BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC THÀNH TÂY

KHOA CÔNG NGHỆ NÔNG - LÂM - THỰC PHẨM…………………

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TÊN ĐỀ TÀI: BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH CÂY NƯA (Amorphophallus sp) TRONG ỐNG NGHIỆM ĐỂ

BẢO TỒN VÀ PHỤC VỤ SẢN XUẤT

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN VĂN DƯ (VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT) TS. LÊ XUÂN ĐẮC (VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC)

BỘ MÔN – KHOA: CÔNG NGHỆ NÔNG - LÂM - THỰC PHẨM

NGƯỜI THỰC HIỆN: LÊ THỊ THANH HUỆ

LỚP: K2-CNSH2

HÀ NỘI - 2012

LỜI CAM KẾT

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và

kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là hoàn toàn trung thực và chưa

được công bố trong bất kì công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2012

Tác giả

Lê Thị Thanh Huệ

1

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn TS.

Nguyễn Văn Dư, Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, TS. Lê Xuân Đắc,

Viện Công nghệ sinh học đã luôn tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong

suốt quá trình thực hiện đề tài.

Đồng thời, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Công nghệ

Nông - Lâm - Thực phẩm trường Đại học Thành Tây đã dạy dỗ, truyền đạt

cho tôi cho tôi những kiến thức vững chắc và lòng đam mê nghiên cứu khoa

học trong suốt thời gian học tập tại trường.

Cuối cùng, tôi xin gửi đến gia đình và bạn bè, những người đã ủng hộ, động

viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu khoa học lời biết

ơn chân thành và sâu sắc nhất.

Hà Nội, tháng 6 năm 2012

2

KÍ TỰ VIẾT TẮT

BAP 6 - Benzyl Amino Purin

CT Công thức

CTMT Công thức môi trường

ĐC Đối chứng

IAA Indoly Acetic Acid

IBA Indoly Butyric Acid

KTST Kích thích sinh trưởng

NAA α – Naphthalen Acetic Acid

TB Trung bình

3

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Kết quả tạo nguyên liệu vô trùng từ hạt

Bảng 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo đa chồi

Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng tạo đa chồi

Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và IAA đến khả năng tạo đa chồi

Bảng 5: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và IBA đến khả năng tạo đa chồi

Bảng 6: Kết quả tổng hợp thí nghiệm tạo đa chồi cây Nưa

Bảng 7: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ

Bảng 8: Ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ

Bảng 9: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ

Bảng 10: Ảnh hưởng của giá thể đến cây trồng trong bầu

4

Phần 1

MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Nưa là một loại cây thường được trồng ở các quốc gia Đông Á như là một

cây lương thực và thực phẩm. Ở nước ta, Nưa mọc hoang rải rác ở khắp các

vùng rừng núi, được người dân nhiều địa phương đem về trồng cũng đã lâu

đời ở trong vườn, quanh bờ ao, dọc hàng rào và trên các đồi để làm thức ăn

cho người và gia súc, gặp nhiều ở các tỉnh Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hoà

Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế... Củ Nưa có nhiều

tinh bột mịn ăn ngon hơn sắn nên trước đây nhân dân ta trồng nhiều để lấy

củ làm lương thực ăn thay cơm, bẹ lá nấu canh hay muối để dành làm thức

ăn như dưa trong những tháng thiếu rau xanh cho người hoặc chế biến thức

ăn cho gia súc. Trong củ Nưa có chứa glucomannan, đây là một

polysaccharide hòa tan trong nước. Nó có khả năng làm giảm lượng đường

và cholesterol trong máu, giảm cân, thúc đẩy hoạt động đường ruột và tăng

cường chức năng miễn dịch. Glucomannan cũng được sử dụng trong công

nghiệp thực phẩm và dược phẩm.

