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双水相体系是怎样形成的？ 其分配机理是什么？ 什么双水相萃取？ 双水相体系的相图？ 双水相萃取的原理是什么？ 特点是什么？ 影响双水相萃取体系的因 

素有哪些？ 其应用范围是什么？ 

2.3 2.3 双水相萃取 双水相萃取

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2.3.1双水相体系的形 成与分配 2.3.2双水相萃取分离 的原理 2.3.3双水相萃取体系 的影响因素 2.3.4双水相萃取操作 及特点 2.3.5双水相萃取的应 用

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掌握： 

了解： 

重点： 

难点： 

本节要点及学习要求 本节要点及学习要求 

双水相体系的形成与分配机理 双水相萃取分离的原理 双水相体系中的分配平衡 

聚合物的不相溶性、 影响物质分配平衡的因素 

双水相中聚合物组成的影响 双水相系统物理化学性质的影响 盐和缓冲液的影响 

双水相系统的应用。 

双水相体系的形成与分配机理 双水相萃取分离的原理和特点 

双水相体系的形成与分配机理 西南科技大学 西南科技大学

形成与分配机理 分离的原理 

分配平衡：静电作用、疏水作用。 

、系线、双节线、临界点。 影响物质分配平衡的因素： 

双水相中聚合物组成的影响； 双水相系统物理化学性质的影响； 盐和缓冲液的影响；温度的影响。 

。 

形成与分配机理， 分离的原理和特点。 

形成与分配机理。

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n双水相萃取技术 (two­aqueous phase extraction,ATPS) 

又称水溶液两相分配技术 

(1)概述： 基因工程产品如蛋白质和酶 

传统的溶剂萃取法并不适合 

问题，但存在大量使用有机相 

基因工程产品的商业化迫切需要开发适合 

经济简便的、快速高效的分离纯化技术 

2.3.1 双水相体系的形成与分配 

活性和功能对pH值、温度和离子强度 在有机溶剂中的溶解度低并且会

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双水相萃取技术 aqueous phase extraction,ATPS) 

水溶液两相分配技术 

蛋白质和酶的特点: 

传统的溶剂萃取法并不适合。反胶束的办法可克服这些 

使用有机相和相的分离问题。 

基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、 

快速高效的分离纯化技术。 

双水相体系的形成与分配 

温度和离子强度等特别敏感； 并且会变性。

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技术诞生 技术诞生 

1896 1896年 年Bei jerinck Bei jerinck观察到 观察到 

先得到一 先得到一浑浊不透明溶液 浑浊不透明溶液，随后分为 ，随后分为 两相 两相，即 ，即双水相系统 双水相系统 ? ? 

将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从 将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从 一个水相 一个水相中 中__ __双水相萃取 双水相萃取. . 

开始于本世纪 开始于本世纪70 70年代，现已应用到 年代，现已应用到 病毒 病毒等分离提纯。 等分离提纯。近年来出现的引人注目 分离技术。 分离技术。 

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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随后分为 随后分为两相 两相, , 水相 水相也可以分为 也可以分为 

蛋白质等生物活性物质从 蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另 一个水相转移到另 

现已应用到 现已应用到酶、核酸、生长激素、 酶、核酸、生长激素、 近年来出现的引人注目、极有前途的新型 极有前途的新型 

明胶 明胶­ ­琼脂水溶液混合 琼脂水溶液混合 明胶 明胶­ ­淀粉水溶液混合 淀粉水溶液混合 

双水相体系的形成与分配

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(2)双水相体系 

在一定浓度范围 

两相均含有 较多的水 

明胶­琼脂水溶液混合 明胶­淀粉水溶液混合 葡聚糖­甲基纤维素 

亲水性高分 子聚合物 

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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双水相 

在一定浓度范围 

密度不同两相 

两相均含有 较多的水 

亲水性高分 子聚合物 

水 

水溶液 

双水相体系的形成与分配

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向水相中加入 向水相中加入高分子化合物 高分子化合物 一定组成范围内 一定组成范围内， ，可以形成 可以形成 

