24-LuanVanThacSi-ChuaPhanLoai (12).PDF

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Cẩm Dương

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN

TÀI NGUYÊN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƯỢC LIỆU

Ở VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ ADN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2010

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN

TÀI NGUYÊN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƯỢC LIỆU

Ở VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ ADN

Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Đinh Đoàn Long

Hà Nội - 2010

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu

sắc tới TS. Đinh Đoàn Long, Chủ nhiệm bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học đã

trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong công tác nghiên cứu khoa học. Đồng thời,

tôi cũng muốn trân trọng cảm ơn các cán bộ thuộc Khoa tài nguyên dược liệu,

Viện Dược liệu (Bộ Y tế), đã cung cấp và giúp tôi phân loại mẫu thực vật sử dụng

trong nghiên cứu này.

Qua đây tôi muốn được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất tới các thầy, cô

giáo của bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học trong đó đặc biệt là Th.S Trần Thị

Thùy Anh đã tạo điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong suốt quá trình học tập

tại bộ môn. Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới Ban giám độc PTNTĐ Công nghệ

Enzyme và Protein thuộc Khoa Sinh học đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi về

trang thiết bị và cơ sở vật chất trong quá trình học tập và nghiên cứu. Đề tài

nghiên cứu của tôi được hỗ trợ một phần tài chính từ đề tài Klept.09.05 thuộc

PTNTĐ Công nghệ Enzym và Protein.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sắc tới bố mẹ, các bác và

đặc biệt là anh chị tôi, những người đã luôn hỗ trợ tôi về mọi mặt trong suốt quá

trình học tập tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQG Hà Nội). Nhân dịp

này, tôi trân trọng gửi lời cảm ơn tới các anh chị khóa trên, bạn bè thân thiết luôn

cổ vũ, động viên và sát cánh bên tôi trong suốt quá trình học tập vừa qua.

Hà Nội, tháng 12 năm 2010

Học viên


i

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh

ADN Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleic acid

ADNts ADN tổng số Total DNA

ARN Axit ribonucleic Ribonucleic acid

ASSOCHAM Hiệp hội thương mại và công nghiệp

Ấn Độ

The Associated Chambers of

Commerce and Industry of India

cs cộng sự Co-workers

CTAB Cetyltrimethylammonium bromide Cetyltrimethylammonium bromide

bp Cặp bazơ nitơ base pair

ddH2O Nước cất khử trùng hai lần Double distilled water

DDT Thuốc trừ sâu dichloro-diphenyl-

trichloroethane

Dichloro-Diphenyl-Trichloroethane

dNTP Deoxyribonucleotit triphosphat Deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA Ethylene diamine tetraacetat Ethylene diamine tetraacetate

HPLC Sắc ký lỏng cao áp High pressure liquid chromatography

IUCN Liên minh bảo tồn thiên nhiên thế

giới

International Union for Conservation

of Nature

kb Kilo bazơ Kilo base

NTSYS Phần mềm hệ thống phân loại số Numerical Taxonomy System

M Thang ADN chuẩn Marker

OD Mật độ quang phổ hấp thụ Optical Density

OPA,OPC Các mồi oligonucleotit

PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp ADN Polymerase Chain Reaction

RAPD Đa hình phân đoạn ADN nhân bản

ngẫu nhiên

Random Amplified Polymorphic

DNA

RAPD-PCR Tương tự như RAPD

Rb1 Nhóm ginsenoside Rb1 (có mặt của

protopanaxadiol)

The ginsenoside Rb1 group

RFLP Đa hình độ dài các đoạn giới hạn Restriction fragment length

polymorphism

ii

Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh

Rg1 Ginsenoside nhóm Rg1 (có chứa

protopanaxatriol)

The ginsenoside Rg1 group

STR/SSR Trình tự vi vệ tinh Microsatellite/simple tandem repeats

TBE Đệm gồm Tris, Borate và EDTA Tris/Borate/EDTA buffer

TE Đệm gồm có Tris và EDTA

UPGMA Thuật toán phân cặp dựa trên giá trị

trung bình

Unweighted pair group with arthmetic

means

V Vol Volte

v/v Tỉ lệ pha theo thể tích/thể tích Volume/volume

WHO Tổ chức Y tế thế giới World Health Organization

iii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3

1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY DƯỢC LIỆU .................................................................... 3

1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................... 7

1.3. LÝ DO THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ................................................................................ 12

1.3.1. Thực trạng nghiên cứu về cây dược liệu ở Việt Nam hiện nay ..................... 12

1.3.1.1. Nghiên cứu về chi Acanthopanax .......................................................... 12

1.3.1.2. Nghiên cứu về chi Illicium ................................................................... 14

1.3.1.3. Nghiên cứu về chi Morinda .................................................................. 15

1.3.1.4. Nghiên cứu về chi Panax L. .................................................................. 16

1.3.2. Chỉ thị ADN – Chỉ thị RAPD-PCR .............................................................. 19

1.3.3. Mục tiêu của đề tài ...................................................................................... 22

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 24

2.1. VẬT LIỆU THỰC VẬT ........................................................................................ 24

2.1.1. Chi Acanthopanax ....................................................................................... 24

2.1.2. Chi Illicium.................................................................................................. 26

2.1.3. Chi Morinda ................................................................................................ 27

2.1.4. Chi Panax L. ............................................................................................... 28

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................... 31

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số bằng phương pháp Mini-CTAB cải tiến ................ 31

2.2.2. Phân tích di truyền bằng kỹ thuật RAPD-PCR ............................................. 33

2.2.3. Điện di ADN trên gel agarose ...................................................................... 34

2.2.4. Dựng cây quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYSpc 2.02h ..................... 35

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 38

3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ ............................................................. 38

iv

3.1.1. Kết quả tách chiết ADNts từ các mẫu thực vật thuộc chi Acanthopanax ...... 38

3.1.2. Kết quả tách chiết ADNts từ các mẫu thực vật thuộc chi Illicium................. 38

3.1.3. Kết quả tách chiết ADNts từ cây Ba kích (Morinda officinalis How) ........... 39

3.1.4. Kết quả tách chiết ADNts các mẫu thực vật thuộc chi Panax L. .................. 39

3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC LOÀI CÂY

THUỐC TRONG NGHIÊN CỨU ................................................................................ 41

3.2.1. Sự đa dạng di truyền giữa các loài cây thuốc thuộc chi Acanthopanax .... 42

3.2.1.1. Phân tích đa hình loài ngũ gia bì gai (A. trifoliatus) ............................. 43

3.2.1.2. Phân tích đa hình loài ngũ gia bì hương (A. gracilistylus) .................... 46

3.2.2. Sự đa dạng di truyền giữa loài cây thuốc thuộc chi Illicium. .................... 48

3.2.2.1. Phân tích đa dạng di truyền loài hồi hương ....................................... 48

3.2.2.2. Phân tích đa dạng di truyền của các loài hồi núi .................................. 51

3.2.3. Sự đa dạng di truyền của loài cây thuốc Ba kích ....................................... 53

3.2.4. Sự đa dạng di truyền của loài cây thuốc thuộc chi Panax L ...................... 56

3.2.5. Bước đầu xác định tập hợp một số chỉ thị RAPD-PCR giúp phân biệt

nhanh nguồn nguyên liệu từ các loài thực vật trong nghiên cứu ......................... 61

3.2.5.1. Chỉ thị ADN giúp phân biệt nguồn dược liệu từ các loài dược liệu

Ngũ gia bì gai và Ngũ gia bì hương ................................................................ 61

3.2.5.2. Chỉ thị ADN (RAPD-PCR) giúp phân biệt nguồn dược liệu từ loài

hồi hương với các loài hồi núi ......................................................................... 63

3.2.5.3. Chỉ thị ADN (RAPD-PCR) giúp phân biệt các dạng hình thái khác

nhau của loài Ba kích ...................................................................................... 64

3.2.5.4. Chỉ thị ADN (RAPD-PCR) giúp phân biệt các loài Sâm Việt Nam,

Sam Vũ Diệp và Tam thất hoang ..................................................................... 66

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................. 68

KẾT LUẬN........................................................................................................... 68

KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 70

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1. Thế hệ chỉ thị ADN đầu tiên 7

Bảng 2. Thế hệ chỉ thị ADN thứ hai 7

Bảng 3. Thế hệ chỉ thị ADN mới 10

Bảng 4. Danh sách mẫu cây dược liệu được thu thập và phân tích trong nghiên cứu 25

Bảng 5. Thành phần (bảng bên trái) và quy trình nhiệt (bảng bên phải) của phản ứng

RAPD-PCR 34

Bảng 6. Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu quần thể loài Acanthopanax

trifoliatus và A. gracilistylus phân tích với 16 mồi ngẫu nhiên. 42

Bảng 7. Số băng ADN đa hình thu được từ các mẫu quần thể loài Ngũ gia bì gai (A.

trifoliatus) (ký hiệu G) thu tại Lào Cai, Cao Bằng và Lạng Sơn được phân tích theo từng

mồi RAPD. 45

Bảng 8. Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu quần thể loài Illicium verum và các

loài hồi núi phân tích với 15 mồi ngẫu nhiên. 48

Bảng 9. Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu quần thể loài Ba kích (Morinda

officinalis) với các dạng hình thái khác nhau: dạng thân có lông (L); dạng thân không có

lông (K); dạng quả tụ (T) và dạng quả rời (R) với 12 mồi ngẫu nhiên. 53

Bảng 10. Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu thuộc ba loài Sâm Việt Nam

(SVN), Sâm Vũ Diệp (SVD) và Tam thất hoang (TTH) phân tích với 13 mồi ngẫu nhiên. 57

Bảng 11. Tập hợp các chỉ thị ADN (chỉ thị RAPD-PCR) đặc trưng có thể giúp phân biệt

các loài dược liệu trong nghiên cứu. 67

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1. Ảnh các loài thực vật thuộc chi Acanthopanax trong nghiên cứu: a-b) Bụi cây, lá và

hoa cây Ngũ gia bì gai; c-d) Bụi cây, lá và hoa cây Ngũ gia bì hương. 26

Hình 2. a-b) Hình thái lá và quả cây Hồi hương (Illicium verum Hook.f); c-d) hình thái lái

và quả của cây hồi núi (I. anasitum). 27

Hình 3. Hình thái các loại kiểu hình của cây Ba kích sử dụng trong nghiên cứu: a) quả tụ;

b) quả rời; c) thân có lông; d) thân không có lông. 28

Hình 4. Các loài thực vật thuộc chi Panax L. trong nghiên cứu: a) Sâm Việt Nam (P.

vietnamensis); b) Sâm Vũ Diệp (P. bipinnatididus); c) dạng trung gian giữa Sâm Vũ Diệp-

Tam thất hoang; d) Tam thất hoang (P. stipulenatus). 29

Hình 5. Bản đồ các địa phương thu mẫu dược liệu trong nghiên cứu 30

Hình 6. ADNts tách chiết từ các phần mô khác nhau: hình bên trái - ADNts từ các mẫu cây

Hồi hương (I); hình bên phải - ADNts từ các phần mô khác nhau ở cây sâm (V). M: thang

ADN chuẩn. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu nêu ở Bảng 4. 40

Hình 7. Ảnh điện di ADN tổng số các mẫu dược liệu được thu thập trong nghiên cứu:

a) mẫu các loài Ngũ gia bì gai (G) và Ngũ gia bì hương (H); b) mẫu các loài Hồi

hương (I) và Hồi núi (N); c) mẫu các loài Ba kích (K); d) mẫu các loài Sâm Việt Nam

(S), Sâm Vũ Diệp (V), Tam thất hoang (T) và dạng trung gian Sâm Vũ Diệp-Tam thất

hoang (VT). M: thang ADN chuẩn. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu nêu ở Bảng 4. 40

Hình 8. Hình ảnh điện di một số sản phẩm RAPD-PCR ở các mẫu Ngũ gia bì gai (G) và

Ngũ gia bì hương (H) trong nghiên cứu: a) Sản phẩm điện di với mồi OPC9; b) Sản phẩm

điện di với mồi OPA5. M: thang ADN chuẩn. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu nêu ở Bảng

4. 43

Hình 9. Sơ đồ hình cây về quan hệ di truyền giữa các mẫu thuộc hai loài cây thuốc Ngũ gia

bì gai (Acanthopanax trifoliatus – ký hiệu G) và Ngũ gia bì hương (A. gracilistylus – ký

hiệu H) thu thập được ở Việt Nam trên cơ sở phân tích chỉ thị RAPD-PCR. Nguồn gốc và

đặc điểm của các mẫu nêu ở Bảng 4. 44

Hình 10. Sơ đồ cây quan hệ di truyền của 39 mẫu Hồi hương với 11 mẫu Hồi núi trong

nghiên cứu. Nguồn gốc và đặc điểm của các mẫu được nêu tại Bảng 4. 52

Hình 11. Sơ đồ hình cây phản ánh mối quan hệ di truyền giữa 25 dòng Ba kích trong

nghiên cứu. Nguồn gốc và đặc điểm của các mẫu được trình bày tại Bảng 4. 54

vii

Hình 12. Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình đầu mũi tên) của các mẫu Sâm Việt Nam (S),

Sâm Vũ Diệp (V), Tam thất hoang (T) và dạng trung gian giữa Sâm Vũ Diệp-Tam thất

hoang (VT) tương ứng với mồi OPA14, OPC1 và OPA7. 57

Hình 13. Cây quan hệ di truyền giữa các mẫu Sâm Việt Nam (ký hiệu S), Sâm Vũ Diệp (ký

hiệu V), dạng trung gian của Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang (ký hiệu VT) và Tam thất

hoang (ký hiệu T) trong nghiên cứu lập bởi số liệu thu được từ phân tích RAPD-PCR.

Nguồn gốc và đặc điểm của các mẫu được nêu ở Bảng 4. 59

Hình 14. Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình mũi tên) của các mẫu ngũ gia bì gai (G) và ngũ

gia bì hương (H) trong nghiên cứu với mồi OPA10. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được

nêu ở bảng 4. 62

Hình 15. Băng đặc trưng phân biệt (chỉ ra bởi hình mũi tên) của các mẫu Ngũ gia bì gai

(G) và Ngũ gia bì hương (H) trong nghiên cứu với mồi OPA12 (hình bên trái) và mồi

OPA1 (hình bên phải). M: thang ADN chuẩn. Trong đó, chỉ thị OPA12750 và OPA1500 đặc

trưng cho các mẫu thuộc loài Ngũ gia bì gai; chỉ thị OPA12950 và OPA1300 đặc trưng cho

các mẫu thuộc loài Ngũ gia bì hương. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được nêu ở Bảng 4. 62

Hình 16. Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình mũi tên) của các mẫu thuộc nhóm loài Hồi

hương (I) (hình bên phải) và các loài Hồi núi (N) trong nghiên cứu với mồi OPA7 (hình

bên trái). M: thang ADN chuẩn. Băng đặc trưng phân biệt của hồi núi là băng có kích

thước 1800 bp. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được nêu ở Bảng 4. 63

Hình 17. Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình mũi tên) ở tất cả 25 mẫu Ba kích trong nghiên

cứu với chỉ thị OPA17. Dạng hình thái thân có lông (L), không có lông (K), dạng hình thái

quả tụ (T) và hình thái quả rời (R). Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được nêu ở Bảng 4. M:

thang ADN chuẩn. 64

Hình 18. Hình ảnh điện di các mẫu Ba kích với mồi OPA1. Băng đồng hình giữa hai dạng

hình thái thân có lông (L) và không có lông (K) có kích thước 600 bp và 300 bp (chỉ ra bởi

hình mũi tên). Băng đặc trưng phân biệt của kiểu hình thái thân không có lông có kích

thước 1100 bp. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được nêu ở Bảng 4. M: thang ADN chuẩn. 65

Hình 19. Ảnh điện di các mẫu Sâm Việt Nam (S), Sâm vũ diệp (V), dạng trung gian (VT) và

Tam thất hoang (T) với mồi OPA14 và OPC16, hình mũi tên chỉ ra các băng đặc hiệu phân biệt

còn hình đầu mũi tên chỉ ra các băng chung. M: thang ADN chuẩn (1kb marker). Nguồn gốc và

đặc điểm của các mẫu được nêu ở Bảng 4. 66

LUẬN VĂN THẠC SĨ

1

MỞ ĐẦU

Theo ước tính hơn 80% dân số trên toàn thế giới hiện nay vẫn phụ thuộc vào

các loại thuốc có nguồn gốc thảo dược trong việc chăm sóc sức khỏe. Các liệu pháp

chữa bệnh dựa vào thảo dược được đánh giá thông qua tính khả dụng và dựa vào

kinh nghiệm lưu truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Phần lớn các loài cây thuốc

hiện nay chủ yếu được thu hái từ tự nhiên. Việc thu hái như vậy nếu không có sự

kiểm soát chặt chẽ dễ gây nên sự suy kiệt tài nguyên di truyền của các loài cây

thuốc nói riêng cũng như của nguồn tài nguyên thực vật nói chung. Đây cũng là

nguyên nhân có thể dẫn tới chất lượng sản phẩm kém ổn định. Bên cạnh đó, nhiều

loài dược liệu quý hiếm có thể bị làm giả hoặc thay thế bằng các dạng dược liệu có

hình thái tương tự, dẫn tới những tác dụng không mong muốn khi sử dụng.

Việt Nam có gần 4.000 loài cây thuốc. Với thế mạnh về tài nguyên dược liệu

dồi dào như vậy, chúng ta có thể hy vọng phát hiện và phát triển được thuốc mới từ

nguồn tài nguyên tự nhiên phong phú này. Tuy vậy, hiện nay công tác bảo tồn, gìn

giữ, chọn tạo giống và phát triển nguồn gen cây thuốc vẫn chưa phát huy hết tiềm

năng. Nhiều loài cây thuốc quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng do bị khai thác ồ

ạt và thiếu kế hoạch.

Những vấn đề trên đặt ra một yêu cầu cấp thiết là cần có các biện pháp bảo tồn

và phát triển nguồn tài nguyên dược liệu của nước ta, cũng như cần phát triển công

tác kiểm định dược liệu nhằm đánh giá hiệu quả nguồn nguyên liệu ban đầu bảo

đảm chất lượng sản phẩm phục vụ ngành công nghiệp dược trong nước về lâu dài.

Trên thế giới, việc sử dụng các chỉ thị ADN (RAPD-PCR, RFLP-PCR, AFLP,

SSR, ...) ngày càng được dùng rộng rãi trong các nghiên cứu phân loại, phân tích đa

dạng sinh học, xác định khoảng cách di truyền và đặc trưng cá thể và quần thể thực

vật nhằm mục đích bảo tồn và chọn giống. So với các chỉ thị truyền thống (chỉ thị

hình thái và chỉ thị hóa học), thì chỉ thị ADN mang những ưu điểm nổi bật: dễ thực

hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào các yếu tố môi trường

và hiện tượng tương tác gen, có thể xác định được các biến dị ADN trong các giai

đoạn khác nhau và ở các cơ quan khác nhau ở thực vật. Việc phân tích các chỉ thị


2

ADN cho phép đánh giá một cách chính xác mức độ đa dạng di truyền của một loài

cây thuốc nào đó nhằm định hướng bảo tồn, chọn, tạo và nhân giống phù hợp, đáp

ứng yêu cầu của quá trình phát triển một nền công nghiệp chế biến dược liệu bền

vững.

Trên cơ sở đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phân tích tính đa dạng di

truyền của một số loài cây thuốc quý ở nước ta hoặc đang bị đe dọa cần được ưu

tiên bảo tồn, hoặc có đặc điểm hình thái giống nhau cần có sự hỗ trợ của các kỹ

thuật sinh học phân tử trong công tác phân loại.

Luận văn này trình bày kết quả phân tích chỉ thị ADN (chủ yếu dựa trên kỹ

thuật RAPD-PCR) của 4 nhóm loài cây thuốc được thu thập ở nước ta, đó là: 1) chi

Acanthopanax (họ Araliaceae) gồm 2 loài là Ngũ gia bì gai (Acanthopanax

trifoliatus (L.) Merr.) và Ngũ gia bì hương (A. gracilistylus W.W. Smith); 2) chi

Illicium gồm loài Hồi hương (Illicium verum Hook.f) và một số loài Hồi núi

(Illicium spp.); 3) một số dạng hình thái khác nhau về đặc điểm thân và quả của loài

Ba kích (Morinda officinalis How.); 4) chi Nhân sâm (Panax; họ Ngũ gia bì

Araliaceae) gồm 3 loài là Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv), Sâm

Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus

H.T. Tsai et K.M. Feng).

Ch��ng 1. T�ng quan tài li�u NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ

3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY DƯỢC LIỆU

Việc sử dụng các loài cây dược liệu làm thuốc nhằm phòng chống và điều trị

bệnh đã được áp dụng từ lâu trong lịch sử loài người [61]. Việc sử dụng cây dược

liệu có lẽ đã được bắt đầu ngay từ thời cổ đại (Bensky và Gamble, 1993). Trong nền

văn hóa cổ xưa, con người tổng hợp những thông tin về cây dược liệu dựa trên các

bài thuốc được lưu truyền trong dân gian qua đó phát triển lên thành các cuốn dược

điển về cây dược liệu. Những minh chứng sớm nhất cho những hiểu biết của con

người được ghi chép lại về dược liệu được ghi nhận tại Ấn Độ, Trung Quốc, Ai

Cập, Hi Lạp, La Mã và Xy-ri khoảng 5000 năm trước. Ví dụ như những thông tin

cổ xưa nhất về cây dược liệu của người Ai Cập được tổng hợp trong 2 cuốn sách là

Charak Samhita và Sushruta Samhita [59].

Ước tính có khoảng 25% các loại thuốc được sử dụng hiện nay trên thế giới có

nguồn gốc từ thực vật và có khoảng 121 hợp chất có hoạt tính đang được sử dụng.

Trong tổng số 252 loại thuốc thiết yếu mà WHO đã liệt kê thì có tới 11% có nguồn

gốc từ thực vật [68]. Gần như 80% dân số Châu Phi và Châu Á phụ thuộc vào các

loại thuốc cổ truyền để chăm sóc sức khỏe [56, 81, 92].

Khoảng 3 thập kỷ trước đây, theo Lipp (1996) chỉ có một lượng nhỏ các sản

phẩm có nguồn gốc từ cây thảo mộc được kiểm nghiệm trên một số bệnh cụ thể

[59]. Tính đến nay, trên thế giới hiện vẫn còn nhiều người ưa dùng các sản phẩm có

nguồn gốc từ thiên nhiên để điều trị một số loại bệnh tật (theo Nazma và cộng sự,

2010). Các sản phẩm được chế biến từ cây dược liệu thường được sử dụng ở các

bệnh nhân mắc một số bệnh mạn tính, bao gồm ung thư vú (12%; Burstein, 1999),

các bệnh về phổi (21%; Strader, 2002), virut gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV)

(22%; Kassler, 1991), bệnh hen suyễn (24%; Blanc, 2001) và rối loạn thấp khớp

(26%; Rao, 1999).

Khoảng 960 loài thực vật đã được sử dụng bởi ngành công nghiệp thảo dược ở

Ấn Độ thì có tới 178 loài thực vật vượt qua sản lượng 100 tấn mỗi năm [41]. Thị

trường dược liệu tại Ấn Độ đang biểu lộ một sự tăng trưởng đặc biệt có thể đạt


4

doanh thu là 145.000 triệu rubi (tương đương khoảng 3,1 tỉ đôla Mỹ) vào năm 2010.

Đồng thời việc xuất khẩu dược liệu của quốc gia này có thể đạt doanh thu là 90.000

triệu rubi (tương đương 2 tỉ đô la Mỹ) (theo thống kê của tổ chức ASSOCHAM,

2008 [59]).

Ảnh hưởng của cây dược liệu tới sức khỏe con người

Thông thường mọi người thường tin rằng nguy cơ gây hại của các loại thảo

dược là rất ít, tuy nhiên trong thực tế nhiều báo cáo đã chỉ ra rằng sản phẩm từ cây

dược liệu có thể dẫn tới những hậu quả nghiêm trọng. Việc dùng sai các loại dược

liệu hay các sản phẩm dược liệu giả mạo đã đặt ra một vấn đề vô cùng quan trọng

về độ an toàn cũng như tính hiệu quả của các sản phẩm dược liệu. Nhiều loại dược

phẩm phổ biến thậm chí có giá thành đắt hiện nay thực chất là những sản phẩm thay

thế kém chất lượng hoặc là các sản phẩm dược liệu thô đã được làm giả [19]. Việc

làm giả các sản phẩm từ dược liệu cũng như việc dùng sai chúng có thể dẫn tới

nhiều bệnh như suy thận, tim mạch, … đã được ghi nhận tại nhiều nơi trên thế giới

như Anh quốc [19, 59], Mỹ [59, 97], Ấn Độ [59], Việt Nam [2]…

Một vấn đề khác trong việc sử dụng các loài dược liệu đó chính là sự có mặt

của kim loại nặng (thủy ngân, chì , arsen, …) có khả năng gây độc [19, 26, 54, 72].

Việc nhiễm độc đã được ghi nhận ở tất cả các bước từ bước khởi đầu là thu thập

dược liệu thô cho tới công đoạn sản xuất [19, 54]. Ghi nhận đầu tiên về trường hợp

nhiễm độc kim loại nặng vào năm 1978 tại Anh. Sau đó đã có hơn 50 trường hợp

nhiễm độc kim loại nặng từ nhiều vùng khác nhau trên thế giới bao gồm trong đó có

lục địa Ấn Độ, Bắc Mỹ, Trung Đông, Tây Âu và Australia [26, 72]. Sự lắng đọng

cặn thuốc diệt cỏ trong các cây dược liệu cũng là một vấn đề gây ảnh hưởng nghiêm

trọng trong quá trình phát triển và đẩy mạnh việc quốc tế hóa các sản phẩm dược

liệu truyền thống. Sự nhiễm độc từ các cây dược liệu thô cũng như các sản phẩm

hay chế phẩm của nó (sự pha chế, sắc thuốc,…) được ghi nhận là ngày càng tăng.

