1er curso de ENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARAS

Actualización del diagnóstico.Actualización del  diagnóstico de las Enfermedades Metabólicas Hereditarias en el laboratorio

Dra. Celia Pérez-Cerdá. Centro de Diagnóstico de Enfermedades

Moleculares (CEDEM)Universidad Autónoma de Madrid

Cómo se diagnostican las EMHs desde elCómo se diagnostican las EMHs desde el punto de vista de laboratorio

El clínico

El diagnóstico de las EMHs depende de su reconocimiento (sospecha) por parte del médico y de la estrecha colaboración

con los laboratorios de Genética Bioquímica y Molecular

Laboratorios de Genética Bioquímica y Molecular

Definición de Enfermedad Metabólica Hereditaria

Enfermedad causada por mutaciones en el DNA que dan lugar a proteínas anómalas en su estructura y/o función  

T i ió RNATranscripción a RNA(Transcriptoma)

TraducciónProcesamiento post‐traducción e intervención de factores celularesTraducción 

a polipéptido

DNA(Genoma)

intervención de factores celulares(Complexoma)

( )

Efectos ambientales(“Enviroma”)

Producto génico(Proteoma)

Vias/Productos metabólicos(Metaboloma)

Fenotipo(Fenoma)

Nivel I: Sospecha de EMH basada en los síntomas clínicos

SÍNTOMASALTERACIÓNMETABÓLICA POSIBLE DEFECTO

Intoxicación aguda Acumulación de AminoacidopatíasIntervalos libres  metabolitos tóxicos Enf. ciclo de la urea

de síntomasRelación con ingesta Acidemias orgánicas

Hipotonía generalizada; Defecto en la Def. b‐oxidación de

Relación con ingesta Acidemias orgánicase intercurrencias Galactosemia

Hipotonía generali ada; efecto en la ef. b oxidación deMiopatía; Cardiomiopatía producción o  ácidos grasosMiopatía; Cardiomiopatía utilización de  GlucogenosisHipoglucemia; energía  Acidosis Láctica ALC (PC, PDH) 

Def. Cadena respiratoria

Progresivos Síntesis y/o Enf LisosomalesProgresivos Síntesis y/o Enf. LisosomalesIndependientes de degradación Enf. Peroxisomalesingesta e intercurrencias moléculas complejas Síndrome CDG

DismorfiasDismorfias

Nivel II: ALTERACIONES BIOQUÍMICAS Y HEMATOLÓGICAS

Acidosis metabólica ( pH< 7.2, HCO3< 10 mmol, pCO2< 25 mmHg

Cetonuria (muy significativa en el R.N.)

Hiperamonemia (> 100 mmol/l, pH 7.45; urea )

Acidemia láctica (> 4 mmol/l)

Hipoglucemia (< 2 mmol/l)

Hiperuricemia (>7mg/dl)  ó hipouricemia (<2 mg/dl)

Leuco trombo ó pancitopenia AnemiaLeuco, trombo ó pancitopenia. Anemia

Nivel III, IV y V: Análisis específicos de metabolitos, enzimas y genes

HPLCCIOGC/MSMS‐MSESPECTROFOMETRÍA

Laboratorio de Genética H

‐ ico

a rno

Ác. Metilcítrate

(2 peaks)

ESPECTROFOMETRÍAIEF, SDS‐PAGECultivo celularTécnicas enzimáticas 

Bioquímica

Ác. 3

‐OH

Prop

ióni

Prop

ionilglicina

Tiglilglicina

Patrón

 Inter

éc cas e át casradiactivas

HIGH RESOLUTION  Exón 7 E390KMELTINGDGGESECUENCIACIÓNPCR

Laboratorio de Genética

PCRMLPA Array‐CGH  

Molecular 

GAA       AAAGlu Lys

TGCCAARCCCCCA

www.cbm.uam.es/cedem/

Glu         Lys

Genética Bioquímica y Molecular

• Es la disciplina del laboratorio centrada en la evaluación y diagnóstico depacientes y familias con enfermedades metabólicas hereditarias así comopacientes y familias con enfermedades metabólicas hereditarias, así comoen la monitorización de tratamientos, estudios de portadores ydiagnóstico prenatal, mediante el estudio en fluidos fisiológicos y tejidosd t b lit d t é i ( i t t í )de metabolitos, productos génicos (enzimas y otras proteínas) y genes.

• Los especialistas en genética bioquímica informan interpretando losresultados obtenidos en el análisis del paciente y actúan comoconsultores para los clínicos en relación al diagnóstico de laboratorio.

