TS. Nguyễn văn Kính 1

MỤC ĐÍCH

Định lượng các hormone và các chất có trong huyết thanh,

huyết tương, dịch sinh học

Nghiên cứu bệnh miễn dịch

Nghiên cứu đánh giá tình trạng dinh dưỡng

Nghiên cứu ung thư

TS. Nguyễn văn Kính 2

NGUYÊN LÝ

I. Kỹ thuật miễn dịch: Dựa mối tương tác đặc hiệu thuận- nghịch giữa kháng nguyên (Ag) với kháng thể (Ab).

+ Nhóm kỹ thuật miễn dịch quan sát trực tiếp (lên bông, kết tủa, ngưng kết, cố định bổ thể, trung hòa)

+ Nhóm kỹ thuật miễn dịch dùng chất đánh dấu

Biến phản ứng không quan sát được thành một phản ứng có thể quan sát & nhận định kết quả.

Tăng độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác.

Tăng khẳ năng tự động hóa

Có thể áp dụng trên cơ thể sống TS. Nguyễn văn Kính 3

NGUYÊN LÝ Chất đánh dấu có 2 loại:

1. Chất đánh dấu không phải phóng xạ ( Enzym, Ferritin, luciferin)

Kỹ thuật miễn dịch Enzyme (immunoenzymometric assay:IEMA)

Miễn dịch huỳnh quang (immunofluorometric assay) Miễn dịch hóa phát quang ( immunochemiluminometric

assay)

2. Chất đánh dấu là đồng vị phóng xạ Đồng vị phóng xạ (RIA, IRMA: Radioimmunoassay.,

Immunoradiometric assay.)TS. Nguyễn văn Kính 4

NGUYÊN LÝ ĐỊNH LƯỢNG MDPX Định nghĩa: MDPX là kỹ thuật vi phân tích trong đó các đồng

vị phóng xạ được dùng vào XN để xác định nồng độ các chất trên các mẫu là dịch sinh học

Rosalyn S. Yalow & SolomonA. Berson dùng đồng vị phóng xạ đánh dấu trên Insuline để nghiên cứu thời gian tồn lưu của Insulin tuần hoàn trong máu; Vitamin B12… được giải Nobel năm 1977

Ưu điểm: Đơn giản có thể triển khai các cơ sơ, giá thành rẻ, độ đặc hiệu & độ nhạy rất cao, có thể xác định được các chất có nồng độ cực thấp trong huyết thanh, dịch sinh học, huyết tương… (10-17 – 10-18 )

Tiêu chuẩn vàng để đánh giá các kỹ thuật khácTS. Nguyễn văn Kính 5

THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA XN MDPX

Kháng thể (Ab) đặc hiệu với chất cần định lượng được sản xuất bằng gây miễn dịch cho động vật or công nghệ sinh học.

Kháng nguyên (Ag - chất cần định lượng) có trong dịch sinh học

Chất đánh dấu (Tracer) là đồng vị gắn vào kháng nguyên (Ag*) ( RIA); hoặc vào kháng thể Ab* (IRMA); nó là thành phần cấu trúc nên chất gắn

Chất phóng xạ có hoạt tính riêng cao, gắn đặc hiệu vào phân tử Ab or Ag, thời gian bán rã không ngắn, phát ra bức xạ gamma đơn thuần như125I.

Hệ thống tách: Tách riêng các phức hợp và chất tự do bằng chất hấp thụ phase rắn:Than hoạt TS. Nguyễn văn Kính 6

Bằng chất kết tủa hóa học: PEG – 6000; Kết tủa miễn dịch: thêm Ab thứ hai làm tăng trọng lượng Ag-Ab được dùng nhiều vì rút ngắn thời gian, không bị ảnh hưởng nồng độ mẫu thử, dùng được cho Ab có ái lực thấp or Ag đặc hiệu thấp.

Hệ thống pha rắn: Ab thứ nhất bắt giữ gắn sẵn thành ống or gắn nên bề mặt hạt nhỏ cellulose, sepharose or hạt cellulose từ ( ly tâm).