Một nghiên cứu gần đây với 280 mẫu có nguồn gốc từ 30 loài dược liệu Trung

Quốc về độ lắng đọng cặn thuốc trừ sâu cho thấy có tới 78,5% mẫu có chứa tối

thiểu một loại thuốc trừ sâu organochlorine như PCNB, aldrin, BHC hay DDT [94],


5

đều là những chất có nguy cơ ảnh hưởng tới sức khỏe người sử dụng [92]. Các loài

cây dược liệu thường có thành phần các chất rất phức tạp chính là nguyên nhân dẫn

tới khó khăn trong việc tìm ra phương pháp loại bỏ triệt để các chất lắng đọng bất

lợi mà không làm mất di các thành phần có hoạt tính có trong các loài cây này [59].

Bên cạnh đó, đã có những báo cáo tổng hợp lại vấn đề nhiễm nấm trong quá trình

thu hái, bảo quản, sản xuất và phân phối các sản phẩm dược liệu trên thế giới [59].

Việc thu hái trên quy mô rộng và không có tính kiểm soát các loài thực vật là

nguyên nhân dẫn tới việc làm suy kiệt nguồn tài nguyên di truyền, bao gồm trong

đó là các loài cây dược liệu [59]. Ví dụ như, loài anh đào Châu Phi (Pygeum hay

Prunus africanum) được sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh liên quan tới u tiền liệt

tuyến, đang phải đứng trước nguy cơ cạn kiệt nguồn tài nguyên, dẫn tới hệ sinh thái

bị ảnh hưởng nghiêm trọng do việc khai thác quá mức loài cây này ở châu Phi.

Chính vì lẽ đó, kể từ năm 1995, trong Công ước Thương mại về động vật và thực

vật hoang dã - CITES (Convention of International Trade in Endangered Species),

loài thực vật này đã được thêm vào phần phụ lục dành cho các loài cần được bảo vệ

[59, 79]. Theo sau đó Tổ chức IUCN cũng đưa loài dược liệu này vào trong danh

sách các loài có nguy cơ tiệt chủng (Sách Đỏ). Loài đàn hương (Santalum spp.)

phân bố ở Nam Á, Indonesia, Australia và Nam Thái Bình Dương dùng để sản xuất

các sản phẩm gỗ và dầu thơm, cũng gặp trường hợp tương tự.

Từ những nghiên cứu trên, chúng ta nhận thấy việc phát triển một hệ thống

đánh giá hiệu quả các loài cây dược liệu và các thành phần của nó là một việc làm

thiết yếu. Những phương pháp đảm bảo chất lượng cũng như độ an toàn của các sản

phẩm này đã và đang được phát triển trên toàn thế giới, thông qua đó đẩy mạnh việc

tiêu chuẩn hóa sản phẩm đầu ra, góp phần toàn cầu hóa các sản phẩm có nguồn gốc

từ dược liệu. Bên cạnh đó việc tiêu chuẩn hóa nguồn dược liệu đang được phát triển

rộng khắp trên phạm vi toàn thế giới. Đây là một việc làm có tính khả thi, nhưng lại

rất khó để thực hiện. Vì rằng, quá trình kiểm định các loại dược liệu không được

thực hiện một cách đồng bộ trên toàn bộ các quốc gia. Do đó, hiện nay trên thế giới


6

có rất nhiều phương pháp được áp dụng để kiểm định nguồn dược liệu và các sản

phẩm của chúng [59].

Tiêu chuẩn hóa dược liệu

Tính phức tạp của quá trình tiêu chuẩn hóa dược liệu

Cây dược liệu có rất nhiều đặc tính riêng, chính điều này làm cho các sản

phẩm từ cây dược liệu khác với các loại thuốc tổng hợp [59]. Chúng thường chứa

đồng thời nhiều hợp. Ví dụ như dược phẩm Huang-qin (Scutellaria baicalensis) có

tới hơn 2000 hợp chất [73]. Những đặc điểm về mặt hóa học của các loài cây dược

liệu bị ảnh hưởng bởi các điều kiện về thu hái, qui trình sản xuất và phân bố. Những

đặc điểm về mặt sinh lý, di truyền cũng như những biến đổi về môi trường (quang

chu kỳ, khí hậu, điều kiện đất, dinh dưỡng) đều có thể gây ảnh huởng tới các đặc

điểm hóa sinh và khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp ở thực vật. Thành phần các

hợp chất thức cấp trong dược liệu còn phụ thuộc vào thời gian thu hái, các phương

pháp bảo quản, sấy khô, tách chiết để thu được sản phẩm đóng gói cuối cùng [59].

Tính ổn định ở tất cả các giai đoạn của quy trình sản xuất có ý nghĩa quan trọng để

đảm bảo hiệu quả chữa bệnh và độ an toàn cho người sử dụng.

Có rất nhiều loại chỉ thị như chỉ thị hình thái, hóa học, chỉ thị liên quan tới hệ

gen (ADN), chỉ thị liên quan tới các protein (izozym), đều là những công cụ có thể

dùng để xác định các thành phần có trong cây dược liệu [59, 76].

Dược điển Trung Quốc (ấn bản năm 2005) thống kê có tất cả 282 chỉ thị hóa

học được sử dụng cho các loài cây thuốc [59]. Đây là một công cụ hữu ích dùng để

xác định sự làm giả cũng như sự khác biệt của các sản phẩm dược liệu có nguồn gốc

khác nhau, kiểm tra tính ổn định của các sản phẩm có tính chất độc quyền [59]. Các

thành phần có độc tính có thể sử dụng như là các chỉ thị hóa học trong các phương

pháp sàng lọc [49]. Tính cho tới thời điểm hiện tại, vẫn còn có rất nhiều loài dược

liệu không có chỉ thị hóa học phù hợp để kiểm định chất lượng. Theo cuốn Dược

điển Trung Quốc, chỉ có 282 trong tổng số 551 loài dược liệu có 1 hoặc 2 chỉ thị

hóa học để kiểm định chất lượng. Thiếu những chỉ thị hóa học, mức độ tinh sạch


7

của các chỉ thị đang có chính là nguyên chính cản trở việc kiểm định chất lượng của

các sản phẩm dược liệu.

Các hợp chất trao đổi thứ cấp là các chỉ thị được sử dụng rộng rãi trong việc

kiểm định và tiêu chuẩn hóa các loài cây dược liệu. Do không bị ảnh hưởng bởi độ

tuổi, điều kiện sinh lý và các nhân tố môi trường, nên các chỉ thị dựa trên phân tử

ADN còn được sử dụng để phân biệt những biến dị giữa và trong loài với nhau. Chỉ

thị đa hình phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên (RAPD) là chị thị được áp

dụng thành công trong việc đánh giá sự khác biệt giữa các loài Taxus wallichiana

Neem, Juniperus communis L., Codonopsis pilosula, Allium schoenoprasum L., A.

paniculata được thu thập từ nhiều vùng địa lý khác nhau [39]. Phân tích RAPD và

Eastern blotting sử dụng 2 kháng thể đơn dòng ginsenoside Rb1 và Rgl đã được áp

dụng thành công trong viêc xác định 3 loài sâm là: Panax notoginseng, P.

quinquefolius và P. japonicus. Đầu tiên, người ta sử dụng chỉ thị RAPD để phân

biệt các loài Panax spp. với nhau. Sau đó bằng kỹ thuật Eastern Blot xác định sự có

hay không có mặt chất ginsenoide Rc trong các sản phẩm tách chiết để định loại tên

loài P. notoginseng trong phân tích Eastern blotting [76].

Mức độ an toàn và hiệu quả sử dụng của các loài dược liệu được hình thành

thông qua quá trình sử dụng lâu dài của chúng. Mặc dù đã có những phép thử

nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên trên một số loài dược liệu, nhưng để có thể kiểm định

một cách triệt để thì cần phải có những nghiên cứu lâm sàng đầy đủ cùng với các

nghiên cứu về mặt độc tính học trên các loài dược liệu này [59].

1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Những tiến bộ gần đây trong lĩnh vực sinh học phân tử đã cung cấp những

công cụ mới áp dụng vào việc làm sáng tỏ những nghi vấn còn tồn tại trong các

nghiên cứu về tiến hóa, hình thái học và phân loại học. Những chỉ thị ADN có nhiều

ưu điểm so với các chỉ thị hình thái vì chúng gắn liền với vật chất di truyền, tương

đối dễ phân tích trong phòng thí nghiệm và ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi

trường [24].


8

Trong hai thập kỉ gần đây, một số kỹ thuật chỉ thị phân tử đã được phát triển

để phân tích về các hệ gen, phần lớn là để xác định những khác biệt giữa các cá thể

trong cùng một loài (đa hình di truyền) hoặc để tìm mối tương quan giữa đa hình di

truyền với các tính trạng nhất định. Tuy nhiên, vì giá thành tương đối cao tăng lên

cùng với sự phát triển của các chỉ thị phân tử, cho nên những phương pháp này mới

chỉ được áp dụng trên một số lượng hữu hạn các loài, và đa số là mới chỉ được tiến

hành ở các nước phát triển. Việc ứng dụng các chỉ thị phân tử còn có xu hướng khu

trú vào một lượng nhỏ các tính trạng hoặc một số vùng của hệ gen. Việc kết hợp các

phương pháp và sự phát triển của việc lập bản đồ đã đưa ra triển vọng áp dụng các

chỉ thị phân tử trên quy mô rộng, với số lượng lớn, qua đó làm giảm chi phí đầu tư

[24].

Theo Maheswaran (2004) tổng kết, sự phát triển của các chỉ thị ADN có thể

chia làm 3 thế hệ: (i) thế hệ chỉ thị ADN đầu tiên bắt đầu từ năm 1975 tới năm

1989; (ii) thế hệ chỉ thị ADN thứ hai bắt đầu từ năm 1990 đến năm 1993; (iii) thế hệ

chỉ thị ADN hiện nay bắt đầu từ năm 1994 cho tới nay. Việc ra đời của kỹ thuật đa

hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP; Grodzicker và cs, 1974) đã đánh dấu khởi

điểm của thế hệ chỉ thị ADN đầu tiên. Ban đầu, chỉ thị RFLP được thu từ các loài

virut [31], sau đó đã được kiểm chứng khi phân tích nhóm gen globin ở người [36].

Tiếp theo chỉ thị RFLP, một loạt các chỉ thị ADN được phát triển như: VNTR-

Variable Number Tandem Repeats (Các mảnh lặp lại có thứ tự với một tần số khác

nhau; Jeffreys, 1985); ASO-Allele Specific Oligonucleotides (xác định một trong

hai dạng sơi đơn của một phân tử ADN sợi kép bằng các oligonucleotide; Saiki và

cs, 1985); … Bảng 1 liệt kê một số chỉ thị ADN được phát triển trong thế hệ chỉ thị

ADN đầu tiên.

Cuộc cách mạng trong lĩnh vực nghiên cứu về di truyền học phân tử trên các

vi vệ tinh – dãy trình tự ADN lặp lại của 2-, 3-, 4- và 5 nucleotide xuất hiện rải rác

suốt hệ gen của các sinh vật nhân chuẩn đã đánh dấu sự ra đời của thế hệ chỉ thị

ADN thứ hai. Các trình tự lặp lại đơn giản (SSR) này gần đây đã được xác định là

những chỉ thị phân tử được dùng trong việc lập bản đồ hệ gen của một quần xã và


9

được ưa dùng trong các nghiên cứu trên đối tượng thực vật. Một số chỉ thị khác

được phát triển trong giai đoạn này được liệt kê tại Bảng 2.

Bảng 1. Thế hệ chỉ thị ADN đầu tiên

Năm Ký hiệu Tên đầy đủ (tiếng Anh) Tài liệu tham khảo

1974 RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Grofzicker và cs. (1974)

1985 VNTR Variable Number Tandem Repeats Jeffreys và cs. (1985)

1986 ASO Allele Specific Oligonucleotides Saiki và cs. (1986)

1988 AS-PCR Allele Specific Polymerase Chain Reaction Landegren và cs. (1988)

1988 OP Oligonucleotide Polymorphism Beckmann (1988)

1989 SSCP Single Stranded Conformational Polymorphism Orita và cs. (1989)

Bảng 2. Thế hệ chỉ thị ADN thứ hai


1990 RAPD Randomly Amplified Polymorphic DNA Williams và cs. (1990)

1990 AP-PCR Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction Welsh và McClelland (1990)

1990 STMS Sequence Tagged Micro Satellite Sites Beckmann and Soller (1990)

1991 RLGS Restriction Landmark Genome Scanning Hatada và cs. (1991)

1992 CAPS Cleaved Amplified Polymorphic Sequence Akopyanz và cs. (1992)

1992 DOP-PCR Degenerate Oligonucleotide Primer - PCR Telenius (1992)

1992 SSR Simple Sequence Repeats Akkaya và cs. (1992)

1993 MAAP Multiple Arbitrary Amplicon Profiling Caeteno-Anolles và cs.

(1993)

1993 SCAR Sequence Characterized Amplified Region Paran và Michelmore (1993)

Với sự phát triển gần đây của sinh học phân tử mở ra triển vọng áp dụng nhiều

loại kỹ thuật phân tử để xác định cũng như dùng để cải tiến hệ gen của nhiều loài

sinh vật khác nhau. Thông tin liên quan tới nền tảng của những kỹ thuật này cũng

như ứng dụng của chúng đều có nguồn gốc từ việc áp dụng công nghệ lên những dự

án hệ gen. Khoảng 10 năm gần đây khoa học đã chứng kiến sự hình thành của một

dãy các chỉ thị phân tử với khả năng thực hiện cao được kết hợp với sự thay đổi từ

phương thức thủ công cho tới sự tự động hóa một cách hoàn chỉnh. Theo đó thế hệ

chỉ thị này sẽ có khả năng tiềm tàng vô cùng to lớn trong sự tìm hiểu những biến dị

ở mức độ ADN. Trong thế hệ chỉ thị ADN mới này có thể kể đến các chỉ thị như


10

ISSR, là chỉ thị được phát triển trên nền tảng thế hệ chỉ thị SSR; hay SNP (đa hình

các đơn nucleotide)… là các chỉ thị có hiệu quả cao trong việc phân tích đa hình di

truyền.

Bảng 3. Thế hệ chỉ thị ADN mới


1994 ISSR Inter Simple Sequence Repeats Zietkiewicz và cs. (1994)

1994 SAMPL Selective Amplification Of Micro Satellite

Polymorphic Loci

Morgante và Vogel (1994)

1994 SNP Single Nuleotide Polymorphism Jordan và Humphries (1994)

1995 AFLP

(SRFA)

Amplified Fragment Length Polymorphism

(Selective Restriction Fragment Amplification)

Vos và cs. (1995)

1996 ISTR Inverse Sequence-tagged Repeats Rohde (1996)

1997 DAMD-

PCR

Directed Amplification Of Mini Satellite

DNA-PCR

Bebeli và cs. 1997

1999 IRAP Inter-retrotransposon Kalendar và cs. (1999)

Đặc điểm của các chỉ thị phân tử nói chung và chỉ thị ADN nói riêng

Mức độ đa hình

Kỹ thuật sử dụng chính xác chỉ thị di truyền có mức độ đa hình cao nên được

áp dụng trong việc lập bản đồ hệ gen. Mức độ đa hình trong số các chỉ thị di truyền

phụ thuộc vào loại chỉ thị và phương pháp được sử dụng để xác định ra nó.

Số lượng các alen

Có hai kiểu chỉ thị: chỉ thị liên quan tới 2 alen và chỉ thị liên quan tới nhiều

alen (đa alen).

Tính đặc hiệu về locus

Các chỉ thị được chia ra thành hai nhóm chính: các chỉ thị liên quan tới 1 locus

(chỉ có một vị trí trên hệ gen) và chỉ thị liên quan tới đa locus (nhiều vị trí trên hệ

gen). Các chỉ thị liên quan đến đơn locus thường được áp dụng trong việc lập bản

đồ hệ gen trong khi đó các chỉ thị liên quan tới đa locus được áp dụng cho các

nghiên cứu xây dựng tàng thư ADN hoặc phân tích đa dạng di truyền chung.

Bản chất của các alen


11

Bản chất của các chỉ thị liên quan tới 2 alen được xác định là đồng trội khi mà

cả hai alen này đều được quan sát thấy ở con lai. Nếu chỉ có một trong hai alen

được quan sát thấy thì chỉ thị tương ứng với alen đó được xác định là trội. Các chỉ

thị đồng trội sẽ mang nhiều tính thông tin hơn so với các chỉ thị trội bởi vì các chỉ

thị đồng trội có thể phân biệt được các kiểu gen dị hợp tử với các kiểu gen đồng hợp

tử. Chính điều này cho phép sự xác định các kiểu gen và tần số alen ở các locus một

cách chuẩn xác. Do đó, những chỉ thị đồng trội được ưa dùng hơn so với các chỉ thị

trội trong nghiên cứu lập bản đồ gen và phân tích đa dạng di truyền.

Ngoài những đặc điểm trên, khi nghiên cứu về các chỉ thị ADN, các nhà

nghiên cứu còn chú ý tới các đặc điểm về mặt kỹ thuật (các phương pháp kèm

theo); yêu cầu về mặt chất lượng của ADN; khả năng tự động hóa; các chi phí hoạt

động (tiền lương, các thiết bị phòng thí nghiệm, máy móc, hóa chất, …); chí phí

phát triển

Những đặc điểm cần có của một chỉ thị ADN lý tưởng

Một chỉ thị ADN lý tưởng là một chỉ thị hội tụ những đặc điểm cần có như

sau:

- Có thể tạo ra được một cách dễ dàng

- Phân tích đơn giản và nhanh

- Có tính đa dạng và tính lặp lại cao

- Di truyền đồng trội và có sự tái xuất hiện ở trên toàn hệ gen

- Chọn lọc một cách trung tính với những điều kiện của môi trường hoặc điều

kiện thực hiện

- Số liệu có thể được thay đổi giữa các phòng thí nghiệm khác nhau.

Việc chọn ra được một chỉ thị phân tử mang đầy đủ tất cả các tiêu chuẩn trên

là một điều hết sức khó khăn. Như vậy, mục tiêu đặt ra là cần phải phát triển được

một loại chỉ thị phân tử hội đủ các đặc điểm kể trên. Nhiều chỉ thị phân tử đã được

sử dụng để đánh giá đa hình ADN. Chúng đã được phân loại thành các chỉ thị dựa

vào các phép lai và các chỉ thị dựa trên phản ứng PCR. Những đặc điểm của các chỉ

thị dựa vào phép lai được thực hiện bởi phép lai giữa phân đoạn ADN đã được cắt


12

bởi enzym giới hạn endonuclease, với một đầu dò được đánh dấu. Trong kỹ thuật

PCR, các phân đoạn ADN được nhân bản trong điều kiện in vitro với sự trợ giúp

của các trình tự oligonucleotit đặc hiệu hoặc tương đồng (còn được gọi là mồi) và

các enzym ADN polymerase chịu nhiệt. Các phân đoạn ADN được nhân bản này

được phân chia nhờ điện di và các băng được xác định bởi nhiều phương pháp như

nhuộm băng (sử dụng thuốc nhuộm ethidium bromide) và phương pháp phóng xạ tự

ghi.

Cùng với những tiến bộ của enzym ADN polymerase chịu nhiệt, việc sử dụng

PCR trong các nghiên cứu và các phòng thí nghiệm lâm sàng đang tăng lên một

cách nhanh chóng. PCR có độ nhạy cao và vận hành ở một tốc độ rất nhanh. Những

ứng dụng của nó trên các mục đích phân tích sự đa dạng đã mở ra vô số những khả

năng mới trong lĩnh vực sinh học phân tử.

1.3. LÝ DO THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

1.3.1. Thực trạng nghiên cứu về cây dược liệu ở Việt Nam hiện nay

Theo thống kê của tổ chức IUCN, hiện Việt Nam có hơn 10.000 loài thực vật

có vai trò cung cấp nguồn thức ăn, thuốc .... Theo điều tra của Viện Dược liệu, nước

ta có gần 4000 loài cây thuốc. Với thế mạnh về tài nguyên dược liệu dồi dào như

vậy, chúng ta có thể hy vọng phát hiện và phát triển được thuốc mới từ nguồn tài

nguyên tự nhiên phong phú này. Tuy vậy, hiện nay công tác bảo tồn, gìn giữ, chọn

tạo giống và phát triển nguồn gen cây thuốc vẫn chưa phát huy hết tiềm năng. Nhiều

loài cây thuốc quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng do bị khai thác ồ ạt và thiếu

kế hoạch. Theo số liệu của các cơ quan chức năng thì có tới 50% nguyên liệu dược

liệu của nước ta là nhập về từ nước ngoài. Trong hoàn cảnh đó, một chiến lược khai

thác, bảo tồn cũng như gây giống hợp lý nguồn tài nguyên dược liệu nói chung và

tài nguyên cây thuốc nói riêng là vấn đề mang tính cấp thiết và có ý nghĩa thực tiễn.

1.3.1.1. Nghiên cứu về chi Acanthopanax

Trên thế giới, chi Acanthopanax có khoảng 35 loài, hầu hết phân bố ở vùng

Đông Á, ít loài có ở Đông Nam, phía Nam và Đông Bắc châu Á. Trong đó, Trung


13

Quốc có tới 26 loài, Hàn Quốc có 17 loài, Nhật Bản có 9 loài. Theo Đỗ Huy Bích, ở

Việt Nam chỉ có 3 loài thuộc chi Acanthopanax đó là Acanthopanax trifoliatus (L.)

Merr., A. gracilistylus W.W. Smith và A. senticosus Harms [1, 2, 45, 50].

Ngũ gia bì hương, Ngũ gia bì gai nói riêng và các loài thuộc chi Acanthopanax

nói chung và thường được xem có công dụng gần giống nhau trong y học cổ truyền.

Ở nước ta, chúng là thành phần được bổ sung trong các vị thuốc bổ gan, bổ thận,

làm mạnh gân cốt, chữa thấp khớp, lưng gối mỏi đau, trẻ em chậm biết đi, phù

thũng, kích thích tình dục, ... [2, 58, 64].

Các nghiên cứu về hóa học và dược lý học

Người ta bắt đầu chú ý nghiên cứu về các loài thuộc chi Acanthopanax từ

khoảng năm 1965, với việc tìm ra các glycosit eleuthrosid A, B, C, D và E từ vỏ rễ

của A. senticosus. Từ đó đến nay, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về các hợp

chất tự nhiên của chi Acanthopanax bao gồm: triterpenoid, triterpen glycosid,

diterpenoid, diterpen glycosid, lignan, phytosteroid, flavonoid, phenolic, curmrin và

các axit béo [1, 2, 43]. Những nghiên cứu về tác dụng dược lý của dịch chiết Ngũ

gia bì hương có tác dụng long đờm, chữa ho (Du Jianh và cs, 1992); ngăn cản và

giải phóng các yếu tố đông máu và làm tắc mạch máu (Chen và cs, 1996); điều hòa

miễn dịch, điều trị các bệnh tự miễn hay dị ứng [22, 65, 74].

Hiện nay, loài Ngũ gia bì hương ở Việt Nam chỉ còn lại một vài tập hợp cá thể

ở tỉnh Hà Giang và Lào Cai, trong đó một số cá thể Ngũ gia bì hương ở Lào Cai có

nguồn gốc được đưa từ Hà Giang về trồng. Số lượng và khu phân bố của Ngũ gia bì

gai gần đây bị thu hẹp nhiều so với trước đây. Theo điều tra vào các năm 1973-1987

ở Lạng Sơn, Cao Bằng và Lai Châu, nguồn Ngũ gia bì gai ở Việt Nam tương đối

phong phú và xác định được trữ lượng đến vài trăm tấn dược liệu. Đáng tiếc, hiện

nay cả Ngũ gia bì hương và Ngũ gia bì gai chỉ còn một số lượng ít ỏi mọc tự nhiên

và còn lại là được trồng ở một số hàng rào xung quanh nhà người dân [2].

Trên thị trường hiện nay có bày bán một số dạng dược liệu khô gọi chung là

“Ngũ gia bì” nhưng không phân biệt đây là dược liệu của loài cây thuốc nào. Như

đã trình bày ở phần trên, thuật ngữ “Ngũ gia bì” được nhiều người sử dụng để gọi


14

cho các loài Ngũ gia bì gai (A. trifoliatus), Ngũ gia bì hương (A. gracilistylus) và

một số loài khác thuộc chi Acanthopanax. Trước thực trạng suy giảm nghiêm trọng

của hai loài cây thuốc Ngũ gia bì gai và Ngũ gia bì hương ở Việt Nam, công tác bảo

tồn nhằm phát triển hai loài cây thuốc quý này là một việc làm có tính cấp thiết. Tuy

vậy, để đạt được mục tiêu đó, việc thăm dò và đánh giá mức độ đa dạng di truyền

của nguồn gen vốn có là một việc làm có ý nghĩa cơ bản.