• Requiere experiencia y conocimiento en Enfermedades MetabólicasHereditariasHereditarias

• Los laboratorios requieren infraestructura y tecnologías sofisticadas,incluyendo instalación radiactiva, laboratorio de cultivos, banco de célulasy de DNA etc

• Sometido a exigencias de calidad muy elevadas, ya que de un erroranalítico o de interpretación de resultados o de un diagnóstico tardíop gpuede depender la vida del paciente o su calidad de vida.

PROGRAMAS DE EVALUACIÓN EXTERNA DE CALIDAD

European Research Network for Evaluation and Improvement of Screening, Diagnosis and treatment of Inherited Metabolic Disease ERNDIM

Cuantitativo de aminoácidos en suero y orinade ácidos orgánicos en orinade purinas y pirimidinas en orina

Ensayos especiales en orina de  ác.5‐OH‐Indolacético (5HIAA), Carnitina libre,  Creatina, Creatinina, Guanidinoacetato, ác. Homovaníllico (HVA), ác. Láctico,  Mucopolisacaridos, ác.Orotico, ác.Pipecólico, ác. Siálico and Succinilacetona

Ensayos especiales en suero de 3 OH Butirato, 7‐Dehidrocolesterol, ác. Grasos de cadena muy larga (C22/24 and 26:0), Carnitina libre, Creatina, Galactosa, ác. Guanidinoacético, Homocisteina, ác. Láctico, ác. metilmalónico, ác. fitánico, ác. Pipecólico, ác. Pristánico y ác. Pirúvico. 

Cuantitativo de enzimas lisosomales en leucocitos o linfoblastos Cuantitativo de cistina en células blancas

Cualitativo de ácidos orgánicos en orinade transferrina glicosilada (CDG) en suerode acilcarnitinas en sangre en papel

“Proficiency” o  de competencia en orina

European Molecular genetics Quality Network EMQN

A) GENÉRICO : ‐ Secuenciación

B) ESPECÍFICO de ENFERMEDAD: Hiperplasia Adrenal Congénita, Fenilcetonuria, Porfiria, Enf de Wilson

INFORMACIÓN  PARA EL LABORATORIO É Í

INFORMACIÓN  PARA EL LABORATORIO É Í

Diagnóstico postnatal

DE GENÉTICA BIOQUÍMICA Y MOLECULARDE GENÉTICA BIOQUÍMICA Y MOLECULAR

Breve historia clínica Antecedentes personales y familiares

Diagnóstico postnatal

Antecedentes personales y familiares Alimentación Medicación C d h d l Cuando se han tomado las muestras

Nivel  de dx del caso índice (metabolitos, enzimático, genético)Diagnóstico prenatal

Confirmación de condición de portadores heterozigotos en los padres (imprescindible si el dx es genético)

F h d t d t ti d t Fecha de toma de muestra y tipo de muestra

MUESTRAS  PARA EL DX DE LAS EMHs EN EL LABORATORIOÉ Í

MUESTRAS  PARA EL DX DE LAS EMHs EN EL LABORATORIOÉ Í

Diagnóstico postnatal

DE GENÉTICA BIOQUÍMICA Y MOLECULARDE GENÉTICA BIOQUÍMICA Y MOLECULAR

• Sangre total con anticoagulante 

• Linfocitos o linfoblastos• Eritocitos

Diagnóstico postnatal

• Sangre impregnada en papel• Plasma o suero • Orina 24 horas

Eritocitos• Biopsia de piel o fibroblastos

(24‐48H postmortem)Orina 24 horas• LCR • Biopsia/necropsia hígado, músculo

Bi i i l él l l i d d ll i l

Diagnóstico prenatal

• Biopsia  corial o células cultivadas de vello corial• Líquido amniótico o amniocitos• DNADNA

VIA DE OXIDACIÓN DEL PROPIONATO

ValinaCLÍNICA DE ACIDEMIA ORGÁNICA:  Vómitos, cetoacidosis metabólica, 

IsoleucinaTreoninaMetionina

AG de cadena impar

hiperamonemia, hipotonía, fallo de medro.