Cây Nưa không chỉ có giá trị về mặt thực phẩm mà còn có ý nghĩa trong

việc chống xói mòn đất. Thực trạng hiện nay, diện tích rừng nước ta đang

ngày càng bị thu hẹp, việc khai thác tài nguyên rừng bừa bãi, sự đa dạng

sinh học bị phá vỡ, nhiều nguồn gen thực vật có nguy cơ tuyệt chủng. Cùng

với thực tế là ngày nay đời sống con người ngày càng nâng cao, nhiều người

không còn nghĩ đến một loài cây dân dã nhưng lại có nhiều giá trị to lớn như

cây Nưa. Hơn nữa hiện nay những nghiên cứu về cây Nưa chưa nhiều, chính

vì vậy việc quan tâm đến cây Nưa là một việc làm cần thiết để có thể nhân

giống và bảo tồn giống cây Nưa.

Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những kỹ

thuật rất quan trọng của công nghệ sinh học thực vật. Những thành tựu mà

5

nuôi cấy mô và tế bào thực vật đạt được đã chứng tỏ khả năng ứng dụng

hiệu quả trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là nhân nhanh và bảo tồn các loài

thực vật quý hiếm. (Lê Trần Bình và CS, 1997)

Với những lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Bước đầu nghiên cứu

nhân nhanh cây Nưa (Amorphophallus sp) trong ống nghiệm để bảo tồn

và phục vụ sản xuất”.

1.2. Mục đích và yêu cầu

1.2.1. Mục đích

Xây dựng quy trình hoàn chỉnh để nhân nhanh và bảo tồn in vitro cây Nưa.

1.2.2. Yêu cầu

- Xây dựng được qui trình nhân cây Nưa trong ống nghiệm với hệ số nhân

chồi cao, chi phí sản xuất thấp, giá thành hạ...

- Cây con nuôi cấy từ ống nghiệm phát triển tốt ở giai đoạn nhà lưới và vườn

ươm.

6

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Vị trí phân loại và giá trị của cây Nưa

Cây Nưa (hay khoai Nưa) có tên khoa học là Amorphophallus sp, thuộc họ

Ráy (Araceae), lớp Một lá mầm (Monocotyledone) (Hoàng Thị Sản và

Hoàng Thị Bé, 2006). Cây thảo có củ lớn hình cầu lõm, đường kính có thể

tới 25cm; trước ra hoa, sau ra lá. Mỗi lá chia làm 3 nhánh, các nhánh lại chia

đốt, phiến lá xẻ thuỳ sâu hình lông chim, các thuỳ cuối hình quả trám thuôn,

nhọn đầu; cuống lá thon, dài 40-80cm, nhẵn, màu lục nâu, có điểm các chấm

trắng. Cụm hoa có mo lớn, phần bao mo màu lục nhạt điểm các vết lục thẫm,

ở phía mép màu hung tím, mặt trong màu đỏ thẫm. Trục hoa dài gấp đôi mo.

Quả mọng. (Hejnowicz Z và Barthlott W 2005), (Jianbin Hu và Jianwu Li,

2008)

Khoai Nưa được trồng ở Nhật bản, Trung quốc, Việt Nam và Philippin. Ở

nước ta, các dân tộc ở một số vùng đồi núi thuộc các tỉnh Quảng Ninh, Lạng

Sơn, Hà Bắc... đã có tập quán trồng khoai Nưa từ lâu đời. Nhiều vùng nông

thôn cũng có trồng để lấy củ ăn. Cây Nưa có giá trị thực phẩm rất to lớn.

Cuống lá Nưa có thể dùng để nấu canh hoặc muối dưa ăn. Củ, dọc và lá, bã

bột khoai Nưa là nguồn thức ăn rất tốt để chăn nuôi gia súc, đặc biệt chăn

nuôi lợn. Củ Nưa là phần có giá trị to lớn nhất. Củ Nưa có thể luộc ăn hoặc

gọt vỏ thổi độn với cơm, ăn mát, chắc dạ, không nóng ruột như khoai lang.