1.3.1.2. Nghiên cứu về chi Illicium ở Việt Nam

Cây Hồi hương (Illicium verum Hook.f) được biết đến từ lâu trong nền y học

cổ truyền của nhiều quốc gia trên thế giới như một loại thảo dược có vị cay, mùi

thơm, tính ấm. Tại Việt Nam Hồi hương được biết đến trong các bài thuốc gây kích

thích trung tiện, tăng cường tiêu hóa, lợi sữa, lợi tiểu, chữa ngộ độc thịt cá, rắn cắn,

… Hiện nay, Hồi hương còn được biết tới là nguồn nguyên liệu ưa thích để bào chế

axit shikimic, là tiền chất của thuốc Tamiflu® - loại thuốc được đánh giá là có hiệu

quả nhất trong việc điều trị bệnh cúm gia cầm H5N1. Hồi hương lại có vùng phân

bố tương đối hẹp, hiện nay Hồi hương chỉ phân bố ở các tỉnh phía bắc Việt Nam

(Cao Bằng, Bắc Kạn, Lạng Sơn và Quảng Ninh) và một số tỉnh miền nam Trung

Quốc. Trước nhu cầu sử dụng thuốc Tamiflu ngày một tăng trên toàn thế giới

(WHO, 2005), nếu không có chiến lược khai thác hợp lý thì rất có khả năng dẫn đến

suy kiệt nguồn tài nguyên dược liệu này.

Các nghiên cứu về hóa học và dược lý học

Quả của cây Hồi hương có chứa cathechin, protocatechin, tinh dầu và một số

hợp chất vô cơ khác [2, 83]. Xuất phát từ những ứng dụng của Hồi hương trong nền

y học cổ truyền hiện nay, những nghiên cứu về thành phần hóa học của Hồi hương

chủ yếu tập trung vào tinh dầu hồi [2, 27, 88, 96]. Các nghiên cứu về dược lý của

tinh dầu hồi đã được thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn Candida albicans,

Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Shigella flexneri, Bacillus mycoides [2].

Tinh dầu hồi đã được chứng minh có khả năng: ức chế quá trình hình thành ấu trúng

cũng như quá trình nở trứng của nhiều loài sâu bọ gây ảnh hưởng đến mùa màng

(Muskesh Kumar Chaubey, 2008); đối vận với histamine và acetylcholine, làm


15

giảm độ co thắt cơ trơn ruột [2]; ngăn ngừa ức chế và hình thành các chất sinh ung

thư gan (Amit Singh Yadar, 2007).

Bên cạnh loài Hồi hương (Illicium verum Hook.f) vốn có giá trị y - dược học

thì tại Việt Nam còn tồn tại một số loài khác thuộc họ hồi (Illiciaceae) thường được

gọi chung là hồi núi, như I. griffithii, I. majus, … (Phan Kế Lộc, 2003) vốn ít có giá

trị y dược học hơn, thậm chí một số loài được xác định là có độc tố. Theo mô tả của

Đỗ Huy Bích và cộng sự (2003), sự tương đồng về mặt hình thái của cây Hồi hương

với các loài hồi núi là khá cao, chính là nguyên nhân chính gây khó khăn trong việc

thu hái đúng dược liệu từ cây Hồi hương, thậm chí có thể dẫn đến việc dùng sai

dược liệu do thu hái nhầm.

1.3.1.3. Nghiên cứu về chi Morinda

Ba kích (Morinda officinalis How) là loài cây nhiệt đới đặc hữu của Việt Nam.

Theo điều tra của Viện Dược Liệu (Bộ Y tế), cây Ba kích chỉ thấy phân bố ở một số

tỉnh trung du và miền núi thấp phía bắc, bao gồm Quảng Ninh, Lạng Sơn, Bắc

Giang, Thái Nguyên, Phú Thọ, Hòa Bình và Hà Tây. Một vài địa phương khác cũng

phát hiện thấy nhưng không đáng kể. Ba kích thường được sử dụng phổ biến làm

thuốc bổ thần kinh, bổ gân cốt, chữa thấp khớp, giảm xơ cứng động mạch. Ba kích

có tác dụng tăng cường khả năng sinh lý đối với nam giới có hoạt động sinh dục yếu

[2]. Ba kích còn được sử dụng để cải thiện sức khỏe, giúp ăn ngủ tốt hơn và giảm

đau mỏi khớp ở người cao tuổi.

Các nghiên cứu về mặt hóa học và dược lý học

Hợp chất được nghiên cứu nhiều nhất ở rễ cây Ba kích chính là nhóm hợp chất

anthraglucosid [2]. Bằng phương pháp nghiên cứu phổ huỳnh quang và UV, nhóm

nghiên cứu Yao H. và cs (2004) đã chứng minh hàm lượng của các anthraquinon có

mối liên quan với cấu trúc rễ của Ba kích: có mạch phloem phát triển và xylem nhỏ.

Theo tài liệu y học Trung Quốc, Ba kích có tác dụng chống lại các tác động bất lợi

của hydrocortisone đối với sự teo tuyến giáp, teo vỏ tuyến thượng thận [2]. Thêm

vào đó, Ba kích có thể được sử dụng chữa bệnh đau lưng, giảm vết thâm, đau mắt

và thậm chí cả đau răng, tác dụng tăng lực (theo nghiên cứu của Cui C. và cs


16

(1995), giảm đau chống viêm (nghiên cứu của Choi J. và cs, 2005), kháng viêm (các

nghiên cứu của Kim I.T. và cs, (2005) và Soon Y.Y. và Tan B.K. (2002)), tác dụng

chống stress (nghiên cứu của Li Y.H. và cs, 2001).

Ở nước ta, theo ghi nhận của Viện Dược Liệu, do sự khai thác quá mức trong

một thời gian dài từ trước năm 1975 cùng với việc rừng bị tàn phá nhiều làm cho số

lượng của cây Ba kích trong tự nhiên bị suy giảm nghiêm trọng và ngày càng khan

hiếm. Hiện nay, cây Ba kích đã được đưa vào trồng xen trong một số mô hình trang

trại nhỏ ở trung du và miền núi thấp phía Bắc như tại Phú Thọ, Thái Nguyên, Hòa

Bình, Tam Đảo...

1.3.1.4. Nghiên cứu một số loài cây thuộc chi Panax

Các loài cây thuốc thuộc chi Panax vốn là những dược liệu quý được sử dụng

từ lâu đời. Ở Việt Nam, theo Nguyễn Tập (2005) hiện có năm loài cây thuốc thuộc

chi Panax , ba trong số đó là những loài bản địa mọc tự nhiên, gồm Sâm Việt Nam

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng). Đặc biệt, Sâm Việt

Nam còn là loài đặc hữu hẹp của nước ta, hiện chỉ phân bố ở vùng núi Ngọc Linh

thuộc địa phận hai tỉnh Quảng Nam và Kon tum (vì vậy loài này còn có tên gọi là

Sâm Ngọc Linh) (Đỗ Huy Bích, 2003). Trên thế giới, Sâm Vũ Diệp được tìm thấy

ở Trung Quốc, bắc Mianma, đông-bắc Ấn Độ và Nêpal. Ở nước ta, Sâm Vũ Diệp

phân bố hẹp ở vùng núi Hoàng Liên Sơn (thuộc địa phận Sapa, Bát Xát, Lào Cai)

và huyện Than Uyên (Lai Châu). Sapa chính là điểm cực nam của bản đồ phân

bố Sâm Vũ Diệp trên thế giới (khoảng 23˚ vĩ Bắc) (Đỗ Huy Bích, 2003).

Khả năng bồi bổ sức khoẻ và chữa bệnh độc đáo của các loài dược liệu này đã

khiến trong một thời gian dài chúng bị khai thác mạnh mẽ và thiếu quy hoạch. Hiện

nay, cả số lượng và vùng phân bố của ba loài dược liệu trên ở Việt Nam đã suy

giảm nghiêm trọng, Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang thậm chí còn đứng trước nguy

cơ tuyệt chủng. Hiện trạng này đặt ra cho chúng ta một yêu cầu cần nhanh chóng có

các chiến lược bảo tồn, chọn tạo giống, phát triển nguồn tài nguyên dược liệu quý

giá nêu trên.


17

Các nghiên cứu về mặt hóa học và dược lý học

Dược liệu từ Sâm Việt Nam, Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang đều là thân rễ

và rễ củ. Hợp chất sinh học được quan tâm nhất của các loài sâm là các saponin

triterpen (gọi chung là ginsenoside). Các nghiên cứu dược học đã chỉ ra rằng hoạt

tính sinh học khác nhau của các saponin là do cấu trúc sapogenin và thành phần

đường quyết định [4, 86, 87]. Các nghiên cứu về dược lý học chỉ ra rằng Sâm Việt

Nam có tác dụng: ngăn chặn ung thư gây bởi các tác nhân hoá học (Takao

Konoshima và cộng sự, 1999); tác dụng bảo vệ gan in vitro ở chuột; tác dụng giảm

thời gian ngủ do thuốc pentobarbital và giảm tổn thương dạ dày ở chuột nhắt chịu

stress tâm lý (Nguyen T.T., 1996), cũng như có khả năng chống stress (Huong

N.T.T., 2005)… So với Sâm Việt Nam, các nghiên cứu về tác dụng dược lý của

Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang còn tương đối ít và mới mẻ [2].

Một vấn đề gặp phải đối với hai loài cây thuốc Tam thất hoang và Sâm Vũ

Diệp là trong tự nhiên, ngoài hai dạng hình thái điển hình (lá xẻ sâu của Sâm Vũ

Diệp và lá không xẻ của Tam thất hoang) còn tồn tại một số dạng hình thái trung

gian giữa hai dạng điển hình là lá xẻ nông. Hiện tượng này dẫn đến sự nhầm lẫn

và khó phân biệt hai loài dược liệu trên trong quá trình thu hái, chế biến và sử

dụng. Về mặt hình thái, việc xếp dạng trung gian này vào nhóm Sâm Vũ Diệp

hay Tam thất hoang vẫn chưa được thống nhất, tồn tại hai nhóm ý kiến trái

ngược là nên xếp những cá thể này vào loài Sâm Vũ Diệp hay Tam thất hoang.

Hiện tượng này gây khó khăn cho công tác kiểm định nguồn nguyên liệu làm thuốc

ban đầu (vốn chủ yếu dựa vào các chỉ thị cảm quan), dẫn đến chất lượng sản phẩm

kém ổn định.

Những dẫn liệu trên đây cho thấy rằng việc khai thác, sử dụng và phát triển

nguồn tài nguyên cây thuốc ở nước ta hiện nay tồn tại nhiều hạn chế và khó khăn.

Phần lớn các loài cây thuốc hiện nay được thu hái chủ yếu từ các nguồn tự nhiên,

thường không rõ về bản chất di truyền, thành phần hóa học cũng như các hoạt tính

sinh học. Phương pháp thu hái trên cho thấy một số nhược điểm như: (i) việc thu hái

không có quy hoạch các loài cây thuốc từ tự nhiên dễ gây suy kiệt nguồn tài nguyên


18

di truyền, do đó nhiều loài cây thuốc quý hiếm càng có nhiều nguy cơ bị tuyệt

chủng; (ii) việc thu hái này không đáp ứng được yêu cầu của công nghiệp sản xuất

dược phẩm do: nguồn nguyên liệu đầu vào không ổn định về mặt hóa học, hoạt chất

sinh học mong muốn, có thể nhầm lẫn với các loài cây có hình thái tương tự nhưng

lại không có hoạt tính mong muốn, thậm chí là có độc tính; (iii) các dạng nguyên

liệu tự nhiên có nguy cơ nhiễm độc cao (nhiễm chất diệt cỏ, thuốc trừ sâu, kim loại

nặng, vi sinh vật...).

Vì vậy, công tác tiêu chuẩn hóa và kiểm định dược liệu là một việc làm cấp

thiết. Để đảm bảo cho công tác bảo tồn và phát triển đa dạng di truyền các loài

dược liệu quý hiện nay ở Việt Nam, cần có sự đánh Cho đến nay, nước ta vẫn

chưa có sự quan tâm đúng mức đối với công tác phát triển các vùng nguyên liệu

cây thuốc. Thêm vào đó, công tác chọn tạo giống cây dược liệu và tiêu chuẩn

hóa nguồn dược liệu ban đầu cũng hạn chế, do đó chưa đáp ứng được nhu cầu

của thị trường trong nước. Nhiều công ty dược phẩm của Việt Nam hiện nay chủ

yếu đều sử dụng nguồn nguyên liệu nhập khẩu để phục vụ cho quá trình sản xuất

của mình (phần lớn được nhập về từ thị trường Trung Quốc do họ có thể đáp ứng

nhanh chóng nguyên liệu cho sản xuất với giá cả hợp lý, đạt chất lượng tốt và

phong phú về chủng loại).

Riêng đối với các loài cây thuốc, một trong những yêu cầu hàng đầu hiện

nay của nền công nghiệp dược phẩm dựa trên dược liệu tự nhiên là yêu cầu tiêu

chuẩn hóa nguồn nguyên liệu ban đầu. Trong đó, việc xác định thành phần các

hợp chất có hoạt tính sinh học, hoạt lực sinh học và độc tính, cũng như công tác

chọn tạo giống các loài cây thuốc có vai trò hết sức quan trọng. Trong quá trình

đó, việc phân tích các chỉ thị ADN cho phép đánh giá một cách chính xác mức

độ đa dạng di truyền của một loài cây thuốc nào đó nhằm định hướng bảo tồn,

chọn, tạo và nhân giống phù hợp, đáp ứng yêu cầu của quá trình phát triển một

nền công nghiệp chế biến dược liệu bền vững (Kalpana et al., 2004). Ngoài ra,

gần đây một số nghiên cứu còn cho thấy chỉ thị ADN ở các loài cây thuốc còn có

thể sử dụng như một công cụ hiệu quả giúp phân loại các dạng dược liệu có đặc


19

điểm hình thái giống nhau, hoặc giúp phát hiện các dạng dược liệu sai nguồn gốc

và dược liệu giả.

1.3.2. Chỉ thị ADN – Chỉ thị RAPD-PCR

Các phương pháp kiểm định dược liệu đang sử dụng hiện nay có nhiều hạn

chế. Các chỉ thị cảm quan về hình thái, mầu sắc, mùi, vị... đã được sử dụng từ lâu

theo kinh nghiệm dân gian để kiểm định dược liệu, song phương pháp này lại phụ

thuộc nhiều vào tính chủ quan của từng người nên dễ gây nhầm lẫn. Vì thế mà trên

thị trường, nhiều loại dược liệu quý hiếm hoặc có giá trị kinh tế cao có thể bị làm

giả hoặc được thay bằng các dược liệu có hình thái tương tự. Việc phân tích dược

liệu bằng các phương pháp hóa phân tích (như kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, sắc ký

lỏng cao áp, sắc ký cột, phương pháp khối phổ...) lại phụ thuộc nhiều vào các điều

kiện ngoại cảnh (thời điểm thu hái, điều kiện canh tác...), có chi phí cao và đòi hỏi

điều kiện phân tích nghiêm ngặt nên chỉ phù hợp trong các phòng thí nghiệm. Với

sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh học, đặc biệt là lĩnh vực sinh học

phân tử, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, các chỉ thị phân tử - trong đó có các

chỉ thị ADN - ngày càng được áp dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phân loại,

phân tích đa dạng sinh học, xác định đặc trưng cá thể và khoảng cách di truyền

giữa các cá thể hoặc quần thể thực vật nhằm mục đích định hướng bảo tồn và chọn

tạo giống cây trồng.

Chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị dựa trên bản chất đa hình ADN, được

sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa

các loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hoá giữa các loài (Ahn và cs,

1995; Zhang và cs, 1995).

Trong đó chỉ thị RAPD-PCR đã được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu về

tính đa dạng di truyền nhiều loài khác nhau trên thế giới như: Yu-ping-feng san

(Cheng và cs, 1998), Taxusbrevifolia (Gocmen và cs, 1996), Scutellaria

(Hosokawa và cs, 2000), Pelargonium graveolens (Shasany và cs, 2002)...

RAPD là một kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR. Phương pháp này dựa trên sự

nhân bản những phân đoạn ADN đích hoặc ngẫu nhiên với các mồi ngẫu nhiên.


20

Vào năm 1991, Welsh và McClellan đã phát triển nên một phép phân tích di

truyền dựa trên phản ứng PCR đặt tên là đa hình các đoạn ADN được nhân bản

ngẫu nhiên (RAPD). Quy trình này sẽ tìm ra sự đa hình trình tự nucleotide trong

phân tử ADN bằng việc sử dụng một mồi đơn có trình tự nucleotide ngẫu nhiên.

Trong phản ứng này, một mồi đơn sẽ gắn với ADN hệ gen ở hai vị trí khác nhau

nằm trên các chuỗi bổ sung của ADN mẫu. Nếu như những vị trí bắt cặp với nhau

nằm trong khoảng có thể nhân bản với từng vị trí, thì sẽ có một đoạn ADN riêng

biệt được tạo thành thông qua sự nhân bản của chu trình nhiệt. Trung bình, mỗi

một mồi sẽ xác định sự nhân bản ở một vài vị trí khác nhau trong hệ gen, qua đó

làm cho các phân tích trở nên có ích trong việc sàng lọc hiệu quả sự đa hình trong

trình tự nucleotide giữa các cá thể với nhau (William và cs. 1993). Tuy nhiên, dựa

vào tính chất ngẫu nhiên trong sự nhân bản ADN với các mồi có trình tự ngẫu

nhiên, cho nên điều quan trọng là cần phải tối ưu hóa và duy trì các điều kiện phản

ứng một cách nhất quán để đảm bảo sự nhân bản ADN. Những trình tự

oligonucleotide này đóng vai trò vừa là mồi xuôi vừa là mồi ngược, đồng thời

chúng thường có khả năng nhân bản các phân mảnh từ 1 - 10 vị trí của hệ gen một

cách đồng thời. Các sản phẩm được nhân bản (thường có kích thước nằm trong

khoảng từ 0,5 - 5 kb) phân tách được trên gel agarose với sự có mặt của ethidium

bromide và quan sát được dưới ánh sáng cực tím (Jones và cs, 1997) và sự có hay

không có mặt của băng sẽ có thể quan sát thấy. Những băng đa hình này được xác

định đầu tiên thông qua những khác biệt ở các vị trí gắn mồi, tuy nhiêu chúng

cũng có thể được hình thành từ sự khác biệt về chiều dài trong các trình tự được

nhân bản giữa các vị trí gắn mồi. Mỗi một sản phẩm thu được từ một vùng của hệ

gen đều chứa hai phân đoạn ngắn có trình tự có hướng ngược nhau, nằm trên các

chuỗi đối diện bổ sung với mồi. Keseli và cs. (1994) đã so sánh mức độ đa hình

của 2 loại chỉ thị phân tử, đó là chỉ thị RFLP và RAPD, bằng việc xác định giữa

hai giống cây rau diếp trong cấu trúc của bản đồ liên kết gen. Chỉ thị RFLP và

RAPD chỉ ra sự phân bố giống nhau dọc theo hệ gen, và chúng thể hiện sự tương

đồng cả về mức độ đa hình. Tuy nhiên, các locus RAPD được xác định nhanh hơn.


21

Ưu điểm

Ưu điểm chính của chỉ thị RAPD là khi phân tích nhanh và dễ dàng. Do liên

quan tới phản ứng PCR, nên chỉ cần một lượng ADN mẫu tương đối ít, thường là

sử dụng từ 5 - 50 ng trên một phản ứng. Bởi vì các mồi là ngẫu nhiên, nên trình tự

cấu trúc hệ gen không cần biết trước. Chúng là các chỉ thị đồng trội và do đó

chúng có những giới hạn trong việc sử dụng là một chỉ thị để lập bản đồ, điều này

đã được khắc phục để có thể mở rộng hơn bằng cách lựa chọn những chỉ thị này

được liên kết thành cặp với nhau (Williams và cs, 1993).

Tóm lại so với các chỉ thị truyền thống (chỉ thị hình thái, chỉ thị hóa học,...)

các chỉ thị RAPD-PCR có các ưu điểm nổi bật như sau:

- Dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm (phép phân tích nhanh,

đơn giản) với chi phí tương đối thấp.

- Có phạm vi đánh giá toàn bộ hệ gen của đối tượng nghiên cứu.

- Không phụ thuộc vào các yếu tố môi trường (các yếu tố môi trường ít

nhiều có ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gen).

- Không phụ thuộc vào hiện tượng tương tác giữa các gen.

- Không phụ thuộc hiệu quả biểu hiện kiểu hình của các gen (chẳng hạn như

các gen đột biến, gen gây chết, gen lặn thường không được biểu hiện kiểu hình

trong tự nhiên).

- Có thể phát hiện các dạng biến dị ADN trong các giai đoạn khác nhau

hoặc giữa các bộ phận khác nhau ở thực vật.

Hạn chế của kỹ thuật RAPD-PCR

Khó khăn chính của chỉ thị RAPD chính là khả năng lặp lại thấp

(Schierwater và Ender, 1993), và do quy trình về mặt thí nghiệm rất cần thiết phải

có độ tiêu chuẩn hóa cao, bởi vì độ nhạy của chỉ thị RAPD đối với các điều kiện

phản ứng. Để hạn chế nhược điểm này, ta cần tuân thủ nghiêm ngặt các điều kiện

thí nghiệm, tiến hành đồng bộ giữa các lần thí nghiệm, hoặc sử dụng số lượng mồi

RAPD-PCR đủ lớn trong nghiên cứu để giảm sai số thí nghiệm.


22

Phân tích RAPD thường cần được tinh sạch, phân tử ADN có trọng lượng

phân tử cao, và cần có sự phòng ngừa khả năng lây nhiễm của các mẫu ADN. Nhìn

chung, với những tồn tại vốn có về khả năng lặp lại của mình, chỉ thị RAPD không

phải là chỉ thị phù hợp đối với việc chuyển giao hay so sánh các kết quả giữa các

nhóm nghiên cứu ở cùng một loài hoặc một đối tượng nào đó. Cũng giống như hầu

hết các kỹ thuật đa locus khác, chỉ thị RAPD không phải là một chỉ thị đặc hiệu

locus, các thông tin thu được từ các băng không thể làm sáng tỏ định nghĩa về các

locus và alen (sự đồng trội của các chỉ thị) đồng thời những phân đoạn có kích

thước giống nhau có thể không phải là đồng hợp. Chỉ thị RAPD được cho rằng dễ

dàng để tiến hành bởi nhiều phòng thí nghiệm khác nhau, tuy nhiên tính lặp lại

không đạt được ở mức độ như ý (Jones và cs. 1997).

Với những đặc điểm như trên, kỹ thuật RAPD -PCR có triển vọng lớn không

những có thể áp dụng hiệu quả để đánh giá đa dạng di truyền, mà còn là công cụ

hữu hiệu giúp bảo tồn, phát triển nguồn gen cây dược liệu và kiểm định nhanh dược

liệu, đặc biệt là các dược liệu dễ nhầm lẫn trong quá trình thu hái hoặc sau khi sơ

chế, từ các loài thảo dược ở Việt Nam trong tương lai.

1.3.3. Mục tiêu của đề tài

Với những ưu điểm nổi bật của chỉ thị ADN (cụ thể là chỉ thị RAPD-PCR) kể

trên đã gợi ý cho chúng tôi thực hiện đề tài “Phân tích đa dạng di truyền nguồn tài

nguyên một số loài cây dược liệu ở Việt Nam bằng chỉ thị ADN”. Từ vai trò thực

tiễn của các loài dược liệu trong nền y học cổ truyền và hiện đại, cùng với thực

trạng phân bố, khai thác chúng hiện nay chính là nguyên nhân gợi ý chúng tôi đã

lựa chọn các loài dược liệu dưới đây làm đối tượng trong nghiên cứu này:

- 2 loài là Ngũ gia bì gai (Acanthopanax trifoliatus) và Ngũ gia bì hương (A.

gracilistylus) thuộc chi Acanthopanax;

- Loài cây thuốc Hồi hương (Illicium verum Hook.f) và một số loài hồi núi;

- Cây Ba kích (Morinda officinalis How) với các kiểu hình thái phổ biến hiện

nay;


23

- Loài sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv), sâm Vũ Diệp

(Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et

K.M. Feng), và dạng hình thái trung gian giữa sâm Vũ Diệp-Tam thất hoang (thuộc

chi Panax).

Chỉ thị ADN chúng tôi sử dụng ở đây chính là chỉ thị RAPD-PCR. Với nhóm

đối tượng và phương pháp cụ thể như trên, chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm:

- Đánh giá mức độ đa dạng di truyền một số loài cây thuốc: các mẫu hai loài

Ngũ gia bì gai (Acanthopanax trifoliatus) và Ngũ gia bì hương (A. gracilistylus);

các mẫu thuộc tập hợp đầy đủ nhất về cây Hồi hương (Illicium verum) với một số

loài hồi núi; các dạng hình thái khác nhau của cây Ba kích; và các mẫu thuộc loài

Sâm Việt Nam, Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang nhằm định hướng bảo tồn và phát

triển nguồn gen của các loài cây thuốc này.

- Bên cạnh đó, sử dụng phương pháp RAPD-PCR, chúng tôi hi vọng bước đầu

có thể xác định được một số tập hợp chỉ thị ADN giúp phân biệt nhanh các loài cây

thuốc có hình thái tương tự như đã trình bày ở trên. Từ đó, cung cấp một công cụ bổ

sung cho công tác kiểm định dược liệu ở Việt Nam trong tương lai.

Ch��ng 2. V�t li�u - Ph��ng pháp NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ

24

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU THỰC VẬT

Các mẫu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu đều được thu thập và cung

cấp bởi Khoa Tài nguyên dược liệu, Viện Dược liệu (Bộ Y tế) cung cấp. Bảng 4 liệt

kê danh sách các loài, các mẫu và địa điểm thu thập mẫu trong nghiên cứu. Tập hợp

mẫu trong nghiên cứu thuộc các loài có đặc điểm hình thái tương đối đa dạng (từ

thân bụi, thân thảo đến thân gỗ). Các mẫu thực vật sau khi đưa về phòng thí nghiệm

được rửa sạch dưới vòi nước máy và phân loại riêng rẽ thành các phần lá, thân và

rễ. Các phần mô dập nát hoặc có biểu hiện nhiễm bệnh được cắt bỏ. Sau đó, các

mẫu được lau sạch bằng ethanol 70%; rồi nghiền trong nitơ lỏng bằng chày và cối

được khử trùng từ trước thành dạng bột mịn có kích thước hạt nhỏ hơn 1 mm. Mẫu

nghiền được bảo quản trong ống Falcon ở điều kiện nhiệt độ -80оC để làm nguyên

liệu tách chiết ADN tổng số.