Chất đánh dấu, Kháng thể, PH và nhiệt độ phản ứng là hằng định, chất cần định lượng là thay đổi.

Các ống huyết thanh chuẩn (Std), huyết thanh giám sát (CS).

1. Nguyên Lý chung: RIA Ag

Ag* + Ab ↔ Ag – Ab, Ag*- Ab, Ag* or AgTS. Nguyễn văn Kính 7

NGUYÊN LÝ ĐỊNH LƯỢNG MDPX

Ag trong chất cần định lượng cao thì Ag*- Ab thấp, ngược lại Ag thấp thì Ag*- Ab sẽ cao.

Mẫu thử thực hiện trong điều kiện như nhau ( thời gian ủ, khối lượng mẫu, nhiệt độ, thời gian, tốc độ quay ly tâm và PH)

Đồ thị chuẩn:

TS. Nguyễn văn Kính 8

B/TCpm

0 Cx Nông đô

B/T%Cpm

Thiết bị: Micropipet (100 – 1000μl), máy lắc (200-350 RPm), máy trộn, giá ống nghiệm, máy đếm gammacounter.VD. Quy trình FT4 : Thuốc thử & mẫu bệnh phẩm để ở nhiệt độ phòng 20’, đánh số ống, trộn thuốc thử…

TS. Nguyễn văn Kính 9

Ống Toatal (T) S1-S6 P1-Pn CS

Standard 100μl

Mẫu B/n 100μl

control 100μl

Đệm ủ 1000μl 1000μl 1000μl

Lắc đều trong 30 phút ở nhiệt độ phòng

Gạn nước, úp ngược 2 phút trên giấy thấm125I-Tracer 1000μl 1000μl 1000μl 1000μl

Lắc ngang 60 phút 200-350 v/p ở nhiệt độ phòng

Gạn nước, úp ngược 2 phút trên giấy thấm

Đo hoạt độ phóng xạ 60 s/ống

2. NGUYÊN LÝ IRMA: Ab* + Ag Ab* - Ag, Ab*- Ab* - Ag tỉ lệ thuận với nồng độ chất cần định lượng - Ab đơn dòng làm pha rắn bắt giữ, Ab* , hai Ab & Ab* quyết

định trên vị trí gắn của Ag. Ab - Ag – Ab* , hạn chế phản ứng chéo, có độ nhạy cao & hạn chế sản xuất Ag tinh khiết giá thành cao để tạo Ab. Nhưng chất cần định lượng phải có trọng lượng phân tử lớn để có hai vị trí gắn của hai Ab, Ab* , Các huyết thanh chuẩn và HT giám sát.

TS. Nguyễn văn Kính 10Nông đô0

B/TCpm

Cx

B/T%Cpm

Ống nghiệm

Mẫu chuẩn & bệnh phẩm

Đệm

Lắc ngang 400 v/ ph,

ủ 3 giờ ở nhiệt

độ phòng 18 – 25

0c ,rửa 2

lần với đệm

125I - tracer

ủ 16 – 20 giờ

ở nhiệt

độ phòng 18 -25

0C, rửa 2 lần với

đệm

Đếm trên máy

gammacount

er

T - - 400S0 – S6 100 300 400

CS1 – CS2 100 300 400

P1 - Pn 100 300 400TS. Nguyễn văn Kính 11

Quy trình thực hiện chuẩn Thyroglobuline IRMA

3. Kỹ thuật MDPX kháng thể kẹp

* Nguyên lý: Ủ Ag trong bệnh phẩm với Ab đơn dòng; Ab gắn

với 1 vị trí đặc hiệu của Ag thành phức hợp Ab – Ag ; rửa

loại bỏ những Ag & Ab tự do.

Gắn Ab* với phức hợp Ab – Ag tạo phức hợp: Ab*- Ag –

Ab .

Loại bỏ những Ab* or Ab – Ag tự do

Ông nghiệm còn: Ab*- Ag – Ab.