AG de cadena imparColesterol

Propionil‐CoA ACIDEMIA PROPIÓNICA

‐ Enzima multimérica dependiente de Propionil‐CoA 

Carboxilasa (PCC)

D M ill l il C A

pBIOTINA

‐ 2 genes implicados: PCCA and PCCBBIOTINA

D‐Metillmalonil‐CoA 

L‐Metillmalonil‐CoA  ACIDEMIA METILMALÓNICA (aislada)E i d di t d it i B

Succinil‐CoA

Metilmalonil‐CoA Mutasa 

‐ Enzima dependiente de vitamina B12 

‐ 4 genes implicados MUT, MMAA, MMAB, MMADHC

Vitamina B12

Succinil CoA 

Ciclo de Krebs 

NIVEL III: Perfil metabólico de Ac. Propiónica y ac. MetilmalónicaCROMATOGRAFÍA DE GASES‐ESPECTROMETRÍA DE MASAS

Ác. Metilcítrico

Propionil CoA

OH‐

ónico

a rno

(2 picos)Propionil‐CoA

Ác. 3

‐OProp

ió

Prop

ionilglicina

Tiglilglicina

Patrón

 Inte

Metilmalonil‐CoAÁc MetilmalónicoÁc. Metilmalónico

terno

Ác. Metilcítrico

(2 picos)

c. 3‐OH‐

ropión

ico Patrón

 In

Succinil‐CoA

Ác Pr

1e5

Intensity,cps

C3Perfil de acilcarnitinas en un plasma de

Acidemia PropiónicaESPECTROMETRÍA DE MASAS EN

8e4

9e4 TANDEM (MS-MS)

6e4

7e4

4 4

5e4

3e4

4e4

1e4

2e4

C2*

*** *

C0

* C4* * * *C6 C8

C10* C12 C14

C16 C18

220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580m/z, amu

* ** C4* C5 C10 *C16 C18

Cromatograma de aminoácidos en plasma de Acidemia PropiónicaAutoanalizador de aminoácidosAutoanalizador de aminoácidos

BIOCHROM 30(cromatografía de intercambio iónico)

Nivel IV: DIAGNÓSTICO ENZIMÁTICO PRENATAL Y POSTNATAL  de ACIDEMIA PROPIÓNICA

PCCpmoles/min/mg prot %PCC

FIBROBLASTOSCaso Índice <5 <1Padre 352 31Padre 352 31Madre 426 38Controles n=43 1123 ± 450 100

BIOPSIA CORIALProbando 1 3307 95Probando 2 2113 61Probando 2 2113 61Probando 3 54 1.5Controles n=8 3485 ± 1187 100

LINFOCITOSProbando 1 1236 109P b d 2 803 70Probando 2 803 70Controles n=32 1196 ± 405 100

DIAGNÓSTICO GENÉTICO DE LAS EMHsDIAGNÓSTICO GENÉTICO DE LAS EMHs

1) Mutaciones puntuales de sustitución de un nucleótido:TIPOS DE MUTACIONES

1) Mutaciones puntuales de sustitución de un nucleótido:Cambio de aa (missense)Cambio por un codón de parada (nonsense)

2) Pequeñas deleciones o inserciones que cambian la fase de lectura (frameshift)) q q ( )Cambio por un codón de paradaInserción o deleción de un aminoácido

3) Mutaciones puntuales, pequeñas deleciones o inserciones que afectan al procesamientodel mRNA (mutaciones de splicing)del mRNA (mutaciones de splicing)

4) Grandes deleciones o duplicaciones genómicas

MÉTODOS basados en el RASTREO DEL GEN

GE

GE

CP

CP

PCR product

normal mutated

DG

GD

GG

SSC

SSC Heat and Cool

Gel electrophoresis

RM

RMPL

CPL

C

HR

HR

dHP

dHP

ANÁLISIS DE MUTACIONES ESPECÍFICAS

SECUENCIACIÓN

ARRAY DEDISCRIMINACIÓN

ALÉLICA A

SECUENCIACIÓN “SANGER”

ARRAY DE MUTACIONES TIEMPO REAL

Reordenamientos genómicos

RAY

RAY

LONG-PCRSNP ARRAY

Whole genome SNP‐array

GH

AR

RG

H A

RR g y

CG

CG

MLPAwww mlpa com

CONTROLCC

CC

CC

C

C C

C

7

8 1 2 9

3

10 4 11 5 12

6

13

1

MLP

AM

LPA www.mlpa.com

Patient DNA EXON 5

C

MM

MULTIPLEX LIGATION PROBE AMPLIFICATION

Secuenciación directa (Sanger)

IDENTIFICACIÓN DE UN CAMBIO (mutación) en el cDNA o gDNA

gDNAg

Cr. 3q13.3-q22PCCB

cDNA

C>T heterozigotoHomozigoto gg

A A A T G T C A G C A A A T G T C A G C

DELECIONES EN ACIDEMIA PROPIÓNICA/c.483_484insT/wt wt/wt

T

c.373-?_543+?

c 483 484insTc 483 484insT/ c 373-? 543+?c.483_484insTc.483_484insT/ c.373-?_543+?