2.1.1. Chi Acanthopanax

Các mẫu thực vật thuộc chi Acanthopanax được sử dụng trong nghiên cứu là

hai loài cây thuốc Acanthopanax trifoliatus (ký hiệu chữ cái đầu tiên là G) và A.

gracilistylus (ký hiệu là H) được thu thập tại 4 tỉnh miền Bắc nước ta, gồm Lào Cai,

Hà Giang, Cao Bằng và Lạng Sơn (Hình 1).

Ngũ gia bì gai

Ngũ gia bì gai là loài cây bụi nhỡ, cao 1 - 7 m, mọc dựa, cành vươn dài, có

gai (hình 1a). Lá kép chân vịt, mọc so le, gồm 3 - 5 lá chét, thường là 3, hình bầu

dục hoặc thuôn, gốc tròn, đầu nhọn, dài 5 - 8 cm, rộng 2 - 4 cm, lá chét giữa lớn

hơn, mép khía răng to, gân lá có gai, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng. Cuống lá kép

dài 4 - 7 cm, có gai. Cụm hoa mọc ở đầu cành, gồm 3 - 10 tán, có cuống dài 3 -4

cm. Hoa nhỏ, mẫu 5, màu trắng lục, lá đài không rõ, cánh hoa hình tam giác, nhị 5,

chỉ nhị mảnh, bầu hạ, 2 ô (Hình 1b). Quả mọng, hình cầu dẹt, khi chín có màu đen,

có 2 hạt. Toàn cây có tinh dầu thơm [2].


25

Bảng 4. Danh sách mẫu cây dược liệu được thu thập và phân tích trong nghiên cứu (các mẫu được

cung cấp và phân loại bởi các cán bộ của Phòng Tài nguyên, Viện Dược liệu, Bộ Y tế).

Loại mẫu Địa điểm thu mẫu Số

lượng Ký hiệu Chi

(họ)

Loài

(dạng đặc điểm hình thái)

Acan

thop

an

ax

(Ara

lia

cea

e) Ngũ gia bì gai

Thị trấn Sapa, Lào Cai 4 GLC1-GLC4

Bản Khoang, Sapa, Lào Cai 2 GLC5-GLC6

Thạch An, Cao Bằng 3 GCB1-GCB3

Tràng Định, Lạng Sơn 3 GLS1-GLS3

Văn Lãng, Lạng Sơn 2 GLS4-GLS5

Ngũ gia bì hương

Thị trấn Sapa, Lào Cai 3 HLC1-HLC3

Bản Khoang, Sapa, Lào Cai 5 HLC4-HLC8

Phó Bảng, Hà Giang 4 HHG1-HHG4

Illi

ciu

m (

Illi

aceae)

Hồi hương

Na Rì, Bắc Kạn 16 IB1 – IB16

Thạch An, Cao Bằng 4 IC1 – IC4

Văn Quan, Lạng Sơn 10 IL1 – IL10

Bình Liêu, Quảng Ninh 10 IQ1 – IQ10

Hồi núi Bát Xát, Lào Cai 9 N1 – N9

Hoàng Liên Sơn, Lào Cai 7 N10 – N16

Mo

rin

da (

Ru

bia

cea

e)

Ba Kích

(loại thân có lông, quả tụ) Chân Mộng, Đoan Hùng, Phú Thọ 3 BLT1-BLT3

Ba Kích

(loại thân có lông, quả rời) Chân Mộng, Đoan Hùng, Phú Thọ 4 BLR1-BLR4

Ba Kích

(loại thân không lông, quả tụ)

Chân Mộng, Đoan Hùng, Phú Thọ 3 BKT1-BKT3

Lâm trường Tân Lạc, Hòa Bình 2 BKT4-BKT5

Ba Kích

(loại thân không lông, quả rời)

Chân Mộng, Đoan Hùng, Phú Thọ 3 BKR1-BKR3

Lâm trường Tân Lạc, Hòa Bình 2 BKR5-BKR6

Quân Chu, Đại Từ, Thái Nguyên 4 BKR7-BKR10

Ba Kích

(loại thân có lông, đồng thời có cả

quả tụ và quả rời) Chân Mộng, Đoan Hùng, Phú Thọ 2 BL1-BL2

Ba Kích

(loại thân không lông, đồng thời

có cả quả tụ và quả rời) Chân Mộng, Đoan Hùng, Phú Thọ 1 BK1

Pa

na

x L

. (A

rali

acea

e)

Sâm Việt Nam

Trà Linh, Nam Trà My, Quảng Nam 9 S1 – S9

Ngọc Lây, Tumơrông, Kon tum 3 S10 – S12

Bản Khoang, Sapa, Lào Cai 2 S13 – S14

Sâm Vũ Diệp Bản Khoang, Sapa, Lào Cai 8 V1 – V8

Dạng trung gian của Sâm Vũ

Diệp và Tam thất hoang Bản Khoang, Sapa, Lào Cai 4 VT1 – VT4

Tam thất hoang Bản Khoang, Sapa, Lào Cai 8 T1 – T8

Ngũ gia bì hương

Ngũ gia bì hương là loài cây bụi, mọc dựa, cao vài mét (hình 1c). Vỏ thân và

cành có màu xám nhạt, có gai thưa. Lá kép chân vịt, mọc so le hoặc tụ tập thành 2 - 3


26

lá, gồm 5 lá chét hình trứng hoặc thuôn, dài 2 - 6 cm, rộng 1 - 3 cm, lá chét giữa to,

những lá chét bên nhỏ dần về phía cuống, mép có răng cưa và lông cứng, hai mặt

nhẵn, sẫm bóng ở mặt trên. Cuống lá dài 2 - 6 cm, nhẵn. Cụm hoa thường mọc đơn

độc ở kẽ lá thành tán, cuống tán dài 2 - 3,5 cm, hoa nhỏ màu vàng lục (hình 1d). Quả

hình cầu dẹt, khi chín màu đen, chứa hai hạt.

Hình 1. Ảnh các loài thực vật thuộc chi Acanthopanax trong nghiên cứu: a-b) Bụi cây, lá và hoa cây

Ngũ gia bì gai; c-d) Bụi cây, lá và hoa cây Ngũ gia bì hương.

2.1.2. Chi Illicium

Để phục vụ cho nghiên cứu chúng tôi tiến hành điều tra và thu thập các mẫu

thực vật thuộc loài Hồi hương (Illicium verum Hook.f) cùng với các loài Hồi núi tại

một số tỉnh miền bắc Việt Nam như Bắc Kạn, Cao Bằng, Lạng Sơn và Quảng Ninh

(các mẫu Hồi hương) và tại Lào Cai (với các mẫu Hồi núi).

Cây Hồi hương (Illicium verum Hook.f)

Cây Hồi hương là loài cây thân gỗ, thường xanh, cao trung bình từ 6 - 8 m.

Cành thẳng, nhẵn, lúc non màu lục nhạt, sau chuyển sang nâu xám. Lá mọc so le,

nhưng thường tụ ở những mấu trông như mọc vòng, hình mác hoặc trứng thuôn [2,

28]. Hoa hồi mọc riêng lẻ hoặc 2 - 3 cái ở kẽ lá, dài 5 răng, dễ rụng, mép là viền

hồng, cánh hoa 5 - 6 đều nhau, màu hồng sẫm dần về phía giữa; nhị thụt, nhẵn, chỉ

nhị rộng mập, trung đới dày. Hoa hồi thuộc loại hoa lưỡng tính [28].

Quả cấu tạo bởi 8 đại đều và rời nhau. Các đại hình thoi xếp tỏa tròn thành

hình sao hay hình nan hoa xung quanh một trục, khi non màu xanh lục sau chuyển

màu nâu sẫm, phần đính cuống rộng bản và dẹt, đầu có mũi nhọn ngắn, thẳng, khi

chín nứt ở mặt trên. Mỗi một đại mang một hạt. Hạt hồi thường có hình trứng nhẵn

bóng, màu nâu hoặc đỏ nhạt [2, 28].

a b c d


27

Hồi núi

Theo Đỗ Huy Bích và cộng sự (2003), Hồi núi ở Việt Nam là những cây thân

gỗ nhỡ hoặc to, cao trung bình từ 7 - 14 m, tán lá tròn. Cây Hồi núi có cành non

mềm có vỉ màu lục nhạt cành khi già có màu xám tro. Hoa Hồi núi thường mọc đơn

độc ở kẽ lá, màu hồng đỏ như I. griffithii [2], hay vàng nhạt như I. anasitum, có

cuống thường dài hơn cuống lá. Quả Hồi núi thường có nhiều cánh khoảng từ 10

đến 13 cánh mọc tỏa tròn, thường mỏng và không đều nhau. Lá Hồi núi thường mọc

so le, thường tụ tập 4 - 5 cái, hình mác, dai và nhẵn, đầu nhọn.

Hình 2. a-b) Hình thái lá và quả cây Hồi hương (Illicium verum Hook.f); c-d) Hình thái lá và quả

của cây Hồi núi (I. anasitum).

2.1.3. Chi Morinda

Cây Ba kích có đặc điểm hình thái cơ bản như sau (Đỗ Huy Bích và cs, 2003): dạng

cây thảo, sống lâu năm, thân leo dài hàng mét, đường kính thân từ 3 - 5 mm và

có nhiều lóng. Lá mọc đối hình mác hoặc bầu dục, thuôn nhọn, dày và cứng, dài

6 - 14 cm, rộng 2,5 - 6 cm, cuống ngắn, lúc non có lông dày ở mặt dưới, thường

tập trung ở các gân lá và mép lá, mầu xanh lục, sau già ít lông hơn mầu trắng

mốc; lá kèm mỏng, ôm sát vào thân.

Tập hợp mẫu cây Ba kích được thu thập tại các tỉnh Phú Thọ, Thái Nguyên,

Hòa Bình và được phân loại dựa trên 2 đặc điểm hình thái chính (hình thái thân có

lông và thân không có lông; hình thái ba kích quả tụ và quả rời) do các chuyên gia

của Viện Dược Liệu xác định. Kí hiệu các mẫu bao gồm hai chữ cái thể hiện hai đặc

điểm hình thái thân có (không có) lông (L hoặc K) và quả tụ (rời) (T hoặc R) kèm

theo số thứ tự của mẫu (kí hiệu cụ thể ở Bảng 4). Trong số các mẫu thu thập được

có những mẫu có cả đặc điểm hình thái quả tụ và quả rời trên cùng một chùm quả.

Để tiện theo dõi, chúng tôi kí hiệu là L và K (Bảng 4).

a b c d


28

Hình 3. Hình thái các loại kiểu hình của cây ba kích sử dụng trong nghiên cứu: a) quả tụ; b) quả

rời; c) thân có lông; d) thân không có lông.

2.1.4. Chi Panax

Tổng cộng 34 mẫu thực vật đã được thu thập hoặc từ các điểm trồng bảo tồn

hoặc mọc tự nhiên ở vùng Sapa thuộc tỉnh Lào Cai và Ngọc Linh thuộc địa phận hai

tỉnh Quảng Nam và Kon tum (Bảng 4). Đặc biệt, trong số các mẫu cây thuốc thu

thập được có một số cây có kiểu hình lá xẻ nông, hiện tại về mặt hình thái chưa

thống nhất xếp vào loài Sâm Vũ Diệp (có kiểu hình thái lá xẻ sâu điển hình) hay

loài Tam thất hoang (có kiểu hình thái lá không xẻ). Trong nghiên cứu này, chúng

tôi tạm gọi những mẫu thực vật đó là Dạng trung gian (TG) Sâm Vũ Diệp – Tam

thất hoang.

Sâm Việt Nam (Sâm Ngọc Linh, Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

Về mặt hình thái, Sâm Việt Nam là loài cây thân thảo, cao từ 40 đến 80 cm, có

thân rễ nạc mọc bò ngang. Thân rễ phân thành nhiều đốt nhưng không phân nhánh,

dài chừng 30 đến 40 cm, trên bề mặt có nhiều vết sẹo do thân khí sinh lụi hàng năm

để lại, mặt ngoài màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phía cuối đôi khi có củ hình cầu.

Thân khí sinh của cây Sâm Việt Nam mảnh, mọc thẳng, lụi hàng năm, mang

từ 2 đến 4 lá kép chân vịt mọc vòng. Mỗi lá kép có 5 lá chét hình mác với mép có

khía răng nhỏ, dài khoảng 10 đến 14 cm, rộng từ 3 đến 5 cm. Ngọn thân có cụm hoa

mọc thành tán đơn, cuống dài màu lục vàng. Quả Sâm Việt Nam hình trứng, màu đỏ

sau đen, hạt màu trắng hình thận, có vân (Đỗ Huy Bích, 2003).

Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)

Về hình thái, Sâm Vũ Diệp là cây thân thảo, cao từ 30 đến 50 cm, có thân rễ

dài và vặn vẹo, phân nhiều đốt, đầu rễ có hình con quay. Thân khí sinh mảnh, có

a b c d


29

vạch dọc, thường đơn độc, mọc thẳng và rỗng giữa. Lá kép chân vịt gồm 2 đến 3 lá

mọc vòng. Lá chét từ 5 đến 7, thuôn, dài từ 2,5 đến 14 cm, rộng từ 1,5 đến 4 cm,

mặt trên có lông. Lá chét xẻ thùy hình lông chim rõ rệt, mép khía răng. Cụm hoa

mọc ở ngọn thân thành tán đơn, hoa màu trắng lục có 5 cánh, 5 nhị, bầu 2 đến 3 ô.

Quả mọng, hình cầu hơi dẹt, màu đỏ, có chấm đen ở đầu, chứa từ 2 đến 3 hạt hình

cầu.

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng)

Về đặc điểm hình thái, Tam thất hoang là cây thân thảo, cao từ 25 đến 75 cm.

Thân rễ mập, nằm ngang, ít khi phân nhánh, đường kính từ 1,5 đến 3 cm, có nhiều u

lồi dính kết nhau. Bề mặt thân rễ có nhiều sẹo lõm do các vết thân lụi để lại. Thân

khí sinh mọc thẳng, nhẵn, mang từ 1 đến 3 lá kép chân vịt mọc vòng ở ngọn, cuống

lá từ 5 đến 10 cm. Lá chét có 5 cái, cuống ngắn, gốc cuống đôi khi có phần phụ hình

tai hoặc hình chỉ, phiến lá chét hình thuôn hay mác, không xẻ thuỳ, dài từ 5 đến 13

cm, rộng từ 2 đến 4 cm. Mép lá chét có răng cưa, thường có lông ở gân lá mặt trên.

Một số cây non có thể có lá chét xẻ thuỳ nông hình lông chim. Cụm hoa là tán đơn,

mọc ở ngọn, hoa màu vàng xanh, 5 lá đài, 5 cánh hoa, 5 nhị, bầu 2 ô. Quả mọng,

hình cầu dẹt, đường kính từ 0,6 đến 1,2 cm, khi chín có màu đỏ. Hạt lớn, dài từ 5

đến 6 mm, hình gần giống hạt đậu tròn, màu xám trắng, vỏ cứng, có rốn hạt

(Nguyễn Tập, 2005).

Hình 4. Các loài thực vật thuộc chi Panax trong nghiên cứu: a) Sâm Việt Nam (P. vietnamensis);

b) Sâm Vũ Diệp (P. bipinnatididus); c) dạng trung gian giữa Sâm Vũ Diệp-Tam thất hoang; d) Tam

thất hoang (P.stipulenatus).

a b c d


30

Hình 5. Bản đồ các địa phương thu mẫu dược liệu trong nghiên cứu (theo điều tra của các cán bộ

Phòng tài nguyên, Viện Dược liệu, Bộ Y tế).

Trà Linh, Trà My,Quảng Nam

Ngok Lây, Tumorong, Kon Tum

Bản Khoang, Sapa, Lào Cai

Thị trấn Sapa, Lào Cai

Thạch An, Cao Bằng

Tràng Định, Lạng Sơn

Văn Lãng, Lạng Sơn

Bát Xát, Lào Cai

Hoàng Liên Sơn, Lào Cai

Na Rì, Bắc Cạn

Văn Quan, Lạng Sơn

Bình Liêu, Quảng Ninh

Tân Lạc, Hòa Bình

Đoan Hùng, Phú Thọ

Đại Từ, Thái Nguyên

SƠ ĐỒ THU MẪU

Địa điểm thu mẫu chi Acanthopanax

Địa điểm thu mẫu chi Illicium

Địa điểm thu mẫu chi Morinda

Địa điểm thu mẫu chi Panax

Thái Nguyên

Phú Thọ

Hòa Bình

Quảng Nam

Kon Tum

Cao Bằng

Bắc Cạn

Lạng Sơn

Quảng Ninh HÀ NỘI

Lào Cai


31

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số bằng phương pháp mini-CTAB cải tiến

Để thu ADN tổng số (ADNts), chúng tôi đã tiến hành tách chiết ADNts từ các

mẫu thực vật theo phương pháp mini-CTAB (do Saghai-Maroof và cộng sự đưa ra

năm 1984) có cải tiến.

Cơ sở lý thuyết

Phương pháp này sử dụng CTAB (Hexadecyltrimethylammoniumbromid) –

một chất tẩy cation hình thành phức hợp với những polysaccharide, protein,

polyphenol, …Phức hợp này sau đó được tách ra khỏi dung dịch tách chiết bằng

hỗn hợp chloroform – isoamyl alcohol, bằng cách hình thành 2 pha: pha thứ nhất là

dung dịch sạch ở phía trên có chứa ADN, pha thứ hai đặc hơn ở dưới chứa

chloroform và tất cả những thành phần cần loại bỏ khác (polysaccharide,

protein,…). Sau khi ly tâm, thu được ADN. Thông thường quy trình ly trích ADN ở

thực vật gồm 3 giai đoạn:

• Giai đoạn 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân. Tế bào lá được nghiền với

dịch trích EB (extraction buffer) để phá vỡ màng tế bào, giải phóng các thành phần

có trong tế bào ra ngoài môi trường dịch trích.

• Giai đoạn 2: Làm biến tính protein, loại bỏ protein và các thành phần hữu

cơ khác (polysaccharide, polyphenol, lipid,…).

• Giai đoạn 3: Tủa ADN bằng isopropanol hay ethanol 100 %, thường tủa

bằng isopropanol lạnh trước, sau đó tiếp tục tủa bằng ethanol 100 % kết hợp với

muối.

Quy trình thực hiện

Quy trình tách chiết được mô tả ngắn gọn như sau:

1. Cân 200 mg mẫu đã nghiền thành dạng bột mịn trong nitơ lỏng vào ống

Eppendorf 1,5 ml

2. Bổ sung 900 µl dung dịch CTAB 2%, trộn đều bằng cách đảo ống nhẹ nhàng

và ủ ở 65оC trong 90 phút

3. Làm nguội về nhiệt độ phòng, bổ sung 450 µl chloroform/isoamylalcohol (tỷ


32

lệ 24:1 v/v), đảo nhẹ hai đầu ống để trộn đều và để ở nhiệt độ phòng trong 10

phút

4. Ly tâm ở 4оC trong 10 phút với tốc độ 13.000 – 14.000 vòng/phút

5. Dùng pipet hút phần dịch nổi bên trên chuyển sang một ống Eppendorf sạch

6. Bổ sung 600 µl iso-propanol, trộn đều bằng cách đảo đầu ống nhẹ nhàng, ủ

trong tủ lạnh từ 3 - 12 giờ.

7. Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 10 phút với tốc độ 13.000 - 14.000 vòng/phút

8. Đổ bỏ phần dịch phía trên và rửa ADN tủa bằng 800 µl dung dịch Wash I

trong 5 phút

9. Ly tâm thu lại tủa ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

10. Rửa ADN tủa bằng 100 µl dung dịch Wash II (ethanol 70%) trong 5 phút

11. Ly tâm thu lại tủa ở 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, để tủa

khô tự nhiên

12. Hoà tan ADN kết tủa trong 100 µl đệm TE, bảo quản ở 4оC

Kiểm tra chất lượng ADNts bằng phương pháp điện di và quang phổ

Vật liệu để tách chiết ADNts là thân, rễ và lá của các mẫu đã được nghiền

mịn. Chúng tôi đã tiến hành tách chiết riêng rẽ các phần của mẫu thực vật và so

sánh hàm lượng ADN thu được bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%

(0,8 g agarose + 100 ml TBE 1X) ở 60 - 80 V trong 30 phút để xác định bộ phận

cho hiệu suất thu ADN cao nhất sử dụng cho các thí nghiệm tách chiết tiếp theo.

Nồng độ và kích thước tương đối của sản phẩm ADNts được xác định bằng cách so

sánh với marker Lambda/HindIII.

Tiếp đó, sản phẩm ADNts được pha loãng 100 lần (10 µl ADNts + 990 µl

ddH2O) cho thí nghiệm đo mật độ quang phổ (OD – Optical Density) bằng máy đo

quang phổ Biomate ở các bước sóng 260 và 280 nm. Mức tinh sạch của sản phẩm

(mức độ lẫn ARN và protein) được xác định bằng tỷ số quang phổ hấp thụ

OD260/OD280. Nồng độ ADN của dung dịch gốc được tính theo công thức 1,0 OD260

= 50 ng/µl.


33

2.2.2. Phân tích di truyền bằng kỹ thuật RAPD-PCR


PCR (Polymerase chain reaction) là phương pháp tổng hợp lượng lớn ADN

in vitro trên cơ sở mẫu khuôn. Quá trình tổng hợp ADN kéo dài mồi dựa trên

nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn ADN có trình tự bổ sung và khả năng kéo

dài chuỗi của enzym bền nhiệt (phổ biến là Taq polymerase - phân lập từ vi khuẩn

chịu nhiệt Thermus aquaticus). PCR gồm một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có ba

bước: biến tính, gắn mồi và kéo dài chuỗi. Kết quả, sau khoảng 2 - 3 giờ, lượng

ADN sẽ được nhân bản lên khoảng 200 - 500 lần.

Kỹ thuật RAPD-PCR ra đời ngay sau khi phản ứng PCR được phát triển, là

kỹ thuật nhân bản ADN hệ gen sử dụng các mồi tổng hợp ngắn (phổ biến nhất là 10

nucleotide) có trình tự ngẫu nhiên trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi thấp. Điểm khác

biệt rõ nét nhất của kỹ thuật RAPD-PCR so với các kỹ thuật PCR truyền thống là

chỉ có một trình tự oligonucleotide được sử dụng làm mồi trong một phản ứng, và

những hiểu biết về các đoạn gen được nhân lên là không cần thiết.

Với nhiệt độ gắn mồi phù hợp, các mồi oligonucleotide trình tự ngẫu nhiên

sẽ gắn vào một vài vị trí có trình tự bổ sung trên sợi khuôn ADN và cho sản phẩm

nhân bản nếu các vị trí gắn mồi nằm trong phạm vi có thể nhân bản được. Sự khác

biệt về trình tự nucleotide của các khuôn ADN khác nhau được thể hiện ở sự có mặt

hay vắng mặt của các băng nhân bản.

Quy trình thực hiện

Phản ứng RAPD-PCR được tiến hành trên tất cả các mẫu với tổng cộng 40

mồi ngẫu nhiêu 10 nucleotide (Operon Technologies, Mỹ) bao gồm OPA-1 đến

OPA-20; OPC-1 đến OPC-20. Thành phần và quy trình nhiệt của phản ứng RAPD-

PCR được trình bày trong Bảng 5.


34

Bảng 5. Thành phần (Bảng bên trái) và quy trình nhiệt (Bảng bên phải) của phản ứng RAPD-

PCR

2.2.3. Điện di ADN trên gel agarose

Sản phẩm nhân bản được phân tích trên gel điện di agarose 1 – 1,5% chạy ở

hiệu điện thế 60 – 80 V trong 45 phút bằng phương pháp nhuộm hiện hình với

ethidium bromide. Kích thước tương đối của các băng nhân bản được so sánh với

marker 1 kb (Fermentas, 1 kb ADN Ladder).


Trong môi trường có pH trung tính, ADN mang điện tích âm. Do đó, khi được

đặt trong một điện trường đều, ADN sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương. Trên

môi trường chất giá agarose, các đoạn ADN có kích thước khác nhau sẽ di chuyển

với tốc độ khác nhau (đoạn ADN có kích thước lớn hơn sẽ di chuyển chậm hơn

đoạn ADN có kích thước nhỏ hơn) và sẽ tách biệt nhau trong quá trình chạy.

Quy trình

Chuẩn bị gel agarose

- Cân bột agarose rồi hoà tan vào đệm TBE 1X sao cho được nồng độ 0,8%.

- Đun sôi dịch agarose cho đến khi tan hết và để dịch nguội đến khoảng 50oC

thì đổ vào khuôn có cài sẵn răng lược.

- Gel sẽ đông và ổn định hoàn toàn trong khoảng 30 phút.

- Rút lược nhẹ nhàng ra khỏi khuôn, đặt gel vào bể điện di, đổ đệm TBE 1X

tới khi ngập mặt gel.

Tra mẫu ADN vào giếng

Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

ddH2O 16,3

ADN khuôn 1,0

10x Taq buffer 2,5

2 mM dNTPs 2,5

Mồi (10-mer Operon) 2,0

5 u/µl Taq polymerase 0,7

Tổng thể tích phản ứng: 25 µl

Nhiệt độ (оC) Thời gian Số chu kỳ

94 4’ 1

94 1’

40 37 1’

72 2’

72 7’ 1

4 ∞ 1


35

- Tùy thuộc vào mục đích điện di khác nhau mà ta có thể sử dụng nồng độ

ADN cao hoặc thấp.