Củ khoai Nưa còn dùng để nấu chè. Tuy nhiên, Nưa chủ yếu được trồng để

lấy bột. Bột Nưa trắng mịn như bột sắn nhưng có hàm lượng tinh bột cao

hơn. Trong 100g củ khô có tinh bột là 75,16g; protein 12,5g; lipid 0,98; dẫn

xuất không protein 3,27; cellulose 3,67; tro 4,42. Tỷ lệ tinh bột nhiều gấp

đôi khoai sọ. Bột Nưa từ lâu đã được người Nam Bộ coi như một thứ thực

phẩm giải nhiệt hữu hiệu giống như bột sắn. Dân gian còn có thể dùng bột

Nưa để làm các loại bánh, làm miến và sử dụng trong công nghiệp để hồ vải.

7

Từ xưa người dân miệt duyên hải Tây Nam Bộ xem bột Nưa như một loại

thuốc dân gian. Củ Nưa có thể dùng như một dược liệu để chữa bệnh sốt rét

có báng, đờm trệ, ăn không tiêu, đầy bụng. (Đỗ Tất Lợi, 2005)

Trong củ Nưa có chứa glucomannan - một polysaccharide hòa tan trong

nước. Glucomannan là một chất phụ gia thực phẩm được sử dụng như một

chất chuyển đổi sữa hay chất làm đặc. Trong lịch sử, glucomannan đã được

sử dụng trong thực phẩm truyền thống châu Á như mì, đậu phụ, và các sản

phẩm khác. Ngoài ý nghĩa trong thực phẩm, glucomannan còn đóng vai trò

quan trọng trong một số loại dược phẩm (Tamura và CS, 2005).

Glucomannan là một chất xơ hòa tan, chính vì vậy nó được sử dụng để điều

trị táo bón. Glucomannan có thể làm giảm táo bón bằng cách giảm thời gian

vận chuyển phân (Marzio, 1989). Trong điều trị táo bón mãn tính,

glucomannan cải thiện đáng kể các triệu chứng táo bón (Passaretti, 1991).

Glucomannan cũng có tác dụng giảm colesterol, lipoprotein và chất béo

trung tính, do đó nó cũng được bổ sung vào thành phần của các loại thuốc

chữa béo phì (Walsh, 1984), (Gallaher, 2002). Chất này cũng được chứng

minh là có tác dụng hỗ trợ tích cực trong hỗ trợ điều trị bệnh nhân tiểu

đường type 2 do có thể điều chỉnh nồng độ đường trong máu (Chen, 2003).

Glucomanan chiếm 70% trong chất khô của củ Nưa, vì vậy việc nghiên cứu

nhân giống cây Nưa để thu glucomannan có ý nghĩa rất to lớn.

Cây Nưa không kén đất, có thể trồng được trên nhiều loại đất từ đất xấu bạc

màu đến đất hoang đồi núi tơi xốp, nhiều mùn. Một trong những đặc điểm

sinh lý quan trọng của cây khoai Nưa là khả năng chịu bóng rất cao, dễ

quang hợp ở những nơi có ánh sáng tán xạ, độ che phủ cao do đó rất thích

hợp để trồng xen dưới các tán rừng, vườn cây ăn quả vừa tận dụng được đất

đai, vừa góp phần chống xói mòn bảo vệ đất và rừng rất tốt. Đây là một loại

cây có củ bản địa có giá trị kinh tế cần được khôi phục sản xuất để phục vụ

nhu cầu kinh tế của xã hội đồng thời góp phần bảo vệ môi trường sinh thái.