Đếm hoạt tính phóng xạ

Hoạt độ phóng xạ tỉ lệ thuận với nồng độ Ag trong mẫu thử. TS. Nguyễn văn Kính 12

Hiệu ứng móc đáp ứng hai pha (Hook Effect – Biphasic Response)

Hiệu ứng móc thường xẩy ra ở XN bánh kẹp Gây nhầm lẫn nhận định kết quả vì: Trong XN này Ab có hạn so Ag dư thừa nên Ab – Ag không

tương thích với nồng độ Ag Xuất hiện không đáp ứng ở phase hai: Phức hợp Ab – Ag

có hạn gắn Ab* xác định, phức hợp Ab – Ag - Ab* không tương thích với Ag trong mẫu có nồng độ cao quá

Kết quả Cpm trong mẫu không phản ánh đúng được nồng độ chất cần định lượng, kết quả thực sự cao bị nhận định sai lầm là thấp.

Khắc phục: Pha loãng mẫu thử XN ở nồng độ khác nhau. Làm mẫu thử theo hai giai đoạn: phase bắt giữ, phản ứng

với Ab*. TS. Nguyễn văn Kính 13

ĐÁNH GIÁ ĐỘ TIN CẬY CỦA PHƯƠNG PHÁP

Sai số:

- Chủ quan

- Khách quan: Hóa chất, thiết bị

Kiểm tra: tính CV% của hai ống, Standard của lần XN.

Các lần XN khác nhau

Kểm tra nội bộ: huyết thanh người bình thường, huyết

thanh bệnh nhân, phân 3 loại : thấp, trung bình, cao.

Làm n= 10 mean ± 2SDTS. Nguyễn văn Kính 14

KHÁC NHAU GiỮA RIA & IRMA

RIA: Cạnh tranh giữa Ag cần định lượng với Ag* với Ab (lượng nhất định thiếu). Chất đánh dấu là Ag.

IRMA: Không có cạnh tranh, Ag cần định lượng gắn với Ab dư thừa xác định. Chất đánh dấu là Ab*.

Độ nhạy: IRMA 10 -34 mol/l > RIA 10 -17 mol/l. Độ đặc hiệu: IRMA > RIA vì dùng Ab đơn dòng. Có thể định lượng được các phân tử sinh học ở miền nồng

độ rất thấp pg… Kỹ thuật đơn giản, kết quả ổn định ít bị chi phối về nhiệt độ. Cần Lab thích hợp, độ độc hại phóng xạ cũng tương đương

như độc hại của hóa chất.TS. Nguyễn văn Kính 15

ỨNG DỤNG

Định lượng các nội tiết tố liên quan đến tuyến giáp

Bệnh tuyến giáp: lâm sàng & XN phong phú, nhiều

phương pháp để chẩn đoán, theo doi & tiên lượng bệnh

tuyến giáp trong đó MDPX là đặc biệt quan trọng vì định

lượng được nồng độ hormone tuyến giáp, nội tiết tố liên

quan (Thyroid – related hormones).

Bệnh cường giáp (Hyperthyroidism) hầu hết T3, T4 or FT3,

FT4 , TRAb (TSH receptor antibody) tăng & TSH giảm.

TS. Nguyễn văn Kính 16

Nhiễm độc giáp do T3 or do T4 hai hormone này không tăng

song hành.

Suy giáp đa số T3 ,T4 thấp do liên bào t/g giảm or mất khả

năng tổng hợp và TSH tăng cao.

Một số yếu tố ảnh hưởng đến T3 ,T4 như bệnh gan, thận, thai

nghén & một số thuốc tránh thai, an thần…

Một số hội chưng quan trong thường găp

- Cường giáp( Hyperthyroidism), Graves – Basedow: T3 ,T4 ,

FT3, FT4, TSH, TRAb.