Gran deleción en heterocigosis

135976819-135989453 (hg19)( g )

de 12634 pb en el gen PCCB

ARRAY-CGHARRAY CGH

DELECIONES EN ACIDEMIA PROPIÓNICAMECANISMOS DE LA DISOMÍA UNIPARENTAL (UPD)MECANISMOS DE LA DISOMÍA UNIPARENTAL (UPD)

RESCATE TRISÓMICO

DISOMÍA UNIPARENTAL EN EMHs

Molecular Genetics Metabolism. 2012. Feb;105(2):270-1

SECUENCIACIÓN DE DNASECUENCIACIÓN DE DNA

1990-2005SANGER

Fluorescencia capilar

Desde 2005Secuenciación de nueva generación (Next Generation Sequencing –NGS)p

Millones pb/día( q g )

Billones pb/día

PLATAFORMAS PARA SECUENCIACIÓN MASIVA

RocheApplied

Biosystems Illumina GARoche454-FLX

BiosystemsSOLID

Illumina GASolexa

EL EXOMA (~20.000 GENES; 30 megabases)

• ~18.000 variantes• ~8-9. 000 variantes podrían estar influenciando la función génica8 9. 000 variantes podrían estar influenciando la función génica• ~95% de las variantes son frecuentes en la población.• ~500-1000 genes contienen variantes nuevas potencialmente

patogénicaspatogénicas.

EL GENOMA (~3.000 megabases)

• 3-4 millones de sustituciones nucleotídicas• ~0.5 millones de pequeñas inserciones y deleciones, ‘indels’ (1-0.5 millones de pequeñas inserciones y deleciones, indels (1

100pb)• ~5,000 grandes deleciones, duplicaciones e inserciones (>100pb)

NGS como herramienta DIAGNÓSTICA

1) Captura de genes candidatos implicadoscandidatos implicados en enfermedad (glucogenosis, enf. 

i l fperoxisomales, enf. lisosomales etc…)

2) Captura del exoma(región codificante, 176.266 exones de 18.409 genes)

ESTRATEGIA para la detección de mutaciones/genes mediante SECUENCIACIÓN MASIVA del EXOMA celularSECUENCIACIÓN MASIVA del EXOMA celular

“Filtro genetico”g• Presencia en Human Genome Mutation Database (HGMD)• Presencia en otras bases de datos: • SNPdb, 1000 Genome Project, HapMap, etc…• Presencia en otras muestras del lab. (in-house data)

Análisisfuncional( )

• Presencia en controles• Presencia de una o dos mutaciones en el gen candidato• Segregación con el fenotipo de la enfermedad

Secuenciación exoma

Detección de variantes

Variantes o genes candidatos

Variantes o genes candidatos

Aplicación diagnóstica

“Filtro funcional”

exoma gg g

Filtro funcional• Predicción de la naturaleza de la variante:

Nonsense, frameshift…• Expresión del gen en el tejido diana• Análisis de conservación evolutiva

SecuenciacióndirectaAnálisis de conservación evolutiva

• Predicción de patogenicidad “in silico”:PolyPhen2, SIFT, MutPred

SECUENCIACIÓN MASIVA EN EL DIAGNÓSTICO DE EMHEN EL DIAGNÓSTICO DE EMH

1. Panel de 45 genes relacionados con CDG

CAPTURA DE GENES CANDIDATOS CONOCIDOS

2. Panel de 4 genes cuyo defecto causa  hiperfenilalaninemia.  3. Panel de 110 genes cuyo defecto causa diferentes EMHs

1. Panel de 16 genes cuyo defecto causa un trastorno peroxisomaldel espectro Zellweger

2 P l d 22 d f l i2. Panel de 22 genes cuyo defecto causa glucogenosis

SECUENCIACION DEL EXOMA CELULAR PARA IDENTIFICAR GENES

Y MUTACIONES EN PACIENTES CDGY MUTACIONES EN PACIENTES CDG

MEDICINA PREVENTIVA: Cribado neonatal 

Técnicas tradicionales

• FenilcetonuriaHi i idi é i

Un análisis‐ un  metabolito‐ una enfermedad

• Hipotiroidismo congénito• Deficiencia de Biotinidasa

Espectrometría de Masas en Tándem (ESI‐MS/MS)

Un análisis‐varios metabolitos‐varias enfermedades

• Más de 30 enfermedades simultáneamente partiendo de la misma muestra

• rapidez y automatización: 500 muestras/ día, 2 min/ análisis

• seguridad: alta sensibilidad especificidad y precisión• seguridad: alta sensibilidad, especificidad y precisión