8

2.2. Tình hình nghiên cứu cây Nưa trong và ngoài nước

2.2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới, những nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn cây Nưa được

thực hiện ở nhiều nước, đặc biệt ở Trung Quốc phát triển rất mạnh (Chun-

Lin Long và CS, 2005). Nhiều nước đã có những nhà máy chế biến, sản xuất

tinh bột Nưa và tách chiết glucomannan ở qui mô công nghiệp. (Suzuki và

CS, 2010)

2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam chi Nưa là chi lớn nhất trong họ Ráy bao gồm 20-25 loài

(Nguyễn Văn Dư, 2005). Lần đầu tiên cây Nưa ở Việt Nam được nhà thực

vật học người Đức Engler nghiên cứu vào năm 1911 trong cuốn

Pflanzenreirich. Trong tài liệu này ông mô tả loài Nưa Bắc Bộ (A.

tonkinensis) như một loài mới ở Bắc Việt Nam. Năm 1942, Gagnepain khi

viết họ Ráy ở Đông Dương, ông đã thống kê và mô tả 4 loài Nưa ở Việt

Nam là Nưa chuông (A. campanulatus = A. paeoniifolius), Nưa Bắc Bộ (A.

tonkinensis), Nưa mekong (A. mekongensis), Nưa đứt đoạn (A. interruptus).

Mãi tới năm 1993, Phạm Hoàng Hộ viết cuốn Cây cỏ Việt Nam ông cũng

thống kê và mô tả ngắn gọn những đặc điểm về cây Nưa.

Từ trước đến nay, việc nhân giống cây Nưa chưa được chú trọng, chủ yếu

người dân tự để giống hoặc vào rừng khai khác theo hình thức tự cung tự

cấp. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về cây Nưa còn rất hạn chế. Gần đây,

nhóm nghiên cứu về Thực vật dân tộc học thuộc Viện Sinh thái và Tài

nguyên sinh vật và Trại Thực nghiệm sinh học thuộc Viện Công nghệ sinh

học đã và đang tiến hành thu thập các giống Nưa với mục đích bảo tồn, tiếp

theo là chọn lọc đánh giá các giống Nưa có hàm lượng glucomannan cao,

chất lượng tinh bột tốt để nhân nhanh và sản xuất cây Nưa phục vụ công

nghiệp chế biến thực phẩm và dược phẩm. Ngày 10/3/2011, Sở Khoa học và

Công nghệ Thừa Thiên Huế đã tổ chức hội nghị tuyển chọn đề tài “Nghiên cứu

hàm lượng, chất lượng, tác dụng và xây dựng quy trình sản xuất glucomannan

9

trong củ Nưa-Amorphophallus (họ Ráy-Araceae) trồng tại tỉnh Thừa Thiên

Huế”.(http://skhcn.hue.gov.vn/Portal/?

GiaoDien=11&ChucNang=341&NewsID=20110324153307). Sáng ngày

08/02/2012, tại Hội trường Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ

Việt Nam, NCS. Nguyễn Tiến An, chuyên ngành Hóa Hữu cơ đã bảo vệ

thành công Luận án Tiến sĩ về đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học, quy

trình tách chiết, biến tính hóa học và khả năng ứng dụng của glucomannan

từ củ một số loài nưa (Amorphophallus. sp – Araceae) ở Việt Nam”.

(http://vienhoahoc.ac.vn/PrintPreview.aspx?ID=414)

2.3. Nuôi cấy mô tế bào thực vật

Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật quan

trọng của công nghệ sinh học, là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các

công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Trải qua hơn

100 năm phát triển và đã đạt được những thành tựu nhất định trong lĩnh vực

nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng (Nguyễn Đức Thành, 2000).

2.3.1. Môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Thành phần hóa học:

Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm

một số thành phần cơ bản sau:

- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

- Các vitamin

- Các amino axít

- Nguồn các - bon: một số các loại đường

- Các chất điều hoà sinh trưởng

- Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai

tây, bột chuối khô...

- Chất làm thay đổi trạng thái môi truờng: các loại thạch (agar)

10

Tất cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong

sự sinh trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro.

Các nhà khoa học sử dụng các môi trường nuôi cấy rất khác nhau. Việc lựa

chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ thuộc vào

một số yếu tố:

- Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về

thành phần môi trường.

- Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo

mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế

bào, vi nhân giống…)

- Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng…).

Độ pH môi trường

Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong

nuôi cấy. Trong khi chuẩn bị môi trường, pH có thể được điều chỉnh đến giá

trị cần thiết của thí nghiệm. Độ pH ảnh hưởng đến sự di chuyển của các ion

và đối với hầu hết các môi trường nuôi cấy pH 5,0 - 6,0 trước khi khử trùng

được xem là tối ưu. Độ pH cao hơn se làm cho môi trường rất rắn trong khi

pH thấp lại giảm khả năng đông đặc của agar. Hầu hết các môi trường nuôi

cấy nghèo đệm, vì thế chúng làm dao động giá trị pH, sự giao động này có

thể gây bất lợi cho thí nghiệm nuôi cấy dài ngày và sự sinh trưởng của các tế

bào đơn hoặc các quần thể tế bào ở mật độ thấp.

Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu

nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Vì vậy, đối với từng

môi trường nhất định và từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh

độ pH của môi trường về mức ổn định ban đầu. Nuôi cấy callus của nhiều

loài cây, pH ban đầu thường là 5,5 - 6,0 sau 4 tuần nuôi cấy pH đạt được giá

trị từ 6,0 - 6,5. Đặc biệt khi sử dụng các loại phụ gia có tính kiềm hoặc tính

acid cao như amino acid, vitamin thì nhất định phải dùng NaOH hoặc HCl

loãng để chỉnh pH môi trường về từ 5,5 - 6,5.

11

Những thí nghiệm nuôi cấy tế bào đơn hay tế bào trần thì việc chỉnh độ pH

là bắt buộc.

Độ pH môi trường thường được điều chỉnh từ 5,8 - 6,0 trước khi khử trùng.

Nhìn chung nếu độ PH cao hơn 6 se làm môi trường bị cứng và nếu thấp hơn

5 thì agar khó đông.

Các tác nhân làm răn môi trường

Các tác nhân làm rắn hoặc tạo gel được sử dụng phổ biến để chuẩn bị các

môi trường nuôi cấy mô dạng rắn (solid) hoặc dạng sệt (semi-solid). Trong

nuôi cấy dịch lỏng mô hoặc tế bào bị ngập trong môi trường và chết do thiếu

oxy. Các gel tạo một giá đỡ cho mô sinh trưởng trong điều kiện tĩnh (static

conditions).

Agar là một loại polysaccharide thu được từ một số loài tảo (ngành tảo đỏ-

Rhodophyta), chúng có ưu điểm hơn các tác nhân tạo gel khác. Trước tiên,

gel của agar không phản ứng với các thành phần của môi trường. Thứ hai,

chúng không bị thủy phân bởi các enzyme thực vật và duy trì sự ổn định ở

tất cả các nhiệt độ nuôi cấy được tiến hành. Bình thường, từ 0,5 - 1% agar

được dùng trong môi trường để tạo gel rắn chắc ở pH đặc trưng cho môi

trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Trong những nghiên cứu về dinh

dưỡng, việc sử dụng agar được tránh bởi vì agar thương phẩm không sạch

do có chứa một số ion Ca, Mg, K, Na và một số nguyên tố khác ở dạng vết.

Tuy nhiên, các chất bẩn nói trên cũng có thể được loại bỏ bằng cách rửa agar

với nước cất hai lần ít nhất là 24 giờ, tráng trong cồn và làm khô ở 60oC

trong 24 giờ. Nói chung, ở 80oC agar ngậm nước chuyển sang trạng thái sol

và ở 40oC trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nước của agar cao từ 6 - 12

g/l nước.

Gelatin ở nồng độ cao (10%) cũng có hiệu quả tạo gel nhưng bị hạn chế sử

dụng bởi vì nó nóng chảy ở nhiệt độ thấp (25oC). Các hợp chất khác đã được

thử nghiệm thành công bao gồm methacel, alginate, phytagel và gel-rite.