- Tra mẫu sau khi đã đổ đệm TBE 1X vào khuôn điện di cho ngập gel. Mẫu

được trộn với loading dye 6X với tỷ lệ mẫu: loading dye là 5:1 và được đưa vào

giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với hiệu điện thế 75 V trong khoảng

45 phút.

- Trong quá trình chạy, cần quan sát sự di chuyển của bromophenol để biết

lúc nào cần dừng điện di.

Nhuộm ADN bằng ethidium bromide: Quá trình điện di kết thúc khi băng màu

bromopenol chạy được 2/3 bản gel agarose, bản gel được lấy ra khỏi khuôn và

ngâm vào dung dịch ethidium bromide nồng độ 0,5 µg/ml trong khoảng 15 phút rồi

rửa lại bằng nước.

Quan sát và chụp ảnh: Bản gel sau khi nhuộm ethidium bromide được quan sát

dưới ánh sáng tử ngoại với bước sóng λ = 302 nm.

2.2.4. Dựng cây quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYSpc 2.02h

Với sự phát triển của sinh học phân tử, người ta có xu hướng phân nhóm đa

dạng di truyền ở mức độ phân tử. Như vậy, sự chính xác sẽ cao hơn rất nhiều so với

phương pháp truyền thống dựa trên tính trạng hình thái học. Người ta khai thác

những khả năng phân tích rất nhanh nhạy của máy tính (computer) với nhiều phần

mềm chuyên dùng, trong đó NTSYS là phần mềm tương đối phổ biến. Trong

nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phiên bản phần mềm NTSYSpc 2.02h

(Numerical Taxonomy System Applied Biotstatistics, Setauket, New York).

Các kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR được chuyển thành dạng ma trận

nhị phân. Từ ma trận nhị phân nói trên, sử dụng hệ số tương quan DICE (SD), ma

trận tương đồng theo từng cặp được xây dựng. Hệ số SD được tính bằng hai lần số

băng chung của hai mẫu chia cho tổng số băng thu được của hai mẫu đó (S = 2NAB /

(NA + NB)). Như vậy, hệ số thu được là 1 có nghĩa là hai mẫu hoàn toàn giống nhau,

trong khi 0 có nghĩa là hai mẫu không có điểm chung nào. Cuối cùng, cây quan hệ


36

di truyền giữa các mẫu được xây dựng theo phương pháp UPGMA (Unweighted

Pair-Group Method with Arithmetical Averages).

Theo nội dung này, chúng ta cho điểm 1 khi có băng thể hiện, và điểm 0 khi

băng không thể hiện trong điện di.

Phân tích ma trận tương đồng, ma trận khoảng cách (similarity / distance matrix)

Các giá trị tương đồng và khoảng cách là những giá trị ước đoán về mặt số

lượng nhằm mô tả sự gần gũi và khoảng cách di truyền giữa hai cặp đơn vị mục

tiêu. Giá trị tương đồng biến thiên từ 0 đến 1. Khoảng cách giảm khi giá trị tương

đồng tăng. Khoảng cách (distances) còn được dùng với thuật ngữ “dissimilarities”

Sokal và Sneath (1963) mô tả nhiều cách tính toán khoảng cách và mức độ giống

nhau giữa hai đơn vị mục tiêu. Khi giá trị ở dạng nhị phân (binary), nghĩa là 1 (có)

và 0 (không có), chúng ta đưa chúng về Bảng hai chiều như sau với 2 đơn vị mục

tiêu là i và j.

Đơn vị mục tiêu i

1 0

Đơn vị mục tiêu j

1 a b m = a + d

u = b+ c

n = m + u 0 c d

Trong đó, m là số dữ liệu tương ứng, u là số dữ liệu không tương ứng, n là tổng số

băng ghi nhận được.

Giá trị khoảng cách

Giá trị khoảng cách là độ lệch của những chỉ số biểu thị mức độ giống nhau.

Chỉ số tương đồng S (similarity) biến thiên từ 0 đến 1 có thể được chuyển đổi thành

giá trị d (distance) theo công thức

d = 1 - S

Chúng ta có thể tính toán bằng tay để chuyển đổi chỉ số Dice thành chỉ số

khoảng cách, nhưng với phần mềm chuyên dùng NTSYSpc 2.02h, chúng ta sẽ dễ

dàng hơn rất nhiều để có kết quả với nhiều cặp đơn vị mục tiêu.


37

Xếp nhóm bằng phương pháp UPGMA

Phân tích nhóm (cluster analysis) thực sự là phương pháp sắp xếp các giống

thành những cụm nhóm khác nhau trên cơ sở mức độ giống nhau theo qui ước

(người ta còn gọi với thuật ngữ agglomerative clustering). Nó được thực hiện theo

qui trình tiêu chuẩn, nên người ta còn gọi đó là “greedy algorithm”. Qui trình theo

các bước tiến hành như sau:

• Tìm các cặp (i, j) có giá trị khoảng cách nhỏ nhất (hoặc giống nhau nhất)

• Nhập các cặp này lại thành một nhóm (cluster)

• Tạo ra nhóm lớn hơn tương ứng với nhóm mới sao cho các cặp (i, j) mới

tương thích với giá trị mức độ giống nhau

• Lập lại qui trình

Một trong những phương pháp đơn giản nhất là phương pháp tính khoảng

cách trung bình với giá trị số đại số UPGMA (được viết tắt từ chữ unweighted pair-

group method with arithmetic mean)

Cách tính bằng tay

• Tìm giá trị khoảng cách nhỏ nhất trong ma trận khoảng cách

• Xếp nhóm 2 đơn vị mục tiêu (isolate) này lại với nhau, theo giá trị khoảng

cách cụ thể, ghi giữa hai điểm

• Xây dựng ma trận khoảng cách mới phối hợp giữa hai isolate gần nhất trong

một nhóm riêng. Khoảng cách giữa hai nhóm mới này và một isolate khác sẽ được

ghi nhận với giá trị khoảng cách trung bình của isolate mới với những isolate trong

cluster

• Lập lại qui trình cho đến hết.

Ch��ng 3. K�t qu� - Th�o lu�n NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ

38

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ

ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp mini-CTAB có xử lý với

RNAse để loại bỏ ARN theo quy trình của Saghai-Maroof và cs (1997) có cải tiến.

Để tiến hành các phản ứng phân tích tính đa dạng di truyền giữa các quần thể mẫu

nghiên cứu, mức độ nguyên vẹn của ADN khuôn dùng cho phản ứng nhân bản có

vai trò quan trọng. Sự đứt, gãy ADN khuôn có thể gây ra hiện tượng đa hình giả,

dẫn đến sự sai lệch trong kết quả phân tích đa hình. Do vậy, tất cả các mẫu ADNts

đều được kiểm tra bằng phương pháp điện di như đã mô tả trong phần Phương pháp

nghiên cứu ở trên.

Để kiểm tra độ tinh sạch của các mẫu ADN thu được, chúng tôi đã tiến hành

đo mật độ quang phổ (OD) của tất cả các mẫu. Hai bước sóng được lựa chọn là 260

nm và 280 nm, tương ứng với hai vùng hấp thụ cực đại của ADN sợi đôi và ARN

hoặc protein.

3.1.1. Kết quả tách chiết ADNts từ các mẫu thực vật thuộc chi Acanthopanax

Từ các mô lá non của tập hợp mẫu thực vật thuộc chi Acanthopanax (gồm 2

loài: Ngũ gia bì gai và Ngũ già bì hương), chúng tôi đã tách chiết thành công ADN

tổng số. ADNts đã thu được từ 26 mẫu thực vật này (trong đó 14 mẫu thuộc loài A.

trifoliatus và 12 mẫu thuộc loài A. gracilistylus) đều đảm bảo mức độ nguyên vẹn

và tinh sạch, đáp ứng được các yêu cầu dành cho việc phân tích tính đa hình di

truyền trong những thí nghiệm tiếp theo.

3.1.2. Kết quả tách chiết ADNts từ các mẫu thực vật thuộc chi Illicium

Từ tập hợp đầy đủ nhất các mẫu Hồi hương hiện có ở Việt Nam hiện cùng các

mẫu Hồi núi thu thập trong nghiên cứu, chúng tôi tiến hành tách chiết ADNts của

các mẫu thực vật thuộc chi Illicium từ các bộ phận lá, thân, quả, hạt và chồi non

theo phương pháp mini-CTAB có cải tiến. Kết quả chúng tôi thu được ADNts duy

nhất từ các chồi non (Hình 6). Các thí nghiệm tách chiết ADNts từ các bộ phận khác

của cây đều không đạt yêu cầu do gặp phải khó khăn trong quá trình loại bỏ các tạp


39

chất. Nhìn chung, dịch chiết ADN mẫu Hồi hương từ các phần mô khác thường có

độ nhớt cao.

Trong tổng số 56 mẫu thực vật thuộc chi hồi thu thập được chỉ có 50 mẫu cho

sản phẩm ADNts đủ độ tinh sạch (đạt tỉ lệ 89,29%) trong đó có 39 mẫu thuộc loài

Hồi hương (trừ mẫu IB1) và 11 mẫu thuộc loài Hồi núi (trừ các mẫu N-7, -8, -9, -

13, và -15). 50 mẫu đã tách chiết thành công ADNts kể trên được sử dụng trong

những thí nghiệm tiếp theo.

3.1.3. Kết quả tách chiết ADNts từ cây Ba kích (Morinda officinalis How)

Khi sử dụng phương pháp mini-CTAB trên mẫu rễ củ và các rễ nhỏ của cây

Ba kích, chúng tôi nhận thấy rằng không còn hiện tượng lẫn chất nhầy trong quá

trình tách chiết. Chúng tôi quyết định sử dụng phương pháp mini-CTAB có cải

tiến trên mẫu vật là rễ nhỏ và rễ củ của cây Ba kích. Kết quả chúng tôi đã thu

được ADN tổng số ở 25 mẫu ADN thu thập được với hàm lượng ADN đạt độ

tinh sạch cho các nghiên cứu tiếp theo. Khi tách chiết ADN ở các phần mô khác

nhau của mẫu rễ, hàm lượng ADN thu được ở các mẫu rễ củ thấp hơn và chỉ đạt

được khoảng bằng 1/10 so với hàm lượng ADN từ mẫu rễ nhỏ. Song do số lượng

các rễ nhỏ thu nhận được ở các mẫu ít (có mẫu không có) nên chúng tôi sử dụng

cả hai phần rễ nhỏ và rễ củ để thu ADN tổng số. Đối với các mẫu rễ củ, chúng

tôi tiến hành tách chiết nhiều lần sau đó gộp chung lại để thu được hàm lượng

ADN cao hơn đủ cho các phân tích tiếp theo.

3.1.4. Kết quả tách chiết ADNts các mẫu thực vật thuộc chi Panax

Chúng tôi đã tách chiết thành công ADNts từ tất cả 34 mẫu thu thập được của

ba loài Sâm Việt Nam, Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang. Trong thí nghiệm xác định

phần mô tốt nhất để tách chiết ADNts, chúng tôi thu được kết quả là so với thân hay

rễ, mô lá là phần cho hiệu suất tách chiết ADN cao nhất trong khi hàm lượng ARN

tăng không đáng kể (Hình 6). Do vậy, trong tất cả các thí nghiệm tách chiết ADN

tiếp theo, chúng tôi đã quyết định sử dụng mô lá làm vật liệu thực vật.

Dưới đây là hình ảnh minh họa ảnh điện di ADN tổng số của một số mẫu dược

liệu được thu thập và phân tích trong nghiên cứu này (Hình 7). Tập hợp ADNts thu


40

được từ các bộ phận mô thích hợp của các mẫu cây dược liệu trong nghiên cứu đều

thể hiện độ tinh sạch đủ đáp ứng cho các kỹ thuật phân tích đa hình di truyền tiếp

theo.

Hình 6. ADNts tách chiết từ các phần mô khác nhau: hình bên trái - ADNts từ các mẫu cây Hồi

hương (I); hình bên phải - ADNts từ các phần mô khác nhau ở cây sâm (V). M: thang ADN chuẩn.

Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu nêu ở Bảng 4.

Hình 7. Ảnh điện di ADN tổng số các mẫu dược liệu được thu thập trong nghiên cứu: a) mẫu

các loài Ngũ gia bì gai (G) và Ngũ gia bì hương (H); b) mẫu các loài Hồi hương (I) và Hồi núi

(N); c) mẫu các loài Ba kích (K); d) mẫu các loài Sâm Việt Nam (S), Sâm Vũ Diệp (V), Tam

thất hoang (T) và dạng trung gian Sâm Vũ Diệp-Tam thất hoang (VT). M: thang ADN chuẩn.

Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu nêu ở Bảng 4.

M IB2 IB4 IC1 IC4 IL1 IL4 IQ1 IQ4 N1 N2 N3 N4 N10 N12 N14 N16 M

M LT1 LT2 LT3 LR1 LR2 LR3 L1 K1 KT1 KT2 KT3 KR1 KR2 KR3 KR4 M

M S1 S5 S10 S14 V1 V3 V5 V7 VT1 VT4 T1 T3 T5 T7 M

d

c

b

a


41

Đã có nhiều quy trình được công bố tách chiết ADN từ thực vật (bao gồm

trong đó là các loài dược liệu), tuy nhiên những quy trình này thường không

được tiến hành một cách nhất quán ở các loại mô thực vật khác nhau, đó là do

những bộ phận mô chứa nhiều các hợp chất thứ sinh như polysaccharide và các

hợp chất phenol. Chính những chất này có thể gây ảnh hưởng trực tiếp tới chất

lượng cũng như hiệu suất thu axit nucleic (bao gồm ADN và ARN) được tách

chiết. Thực chất là các loài khác nhau có xu hướng chứa thành phần các hợp chất

thứ cấp khác nhau nên có thể ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết ADN hệ gen.

Từ những kết quả trên đây, chúng tôi nhận thấy rằng, quy trình mini-CTAB

có cải tiến được áp dụng thành công trong việc tách chiết ADNts từ tất cả các

mẫu dược liệu trong nghiên cứu này. Những kết quả thu được từ những thí

nghiệm xác định phần mô tốt nhất để tách chiết ADNts ở các loài dược liệu trong

nghiên cứu là những kết quả rất có ý nghĩa. Đây là những kết quả gợi mở cho

những nghiên cứu về sau này có thể lựa chọn đúng bộ phận phù hợp nhất để có thể

thu được hàm lượng ADNts có hiệu suất cao nhất phục vụ cho các nghiên cứu về

ADN trên các đối tượng dược liệu này.

3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC LOÀI

CÂY THUỐC TRONG NGHIÊN CỨU

Trong số 40 mồi RAPD-PCR được sử dụng trong nghiên cứu, số mồi cho sản

phẩm ADN nhân bản khác nhau ở các nhóm loài khác nhau. Đối với nhóm loài

thuộc chi Panax, có 13 mồi cho sản phẩm ADN nhân bản rõ nét nhất, gồm có OPA-

1, -2, -3, -7, -8, -12, -14 và OPC-1, -6, -12, -15, -16, -17. Đối với các loài thuộc chi

Acanthopanax có 16 mồi, gồm OPA-1, -4, -5, -9, -10, -12, -13, -15, -17 và OPC-1, -

3, -5, -7, -9, -19, -20. Trong khi đó, với các loài thuộc chi Illicium, có 15 mồi cho

sản phẩm ADN nhân bản rõ nét, bao gồm OPA-6, -7, -10, -14, 16, -17, -19 và OPC-

1, - 2, -4, -7, -9, -10, -11, -12, -18, -20. Đối với loài Ba kích (chi Morinda), có 12

mồi cho sản phẩm ADN nhân bản rõ nét nhất được lựa chọn để phân tích gồm

OPA-1, -7, -12, -13, -15, -17, -19, -20 và OPC-1, -3, -12, -20.


42

3.2.1. Sự đa dạng di truyền giữa các loài cây thuốc thuộc chi Acanthopanax

Kết quả phân tích RAPD-PCR trên 14 mẫu Acanthopanax trifoliatus và 12

mẫu A. gracilistylus phân tích với 16 mồi ngẫu nhiên kể trên cho thấy các tập hợp

cá thể của hai loài A. trifoliatus và A. gracilistylus ở Việt Nam có mức độ đa hình di

truyền tương đối cao. Tổng số băng RAPD nhân bản được là 157 băng, trong đó có

126 băng xuất hiện ở loài A. trifoliatus và 125 băng xuất hiện ở loài A. gracilistylus,

trung bình mỗi mồi nhân bản được 7 - 8 băng đối với mỗi mồi khi phân tích ở cả hai

loài.

Trong 16 mồi ngẫu nhiên sử dụng phân tích, đa số các mồi cho kết quả thể

hiện tính đa hình cao, đặc biệt là các mồi OPC9, OPC20, OPA17, OPA10, OPC19.

Riêng với mồi OPC9, toàn bộ 14 mẫu thuộc loài A. trifoliatus và 12 mẫu thuộc loài

A. gracilistylus đều cho phổ điện di sản phẩm PCR khác nhau, thể hiện sự đa hình

cao của các mẫu, và đây cũng là mồi cho số băng đa hình cao nhất (19 băng xét trên

cả 2 loài). Số liệu về các băng đa hình thu được từ mỗi mồi Bảng 6 và phổ điện di

được minh họa trên hình 8a.

Bảng 6. Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu quần thể loài Acanthopanax trifoliatus và A.

gracilistylus phân tích với 16 mồi ngẫu nhiên.

Mồi Số băng đa hình/Tổng số băng mỗi loài

Mồi Số băng đa hình/Tổng số băng mỗi loài

Ngũ gia bì gai (A. trifoliatus)

Ngũ gia bì hương (A. gracilistylus)

Ngũ gia bì gai (A. trifoliatus)

Ngũ gia bì hương (A. gracilistylus)

A1 4/8 6/10 A17 13/14 14/15

A4 6/9 2/6 C1 1/2 4/6

A5 0/2 0/2 C3 1/3 4/6

A9 7/8 3/6 C5 5/8 7/8

A10 7/8 7/9 C7 3/5 7/9

A12 3/6 5/8 C9 17/17 10/10

A13 7/8 4/7 C19 9/11 6/8

A15 5/10 7/10 C20 7/7 4/5

Tuy nhiên có một số mồi thể hiện đa hình không cao. Chẳng hạn như mồi

OPA5 biểu hiện tính đồng hình 100% ở tất cả các mẫu nghiên cứu thuộc cả hai loài.

Đây cũng là mồi cho số băng RAPD-PCR ít nhất trong số 16 mồi phân tích. Với tất

cả các mẫu chỉ thu được 2 băng đồng hình (hình 8b).


43

Hình 8. Hình ảnh điện di một số sản phẩm RAPD-PCR ở các mẫu Ngũ gia bì gai (G) và Ngũ gia bì

hương (H) trong nghiên cứu. Hình bên phải) Sản phẩm điện di với mồi OPC9; Hình bên trái) Sản

phẩm điện di với mồi OPA5. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu nêu ở Bảng 4. M: thang ADN chuẩn.

Từ những số liệu thu được qua xử lý bằng phần mềm NTSYSpc 2.02h, chúng

tôi đã xác định được hệ số tương đồng di truyền và xây dựng được sơ đồ hình cây

về quan hệ di truyền giữa 14 mẫu quần thể loài Ngũ gia bì gai (A. trifoliatus) và 12

mẫu còn lại thuộc loài Ngũ gia bì hương (A. gracilistylus). Số liệu và kết quả phân

tích chi tiết được trình bày trên hình 9.

Từ sơ đồ hình cây về quan hệ di truyền giữa các mẫu thuộc hai loài (hình 9),

chúng ta có thể dễ dàng nhận thấy sự khác biệt khá rõ rệt về cấu trúc di truyền giữa

hai loài Ngũ gia bì hương và Ngũ gia bì gai. Kết quả là, các mẫu thuộc hai loài tách

thành hai nhóm rõ rệt, với hệ số khoảng cách di truyền giữa chúng là khoảng 0,5.

3.2.1.1. Phân tích đa hình loài Ngũ gia bì gai (A. trifoliatus)

Phân tích số băng đa hình

Phân tích với 16 mồi ngẫu nhiên ở 14 mẫu A. trifoliatus, chúng tôi thu được

95 băng đa hình trong tổng số 126 băng nhân bản được. Tức là số băng đa hình

chiếm 75,4% tổng số băng (chi tiết số băng đa hình thu được với mỗi mồi được

trình bày tại Bảng 6).


44

Hìn

h 9

. Sơ

đồ

hìn

h c

ây

về q

uan

hệ

di

tru

yền g

iữa

các

mẫu

thuộc

hai

loài

cây

thuốc

Ngũ

gia

bì

ga

i (A

can

thopana

x tr

ifoli

atu

s) v

à N

gũ

gia

bì

hươ

ng

(A

. gra

cili

styl

us)

th

u t

hập

đượ

c ở

Việ

t N

am

trê

n cơ

sở

phâ

n t

ích c

hỉ

thị

RA

PD

-PC

R. N

gũ

gia

bì

ga

i (G

), N

gũ

gia

bì

hươ

ng (

H).

Nguồn

gốc

và đặc

điể

m của

cá

c mẫu

nêu

ở Bản

g 4

.


45

Đối với loài A. trifoliatus, chúng tôi nhận thấy các mẫu được thu tại hai tỉnh

Lào Cai và Cao Bằng có mức độ đa dạng di truyền cao hơn so với các mẫu thu tại

Lạng Sơn. Số băng đa hình trung bình thu được từ các mẫu thuộc loài A. trifoliatus

thu ở các tỉnh Lào Cai, Cao Bằng và Lạng Sơn lần lượt là 4,3; 4,1 và 2,8 băng trên

tổng số băng trung bình thu được là 7,8 băng. Tỷ lệ số băng đa hình trên tổng số

băng giữa các mẫu thu được từ ba địa phương này tương ứng là 0,55, 0,53 và 0,36

(Bảng 7).

Bảng 7. Số băng ADN đa hình thu được từ các mẫu quần thể loài Ngũ gia bì gai (A. trifoliatus) (ký

hiệu G) thu tại Lào Cai, Cao Bằng và Lạng Sơn được phân tích theo từng mồi RAPD.

Mồi Số băng đa hình/tổng số băng

Mồi Số băng đa hình/tổng số băng

Lào Cai (GLC)

Cao Bằng (GCB)

Lạng Sơn (GLS)

Lào Cai (GLC)

Cao Bằng (GCB)

Lạng Sơn (GLS)

A1 3/8 4/8 1/8 A17 9/14 12/14 6/14

A4 3/9 3/9 3/3 C1 0/2 0/2 1/2

A5 0/2 0/2 0/2 C3 0/3 1/3 0/3

A9 2/8 7/8 0/8 C5 4/8 3/8 1/8

A10 4/8 5/8 6/8 C7 2/5 0/5 3/5

A12 3/6 1/6 1/6 C9 12/17 13/17 9/17

A13 6/8 3/8 3/8 C19 9/11 6/11 5/11

A15 5/10 4/10 4/10 C20 7/7 4/7 2/7

Sự đa dạng di truyền của loài Ngũ gia bì gai (A. trifoliatus) ở các địa phương

thu thập mẫu (Lào Cai, Cao Bằng và Lạng Sơn) còn được thể hiện qua việc không

tìm thấy một chỉ thị RAPD-PCR đồng hình nào xét trong từng nhóm mẫu được thu

thập tại mỗi địa phương.

Phân tích cây quan hệ di truyền

Khi phân tích cây quan hệ di truyền giữa các mẫu của loài Ngũ gia bì gai

chúng tôi cũng thu được những kết quả hết sức lý thú. Từ sơ đồ hình cây quan hệ về

quan hệ di truyền giữa các mẫu (hình 9), chúng ta nhận thấy hệ số tương đồng di

truyền giữa các mẫu thuộc loài Ngũ gia bì gai dao động từ 0,62 đến 0,92. Khi so

sánh giữa các mẫu có địa điểm phân bố gần nhau tương ứng tại các tỉnh Lào Cai,

Cao Bằng và Lạng Sơn, hệ số tương đồng di truyền của các mẫu thuộc loài Ngũ gia

bì gai tương ứng là 0,78; 0,69 và 0,84. Trong số đó, hai mẫu thể hiện tính đồng hình


46

lớn nhất (hệ số tương đồng di truyền 0,92) là GLS1 và GLS2. Hai mẫu này đều được

thu ở huyện Tràng Định, tỉnh Lạng Sơn. Hai mẫu có sự khác biệt di truyền lớn nhất

(hệ số tương đồng di truyền 0,62) là hai mẫu GCB2 (thu ở Cao Bằng) và GLC6 (thu ở

Lào Cai).

Từ cây quan hệ di truyền giữa các mẫu thuộc loài Ngũ gia bì gai (hình 9),

chúng ta cũng có thể nhận thấy không có sự tương đồng rõ rệt về hệ số tương đồng

di truyền giữa các mẫu và địa điểm phân bố của chúng. Đây là một kết quả có ý

khẳng định đối với các phân tích về số băng đa hình giữa các mẫu Ngũ gia bì gài

được trình bày ở trên. Nhìn chung, các cá thể thu ở tỉnh Lào Cai và Cao Bằng thể

hiện tính đa hình di truyền cao hơn so với các cá thể thu ở tỉnh Lạng Sơn.

Từ những kết quả trên đây có thể thấy các quần thể A. trifoliatus ở mỗi địa

phương có thể có nhiều nguồn gốc di truyền khác nhau tương ứng với mức độ đa

dạng di truyền trong chúng. Những kết quả phân tích nêu trên, với một số lượng

mẫu ban đầu được thu từ nhiều địa phương, có thể là cơ sở cho việc từng bước lên

kế hoạch và biện pháp bảo tồn, phát triển loài Ngũ gia bì gai (A. trifoliatus) ở nước

ta. Tuy vậy, để có thể có được những cơ sở dữ liệu đầy đủ và hoàn thiện hơn về loài

cây thuốc này, cần phải tiếp tục mở rộng quy mô nghiên cứu lớn hơn cả về địa điểm

phân bố và số lượng mẫu phân tích.