ENFERMEDADES DETECTABLES POR MS/MS

Cit li i• Ac. propiónica

AA: Aminoacidopatías  AO: Acidemias orgánicas

• Citrulinemia• Aciduria argininsuccínico• Argininemia• PKU/HFA

• Ac. metilmalónica• Defectos de cobalaminas• Ac. glutárica tipo IA i lé i

/• Tirosinemia tipo I‐tipo II• MSUD• HipermetioninemiaH i ti i

• Ac. isovalérica• Def. HMGCoA liasa• Def. múltiple de carboxilasas• Metilcrotonilglicinuria• Homocistinuria Metilcrotonilglicinuria• Ac. metilglutacónica• Def. cetotiolasa

FAO: Defectos en la ‐oxidación de ácidos grasos

• LCHAD/Proteína Trifuncional• VLCAD

FAO: Defectos en la ‐oxidación de ácidos grasos y ciclo de la carnitina.

VLCAD• MCAD• SCAD• MADD• Def. transportador de carnitinaDef. transportador de carnitina• CPT I• CPT II/ carnitina‐acilcarnitina traslocasa

FLUJO DE INFORMACIÓN ENTRE CENTRO DE CRIBADO, DE CONFIRMACIÓN Y UNIDAD CLÍNICA

MATERNIDADSangre  en papel de ≥ 48 hr de vida

CENTRO DE DETECCIÓN o CRIBADOCENTRO DE DETECCIÓN o CRIBADOAnálisis mediante MS/MS

Marcador alterado:Ph T F/T Xl SA il iti

Marcador NO alterado:Phe,Tyr, F/T, Xle, SA y acil‐carnitinas

FUERA de los límites normales

Phe,Tyr, F/T, Xle, SA y acil‐carnitinas

DENTRO d l lí it l FUERA de los límites normales

Informe resultado

UNIDAD CLÍNICA DE REFERENCIA

DENTRO de los límites normales

Informe de normalidad a UNIDAD CLÍNICA DE REFERENCIALOCALIZACIÓN DEL PACIENTEDIAGNÓSTICO DEL PACIENTE

Envío de muestras Informe resultado

Informe de normalidad a los padres

CENTRO DE CONFIRMACIÓNLab. GENÉTICA BIOQUÍMICA  Y MOLECULAR

Envío de muestras Informe resultado 

Análisis de AA, AO, ACC y de mutaciones en el gen correspondiente

Laboratorio de Cribado NeonatalC3 elevado en SP

Rutina Laboratorio:Glucosa, electrolitos,pH, gases, amonio..

C3 elevado en SP

LAB GENÉTICA BIOQUÍMICA Y MOLECULARPlasma ACOrina AO

Plasma C3 y C4DC ↑Orina AMM y Lac ↑

Plasma C3 ↑ Orina AMM ↑

Plasma C3 ↑ Orina AMM ↑

Plasma C3 ↑ Orina AP ↑

Plasma C3 N- ↑ Orina AMM N- ↑

Plasma HCys

Deficiencia t i i l l t t

Deficiencia Succinil CoA

Deficiencia MMCoA mutasa

Deficiencia CblC CblD CblF

Deficiencia PCoA

y ↑Plasma Hcys N

↑Plasma Hcys N

↑Plasma Hcys ↑

↑Plasma Hcys N Plasma Hcys N- ↑

nutricional lactante y/o materna de

vitamina B12o

Falso positivo

Succinil-CoA sintetasa

MMCoA mutasa,CblA o CblB

CblC, CblD, CblF,TC-II, CblJ

PCoA carboxilasa

Análisis molecular Actv. Mutasa, Incorp PropA áli i Actv.PCCAnálisis molecular

Análisis genes SUCLA2,SUCLG1

incorp PropAnálisis genes MUT,

MMAA, MMAB,MMADHC

Análisis genes MMACHC, MMADHC(2),

TCN2, LMBRD1, ABCD4

Actv.PCCAnálisis genes PCCA y PCCB

D fi i i d A id i A id i A id iDeficiencia de SUCLA

Aciduria Metilmalónica

Aciduriametilmalónica

con homocistinuria

Acidemia propiónica

CRIBADO NEONATAL AMPLIADO  EN ESPAÑACRIBADO NEONATAL AMPLIADO  EN ESPAÑA

PaisVasco

2007Sólo PKU+MCAD

Galicia2000

Vasco

La RiojaAragón2010

Cataluña2013

Madrid2011

2009Extremadura Castilla la Mancha

Sólo 2011

2011

Murcia2007

2009 Sólo 2011

Andalucía2008

MelillaCeuta