Công ty FMC Corp. gần đây đã phát triển một loại agarose được tinh sạch

12

cao gọi là Sea Plaque(k), loại này có thể được dùng để phục hồi các

protoplast đơn (single protoplast) trong nuôi cấy. Cellophane đục lỗ

(perforated cellophane), cầu giấy lọc (filter paper bridge), bấc giấy lọc (filter

paper wick), bọt polyurethane (polyurethane foam) và xốp polyester

(polyester fleece) là các phương thức thay đổi giá thể được dùng trong môi

trường nuôi cấy mô hoặc tế bào.

Điều thuận lợi khi làm việc với các hợp chất tạo gel nhân tạo là chúng tạo ra

các gel sạch ở các nồng độ tương đối thấp (1,25 - 2,5 g/l) và nó có thể giúp

phát hiện sự nhiễm bẩn được phát triển trong suốt thời gian nuôi cấy. Các

mẫu vật sinh trưởng tốt hơn trên agar hoặc các tác nhân tạo giá thể khác phụ

thuộc vào loại mô và từng loài khác nhau.

Một số loại môi trường cơ bản thường được sử dụng trong nuôi cấy mô

tế bào thực vật:

Môi trường Murashige-Skoog (MS) là một trong những loại môi trường

được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Môi trường

MS thích hợp cho cả thực vật hai lá mầm và một lá mầm (Murashige, 1962).

Tới nay, có rất nhiều công thức cải tiến môi trường MS trên cơ sở công thức

gốc do Murashige và Skoog công bố năm 1962. Môi trường B5 được thiết

kế đầu tiên cho nuôi cấy callus hoặc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào, sau đó

được cải tiến và trở thành môi trường thích hợp cho nuôi cấy protoplast. Môi

trường này cũng được sử dụng để tái sinh cây từ protoplast. Môi trường Chu

(N6) là loại môi trường rất hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn của lúa, được

phát triển đặc biệt cho nuôi cấy bao phấn các loài hòa thảo, mặc dù trong các

thí nghiệm nuôi cấy bao phấn môi trường được phát minh bởi Nitsch (1969)

vẫn được dùng phổ biến hơn. Môi trường Nitsch ngày càng thích hợp và phổ

biến trong nuôi cấy cây đậu tương, cỏ ba lá đỏ (red clover) và các loài

legume khác. Thành phần dinh dưỡng của môi trường này đã giúp tăng sinh

trưởng của tế bào trong quá trinh phát sinh phôi và nuôi cấy protoplast.

13

Thành phần hoá học của môi trường đóng vai trò quyết định đối với thành

công của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi loài cây, thậm chí mỗi kiểu

gen, các kiểu nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào, tế bào

trần, bao phấn, hạt phấn…) có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi

trường. Khi bắt đầu nuôi cấy mô một loài mới hoặc một giống mới, cần phải

lựa chọn cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp.

Cho đến nay, các nhà khoa học đã tạo ra một số lượng rất lớn các môi

trường thích hợp với từng đối tượng và mục tiêu nghiên cứu.

2.3.2. Ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Hiện nay, từ những thành tựu của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô tế

bào có thể ứng dụng rất nhiều vào lĩnh vực trồng trọt, như:

- Nhân nhanh vô tính các giống cây quý: từ một mẫu nuôi cấy người ta có

thể tạo ra hàng triệu cây con như nhau nếu đủ thời gian cấy chuyển. Tuy

nhiên, hệ số cấy chuyển phụ thuộc tuỳ giống, càng cấy chuyển nhiều lần

càng tạo nhiều biến dị. Ví dụ, các nhà khoa học đã kết luận từ một chồi dứa

đưa vào nuôi cấy trong ống nghiệm có thể nhân ra hàng triệu cây dứa giống;

từ một chồi chuối đưa vào nuôi cấy có thể nhân ra 2.000 cây chuối giống,

nếu qua số này se có tỷ lệ biến dị cao.