3.2.1.2. Phân tích đa hình loài Ngũ gia bì hương (A. gracilistylus)

Phân tích băng đa hình

Đối với 12 mẫu thuộc loài A. gracilistylus xuất hiện 90 băng đa hình trong

tổng số 125 băng nhân bản được, chiếm 72% (Bảng 6). Như vậy kết quả phân tích

thu được thể hiện tính đa hình tương đối cao trong các mẫu ở hai loài cây thuốc

nghiên cứu.

Như ở phần tổng quan tài liệu đã đề cập, loài Ngũ gia bì hương ở nước ta hiện

nay chỉ còn tập hợp một số ít nhóm các cá thể, mà phương pháp nhân giống vô tính

là hiệu quả ở loài cây này. Nên, từ lâu một câu hỏi đặt ra là mức độ đa dạng di

truyền của loài Ngũ gia bì hương ở nước ta biểu hiện trong các cá thể ít ỏi còn lại

hiện nay như thế nào? Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy ở hầu hết các mồi


47

phân tích (trừ mồi OPA5) đều xuất hiện các băng đa hình khi phân tích 12 mẫu thu

được thuộc loài Ngũ gia bì hương. Điều này cho thấy mặc dù ở nước ta loài Ngũ gia

bì hương hiện chỉ còn một số ít tập hợp các nhóm cá thể, nhưng có nhiều kiểu di

truyền khác nhau. Do vậy, công tác bảo tồn cần ưu tiên cho tất cả các nhóm cá thể

hiện có.

Đối với loài Ngũ gia bì hương, các cặp mẫu có hệ số tương đồng di truyền cao

nhất (0,95) là cặp mẫu HHG1 và HHG2 (đều thu ở Hà Giang), và cặp mẫu HLC1 (thu ở

Lào Cai) và HHG4 (thu ở Hà Giang). Theo thông tin chúng tôi được biết trong quá

trình điều tra thu thập mẫu thì trước đây một số cây Ngũ gia bì hương ở Lào Cai đã

được di thực về từ Hà Giang. Do đó, có thể mẫu HLC1 (thu ở Lào Cai) chính là mẫu

có nguồn gốc di thực từ Hà Giang (mẫu HHG4).


Hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu Ngũ gia bì hương là từ 0,67 đến

0,95. Đối với loài Ngũ gia bì hương (A. gracilistylus), kết quả phân tích cho thấy

tính đa hình tương đối cao trong nhóm các mẫu đã thu thập được trong nghiên cứu

này. Cây quan hệ di truyền (hình 9) cho thấy các cá thể A. gracilistylus nghiên cứu

phân thành 3 nhóm tách biệt về cấu trúc di truyền. Nhóm thứ nhất bao gồm các mẫu

HLC4, HLC5 và HLC6 (tất cả đều được thu ở Lào Cai). Nhóm thứ hai gồm các mẫu

HLC7, HLC8, HLC1 và HHG4 (gồm 3 mẫu thu ở Lào Cai, và 1 mẫu thu ở Hà Giang).

Nhóm thứ ba gồm các mẫu HLC2, HLC3, HHG1, HHG2 và HHG3 (gồm 2 mẫu thu ở

Lào Cai, và 3 mẫu thu ở Hà Giang). Kết quả này cho thấy có thể có sự liên hệ nào

đó về nguồn gốc của các mẫu Ngũ gia bì hương thu ở Lào Cai và Hà Giang.

Mặt khác, khi xét trong phạm vi các mẫu A. gracilistylus thu ở Lào Cai,

chúng tôi nhận thấy chúng phân tách thành hai nhóm. Một nhóm tách biệt gồm 3

mẫu thu ở Lào Cai là HLC4, HLC5 và HLC6. Nhóm các mẫu thu ở Lào Cai còn lại

(HLC1, HLC2, HLC3, HLC7 và HLC8) có cấu trúc di truyền gần hơn với các mẫu thu ở

Hà Giang. Đây cũng là những dữ liệu cơ sở để có thể có những biện pháp và chiến

lược bảo vệ và lưu giữ nguồn gen của loài cây thuốc quý hiếm đang đứng trước

nguy cơ bị tuyệt chủng này.


48

3.2.2. Sự đa dạng di truyền giữa loài cây thuốc thuộc chi Illicium

Sử dụng chọn lọc 15 mồi ngẫu nhiên kể trên để phân tích nhóm đối tượng

thuộc chi Illicium chúng tôi được 218 băng nhân bản. Trong đó tổng số băng nhân

bản của Hồi hương và các loài Hồi núi lần lượt là 176 và 140 băng. Trung bình mỗi

mồi nhân bản được 14,53 băng. Danh sách mồi, tổng số băng được nhân bản và số

băng đa hình của loài Hồi hương và các loài Hồi núi sử dụng trong nghiên cứu được

trình bày ở Bảng 8.

Bảng 8. Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu quần thể loài Illicium verum và các loài Hồi

núi phân tích với 15 mồi ngẫu nhiên.

Mồi Số băng đa hình/Tổng số băng


Hồi hương (Illicium verum)

Hồi núi (Illicium spp.)

Hồi hương (Illicium verum)

Hồi núi (Illicium spp.)

A6 10/13 8/11 C7 11/13 9/11

A7 12/13 9/15 C9 12/14 11/12

A10 16/18 5/7 C10 6/8 6/7

A14 2/4 2/4 C11 9/10 9/9

A16 11/11 9/9 C12 14/15 7/10

C1 9/11 6/8 C18 4/4 1/2

C2 17/18 9/14 C20 12/15 7/10

C4 4/9 11/12 Tổng số 149/176 109/140

Từ Bảng phân tích số băng đa hình trên tổng số băng nhân bản tương ứng với

các nhóm loài thuộc chi Illicium trong nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy mức độ đa

hình tương đối rõ rệt ở các nhóm loài này. Trong 15 mồi ngẫu nhiên sử dụng phân

tích, đa số các mồi cho kết quả thể hiện tính đa hình cao.

3.2.2.1. Phân tích đa dạng di truyền loài Hồi hương

Phân tích số băng đa hình

Khi phân tích 15 mồi ngẫu nhiên ở 39 mẫu Hồi hương, chúng tôi thu được

tổng cộng 149 băng đa hình trên tổng số 176 băng nhân bản được. Tức là số băng

đa hình chiếm 84,66% tổng số băng. Như vậy kết quả phân tích thu được thể hiện

tính đa hình tương đối cao trong các mẫu ở loài cây thuốc Hồi hương.


49

Từ những kết quả trên sử dụng phần mềm NTSYSpc 2.02h, chúng tôi đã xây

dựng được Bảng hệ số tương đồng di truyền giữa 39 mẫu Hồi hương trong nghiên

cứu. Cụ thể các mẫu Hồi hương có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,59 đến

0,96. Khi so sánh giữa các mẫu có địa điểm thu mẫu tương ứng là Bắc Kạn, Cao

Bằng, Lạng Sơn và Quảng Ninh, hệ số tương đồng di truyền của các mẫu thuộc loài

Hồi hương tương ứng là 0,81; 0,83; 0,78; 0,81. Như vậy có thể thấy các mẫu thu từ

Cao Bằng có sự tương đồng về mặt di truyền cao nhất. Trong khi đó các mẫu thu từ

Lạng Sơn thể hiện cấu trúc di truyền khác biệt nhau đáng kể nhất. Tuy vậy, sự khác

biệt giữa các quần thể thu mẫu là không lớn.


Từ những kết quả trên sử dụng phần mềm NTSYSpc 2.02h, chúng tôi đã xây

dựng được Bảng hệ số tương đồng di truyền giữa 39 mẫu Hồi hương trong nghiên

cứu (Bảng 7). Cụ thể các mẫu Hồi hương có hệ số tương đồng di truyền dao động từ

0,59 đến 0,96. Như vậy, hệ số tương đồng di truyền trung bình giữa các mẫu quần

thể loài Hồi hương ở Việt Nam là 0,74. Trong số 39 mẫu quần thể Hồi hương, cặp

mẫu thể hiện tính đồng hình lớn nhất (hệ số tương đồng di truyền 0,96) là giữa mẫu

IQ5 và IQ6 cũng như giữa mẫu IQ9 với mẫu IQ7 và IQ8, đều được thu ở tỉnh

Quảng Ninh. Với hệ số tương đồng di truyền là 0,59, mẫu IB2 (thu ở Bắc Kạn) và

các mẫu IQ5, -6, -7 thể hiện cấu trúc di truyền khác biệt nhau nhiều nhất.

Khi so sánh giữa các mẫu có địa điểm thu mẫu tương ứng là Bắc Kạn, Cao

Bằng, Lạng Sơn và Quảng Ninh, hệ số tương đồng di truyền của các mẫu thuộc loài

Hồi hương tương ứng là 0,81; 0,83; 0,78; 0,81. Như vậy có thể thấy các mẫu thu từ

Cao Bằng có sự tương đồng về mặt di truyền cao nhất. Trong khi đó các mẫu thu từ

Lạng Sơn thể hiện cấu trúc di truyền khác biệt nhau đáng kể nhất. Tuy vậy, sự khác

biệt giữa các quần thể thu mẫu là không lớn.

Sử dụng phần mềm NTSYSpc 2.02h dựa trên thuật toán UPGMA, chúng tôi

đã xây dựng được cây quan hệ di truyền giữa 39 mẫu Hồi hương thu từ Bắc Kạn,

Cao Bằng, Lạng Sơn và Quảng Ninh như trình bày trên hình 10. Có thể thấy từ sơ


50

đồ hình cây biểu hiện mối quan hệ di truyền, các mẫu thực vật có xu hướng kết cụm

thành 4 nhóm riêng biệt, khá tương đồng với khu vực thu mẫu.

Nhóm thứ nhất gồm 16 mẫu thu từ cả 4 khu vực địa lý được tiến hành khảo sát

và điều tra trong nghiên cứu này là Bắc Kạn, Cao Bằng, Lạng Sơn và Quảng Ninh

đó là các mẫu IB2 - IB5, IC1 - IC4, IL1 - IL4, IQ1 - IQ4. Trên sơ đồ hình cây phản

ánh mối quan hệ di truyền chúng tôi nhận thấy tập hợp mẫu Hồi hương có ký hiệu

từ IB6 đến IB16 (thu ở Bắc Kạn) kết tụ lại thành một nhóm thứ 2, tách biệt với

nhóm thứ 3 gồm các mẫu có ký hiệu từ IL5 - IL10 (thu ở Lạng Sơn). Hai nhóm mẫu

này tách biệt với nhau trên cây quan hệ di truyền với hệ số tương đồng di truyền là

0,77. Trong khi đó, cả 2 nhóm (2 và 3) tách biệt với nhóm thứ nhất với hệ số tương

đồng di truyền là 0,69. Một kết quả đáng chú ý khác là một tập hợp mẫu được ký

hiệu từ IQ5 đến IQ10 (thu từ Quảng Ninh) tập hợp thành một nhóm riêng (nhóm

thứ 4) có cấu trúc di truyền khác biệt biệt hẳn với các nhóm mẫu còn lại với hệ số

tương đồng di truyền là 0,68.

Từ những kết quả trên đây có thể thấy các quần thể Hồi hương thu thập từ 4

địa phương Bắc Kạn, Cao Bằng, Lạng Sơn và Quảng Ninh có sự đa dạng di truyền

tương đối rõ rệt. Vì tập hợp mẫu Hồi hương được dùng trong nghiên cứu này được

coi là đại diện đầy đủ nhất cho các quần thể loài Hồi hương ( I. verum Hook.f) hiện

có ở Việt Nam nên kết quả trên cũng phản ánh mức độ đa dạng di truyền của loài

cây này ở Việt Nam là rõ rệt. Đây là một kết quả rất có ý nghĩa cho ngành công

nghiệp bào chế thuốc và các sản phẩm chức năng từ loài Hồi hương ở Việt Nam.

Do loài Hồi hương là một trong những loài cây có diện tích phân bố tự nhiên

tương đối hẹp trên thế giới nên kết quả trên đã cho thấy một dấu hiệu thuận lợi cho

công tác bảo tồn nguồn gen loài cây dược liệu quý này. Để bảo tồn được tính đa

dạng di truyền của loài cây thuốc quý này cần thiết phải quan tâm hơn nữa đến khu

vực và điều kiện sinh sống của chúng, cụ thể tạo những điều kiện thuận lợi nhất để

cho cây có thẻ phát triển tốt nhất tương xứng với tiềm năng đa dạng di truyền cũng

như giá trị sử dụng sẵn có trong nền y học cổ truyền cũng như trong nền y học hiện

đại của loài cây này.


51

3.2.2.2. Phân tích đa dạng di truyền của các loài Hồi núi


Cũng giống các kết quả thu được từ các mẫu Hồi hương, các mẫu Hồi núi

trong nghiên cứu này cũng thể hiện sự đa hình di truyền tương đối rõ nét. Bằng việc

sử dụng 15 mồi ngẫu nhiên gồm 10 nucleotide để phân tích cấu trúc di truyền của

11 mẫu Hồi núi, chúng tôi thu được tổng cộng 140 băng ADN có kích thước khác

nhau. Trong đó số băng đa hình là 109 băng trên tổng số 140 băng ADN được tạo

thành, tương đương với 77,86% tổng số băng (Bảng 8).


Dựa trên phần mềm NTSYSpc 2.02h, chúng tôi xác định được hệ số tương

đồng di truyền giữa các mẫu thuộc các loài Hồi núi được thu thập trong nghiên cứu

này. Như phần tổng quan tài liệu chúng tôi đã đề cập tới, các mẫu Hồi núi được thu

thập ngẫu nhiên trong tự nhiên chưa được định rõ tên loài. Do vậy trong những kết

quả đạt được qua nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy khi so sánh giữa các mẫu Hồi

núi có địa điểm thu mẫu giống nhau là huyện Bát Xát và dãy núi Hoàng Liên Sơn,

hệ số tương đồng di truyền của các mẫu lần lượt là 0,78 và 0,60.

Trên sơ đồ hình cây quan hệ di truyền (Hình 10), chúng tôi nhận thấy, tập hợp

mẫu thu từ Bát Xát có xu hướng kết tụ lại thành một nhóm khác biệt hẳn với các

mẫu thu từ dãy núi Hoàng Liên Sơn, với hệ số tương đồng di truyền là 0,76. Một

kết quả đáng chú ý ở đây là trong số các mẫu Hồi núi thu thập từ Hoàng Liên Sơn

có xu hướng phân ly thành 2 nhóm khác biệt về cấu trúc di truyền. So với nhóm Hồi

núi gồm các mẫu N10 - N12, nhóm mẫu gồm mẫu Hồi núi ký hiệu là N14 và N16

có cấu trúc di truyền gần với nhóm mẫu thu từ Bát Xát hơn với hệ số tương đồng di

truyền là 0,56. Các mẫu Hồi núi từ N10 - N12 kết tụ lại thành một nhóm với hệ số

tương đồng di truyền là 0,61. Nhóm mẫu này sau đó kết tụ lại với tập hợp mẫu còn

lại với hệ số tương đồng di truyền là 0,51. Kết quả này cho thấy sự đa hình cao

trong cấu trúc di truyền của tập hợp 11 mẫu Hồi núi trong nghiên cứu này, thậm chí

không ngoại trừ các mẫu này là các loài Hồi núi khác nhau (hình 10).


52

Hìn

h 1

0.

Sơ

đồ

cây

qu

an hệ

di

truyề

n của

39 mẫu

Hồi

hươ

ng

vớ

i 11 mẫu

Hồi

núi

tron

g n

ghiê

n cứ

u.

Ng

uồn

gốc

và

đặc

điể

m của

cá

c m

ãu

đượ

c

nêu

tại

Bản

g 4

.


53

3.2.3. Sự đa dạng di truyền của loài cây thuốc Ba kích


Phân tích phổ điện di sản phẩm RAPD-PCR của 25 mẫu Ba kích với tất cả 12

mồi RAPD sử dụng (tên mồi được trình bày ở trên), chúng tôi nhận thấy số lượng

băng ADN thu được là rất khác nhau giữa các mồi trên cùng một mẫu nghiên cứu

cũng như giữa các mẫu đối với cùng một mồi. Trong đó, số băng đa hình là 138,

(chiếm 90,2% tổng số băng). Điều này chứng tỏ 12 mồi RAPD đã nghiên cứu cho

mức độ đa hình rất cao trên 25 mẫu Ba kích nghiên cứu.

Tiến hành phân tích cụ thể với từng dạng hình thái, chúng tôi nhận thấy số

băng ADN thu được của 4 dạng hình thái Ba kích thân có lông, thân không có lông,

quả tụ và quả rời khi sử dụng 12 mồi RAPD lần lượt là 137, 130, 135 và 125 băng,

trong đó tỉ lệ % của số băng đa hình/ tổng số băng ADN của từng dạng hình thái rất

cao, tương ứng là: 84,7%, 83,1%, 88,9% và 88%. Điều đó thể hiện xu thế đa hình

cao trong từng dạng hình thái đề cập đến trong nghiên cứu này.

Bảng 9. Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu quần thể loài Ba kích (Morinda officinalis)

với các dạng hình thái khác nhau: dạng thân có lông (L); dạng thân không có lông (K); dạng quả

tụ (T) và dạng quả rời (R) với 12 mồi ngẫu nhiên.



Dạng L Dạng K Dạng T Dạng R Dạng L Dạng K Dạng T Dạng R

A1 14/16 10/12 12/15 11/13 A19 10/11 10/11 11/12 11/12

A7 11/11 9/10 6/7 9/11 A20 10/12 11/12 14/14 11/11

A12 7/7 8/8 7/8 8/8 C1 3/9 10/12 11/12 8/10

A13 14/15 11/13 13/14 13/14 C3 12/12 15/16 16/16 13/13

A15 7/10 3/7 4/7 4/7 C12 7/10 6/10 7/10 7/10

A17 14/15 11/13 13/13 10/10 C20 7/9 4/6 6/7 5/6


Hệ số tương đồng di truyền của các dòng Ba kích trong nghiên cứu nằm

trong khoảng 0,49 - 0,95. Như vậy, 25 dòng Ba kích nghiên cứu thể hiện mức độ

đa hình di truyền khá rõ rệt. Trong đó, hệ số tương đồng di truyền của từng nhóm

hình thái Ba kích thân có lông (bao gồm cả mẫu LT, LR và L) và thân không có


54

lông (gồm mẫu KT, KR và K) khác nhau khá rõ, lần lượt là 0,69 và 0,73. Điều đó

chứng tỏ hai nhóm này có mức độ khác biệt về mặt di truyền khá rõ rệt và mức độ

đa hình của nhóm hình thái Ba kích thân không có lông (K) là cao hơn nhóm Ba

kích thân có lông (L).

Tương tự như vậy, hệ số tương đồng di truyền của hai dạng hình thái Ba

kích quả tụ và Ba kích quả rời tương ứng là 0,73 và 0,74. Chứng tỏ hai dạng hình

thái Ba kích quả tụ và quả rời cũng có độ đa dạng cao, tuy thế sự khác biệt là

không rõ ràng.

Từ sơ đồ hình cây trên, một lần nữa có thể thấy, giữa 25 mẫu loài Ba kích thu thập

trong nghiên cứu được chia thành hai nhóm lớn rõ rệt: Nhóm thứ nhất (I) bao gồm các

mẫu Ba kích có đặc điểm hình thái thân có lông (L) có hệ số tương đồng di truyền giữa

chúng dao động từ 0,54 đến 0,88; nhóm thứ hai (II) là các mẫu Ba kích có đặc điểm

hình thái thân không có lông (K) có hệ số tương đồng di truyền giữa chúng từ 0,56 đến

0,95 (Hình 11).

Hình 11. Sơ đồ hình cây phản ánh mối quan hệ di truyền giữa 25 dòng Ba kích trong nghiên cứu.

Nguồn gốc và đặc điểm của các mẫu được trình bày tại Bảng 4.


55

Phân tích mức độ tương đồng của các mẫu Ba kích thuộc nhóm I, nhóm các

mẫu Ba kích có đặc điểm hình thái thân có lông, chúng tôi nhận thấy nhóm mẫu Ba

kích kí hiệu LT1-3 (có đặc điểm hình thái quả tụ) quy tụ với nhóm mẫu Ba kích kí

hiệu LR1-4 (đặc điểm hình thái quả rời) ở mức độ tương đồng 0,66; trong khi đó hai

mẫu Ba kích L1 và L2 nằm riêng rẽ và quy tụ với hai nhóm trên ở hệ số tương đồng

là 0,58.

Tương tự như vậy, nhóm các mẫu Ba kích có đặc điểm hình thái thân có lông

(nhóm II), nhận thấy: các mẫu Ba kích có hình thái thân không có lông, quả tụ (KT)

kết cụm với nhau tại hệ số tương đồng là 0,71; các mẫu Ba kích có hình thái thân

không có lông, quả rời (KR) kết cụm với nhau ở hệ số tương đồng di truyền là 0,67.

Hai phân nhóm trên quy tụ với nhau về mặt di truyền tại hệ số tương đồng là 0,62;

trong khi đó mẫu K1 nằm tách riêng với hai nhóm trên tại hệ số tương đồng là 0,59.

Từ kết quả trên, chúng tôi đưa ra một số nhận xét sau: với các mẫu Ba kích sử

dụng trong nghiên cứu, hệ số tương đồng giữa kiểu hình thái thân có lông và thân

không có lông (0,54) là thấp hơn hệ số tương đồng giữa kiểu hình thái quả tụ và quả

rời (trung bình là 0,64); điều đó chứng tỏ sự khác biệt giữa đặc điểm hình thái Ba

kích thân có lông và thân không có lông là rõ rệt hơn giữa đặc điểm hình thái quả tụ

và quả rời. Tuy vậy, nhận định này cần có các nghiên cứu tiếp theo để làm rõ.

Các mẫu Ba kích L1, L 2 và K1 nằm tách biệt với các mẫu có đặc điểm hình thái

quả khác trong từng nhóm L và K ở trên, chứng tỏ đặc điểm hình thái có cả quả tụ

và quả rời trên cùng một chùm quả của các mẫu trên có thể là đặc điểm trung gian

của hai dạng hình thái quả tụ và quả rời. Vấn đề này cũng cần được nghiên cứu

thêm.

Các số liệu chúng tôi thu được đồng thời cũng cho thấy có sự khác biệt về mặt di

truyền của các mẫu Ba kích thu tại các địa điểm địa lý khác nhau trong cùng một nhóm

có kiểu hình thái giống nhau. Cụ thể là giữa nhóm mẫu KT1-3 (thu tại Đoan Hùng, Phú

Thọ) và KT 4-5 (Lâm trường Tân Lạc, Hòa Bình); giữa nhóm mẫu KR 1- 4 (Đoan Hùng,

Phú Thọ) với nhóm mẫu KR 5-6 (Lâm Trường Tân Lạc, Hòa Bình), KR 7-10 (Đại Từ,

Thái Nguyên).


56

Bằng phần mềm NTSYS, chúng tôi cũng xác định được khoảng cách di truyền

giữa 25 mẫu Ba kích sử dụng trong nghiên cứu. Hệ số khoảng cách di truyền dao

động từ 0,21 đến 0,71; trung bình là 0,62. Điều đó một lần nữa khẳng định mức độ

đa dạng di truyền của quần thể Ba kích ở Việt Nam là khá cao. Hệ số khoảng cách

di truyền trung bình của các mẫu Ba kích thu tại 3 địa điểm Phú Thọ, Thái Nguyên,

Hòa Bình lần lượt là 0,59; 0,49 và 0,41. Điều đó cho thấy độ đa dạng về hệ gen loài

Ba kích tại 3 khu vực này là khác nhau. Tại Phú Thọ có mức độ đa dạng về kiểu gen

cao nhất. Tại Hòa Bình, độ đa dạng về kiểu gen là thấp nhất. Điều đó cũng phù hợp

với nguồn gốc cây giống được trồng tại 3 khu vực trên. Tại Phú Thọ, các cây Ba

kích được nhân giống từ hạt, qua quá trình sinh sản hữu tính nên có sự đa dạng kiểu

gen rất lớn. Tại Thái Nguyên, các cây Ba kích được đem về trồng có nguồn gốc

hoang dại nên cũng có sự đa dạng kiểu gen khá lớn. Chỉ có tại khu vực Lâm trường

Tân Lập - Hòa Bình, các cây Ba kích được nhân giống bằng việc cắt cành, giâm

hom. Đây là hình thức sinh sản hữu tính, vì thế mà các cây Ba kích ở đây có sự

giống nhau lớn hơn về mặt di truyền.

Sự đa dạng về cấu trúc của các quần thể Ba kích hiện có ở Việt Nam một

phần cho thấy yêu cầu về bảo tồn các nguồn gen loài cây thuốc này là việc làm cần

thiết, đồng thời cho thấy công tác tiêu chuẩn hóa quy trình chọn, tạo giống, thu hái,

chế biến và sản xuất dược liệu từ loài cây thuốc này ở nước ta cần quan tâm phát

triển bởi sự đa dạng của nguồn gen cây thuốc cũng có thể là nguyên nhân dẫn đến

sự biến động về chất lượng sản phẩm dược liệu.

3.2.4. Sự đa dạng di truyền của loài cây thuốc thuộc chi Panax


Một đặc điểm chung nhận thấy ở cả ba loài cây thuốc thuộc chi Panax trong

nghiên cứu là tính đồng hình thể hiện rất rõ nét. Tỷ lệ phần trăm số băng đa hình

trên tổng số băng thu được của mỗi loài lần lượt là 33,3%, 26,0% và 27,4%. Kết

quả trên thể hiện tính đa hình không cao trong các quần thể Sâm Việt Nam, Sâm Vũ

Diệp và Tam thất hoang nghiên cứu. Đặc biệt, phổ băng điện di RAPD-PCR của


57

dạng trung gian giữa Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang có sự tương đồng đáng kể

với các mẫu Sâm Vũ Diệp.