轻相 轻相富含 富含高分子化合物 高分子化合物PEG PEG 

重相 重相富含 富含盐 盐或 或高分子化合物 高分子化合物 

举 例 

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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高分子化合物 高分子化合物PEG/ PEG/葡聚糖 葡聚糖或 或盐 盐， ，在 在 可以形成 可以形成密度不同的两相 密度不同的两相。 。 

PEG PEG， ， 

高分子化合物 高分子化合物Dx Dx葡聚糖 葡聚糖。 。 

双水相体系的形成与分配

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葡聚糖 葡聚糖- -甲基纤维素钠两相体系 甲基纤维素钠两相体系 

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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甲基纤维素钠两相体系 甲基纤维素钠两相体系 

双水相体系的形成与分配 

0.39% 葡聚糖 

0.65% 甲基纤维素钠 

98.96% 水 

1.58% 葡聚糖 

0.15% 甲基纤维素钠 

98.27% 水

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聚丙二醇 聚丙二醇 

聚乙二醇（ 聚乙二醇（ PEG PEG） ） 

硫酸葡聚糖钠盐 硫酸葡聚糖钠盐 

羧基甲基葡聚糖钠盐 羧基甲基葡聚糖钠盐 

羧甲基葡聚糖钠盐 羧甲基葡聚糖钠盐 

聚乙二醇 聚乙二醇 

几种典型的双水相系统 几种典型的双水相系统 

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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聚乙二醇、聚乙烯醇 聚乙二醇、聚乙烯醇 葡聚糖（ 葡聚糖（Dex Dex） ） 羟丙基葡聚糖 羟丙基葡聚糖 聚乙烯醇、 聚乙烯醇、 Dex Dex 

聚丙烯乙二醇 聚丙烯乙二醇 

甲基纤维素 甲基纤维素 

羧甲基甲基纤钠盐 羧甲基甲基纤钠盐 

磷酸钾、硫酸铵 磷酸钾、硫酸铵 硫酸钠、硫酸镁 硫酸钠、硫酸镁 

几种典型的双水相系统 几种典型的双水相系统 

双水相体系的形成与分配

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各种双水相体系 

2.3.1 双水相体系的形成与分配 聚合物1  聚合物2或盐 

聚丙二醇 

甲基聚丙二醇 聚乙二醇 聚乙烯醇 

聚乙烯吡咯烷酮 羟丙基葡聚糖 

葡聚糖 

聚乙二醇 

聚乙烯醇 聚乙烯吡咯烷酮 

葡聚糖 聚蔗糖 

聚乙烯醇 或 

聚乙烯吡咯烷酮 

甲基纤维素 羟丙基葡聚糖 

葡聚糖 

甲基纤维素 羟丙基葡聚糖 

葡聚糖 西南科技大学 西南科技大学

双水相体系的形成与分配 聚合物1  聚合物2或盐 

乙基羟乙基纤维素  葡聚糖 

羟丙基葡聚糖  葡聚糖 

聚蔗糖  葡聚糖 

聚丙二醇 甲氧基聚乙二醇 

聚乙二醇 聚乙烯吡咯烷酮 

磷酸钾 

聚乙二醇 

硫酸镁 硫酸铵 硫酸钠 甲酸钠 

酒石酸钾钠

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( (3 3) )双水相体系的类型 双水相体系的类型 

双聚合物体系 双聚合物体系 

聚合物与无机盐体系 

表面活性剂­表面活性剂 

亲和配基­高聚物, 亲和双水相萃取 

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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双水相体系的类型 双水相体系的类型 

常用PEG/Dx 

如PEG/磷酸钾 

表面活性剂 

亲和双水相萃取 

双水相体系的形成与分配

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双聚合物体系 活性损失  小 

盐浓度  低 

成本  高 

粘度  大 

环境污染  无 

其它  分相困难 

比  较 

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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双聚合物体系  聚合物/盐体系 大