- Cải lương giống cây trồng bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristerm): để

phục tráng những giống cây quý đã nhiễm virus người ta có thể nuôi cấy

đỉnh sinh trưởng để nhân nhanh. Qua một số lần nuôi cấy theo kiểu này se

tạo ra được những cây hoàn toàn sạch bệnh từ cây đã nhiễm virus.

- Tạo dòng đơn bội từ nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy tế bào hạt phấn: Người

ta đã ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn để tạo những cây đơn

bội từ bao phấn hoặc hạt phấn, sau đó lưỡng bội hoá và tạo thành dòng đồng

hợp tử. Kĩ thuật này đã thành công nhiều ở những cây họ cà.

- Khắc phục lai xa bằng cách thụ phấn trong ống nghiệm nhờ kĩ thuật nuôi

cấy phôi: Nhờ nuôi cấy trong ống nghiệm đã khắc phục tính bất hợp giao tử

14

trước và sau khi thụ tinh đối với lai giữa các cây khác nhau khá xa về mặt di

truyền.

- Lai vô tính còn gọi là dung nạp tế bào trần (Protoplast): Nhờ kĩ thuật nuôi

cấy mô tế bào thực vật mà người ta đã tạo thành cây lai từ 2 giống khác nhau

khá xa về mặt di truyền bằng cách dùng các enzim để hoà tan màng tế bào

rồi cho các tế bào trần (không còn màng) vào nuôi cấy chung trong môi

trường nhân tạo và chúng phát triển thành khối mô sẹo (callus), từ đó

chuyển khối callus này sang các môi trường phân hoá chức năng tế bào và

để nuôi cấy thành cây lai. (Nguyễn Đức Thành, 2000)

2.3.3. Vai trò của các chất kích thích sinh trưởng đối với tái sinh cây

in vitro

Các chất kích thích sinh trưởng thực vật có vai trò quan trọng trong kỹ thuật

nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Bằng cách cung cấp các chất kích thích sinh

trưởng ở một mức độ thích hợp, chúng ta có thể điều khiển được chiều

hướng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Auxin và cytokinin là hai chất

kích thích sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy mô

(Geoge, 1993).

Đặc tính của Auxin

Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên

trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt che với các thành

phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô

sẹo, huyền phù tế bào và sự điều hòa sự phát sinh hình thái đặc biệt là khi nó

được sử dụng với cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi

trường nuôi cấy phụ thuộc vào: kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên

cứu, hàm lượng auxin nội sinh của mẫu nuôi cấy, sự tác động qua lại giữa

auxin ngoại sinh và auxin nội sinh.

Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Cùng với

cytokinin các nhóm auxin kích thích sự phân chia tế bào. Các hormone của

15

nhóm này có hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính hướng

(sáng, đất), tính ưu thế ngọn, kích thích ra rễ và phân hóa mạch dẫn. Tác

động của các auxin thường liên quan đến độ dài của thân, đốt, chồi chính,

rễ… Đối với nuối cấy mô và tế bào thực vật, auxin được sử dụng để kích

thích phân chia tế bào và phân hóa rễ. Những auxin thường dùng là: IBA

(Indoly Butyric Acid), IAA (Indoly Acetic Acid), NAA (α - Naptalen Acetic

Acid), 2,4 - D (Dichlorphenoxy Acetic Acid) (Đỗ Năng Vịnh, 2005)

Đặc tính của cytokinin

Cytokinin là dẫn xuất của adenine, hormone liên quan chủ yếu đến sự phân

chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô và

tế bào thực vật. Các cytokinin thường xuyên được sử dụng nhất là BAP (6 -

Benzyl Amino Purin), kinetin (N - (2 - furfurylamin) - 1 - H - 6 - amin),

zeatin (6 - (4 - hydroxyl - 3 metyl - trans - 2 butanylamin) purin). Hàm

lượng sử dụng các loại cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình

thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy.