Bảng 10. Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu thuộc ba loài Sâm Việt Nam (SVN), Sâm

Vũ Diệp (SVD) và Tam thất hoang (TTH) phân tích với 13 mồi ngẫu nhiên.



SVN SVD TTH SVN SVD TTH

A1 1/8 1/7 3/7 C1 3/5 0/4 0/4

A2 1/6 0/6 1/6 C6 6/7 4/6 5/5

A3 0/5 0/2 2/4 C12 1/5 4/7 0/6

A7 3/7 2/4 0/3 C15 2/4 1/3 1/2

A8 1/2 0/4 3/7 C16 3/8 0/7 1/8

A12 2/3 1/9 0/9 C17 0/4 4/6 3/6

A14 0/3 2/8 1/6 Tổng số 23/69 19/73 20/73

Phổ băng điện di RAPD-PCR thu được cũng cho thấy cấu trúc di truyền của

hai loài Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang có sự tương đồng lớn, thể hiện quan hệ

gần gũi hơn giữa hai loài này với nhau so với Sâm Việt Nam. Mặc dù vậy, tất cả các

mẫu trung gian giữa Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang đều thể hiện cấu trúc di

truyền tương đồng với Sâm Vũ Diệp hơn là Tam thất hoang (hình 12).

Hình 12. Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình đầu mũi tên) của các mẫu Sâm Việt Nam (S), Sâm Vũ

Diệp (V) và Tam thất hoang (T) và dạng trung gian giữa Sâm Vũ Diệp-Tam thất hoang (VT) tương

ứng với mồi OPA14, OPC1 và OPA7 từ trái qua phải.


Sử dụng phần mềm NTSYSpc 2.02h, theo nguyên tắc UPGMA, chúng tôi đã

xây dựng được cây quan hệ di truyền giữa các mẫu Sâm Việt Nam, Sâm Vũ Diệp và

Tam thất hoang (Hình 13). Có thể thấy tất cả các mẫu thực vật đều kết nhóm với

nhau thành ba cụm riêng biệt ứng với ba loài. Sâm Việt Nam tách thành một nhánh


58

riêng, có hệ số tương đồng di truyền với nhóm Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang là

khoảng 0,40. Tam thất hoang và Sâm Vũ Diệp thể hiện quan hệ gần gũi hơn với hệ

số tương đồng di truyền khoảng 0,69.

Hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu Sâm Việt Nam dao động từ 0,87 đến

1,00 trong đó hai mẫu S3 và S4 (cùng thu ở Quảng Nam) thể hiện cấu trúc di truyền

giống nhau hoàn toàn còn hệ số tương đồng di truyền thấp nhất là giữa S12 (thu ở

Kon tum) và các mẫu S6, S7 và S8 (thu ở Quảng Nam). Trong nghiên cứu này,

không nhận thấy có sự tách biệt về mặt di truyền giữa các mẫu Sâm Việt Nam thu

từ hai tỉnh Quảng Nam và Kon tum (các mẫu Sâm Việt Nam thu ở Sapa là những

mẫu được di thực về từ Quảng Nam và Kon tum).

Với các mẫu Sâm Vũ Diệp (bao gồm cả dạng có kiểu hình trung gian giữa

Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang) hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,89 đến

1,00, trong đó mẫu V2 có cấu trúc di truyền hoàn toàn giống mẫu V3, tương tự với

hai mẫu V5 và V6. Cấu trúc di truyền khác nhau nhất là của các mẫu V2, V3 ,V4 với

V7 và giữa mẫu VT1 với mẫu VT3.

Có thể nhận thấy, ở cả ba loài cây thuốc nghiên cứu, hệ số tương đồng di

truyền giữa các mẫu trong loài là khá cao, thể hiện tính đồng hình tương đối cao

trong và giữa các quần thể của mỗi loài. Kết quả này phù hợp với thực tế là trong tự

nhiên, các loài cây thuốc nói trên thường có vùng phân bố hẹp và kích thước quần

thể nhỏ. Đặc biệt, việc các quần thể của Sâm Việt Nam, Sâm Vũ Diệp và Tam thất

hoang ở nước ta trong tự nhiên gần như đã biến mất do tình trạng khai thác quá mức

trong một thời gian dài cũng có thể là nguyên nhân dẫn đến tính đa dạng di truyền

thấp của ba loài dược liệu này ở nước ta hiện nay.

Về mức độ tương đồng di truyền giữa các loài nghiên cứu, hệ số tương đồng

di truyền giữa Sâm Việt Nam với Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang lần lượt dao

động trong khoảng từ 0,33 đến 0,43 và 0,37 đến 0,47, còn giữa Sâm Vũ Diệp và

Tam thất hoang là từ 0,63 đến 0,75. Kết quả trên cho thấy mối quan hệ gần gũi hơn

giữa Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang so với Sâm Việt Nam.


59

Hìn

h 1

3.

Cây

qu

an hệ

di

tru

yền g

iữa

cá

c mẫu

Sâm

Việ

t N

am

(ký

hiệ

u S

), S

âm

Vũ

Diệ

p (

ký

hiệ

u V

), dạn

g t

rung g

ian của

Sâm

Vũ

Diệ

p

và T

am

thất

ho

ang (

ký h

iệu V

T)

và T

am

thất

ho

ang (

ký h

iệu T

) tr

on

g n

ghiê

n cứ

u lập

bởi

số

liệu

th

u đượ

c từ

phân t

ích

RA

PD

-PC

R.

Nguồn

gốc

và đặc

điểm

của

cá

c mẫu

đượ

c nêu

ở Bản

g 4

.


60

Như ở phần tổng quan tài liệu chúng tôi đã đề cập tới, một vấn đề gặp phải

đối với hai loài cây thuốc Tam thất hoang và Sâm Vũ Diệp là trong tự nhiên,

ngoài hai dạng hình thái điển hình (lá xẻ sâu của Sâm Vũ Diệp và lá không xẻ

của Tam thất hoang) còn tồn tại một số dạng hình thái trung gian giữa hai dạng

điển hình là lá xẻ nông. Khi tiến hành phân tích, chúng tôi đã thu được một kết

quả lý thú là hệ số tương đồng di truyền của các mẫu có kiểu hình trung gian so với

các mẫu Sâm Vũ Diệp dao động từ 0,90 đến 0,97, trong khi với các mẫu Tam thất

hoang là từ 0,65 đến 0,73. Kết quả trên thể hiện cấu trúc di truyền của dạng trung

gian giống với Sâm Vũ Diệp hơn là Tam thất hoang. Hay nói cách khác, có thể thấy

cấu trúc ADN của hai dạng lá xẻ (nông và sâu) là không phân biệt rõ rệt, trong khi

dạng lá không xẻ thể hiện cấu trúc di truyền riêng biệt.

Các mẫu Sâm Việt Nam phân tách thành bốn cụm lớn tương đối rõ rệt, trong

đó S12 tạo thành một nhánh riêng biệt. Mẫu S6 hợp với S7 thành một cụm, tương tự

là hai mẫu S1 và S2. Cụm còn lại là tập hợp của các mẫu S3, S4, S5, S8, S9, S10, S11

và hai mẫu thu ở Sapa là S13 và S14.

Trên hình cây quan hệ di truyền có thể thấy rõ tất cả 4 mẫu có kiểu hình trung

gian giữa Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang đều kết cụm với các mẫu Sâm Vũ Diệp

tạo thành một nhóm lớn riêng biệt, phân tách với các mẫu Sâm Việt Nam và Tam

thất hoang. Điều này càng cho thấy sự gần gũi trong cấu trúc di truyền của dạng có

kiểu hình thái trung gian với Sâm Vũ Diệp hơn là với Tam thất hoang. Các mẫu

trong nhóm lớn này lại phân chia thành hai nhánh, nhánh thứ nhất gồm các mẫu từ

V1 đến V6 cùng với VT2 và VT3. Phần còn lại là các mẫu V7, V8, VT1 và VT4 kết

cụm lại thành một nhóm. Trong nhóm thứ nhất, mẫu VT3 tạo thành một nhánh

riêng, tách biệt với nhánh còn lại gồm hai cụm: V1, V2, V3 và VT2 tạo thành cụm

thứ nhất, V4, V5 và V6 tạo thành cụm thứ hai.

Như vậy nói cách khác chỉ thị RAPD-PCR không cho thấy có sự khác biệt rõ

rệt về cấu trúc di truyền giữa dạng lá xẻ sâu (Sâm Vũ Diệp) và dạng lá xẻ nông (vốn

được coi là dạng trung gian của Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang).


61

Các mẫu Tam thất hoang trong nghiên cứu cũng tách thành hai nhóm nhỏ,

nhóm thứ nhất gồm T1 đến T5, nhóm còn lại được hợp bởi T6, T7 và T8. Nhóm đầu

lại chia thành hai cụm nhỏ là T1 – T2 – T3 và T4 – T5. Ở cụm còn lại, mẫu T8 tạo

thành một nhánh, nhánh kia gồm T6 và T7.

Cũng từ việc phân tích nhờ phần mềm NTSYSpc 2.02h, chúng tôi đã xác định

được khoảng cách di truyền giữa các mẫu Sâm Việt Nam, Sâm Vũ Diệp và Tam

thất hoang trong nghiên cứu. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu Sâm Việt Nam là

từ 0,00 đến 0,35; giữa các mẫu Sâm Vũ Diệp và giữa các mẫu Tam thất hoang đều

là từ 0,00 đến 0,33. Điều này cho thấy mức đa hình thấp trong các quần thể của cả

ba loài dược liệu nghiên cứu. Khoảng cách di truyền giữa Sâm Vũ Diệp và Tam thất

hoang là từ 0,51 đến 0,61, trong khi đó khoảng cách di truyền của hai loài nói trên

với Sâm Việt Nam tương ứng là 0,75 đến 0,81 và 0,71 đến 0,78. Có thể nhận định,

trong quá trình phát sinh của chi Panax, Sâm Việt Nam là một nhánh tách ra sớm

hơn còn Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang mới chỉ tách ra gần đây.

3.2.5. Bước đầu xác định tập hợp một số chỉ thị RAPD-PCR giúp phân biệt

nhanh nguồn nguyên liệu từ các loài thực vật trong nghiên cứu

Có thể nhận thấy, đặc điểm chung ở mỗi nhóm cây dược liệu được sử dụng

trong nghiên cứu này là dược liệu xuất xứ từ các loài hoặc các dạng dưới loài

thường rất khó phân biệt với nhau về hình thái. Sau khi phân tích tính đa dạng di

truyền của chúng, một kết quả quan trọng khác chúng tôi thu được đó là chúng

tôi đã tìm được tập hợp nhiều băng đồng hình trong phạm vi mỗi loại. Bên cạnh

đó, chúng tôi cũng đã xác định được một số băng đa hình có tính chất đặc trưng

giúp dễ dàng phân biệt được các loài với nhau. Cụ thể như sau:

3.2.5.1. Chỉ thị ADN giúp phân biệt nguồn dược liệu từ các loài dược liệu Ngũ

gia bì gai và Ngũ gia bì hương

Trong nghiên cứu này, ngoài việc đã xác định được một số chỉ thị RAPD-PCR

đồng hình có mặt ở tất cả các mẫu thuộc hai loài A. trifoliatus và A. gracilistylus

thu thập được trong nghiên cứu, chúng tôi còn xác định được nhiều chỉ thị RAPD-

PCR cho phép phân biệt các mẫu giữa hai loài với nhau. Nghĩa là các chỉ thị RAPD-


62

PCR chỉ xuất hiện trong tất cả các mẫu của loài này nhưng vắng mặt ở tất cả các

mẫu thuộc loài kia. Các băng này được chúng tôi tạm gọi là các chỉ thị RAPD-PCR

có tiềm năng đặc trưng phân biệt hai loài.

Cụ thể chúng tôi xác định đuợc 10 băng RAPD-PCR đồng hình có mặt ở tất cả

26 mẫu thuộc hai loài (Bảng 11), chẳng hạn như chỉ thị OPA10400 (băng ADN nhân

bản bằng mồi OPA10 có kích thước 400 bp) như minh họa trên Hình 14.

Hình 14. Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình mũi tên) của các mẫu Ngũ gia bì gai (G) và Ngũ gia bì

hương (H) trong nghiên cứu với mồi OPA10. M: thang ADN chuẩn. Nguồn gốc và đặc điểm các

mẫu được nêu ở Bảng 4.

Trong số 14 băng RAPD-PCR có tiềm năng đặc trưng phân biệt hai loài có 6

chỉ thị đặc trưng cho loài A. trifoliatus (OPA1500, OPA9400, OPA12750, OPA151000,

OPC51200, OPC19700) và 8 chỉ thị đặc trưng cho loài A. gracilistylus (OPA1300,

OPA4400, OPA41500,OPA9550, OPA101500, OPA12950, OPA15850 và OPA151500).

Hình 15. Băng đặc trưng phân biệt (chỉ ra bởi hình mũi tên) của các mẫu Ngũ gia bì gai (G) và

Ngũ gia bì hương (H) trong nghiên cứu với mồi OPA12 (hình bên trái), và mồi OPA1 (hình bên

phải). Trong đó, chỉ thị OPA12750 và OPA1500 đặc trưng cho các mẫu thuộc loài Ngũ gia bì gai; chỉ

thị OPA12950 và OPA1300 đặc trưng cho các mẫu thuộc loài Ngũ gia bì hương. Nguồn gốc và đặc

điểm các mẫu được nêu ở Bảng 4. M: thang ADN chuẩn.


63

Các kết quả thu được của chúng tôi trên đây cho thấy: ở các loài Ngũ gia bì

hương và Ngũ gia bì gai, chỉ thị RAPD-PCR không chỉ giúp phân tích và đánh giá

mức độ đa dạng di truyền của các mẫu trong phạm vị một loài và còn cho thấy một

số chỉ thị giúp phân biệt nguồn nguyên liệu từ hai loài với nhau. Do các chỉ thị

ADN vốn không phụ thuộc vào các yếu tố môi trường và đặc điểm sinh lý của cá

thể phân tích, nên các chỉ thị ADN, trong đó có các chỉ thị RAPD-PCR vừa nêu ở

trên, rất có thể được sử dụng như một công cụ bổ sung khi cần thiết trong công tác

kiểm định và tiêu chuẩn hóa dược liệu vốn ngày càng được yêu cầu cao hơn trong

lĩnh vực sản xuất dược phẩm có nguồn gốc tự nhiên.

3.2.5.2. Chỉ thị ADN (RAPD-PCR) giúp phân biệt nguồn dược liệu từ loài Hồi

hương với các loài Hồi núi

Tương tự như vậy, khi chúng tôi thu được trong nghiên cứu là ở cả 50 mẫu

thực vật được phân tích cấu trúc di truyền bằng chỉ thị RAPD-PCR, chúng tôi đều

tìm được tập hợp nhiều băng đồng hình xuất hiện ở tất cả các mẫu (39 mẫu Hồi

hương và 11 mẫu Hồi núi), bên cạnh đó cũng xác định được một số băng đa hình có

tính đặc trưng giúp dễ dàng phân biệt được loài Hồi hương với các loài Hồi núi với

nhau. Cụ thể, trong nghiên cứu này chúng tôi đã xác định được 13 băng ADN đồng

hình có mặt ở tất cả 50 mẫu hồi, chẳng hạn chỉ thị OPA7400, 300 như minh họa trên

Hình 16.

Hình 16. Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình mũi tên) của các mẫu thuộ: hình bên trái - nhóm loài

Hồi hương (I) và hình bên phải - các loài Hồi núi (N) trong nghiên cứu với mồi OPA7. M: thang

ADN chuẩn. Băng đặc trưng phân biệt của Hồi núi là băng có kích thước 1800 bp. Nguồn gốc và

đặc điểm các mẫu được nêu ở Bảng 4.


64

Trong số 12 băng RAPD-PCR có tiềm năng đặc trưng phân biệt loài Hồi

hương và các loài Hồi núi có 8 chỉ thị đặc trưng cho loài hồi I. verum Hook.f và 4

chỉ thị mang tính chất đặc trưng cho các loài Hồi núi. Ví dụ như chỉ thị OPA61300

OPC41100, OPC10600, … là các chỉ thị đặc trưng cho loài Hồi hương. Bên cạnh đó,

các chỉ thị OPA71800 (Hình 16), … là chỉ thị đặc trưng của các mẫu Hồi núi trong

nghiên cứu. Tập hợp các chỉ thị đặc trưng phân biệt được chúng tôi tổng kết trong

Bảng 11.

Như vậy, từ các kết quả trên đây chúng tôi nhận thấy: chỉ thị RAPD-PCR

không chỉ giúp phân tích và đánh giá mức độ đa dạng di truyền của các mẫu trong

phạm vi loài Hồi hương cũng như ở các loài Hồi núi trong nghiên cứu mà còn có

thể góp phần phân biệt nguồn nguyên liệu từ hai nhóm đối tượng này với nhau. Đây

cũng là cơ sở cho việc sử dụng các chỉ thị RAPD-PCR như một công cụ bổ sung

cho công tác bảo tồn nguồn gen dược liệu.

3.2.5.3. Chỉ thị ADN (RAPD-PCR) giúp phân biệt các dạng hình thái khác

nhau của loài Ba kích

Phân tích phổ băng điện di của 12 mồi RAPD-PCR đã sử dụng trên 25 mẫu Ba

kích nghiên cứu, ở một số mồi (ví dụ các mồi OPA17, OPA15, OPC3...) chúng tôi

cũng thu được một số băng ADN đồng hình cho tất cả 25 mẫu Ba kích sử dụng

trong nghiên cứu (Hình 17).

Hình 17. Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình mũi tên) ở tất cả 25 mẫu Ba kích trong nghiên cứu với

chỉ thị OPA17. Dạng hình thái thân có lông (L), không có lông (K), dạng hình thái quả tụ (T) và

hình thái quả rời (R). Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được nêu ở Bảng 4. M: thang ADN chuẩn.

��1000bp

�� 500bp


65

Mặt khác Phân tích phổ băng điện di của 12 mồi RAPD-PCR đã sử dụng trên 25

mẫu Ba kích nghiên cứu chúng tôi nhận thấy ở đa số các mồi có sự khác biệt giữa phổ

băng ADN của các mẫu có đặc điểm hình thái thân có lông và thân không có lông, đây

chính là các chỉ thị ADN khác biệt, chỉ xuất hiện ở các mẫu Ba kích thân có lông mà

không xuất hiện ở các mẫu Ba kích có hình thái không có lông và ngược lại cũng có

những băng ADN chỉ xuất hiện ở các mẫu Ba kích thân không có lông mà không có ở

các mẫu Ba kích thân có lông (Hình 18).

Hình 18. Hình ảnh điện di các mẫu Ba kích với mồi OPA1. Băng đồng hình giữa hai dạng hình

thái thân có lông (L) và không có lông (K) có kích thước 600 bp, và 300 bp (chỉ ra bởi hình mũi

tên). Băng đặc trưng phân biệt của kiểu hình thái thân không có lông có kích thước 1100 bp.

Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được nêu ở Bảng 4. M: thang ADN chuẩn.

Giữa hai đặc điểm hình thái quả tụ và quả rời của cây Ba kích, chúng tôi nhận

thấy sự đa hình về phổ băng ADN lớn hơn. Với tất cả 12 mồi RAPD đã sử dụng thì

không thu được băng ADN nào riêng biệt cho nhóm Ba kích có hình thái quả tụ (gồm

cả mẫu có kí hiệu LT và KT) phân biệt với nhóm Ba kích có hình thái quả rời (gồm cả

mẫu có kí hiệu LR và KR).

Tập hợp các băng chỉ thị RAPD chung cho tất cả các mẫu Ba kích trong nghiên

cứu, cũng như tập hợp chỉ thị ADN phân biệt giữa kiểu hình thái Ba kích thân có lông

(L) và Ba kích thân không có lông (K) được tổng kết ở Bảng 11. Không tìm thấy chỉ thị

ADN phân biệt giữa hai dạng hình thái Ba kích quả tụ (T) và Ba kích quả rời (R).

OPA17


66

3.2.5.4. Chỉ thị ADN (RAPD-PCR) giúp phân biệt các loài Sâm Việt Nam, Sâm

Vũ Diệp và Tam thất hoang

Một kết quả quan trọng khác chúng tôi thu được trong đề tài là ở cả ba loài cây

thuốc nghiên cứu chúng tôi đều tìm được tập hợp nhiều băng đồng hình trong phạm

vi mỗi loài, bên cạnh đó cũng xác định được một số băng đa hình có tính đặc trưng

giúp dễ dàng phân biệt được các loài với nhau.

Chẳng hạn, như trên hình 19, khi sử dụng mồi OPA14, tất cả các mẫu Sâm

Việt Nam đều cho hai băng nhân bản 650 bp và 1100 bp (ký hiệu tương ứng là

OPA14650 và OPA141100) phân biệt với tất cả các mẫu Sâm Vũ Diệp và Tam thất

hoang cho hai băng nhân bản OPA14550 và OPA14750. Tương tự, khi sử dụng mồi

OPC16, chúng tôi đã thu được băng OPC16550 xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên

cứu. Đây có thể là băng chỉ thị chung cho cả 3 loài nghiên cứu. Ngoài ra, chúng tôi

còn thu được hai băng OPC16320 và OPC16650 là những băng chỉ xuất hiện ở các

mẫu Sâm Việt Nam. Đây là chỉ thị giúp phân biệt các mẫu Sâm Việt Nam với các

mẫu Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang khác.

Hình 19. Ảnh điện di các mẫu Sâm Việt Nam (S), Sâm Vũ Diệp (V), dạng trung gian (VT) và Tam thất

hoang (T) với mồi OPA14 và OPC16, hình mũi tên chỉ ra các băng đặc hiệu phân biệt còn hình đầu

mũi tên chỉ ra các băng chung. M: thang ADN chuẩn (1kb marker). Nguồn gốc và đặc điểm của các

mẫu được nêu ở Bảng 4.

Tổng hợp kết quả từ 13 mồi ngẫu nhiên sử dụng trong đề tài này, bước đầu

chúng tôi đã tìm được tập hợp một số chỉ thị RAPD-PCR chung cho cả ba loài Sâm

Việt Nam, Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang, cũng như các tập hợp chỉ thị RAPD-

PCR đặc trưng có thể giúp phân biệt ba loài dược liệu nói trên với nhau (Bảng 11).


67

Bảng 11. Tập hợp các chỉ thị ADN (chỉ thị RAPD-PCR) đặc trưng có thể giúp phân biệt các loài

dược liệu nói trên.

Chỉ thị đặc trưng phân biệt Chỉ thị chung C

hi

A

CA

NT

HO

PA

NA

X

Ngũ gia bì hương A1500, A4600, 300, A12750, A151000,

C51200, C9700

A11100, A41000, 700, 500,

250, A5500, 400, A10400,

A12300, A15600, C5400,

C9350 Ngũ gia bì gai

A1300, A41500, 400, A101500, A12950,

700, A151500, 850

Chi

ILL

ICIU

M

Hồi hương

A61300, A10400, C2350, C41100, C9900,

C101600, C201100, 300

A6500, A7400, 300,

A10550, A141050, 400,

C11100, 550, C4300,

C72100, C10600, C12830,

C20600

Một số loài Hồi núi A6400, A71800, C21200, C20400

Chi

MO

RIN

DA

(Mori

nda o

ffic

inali

s)

Dạng thân có lông A191000, 700, 600, C12750, C1300, C3

1500, 650, 500 A1600, 300, A13350,

A15700, 400, A17500,

A19850, C1700, 400,

C12600, 500, C201400

Dạng thân không có lông A191000, 700, 600, C12750, C1300, C3

1500, 650, 500

Dạng quả tụ A7200, A11100, C1600, C20500

Dạng quả rời C1700, 400, C201400

Chi

P

AN

AX

Sâm Việt Nam A2900, A8150, A141100, 650, C6900,

C16650, 320, C17700, 450 A21200, 450, A81600, 200,

A12250, A14270, C1750,

C16550, 250, C17350

Sâm Vũ Diệp A2530, A8750, 730 , A121500, 150, C1250,

Tam thất hoang A8400, 240, A121300, 800, 700, 550, C1400,

C12850

Kết quả thu được cho thấy chỉ thị RAPD-PCR có thể được áp dụng hiệu quả

trong việc giúp phân biệt nhanh một số loài dược liệu có hình thái gần gũi. Đây

cũng là cơ sở cho việc sử dụng các chỉ thị RAPD-PCR như một công cụ bổ sung

trong công tác bảo tồn nguồn gen cây dược liệu.


68

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Từ những kết quả phân tích bước đầu tính đa dạng nguồn tài nguyên một số

loài dược liệu ở Việt Nam bằng chỉ thị RAPD-PCR chúng tôi rút ra một số kết luận

chính như sau.

1. Phương pháp mini-CTAB có cải tiến dựa theo quy trình của Saghai-Maroof

và cs (1984) đã được sử dụng để tách chiết thành công ADN tổng số từ 134 mẫu

thuộc hơn 8 loài cây dược liệu trong nghiên cứu.

2. Bước đầu chúng tôi đã đánh giá được mức độ đa dạng di truyền của các loài

cây thuốc nghiên cứu. Các loài thuộc chi Panax có mức đồng hình rất cao: Hệ số

tương đồng di truyền trong loài Sâm Việt Nam là 0,87 – 1, trong loài Sâm vũ diệp là

0,89 – 1 và trong loài Tam thất hoang là 0,89 – 1. Trong khi đó, các loài Ngũ gia bì

gai, Ngũ gia bì hương, hồi hương, các loài hồi núi và Ba kích thể hiện tính đa hình

cao, hệ số tương đồng di truyền tương ứng là 0,62 – 0,92; 0,67 – 0,95; 0,59 – 0,96;

0,56 – 0,78 và 0,49 – 0,95.