高

低

小 

废水处理困难 

分相困难  界面吸附多 

较 

双水相体系的形成与分配

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4 4. . 聚合物双水相形成机理 聚合物双水相形成机理 

两个 因素 

体系熵的增加 

单一相 

聚合物的不相容性 

两种聚合物 

相互混合 

分离 混合 

分相 

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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富含不同聚合 物的两相 

聚合物的不相容性 

一定浓度范围 

空间位阻, 相互排斥 

双 相 

双水相体系的形成与分配

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( (5 5) )双水相萃取分离的原理 双水相萃取分离的原理 

生物分子在双水相体系中的 生物分子在双水相体系中的 分配规律服从 分配规律服从能特特分配定律 能特特分配定律 与溶剂萃取比 与溶剂萃取比, ,表现出更大或更小的 表现出更大或更小的 

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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生物分子在双水相体系中的 生物分子在双水相体系中的选择性分配 选择性分配 能特特分配定律 能特特分配定律. . 表现出更大或更小的 表现出更大或更小的分配系数 分配系数.→ .→相 相图 图 

双水相体系的形成与分配

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双水相体系的相图 双水相体系的相图 

a 

系线 

双节线 

均相区 

两相区 

T 

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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双水相体系的相图 双水相体系的相图 

系线 

两相区 

临界点 B 

双水相体系的形成与分配

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K临界点 

TKB 双 节线 

双水相体系的相图

•N

T’ 

单相 

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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双 

节线

M’

B’

双相 

双水相体系的形成与分配

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M点, 两相T和B的量之间的关系 

系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度 相间的性质差别越大，反之则越小 即在图b的双节线上K点，两相差别消失 的分配系数均为1，因此K点称为 

2.3.1 双水相体系的形成与分配

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的量之间的关系(体积)服从杠杆规则，即 

是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两 反之则越小。当系线长度趋向于零时， 

两相差别消失，任何溶质在两相中 称为临界点(critical point)。 

双水相体系的形成与分配

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2.3.2.1 双水相分配系数 分配系数取决于溶质与双水相系统 

作用。 包括：静电作用 

疏水作用 生物亲和作用。 

分配系数是各种相互作用力的和 lnm=lnm e +lnm 

2.3.2双水相萃取体系的影响因素

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双水相系统间的各种相互 

各种相互作用力的和。 +lnm h +lnm l 

双水相萃取体系的影响因素

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2.3.2.2 影响分配系数的因素分析 

1 1） ）成相聚合物 成相聚合物 --- ---相对分子质量和浓度影响分配平衡 相对分子质量和浓度影响分配平衡 

对于成相聚合物系统和生物大分子来说 对于成相聚合物系统和生物大分子来说 

A 聚合物的分子量降低 

上相分子量降低 

形成双水相所 需的浓度越高 

分配系数 增大 

B 成相聚合物的浓度越高 两相体系距离临界越远 分配系数增大。 

2.3.2双水相萃取体系的影响因素

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影响分配系数的因素分析 

相对分子质量和浓度影响分配平衡 相对分子质量和浓度影响分配平衡. . 

对于成相聚合物系统和生物大分子来说： 对于成相聚合物系统和生物大分子来说： 

上相分子量降低  下相分子量降低 

生物大分子该相溶解度增大 

分配系数  分配系数 降低 

双水相萃取体系的影响因素

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2 2） ）盐的种类和浓度 盐的种类和浓度 --- ---主要影响 主要影响相间电位 相间电位和 和 

在双聚合物 在双聚合物 双水相系统 双水相系统中 

无机离子分配系 无机离子分配系 

影响带电蛋白质、 影响带电蛋白质、 物大分 物大分 子的分配系数 子的分配系数 

2.3.2双水相萃取体系的影响因素

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和 和蛋白质疏水性 蛋白质疏水性。 。 

无机离子分配系 无机离子分配系数 

相间电位不同 相间电位不同 

、核酸生 、核酸生 子的分配系数 子的分配系数 

盐种类 盐种类 

双水相萃取体系的影响因素

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u影响蛋白质的表面疏水性 u改变各相成相物质组成 u分配系数随盐浓度增加 增加不同. 