- Hội chưng binh giáp bệnh lý

+ T4 bình thường, T3 giảm do bệnh lý khác

+ T4 thấp do suy giáp, giảm tiết chế TSH ở tuyến yên TS. Nguyễn văn Kính 17

+ T4 tăng: phụ nữ nhiều tuổi, dùng thuốc chứa iot, tâm thần…

+ Bất thường về liên kết hormone: T3, T4 giảm điều trị hormone

không hiệu quả

- Suy giáp: Hầu hết FT3, FT4 giảm TSH tăng

- Bướu cổ địa phương T3, T4 bình thường or tăng nhẹ

Tóm lại: Bệnh lý tuyến giáp nên chỉ định ít nhất 2 XN, chú ý

đến TSH (IRMA)

+ Định lượng kháng thể kháng receptor của TSH. TRAb ý

nghĩa trong theo doi điều trị

TS. Nguyễn văn Kính 18

+ Định lượng một số loại hormone:

GH: theo doi bệnh to đầu chi, lùn do …tuyến yên, chứng khống lồ.

PTH: hormone tuyến cận giáp. Chuyển hóa calci,

Cortisol, Insuline, Calcitonin, Plolactin, ACTH….

Các chất dấu ấn ung thư: là đại phân tử, sự có mặt của chúng liên quan đến sự có mặt hoặc phát triển của khối u ác tính. Chúng hình thành từ trong or trên tế bào K or kích thích TB phân chia không kiểm soát.

Dấu ấn ung thư tiết vào máu ngoại vi ở nồng độ có thể phát hiện được khi TB chuyển thành ác tính.

Cho phép kết luận vị trí xuất phát của khối U.TS. Nguyễn văn Kính 19

Kỹ thuật IRMA sử dụng trong XN theo doi diễn tiến, đánh giá hiệu quả & tiên lượng.

AFP: Glycoprotein , W= 70.000 daltons, hình thành trong gan, dạ dày, ruột bào thai. AFP đạt đỉnh tuần 12 – 16 của thai kỳ và giảm khi sinh. Chăm sóc tiền sản. Giám sát K gan nguyên phát, đánh giá đáp ứng điều trị.

CEA: Glycoprotein , W= 180.000 daltons, là KN ung thư phôi thai được sản xuất trong đời sống phôi và bào thai. CEA kìm hãm sau sinh, không thấy trong huyết thanh người lớn bình thường, KN giải tỏa ở các tế bào một số K đang phát triển . Cao trong ung thư biểu mô tuyến đại trực tràng. Giám sát tiến triển & đáp ứng điều trị b/n K đại trực tràng.

TS. Nguyễn văn Kính 20

PSA: Glycoprotein , W= 34.000 daltons. Có trong ống

ngoại tiết của tiền liệt tuyến. Giám sát diễn tiến & đáp ứng

điều trị K TLT. Giám sát B/N phì đại TLT độ đặc hiệu 90%.

Là chỉ tiêu XN sàng lọc K TLT ở nam tuổi > 50

Tg: Glycoprotein của tuyến giáp.Trong K giáp biệt hóa Tg

là chất chỉ điểm sự tồn tại của mô giáp. Tg + WBS có giá trị

sau điều trị K giáp. 80 – 85 % Tg + WBS phù hợp LS. Sau

điều trị I-131 Tg < 2 ng/ml. 15 – 20% Tg & WBS không

tương đồng. Tg > 5 - 10ng/ml là điều trị. Nồng độ Tg tăng

cao khi có di căn xa

TS. Nguyễn văn Kính 21

CÂU HỎI.

1. Nguyên lý của phương pháp miễn dịch phóng xạ

2. Ưu điểm của kỹ thuật RIA & IRMA

3. Sự giống nhau & khác nhau giữa RIA & IRMA

4. Những yếu tố làm ảnh hưởng đến kết quả XN

5. Nêu ứng dụng của phương pháp miễn dịch phóng xạ

trong chẩn đoán bệnh tuyến giáp & các dấu ấn chỉ điểm

khối u trong một số bệnh ung thư thường gặp

TS. Nguyễn văn Kính 22

TS. Nguyễn văn Kính 23

TRÂN TRỌNG CẢM ƠN