3. Dựa trên sự khác biệt của phổ điện di, bước đầu chúng tôi đã xây dựng

được các tập hợp chỉ thị RAPD-PCR có thể sử dụng để góp phần phân biệt giữa 2

loài Ngũ gia bì gai và Ngũ gia bì hương; loài hồi hương và một số loài hồi núi; 3

loài Sâm Việt Nam, Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cũng như giữa các dạng hình

thái khác nhau của loài Ba kích.

4. Sự khác biệt rõ rệt về chỉ thị ADN giữa hai loài cây thuốc trong phạm vi

mỗi chi, cũng như giữa các dạng hình thái trong phạm vi mỗi loài cho thấy chỉ thị

ADN nói chung và chỉ thị RAPD-PCR nói riêng, không những có thể giúp đánh giá

mức độ đa dạng di truyền của các loài cây thuốc, xác định khoảng cách di truyền

giữa chúng, mà còn có tiềm năng sử dụng như một phương pháp bổ sung trong công

tác phân loại, kiểm định và tiêu chuẩn hóa dược liệu từ các loài cây thuốc ở Việt

Nam trong tương lai.


69

KIẾN NGHỊ

Trên cơ sở các kết luận trên, chúng tôi có một số kiến nghị như sau:

1. Tiếp tục sử dụng các chỉ thị phân tử khác như RFLP, AFLP, 18S ARN...

để nghiên cứu sâu thêm về đặc điểm di truyền của các loài cây thuốc có trong

nghiên cứu. Đồng thời tiếp tục nghiên cứu phát triển khả năng ứng dụng các chỉ

thị ADN nói chung và chỉ thị RAPD-PCR nói riêng trong các nghiên cứu đánh

giá sự đa dạng di truyền và góp phần phân loại các loài cây thuốc quý ở Việt

Nam nhằm định hướng bảo tồn, chọn tạo giống và cung cấp một công cụ sinh

học hữu hiệu trong công tác kiểm định và tiêu chuẩn hóa dược liệu theo định

hướng từng bước hiện đại hóa nền y học cổ truyền trong nước.

2. Cần tăng cường các biện pháp bảo tồn, lưu giữ nguồn gen của loài dược liệu

quý hiếm ở Việt Nam nói chung và đặc biệt là loài Ngũ gia bì hương (do số lượng

cá thể còn rất ít ỏi), Ba kích (do trong tự nhiên quần thể loài này bị suy giảm một

cách nghiêm trọng và ngày càng trở nên khan hiếm),…nói riêng. Đồng thời mở

rộng quy mô nghiên cứu về số lượng loài, nghiên cứu về dược lý học của các loài

cây dược liệu trong nghiên cứu.


70

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1 Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm (2006), Hóa học và hoạt tính sinh học cây

Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus), Nhà xuất bản Khoa học và kỹ

thuật, Hà Nội. 2 Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004), 1000 cây thuốc và động vật làm thuốc ở

Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tập 1: trang 986-993,

Tập II: 410-415. Trang 101, tr 704 – 714.

3 Nguyễn Tiến Ban (1996), Sách đỏ Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, phần thực vật, trang 29-30.

4 Nguyễn Minh Đức (2003), “Thành phần saponin Sâm Việt Nam thiên nhiên và

trồng trọt, giá trị Sâm Việt Nam theo quan điểm hoá phân loại và dược lý học”,

Hội thảo bảo tồn và phát triển Sâm Ngọc Linh, Bộ Y tế – Uỷ ban nhân dân tỉnh

Quảng Nam, tr 125 – 134.

5 Nguyễn Tập (2005), Các loài thuộc chi Panax L. ở Việt Nam, Tạp chí Dược

liệu, Tập 10, số 3/2005, tr 71 – 76.

6 Phan Kế Lộc, 2003. Danh lục các loài thực vật Việt Nam. Nhà xuất bản Nông

nghiệp, Hà Nội, trang 130 – 134. Tập II: tr 704 – 714.

TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI

7 Akkaya M.S., Bhagwat A.A. and Cregan P.B. (1992), “Length

polymorphisms of simple sequence repeat DNA in soybean”, Genetics, 132,

p1131-1139.

8 Akopyanz N., Bukanov N.O., Westblom T.U. and Berg D.E. (1992), “PCR-

based RFLP analysis of DNA sequence diversity in the gastric pathogen

Helicobacter pylori”, Nucleic Acid Res., 20, p6221-6225.

9 Amit Sigh Yadav, D. Bhatagar (2007), “Chemo-preventive effect of star

anise in N-nitrosodiethylamine initiated and phenobarbital promoted hepato-

carcinogenesis”, Chemo-Biol.Int.

10 Bae E.A., Yook C.S., Oh O.J., Chang S.Y., Nohara T., Kim D.H. (2001),

“Metablism of Chiisanoside from Acanthopanax divaricatus var. albeofructus

by Human Intestinal Bacteria and Its Relation to Some Biological Activities”,

Biol. Pharm. Bull., 24(5), 582-585.

11 Bebeli P.J., Zhou Z., Somers D.J. and Gustafson J.P. (1997), “PCR primed


71

with mini satellite core sequences yields DNA fingerprinting probes in

wheat”. Theor. Appl. Genet., 95, p276-283.

12 Beckmann J.S. (1988), “Oligonucleotide polymorphisms: A new tool for

genomic genetics”, Bio/Technology, 6, p161-164.

13 Beckmann J.S. and Soller M. (1990), “Toward a unified approach to genetic

mapping of eukaryotes based on sequence tagged microsatellite sites”,

Bio/Technology, 8, p930-932.

14 Bensky D., Gamble A. et al (1993), Chinese Herbal Medicine Materia

Medica, Seattle: Eastland Press, 331-332.

15 Blanc P.D. et al (2001), Alternative therapies among adults with a reported

diagnosis of asthma or rhinosiusitis, data from a population-based survey,

Chest, 120, 1461-1467.

16 Buiatti M., Maestri E., Malcevschi A., Marmiroli N., Aert R., Volckaert G.,

Rudea J., Linacero R., Vazquez A., Karp A. (1997), “Reproducibility testing

of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a network ofEuropean

laboratories”, Mol Breed, 3, p381–390.

17 Burstein H.J. et al (1999), “Use of alternative medicine by women with early-

stage breast cancer”, New Engl J Med, 340, 1733-1739

18 Caetano-Anollés G., Bassam B.J. and Gresshoff P.M. (1993), “Enhanced

detection of polymorphic DNA by multiple arbitrary amplicon profiling of

endonuclease-digested DNA: identification of markers tightly linked to the

super nodulation locus in soybean”, Molec. Gen. Genet., 241, p57-64.

19 Chan K. (2003), Chemosphere, 52, 1361.

20 Chen X.C., Xia L., Hu S., Huang G. (1996), “Inhibitory effects of

Acanthopanax gracilistylus saponins on human platelet aggregation and

platelet factor 4 liberation in vitro”, Zhongguo Yao Li Xue Bao, 17(6), 523-

526.

21 Cheng, K.T., Tsay, H.S., Chen, C.F., Chou, T.W. (1998). " Determination of

the components in a Chinese prescription, yu-ping-feng san, by RAPD

analysis" . Planta Medica, 64: 563-565.

22 China National Medicines & Health Products Imp. & Exp. Corporation,

Memory-enhancing Brain Tonic, Curing Herbs. com.

23 Choi J. et al., (2005). "Antinociceptive anti-inflammatory effect of

Monotropein isolated from the root of Morinda officinalis". Biol. Pharm.

Bull. 28(10):1915-8.

24 Chris Duran et al (2009), “Molecular genetic markers: discovery,

applicatiosn, data storage and visulaisation”, Current Bioinformatics, 4, 16-


72

27.

25 Cui, C., et al. (1995). "Antidepressant active constituents in the roots of

Morinda officinalis How", Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 20(1):36-9.

26 Dargan P.I., Gawarammana I.B. et al (2008), Int J Environ Health, 2 (3/4),

136.

27 Diego Ize-Ludlow, et al. (2004), “Neurotoxicities in infants seen with the

consumption of Star anise tea”, American academy of Pediatrics,

114(5):653-656.

28 Dorthe Joker and Nguyen Duc To Luu (2002), “Illicium verum Hook.f, Seed

leaflet”, Danicla Forest Seed centre , 52.

29 Du J., Gao L. (1992), “Chemical constituents of the leaves of Acanthopanax

trifoliatus (L.) Merr.”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 17(6), 256-257, 383.

30 Gocmen B., Jermstad, K.D., Neale, D.B. and Kaya, Z. (1996).

"Development of random amplified polymorphic DNA markers for genetic

mapping in Pacific yew (Taxusbrevifolia)". Can. J. For. Res. 26 (3): 497-

503.

31 Grodzicker T. et al (1974), “Physical mapping of temperature sensitive

mutatiosns”, Cold Spring Harbor Symp, 39, p439-470.

32 Hadrys H., Balick M., Schierwater B. (1992), “Applications of random

amplified polymorphicDNA (RAPD) in molecular ecology”, Molec Ecol1,

p55–63.

33 Hatada I., Hayashizaki Y., Hirotsune S., Komatsubara H. and Mukai T.

(1991), “A genome scanning method for higher organism using restriction

sites as landmarks”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 , p397-400.

34 Hosokawa K., Minami, M., Kawahara K., Nakamura I. and Shibata T.

(2000). "Discrimination among three species of medicinalScutellaria plants

using RAPD markers". Planta Medica, Stuttgart, V. 66: 270-272.

35 Huong N.T.T., Yukihisa Murakami, Michihisa Tohda, Hiroshi Watanabe,

Kinzo Matsumoto (2005), “Social isolation stress-induced oxidative damage

in mouse brain and its modulation by majonoside-R2, a Vietnamese ginseng

saponin”, Biol. Pharm. Bull., 28(8), pp 1389 – 1393.

36 Jeffrey A.J. (1979), “DNA sequence variants in the GA and B-globin gense

of Man”, Cell, 18, p1-10.

37 Jeffreys AJ., Wilson V. and Thein SL (1985), “Hyper variable min satellite

regions in human DNA”, Nature, 314, p67-73.

38 Jones C.J., Edwards K.J., Castaglione S., Winfield M.O., Sala F., Wiel C. van

de, Bredemeijer G., Vosman B., Matthes M, Daly A., Brettschneider R.,


73

Bettini P., Jordan S.A., and Humphries P. (1994), “Single nucleotide

polymorphism in exon 2 of the BCP gene on 7q31-q35”, Human Molecular

Genetics, 3, p1915

39 Joshi K., Chavan P. et al (2004), Curr Sci, 87 (2), 159.

40 Kalendar R., Grob T., Regina M., Suoniemi A. and Schulman A. (1999),

“IRAP and REMAP: two new retrotransposon-based DNA fingerprinting

techniques”, Theor. Appl. Genet., 98, p704-711.

41 Karnataka Medicinal Plants Authoriy (2009), Authenticity, puriy of herbal

drugs critical for sustained growth in global markets, KMPA chief.

42 Kassier W.J. et al (1991), “The use of medicinal herbs by human

immunodeficiency virus-infected patients”, Arch Intern Med, 151, 2281-

2288.

43 Kiem P.V., Minh C.V., Cai X.F., Lee J.J., Kim Y.H. (2003), “A new-24-nor-

Lupane-Glycoside of Acanthopanax trifoliatus”, Arch. Pharm. Res., 26(9),

706-708.

44 Kiem P.V., Minh C.V., Dat N.T., Cai X.F., Lee J.J., Kim Y.H. (2003), “Two

new Phenyl propanoid glycosides from the stem bark of Acanthopanax

trifoliatus”, Arch. Pharm. Res., 26(12), 1014-1017.

45 Kim C.H., Sun B.Y. (2000), “New Taxa and Combinations in

Eleutherococcus (Araliaceae) from Eastern Asia”, Novon, 10(3), 209-214.

46 Kim, I.T, et al., (2005). "In-vitro and in-vivo anti-inflammatory and

antinociceptive effects of the methanol extract of the roots of Morinda", J.

Pharm. Pharmacol. 57(5):607-15.

47 Kumar P. (2009), “Potential of molecular markers in Plant biotechnology”,

Plant Omics Journal, 2 (4), p141-162.

48 Landergren U. et al (1988), “DNA diagnostics. Molecular technigues

andautomation”, Science, 241, 1077-1080.

49 Li S. et al (2008), Chin Med, 3, 7

50 Li Z.Y., Zhu G. (2005), “(1669) Proposal to conserve the name

Acanthopanax against Eleutherococcus (Araliaceae)”, Taxon, 54(1), 194-195.

51 Li, Y.F., Yuan, L., Xu, Y.K., Yang, M., Zhao, Y.M., Luo, Z.P. (2001).

"Antistress effevt of oligosaccharide extracted from Morinda officinalis in

mice and rats", Acta Pharmacol Sin., 22(12): 1084-8.

52 Lipp F.J. (1996), “The efficacy, history and politics of medicinal plants”,

Alternative Therapy and Health Medicine, 2, 36-41.

53 Maheswaran M. (2004), “Molecular markers: history, features, and

application”, Advanced Biotech, p17-24.


74

54 Mazzanti G. et al (2008), Food Chem Toxicol, 46, 3043

55 Morgante M. and Vogel J. (1994), “Compound micro satellite primers for the

detection of genetic polymorphisms”, U. S. Patent Appl., 08/326456.

56 Mukherjee PK. (2006), Ethnopharmacology, 103, 25

57 Muskesh Kumar Chaubey (2008), “Funmigant toxicity of essential oils from

some common spices against Pulse Beetle”, Callosobruchus chenensis

(Coleoptera: Bruchiae), J. Oleo Sci., 57(3), pp: 171 - 179.

58 National institute of materia medica Hanoi - Vietnam, Selected medicinal

plants in Vietnam, Hanoi, Vol. I, 12-17.

59 Nazma Inamdar et al (2008), “Herbal drugs in milieu of modern drugs”,

International Journal of Green Pharmacy, vol 2 (1), p 1-8.

60 Nguyen T.T., Matsumoto K., Yamasaki K., Nguyen MD., Nguyen TN.,

Watanabe H. (1996), “Effects of majonoside-R2 on pentobarbital sleep and

gastric lesion in psychologically stressed mice”, Pharmacol. Biochem.

Behav., 53(4), pp 957 – 963.

61 Niharika Sahoo et al (2010), “Herbal drugs: Standards and Regulation”,

Fitoterapia, 81, pp 462-471.

62 Orita M., Suzuki, Y., Sekiya T. and Hayashi K. (1989), “Rapid and sensitive

detection of point mutations and DNA polymorphisms using polymerase

chain reaction”, Genomics, 5, p874-879.

63 Paran I. and Michelmore RW. (1993), “Development of reliable PCR-based

markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce”, Theor.

Appl.Genet, 85, p985-993.

64 Park S.Y., Yook C.S., Nohara T., Mizutani T., Tanaka T. (2004), “Random

Amplified Polymorphic DNA Analysis of Genetic Relationships Among

Acanthopanax Species”, Arch. Pharm. Res., 27(12), 1270-1274.

65 Phuong N.T., Lee k. A., Jeong S. J., Fu C. X., Choi J. K., Kim Y. H., J. S.

Kang (2006), “Capillary electrophoretic method for the determination of

diterpenoid isomer in Acanthopanax species”, Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis, 40, 56-61.

66 Phuong N.T., Lee K.A., Jeong S.J., Fu C.X., Choi J.K., Kim Y.H., J.S. Kang

(2006), “Capillary electrophoretic method for the determination of

diterpenoid isomer in Acanthopanax species”, Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis, 40, 56-61.

67 Rao J.K. et al (1999), “Use of complementary therapies for arthritis among

patients of rheumatologist”, Ann Intern Med, 131, 409-416.


75

68 Rates S.M.K. (2001), Toxicon, 39, 603.

69 Rohde W. (1996), “Inverse sequence-tagged repeat (ISTR) analysis, a novel

and universal PCR-based technique for genome analysis in the plant and

animal kingdom”, Journal of Genetics Breed, 50, p249-261.

70 Rohlf F.J., 2000. NTSys-PC numerical taxonomy and multivariable analysis

system.Exeter software. Applied Biostatistics Ins., New York.

71 Saiki R.K. et al (1986), “Analysis of enzymatically amplified beta-globin and

HLA-DQ alpha DNA with allele-specific oligonucleotide probes”, Nature,

324, p163-6.

72 Saper R.B. et al (2008), JAMA, 300(8), 915.

73 Saxena P.K., Cole I.B., Murch S.J. (2007), “Approaches to quality plant

based medicine: signficance of chemical profiling”, Applications of Plant

Metabolic Engineering, p311.

74 Schierwater B., Ender A. (1993), “Different thermostable DNA polymerases

may amplify different RAPD products”, Nucleic Acids Research, 21, 4647-

4648.

75 Shan B. E., Yoshita Y., Sugiura T., Yamashita U. (1999), “Suppressive effect

of Chinese medicinal herb, Acanthopanax gracilistylus, extract on human

lymphocytes in vitro”, Clin. Exp. Immunol., 118(1), 41-48.

76 Sharma M. et al (2008), “Molecular markers: new prospects in plant genome

analysis”, Pharmacognosy Review, 2(3), p23-34.

77 Shasany A.K., Kukreja A.K., Saikia D., Darokar M.P., Khanuja S.P.S and

Kumar S. (1999). "Assessment of diversity among Taxus wallichiana

accessions from North East India using RAPD analysis". Plant Genetic

Resources Newsletter,121: 27-31.

78 Soon Y.Y., Tan B.K. (2002), "Evaluation of the hypoglycemic and anti-

oxidant activitives of the Morinda officinalis in streptozotocin-induced

diabetic rats ". Singapore Med. J., 43(2): 77-85.

79 Stewart K.M. (2003), Ethnopharmacology, 89, 3.

80 Strader D.B. et al (2002), “Use of complementary and alternative medicine in

patients with liver disease”, Am J Gastroenterol, 97, 2391-2397.

81 Suhhanshu Tiwari (2008), “Plants: A Rich Source of Herbal Medicine”,

IJournal of Natural Products, 1, pp. 27 - 35.

82 Telenius H., Carter N.P., Bebb C.E., Nordenskjold M., Ponder B.J.,

TunnacliffebA. (1992), “Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general

amplification of target DNA by a single degenerate primer”, Genomics, 13,


76

p718-725.

83 Thomas A. Mc, Donald et al. (1999), Evidence on the carcinogeneicity of

estragole, Reproductive and Cancer Hazard Assesment Section.

84 Tran Q.L., Adnyana I.K., Tezuka Y., Harimaya Y., Saiki I., Kurashige Y.,

Tran Q.K., Kadota S. (2002), “Hepatoprotective effect of majonoside-R2, the

major saponin from Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis)”, Planta

Medica, 68(5), pp 402 – 406.

85 Vos P., Hogers R., Bleeker M., Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J.,

Peleman J., Kuiper M. and Zabeau M. (1995), “AFLP: A new technique for

finger printing”, Nucleic Acids Res., 23, p4407-4414.

86 Wang D.Q., Fan J., Feng S.B., Li S.R., Wang X.B., Yang C.R., Zhou J.

(1989a), “Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var.

bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng”, Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 593 – 599.

87 Wang D.Q., Feng B.S., Wang X.B., Yang C.R., Zhou J. (1989b), “Further

study on dammarane saponins of leaves of Panax japonicus var. major

collected in Quinling Mountains China”, Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 633 –

636.

88 Waumans D., Brunnel N., Tytagat J. (2004), Anise oil as a precusor for 2-

Alkoxy-5-methoxybenzadehydes, Microgram Journal, 2(1-4), 4 - 10.

89 Welsh J. and McClelland M. (1990), “Fingerprinting genomes using PCR

with arbitrary primers”, Nucleic Acids Res. 18, p7213-7218.

90 Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalsk J.A. and Tingey S.V.

(1990), “DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as

genetic markers”, Nucleic Acid Research, 18, p6531-6535.

91 World Health Organization (1978), The Declaration of Alma-Ata, WHO

express.

92 World Health Organization (2007), WHO guidelines for assessing quality of

herbal medicines with reference to contaminants and residues. WHO

express.

93 World Health Organization (2008), Traditional medicine, WHO express.

94 Xue J., Hao L., Peng F. (2008), Chemosphere, 71, 1051.

95 Zietkiewicz E., Rafalski A. and Labuda D. (1994), “Genome fingerprinting

by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction

amplification”, Genomics, 20: 176-183.

96 Ziming Wang, Lu Wang, Tiechun Li, Xin Zhou, Lan Ding, Young Yu, Aimin

Yu, Hanqi Zhang (2006), “Rapid analysis of the essential oils from dried

Illicum verum Hook.f and Zingiber officinale Rosc. By improved solvent-


77

free microwave extraction with three types of microwave-absorption

medium”, Anal Bioanal Chem, 386, 1863-1868.

97 Yap K.Y., Chan S.Y., Lim C.S. (2008), Food Chem, 107, 570.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Thành phần các dung dịch sử dụng trong phản ứng tách chiết ADN

tổng số

Dung dịch CTAB 2% 10 ml

Nước cất (dH2O) 3,2 ml

0,5 M Tris-HCl pH8 2 ml

5 M NaCl 2,8 ml

0,1 M EDTA 2 ml

14,3 M β-mercaptoethanol 28 µl

CTAB 0,2 g

Dung dịch Wash I 10 ml

100% ethanol 7,6 ml

NaOAc 0,272 g


Dung dịch Wash II 10 ml

100% ethanol 7 ml

Nước cất 3 ml

Dung dịch đệm TE 10 ml


0,5 M Tris-HCl pH8 0,2 ml

0,1 M EDTA 0,1 ml

Phụ

lụ

c 2.

Bả

ng hệ

số tươ

ng đồ

ng d

i tr

uyề

n g

iữa

các mẫ

u t

huộc h

ai

loài

cây t

huốc N

gũ g

ia b

ì g

ai

(G)

và

Ngũ g

ia b

ì

hươ

ng (

H)

thu t

hập đượ

c t

rong n

ghiê

n cứ

u t

rên cơ

sở

ph

ân t

ích c

hỉ

thị

RA

PD

-PC

R.

Ng

uồ

n gốc v

à đặc đ

iểm

các mẫu

đượ

c t

rình b

ày ở

bản

g 4

.

Phụ

lụ

c 3

. Bảng hệ số

tươ

ng đồn

g d

i tr

uyền g

iữa c

ác mẫu t

huộc loài cây th

uốc hồi hươ

ng

tro

ng n

gh

iên cứ

u t

rên cơ

sở

phân tíc

h c

hỉ t

hị R

AP

D-P

CR

. N

guồn gốc v

à đặc đ

iểm

các mẫ

u đượ

c t

rình b

ày ở

bản

g 4

.

Phụ

lụ

c 4

. Bảng hệ số tươ

ng đồn

g d

i tr

uyề

n g

iữa c

ác mẫu q

uầ

n t

hể t

huộc l

oài

Ba k

ích.

Nguồn gốc v

à đặc đ

iểm

củ

a

các mẫ

u đượ

c t

rìn

h b

ày ở

bản

g 4

.

Phụ

lụ

c 5

. Bả

ng

hệ số tươ

ng đồng

di

truyề

n g

iữa

các mẫu

quầ

n t

hể t

huộc b

a l

oài

cây t

huốc s

âm

Việ

t N

am

, S

âm

Vũ

Diệ

p v

à T

am

thất

hoa

ng t

hu t

hập ở

Việ

t N

am

. N

guồn gốc v

à đặc đ

iểm

các mẫ

u đượ

c t

rìn

h b

ày ở

bản

g 4

.

Phụ lục 6. Sản phẩm điện di băng đồng hình và băng đặc trưng phân biệt ở cả

hai loài ngũ gia bì gai và ngũ gia bì hương với mồi OPA15. Băng OPA151000 đặc

trưng cho A. trifoliatus, hai băng OPA151500 và OPA15850 đặc trưng cho A.

gracilistylus. Băng chung cho tất cả các mẫu OPA15600. M thang ADN chuẩn.

Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được nêu ở bảng 4.

Phụ lục 7. Băng đặc trưng phân biệt (được chỉ ra bởi hình mũi tên) ở của ngũ gia

bì hương với mồi OPA4. M thang ADN chuẩn. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu

được nêu ở bảng 4.

600 bp600 bp600 bp600 bp

Phụ lục 8. Hình ảnh một số băng đồng hình ở mồi OPA6, M - thang ADN chuẩn,

băng chung cho tất cả các mẫu hồi là 500 bp; băng mang tính đặc hiệu cho loài

hồi hương là 1300 bp.

Phụ lục 9. Hình ảnh một số băng đồng hình ở mồi OPC4, M - thang ADN chuẩn,

băng chung cho tất cả các mẫu hồi là 300 bp; băng mang tính đặc hiệu cho loài

hồi hương là 1100 bp.

Phụ lục 10. Hình ảnh một số băng đồng hình ở mồi OPA14, M - thang ADN

chuẩn, băng chung cho tất cả các mẫu hồi là 1050 và 400 bp.

Phụ lục 11. Hình ảnh điện di mồi OPC10, với M - thang ADN chuẩn; băng chung

cho tất cả các mẫu hồi có kích thước 1600 bp; băng đặc hiệu loài hồi hương có

kích thước 1600 bp.

Phụ lục 12. Hình ảnh một số băng đồng hình từ kết quả điện di các mẫu ba kích

với mồi OPA15. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu nêu ở bảng 4.

24-LuanVanThacSi-ChuaPhanLoai (12).PDF

Documents

Transcript of 24-LuanVanThacSi-ChuaPhanLoai (12).PDF