盐浓度 

调节双水相系统的盐浓度 

有效萃取分离不同的蛋白质 

PEG/KPi 相)的 在上、 NaCl 

2.3.2双水相萃取体系的影响因素

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蛋白质的表面疏水性， 组成和相体积比. 

随盐浓度增加而增加,不同蛋白质 

调节双水相系统的盐浓度，可 

有效萃取分离不同的蛋白质 

PEG/KPi系统中上、下相(或称轻重 的PEG和磷酸钾浓度以及Cl离子 

、下相中的分配平衡随添加 NaCl浓度的增大而改变。 

双水相萃取体系的影响因素

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3 3） ）pH pH值 值 

4 4）温度 ）温度 温度影响相图, 规模化操作采用 相系统来说，温度的影响很小 

蛋白质的表面电荷数 

改变  pH值 

分配系数 

改变 

2.3.2双水相萃取体系的影响因素

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规模化操作采用常温, 一般双水 温度的影响很小。 

磷酸盐的解离 

影响 值 

系统的相间电位和 蛋白质的分配系数。 

影响 

双水相萃取体系的影响因素

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2.3.2双水相萃取体系的影响因素

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双水相萃取体系的影响因素

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温度的影响 温度影响双水相系统的相图， 

数。但一般来说，当双水相系统离 的影响很小，1-2度的温度改变 离。 

大规模双水相萃取操作一般在 这是基于以下原因： 

(1)成相聚合物PEG对蛋白质有 质一般不会发生失活或变性； 

(2)常温下溶液粘度较低，容易相分离 (3)常温操作节省冷却费用。 

2.3.2双水相萃取体系的影响因素

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，因而影响蛋白质的分配系 当双水相系统离双节线足够远时，温度 

的温度改变不影响目标产物的萃取分 

大规模双水相萃取操作一般在室温下进行，不需冷却。 

对蛋白质有稳定作用，常温下蛋白 ； 容易相分离； 。 

双水相萃取体系的影响因素

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6) 6)双水相体系物理化学性质的影响 双水相体系物理化学性质的影响 双水相系统的性质主要取决于下列物理化学参数 

密度 密度( (ρ ρ) )和两相间的密度差 和两相间的密度差 黏度 黏度( (μ μ) )和两相间的黏度差以及表面张力 和两相间的黏度差以及表面张力 相间电势差 相间电势差, ,相分离时间等 相分离时间等 

5) 5)低分子量化合物 低分子量化合物: :高浓度时起作用 

2.3.2双水相萃取体系的影响因素

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双水相体系物理化学性质的影响： 双水相体系物理化学性质的影响： 双水相系统的性质主要取决于下列物理化学参数： 

和两相间的密度差 和两相间的密度差 和两相间的黏度差以及表面张力 和两相间的黏度差以及表面张力( (σ σ) ) 

相分离时间等。 相分离时间等。 

高浓度时起作用。

双水相萃取体系的影响因素

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系线长度代表了系统达到平衡时 上、下相和总组成的关系，在临 界点附近系线的长度趋向于零， 上相和下相的组成相同，因此, 分配系数应该是1。 

界面张力增加→系线的长度 增加,上相和下相相对组成的 差别就增大，这将会极大地 影响产物如酶分配系数，使 酶富集于上相。 

2.3.2双水相萃取体系的影响因素

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时临， 

双水相萃取体系的影响因素

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2 2. .3 3. .3 3. .1 1 双水相系统的选择 双水相系统的选择 

