komori pojavile su se nekroze, a na nekima od njih se na mjestu inokulacije pojavio i eksudat. Pojava znakova bolesti nakon umjetne zaraze u laboratoriju koji odgovaraju znakovima bolesti koji se pojavljuju u prirodi svjedoi o patogenosti testiranog izolata. Bakterijski izolati E. amylovora su patogeni na nezrelim plodovima (nekroza i kapljica eksudata).

Slika 42: zaraza nezrelih plodova

43

Principi suzbijanja fitopatogenih bakterija a) Preventiivne mjere:

1) agrotehnike mjere 2) obavjetajna sluba 3) karantenska sluba

b) Preventivno kurativne mjere: 1) mehanike mjere borbe 2) fiziko termike mjere borbe 3) kemijske mjere borbe- uinkovita su jedino bakrena sredstva. Antibiotici se mogu davati

dobre rezultate, ali mogu urokovati i fitotoksinost. U Europi i Hrvatskoj nemaju dozvolu za primjenu u poljoprivredi (zbog opasnosti od pojave rezistentnosti).

4) bioloke mjere borbe: antagonistiki odnosi fitopatogenih bakterija i saprofitne mikroflore u tlu antagonistiki odnosi fitopatogenih bakterija epifitne mikroflore (flora povrine biljke) koritenje bakteriofaga

44

Specijalna bakteriologija

Pseudomonas

naseljavaju uglavnom parenhimsko ali i druga biljna tkiva. Uzrokuju nekroze (pjegavost), pale, tumore, uvelost

i trule.

Pseudomonas syringae pv. tabaci (sin. Pseudomonas tabaci

Bakterijska plamenjaa (pale) duhana ili "divlja vatra". Naseljava

parenhimska tkiva. Najtetnija na klijalitima (pogoduju toplina i

vlaga). Zaraene biljke najprije potamne, zatim venu i polijeu i trunu. Na polju - klorotine pjege unutar kojih tkivo nekrotizira. Nekroza se iri i cijela biljka propada. irenju bolesti pogoduje

kia, prenosi se insektima ali i pri berbi (radnici). Moe se prenijeti

i sjemenom te biljnim ostacima.

)

Pseudomonas solanacearum (sin.

Uzrokuje bakterijsku uvelost i mrku trule krumpira. Polifag. Lie

vene a na gomoljima trule (tamne zone i uto-bijeli eksudat). Bolest se prenosi gomoljima, biljnim ostacima u tlu i insektima

(krumpirova zlatica). Razvoju bolesti pogoduje kia i vie

temperature. Kod nas nije utvren.

Ralstonia solanacearum)

Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (sin. Pseudom