选择原则： 选择原则： 

根据 根据目标蛋白质 目标蛋白质和 和共存杂质 共存杂质的 的 质量 质量、 、等电点和表面电荷 等电点和表面电荷等性质上的差别 等性质上的差别 

综合利用 综合利用静电作用 静电作用、 、疏水作用 疏水作用 的盐 的盐， ，可选择性萃取目标产物 可选择性萃取目标产物 

2.3.3 双水相萃取操作及特点

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的 的表面疏水性 表面疏水性、 、相对分子 相对分子 等性质上的差别 等性质上的差别 

疏水作用 疏水作用, ,添加适当种类和浓度 添加适当种类和浓度 可选择性萃取目标产物 可选择性萃取目标产物。 。 

双水相萃取操作及特点

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目标产物与杂蛋白的 目标产物与杂蛋白的等电点 等电点不同 不同 

调节系统 调节系统pH pH值 值， ，添加适当盐 添加适当盐， ， 

目标产物与杂蛋白的 目标产物与杂蛋白的疏水性 疏水性不同 不同 

增大成相系统 增大成相系统浓度 浓度－使细胞碎片选择性分配于 －使细胞碎片选择性分配于 

采用相对分子质量较大的 采用相对分子质量较大的PEG PEG 

降低蛋白质的 降低蛋白质的分配系数 分配系数， ，提高目标蛋白的 提高目标蛋白的 

方 

2.3.3 双水相萃取操作及特点

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不同 不同， ， 

， ，产生希望的 产生希望的相间电位 相间电位。 。 

不同－充分利用 不同－充分利用盐析作用 盐析作用 

使细胞碎片选择性分配于 使细胞碎片选择性分配于下相 下相。 。 

PEG PEG 

提高目标蛋白的 提高目标蛋白的选择性 选择性。 。 

法 

双水相萃取操作及特点

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2.3.3.2 双水相萃取过程 

包括： 

双水相的形成 双水相的形成 

溶质在双水相中的分配 溶质在双水相中的分配 

双水相的分离。 双水相的分离。 

2.3.3 双水相萃取操作及特点

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双水相萃取过程 

溶质在双水相中的分配 溶质在双水相中的分配 

。 。 

双水相萃取操作及特点

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萃取一般操作 

l蛋白质在两相中发生物质传递 

l采用离心沉降进行相分离 

固体聚合物 

盐 加入 

成相物质溶解 

2.3.3 双水相萃取操作及特点

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萃取一般操作 

物质传递，达到分配平衡； 

进行相分离。 

细胞匀浆  搅拌 

成相物质溶解  形成双水相 

双水相萃取操作及特点

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图5-19 聚已二醇(PEG)-磷酸盐双水相体系萃取酶的一般流程 

2.3.3 双水相萃取操作及特点

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磷酸盐双水相体系萃取酶的一般流程 

双水相萃取操作及特点

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两步萃取法连续分离胞内酶的流程图 

2.3.3 双水相萃取操作及特点

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两步萃取法连续分离胞内酶的流程图 

双水相萃取操作及特点

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2.3.3.3 2.3.3.3 双水相萃取的特点： 双水相萃取的特点： 

相混合能耗低， 相混合能耗低， 

达到萃取平衡所需的时间短 达到萃取平衡所需的时间短 

易进行工业放大 易进行工业放大(10ml (10ml离心管的实验结果即可放大 离心管的实验结果即可放大 

适于易失活的蛋白质的提取纯化 适于易失活的蛋白质的提取纯化 

易实现连续操作－最大特点 易实现连续操作－最大特点 

蛋白质下游加 工中比较独特 

2.3.3 双水相萃取操作及特点

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离心管的实验结果即可放大） 离心管的实验结果即可放大） 

适于易失活的蛋白质的提取纯化（超滤或沉淀） 适于易失活的蛋白质的提取纯化（超滤或沉淀） 

最大特点 最大特点 

蛋白质下游加 工中比较独特 

双水相萃取操作及特点

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可用于多种生物活性物质的分离纯化 可用于多种生物活性物质的分离纯化 

1 1） ）酶的提取和纯化 酶的提取和纯化 

酶主要分配在上相 酶主要分配在上相， ，菌体在下相或界面处 菌体在下相或界面处 

2.3.4 双水相萃取的应用

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可用于多种生物活性物质的分离纯化 可用于多种生物活性物质的分离纯化 

菌体在下相或界面处 菌体在下相或界面处. . 

双水相萃取的应用

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表5-7双水相萃取体系从微生物的破碎细胞中提取分离酶的实例 p84

2.3.4 双水相萃取的应用

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双水相萃取体系从微生物的破碎细胞中提取分离酶的实例 

双水相萃取的应用

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2 2）核酸分离纯化 ）核酸分离纯化 

用 用PEG/Dextran PEG/Dextran体系 体系萃取核酸时 萃取核酸时 小变化将会引起分配系数的微小变化 小变化将会引起分配系数的微小变化 

3 3）人生长激素的提取 ）人生长激素的提取 

用 用PEG4000 6.6%/ PEG4000 6.6%/磷酸盐 磷酸盐 片中提取 片中提取人生长激素（ 人生长激素（ 

（ （hGH) hGH)分配在 分配在上相 上相，分配系数 ，分配系数 

2.3.4 双水相萃取的应用

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萃取核酸时， 萃取核酸时，盐组分 盐组分的微 的微 小变化将会引起分配系数的微小变化。 小变化将会引起分配系数的微小变化。 

磷酸盐 磷酸盐14 14％ ％体系从 体系从E.coli E.coli 碎 碎 （ （hGH) hGH) 

分配系数 分配系数6.4 6.4，收率 ，收率60 60％ ％. . 

双水相萃取的应用

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从E.coli中提取hGH的三级错流萃取 

2.3.4 双水相萃取的应用

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的三级错流萃取 

收率为81％

双水相萃取的应用

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4 4） ）β β干扰素（ 干扰素（ β β- -IFN) IFN)的提取 的提取 不用 不用PEG/Dextran PEG/Dextran体系 体系 用 用PEG PEG－磷酸酯 －磷酸酯/ /盐 盐的体系才能使 的体系才能使 

蛋白 蛋白分配在 分配在下相 下相。 。 

双水相萃取 

结合 

双水相萃取 

工业生产 

2.3.4 双水相萃取的应用

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的提取 的提取 

的体系才能使 的体系才能使β β- -IFN IFN分配在 分配在上相 上相， ，杂 杂 

层析技术 

结合 

双水相萃取，层析纯化 

工业生产 

双水相萃取的应用

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5 5）病毒的分离纯化 ）病毒的分离纯化 

6 6）生物活性物质的分析检测 ）生物活性物质的分析检测 

7) 7)在中草药有效成分分离中的应用 在中草药有效成分分离中的应用 

2.3.4 双水相萃取的应用

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生物活性物质的分析检测 生物活性物质的分析检测 

在中草药有效成分分离中的应用 在中草药有效成分分离中的应用p85 p85 

双水相萃取的应用

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双水相体系形成、类型及机理 

双水相萃取的应用 

双水相萃取 

双水相萃取分配 系数影响因素 

成相聚合物 盐的种类和浓度 

pH 温度 

双水相萃取操作及特点 

细胞碎片和蛋 白质分离纯化 

流程 

增大收率应考虑的因素 双水相组成的选择 

双水相萃取与细胞破碎的结合 

双水相萃取同其 它分离技术结合· 

双水相体系与生物转化相结合 双水相萃取同膜分离技术相结合 双水相萃取同亲和层析相结合 

2.3.4 双水相萃取的应用

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类型及机理 成相聚合物 

盐的种类和浓度 pH值 温度 

双水相萃取操作及特点 双水相系统的选择 双水相萃取过程 双水相萃取的特点 

流程 

增大收率应考虑的因素 双水相组成的选择 

双水相萃取与细胞破碎的结合 

双水相体系与生物转化相结合 双水相萃取同膜分离技术相结合 双水相萃取同亲和层析相结合 

总结

双水相萃取的应用