Ngoài 2 nhóm chính là auxin và cytokinin, trong nuôi cấy mô và tế bào thực

vật người ta còn sử dụng thêm gibberellin để kích thích sự kéo dài tế bào,

qua đó làm tăng kích thước của chồi nuôi cấy… GA3 là loại được sử dụng

nhiều nhất.

Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc

cytokinin, tuy nhiên người ta hay dùng phối hợp cả auxin và cytokinin ở tổ

hợp tỷ lệ khác nhau se cho hiệu quả tốt hơn (Vũ Văn Vụ, 2005)

2.4. Thành tựu bảo tồn nguồn gen cây trồng sử dụng phương pháp nuôi

cấy mô và tế bào thực vật

Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã trở thành một trong những

phương thức quan trọng nhất để nhân nhanh và bảo tồn, đặc biệt là đối với

cây trồng khó nhân nhanh bằng phương pháp truyền thống (Đỗ Năng Vịnh,

2005), (Daniel Lineberger, 1980). Dưới đây là một số thành tựu đã đạt được.

16

Trong nước

Ở Việt Nam việc áp dụng kỹ thuật này để bảo tồn các loài thực vật nhiệt đới

quý hiếm, có giá trị kinh tế cũng được các nhà nghiên cứu quan tâm, bắt đầu

từ các cây Thông (Taxus sps.) là loài có chứa các hoạt chất chữa ung thư

hiệu quả như Taxoid và các hợp chất và một số loài thực vật có giá trị làm

thuốc (Lê Thị Xuân và CS, 1996)

Cây Màng tang (Litsea verticillata) là một loại cây thân gỗ có chứa một số

hợp chất có khả năng kháng HIV (+) – demethoxyapiercelsin và verticillatol

(Hoang VD, Zhang HJ). Tác giả Lê Xuân Đắc và cộng sự đã thành công

trong việc nhân nhanh và bảo tồn cây Màng tang (Litsea verticillata) được

tìm thấy ở vườn Quốc gia Cúc Phương bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào

thực vật (Lê Xuân Đắc và CS, 2004)

Tác giả Nguyễn Thanh Tùng đã nhân giống in vitro thành công cây sưa

(Dalbergia tonkinensis Prain), cây thân gỗ quý hiếm và có giá trị kinh tế cao

vào năm 2008. Năm 2009 tác giả này cũng thành công với đề tài “Nghiên

cứu bảo tồn in vitro một số loài lan rừng Việt Nam quý hiếm”, nhân được

nhiều giống lan như: Thanh đạm một hoa, Thủy tiên hường, Ngọc vạn sáp,

Mỹ dung dạ lan… (http://www.baomoi.com/8X-bao-ton-gien-nhieu-giong-

cay-quy/79/3777758.epi)

Cây Ba kích là một cây dược liệu quý, có tác dụng bổ thận âm, bổ thận

dương, tăng cường gân cốt, khử phong thấp (Ning-Zhen Huang, 2007). Dịch

chiết cồn từ củ cây Ba kích có tác dụng giảm huyết áp, tác dụng nhanh đối

với các tuyến cơ năng, bổ trí não, giúp ăn và ngủ ngon (Wei, 2006). Ngày

nay nhu cầu sử dụng loài cây này làm dược liệu đang gia tăng nên nó bị khai

thác kiệt quệ. Năm 2010, các tác giả Võ Châu Tuấn, Huỳnh Minh Tư đã

nghiên cứu và nhân giống thành công giống cây quý này bằng phương pháp

nuôi cấy mô và tế bào thực vật (Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh Tư, 2010).

Thế giới

17

Các nhà khoa học Ấn Độ đã xây dựng thành công quy trình tái sinh một số

giống tre quý như Dendrocalamus asper (tre mạnh tông), Bambusa

multiplex (cây Hóp) thông qua nuôi cấy hạt hoặc chồi bên (Nandi, 2002)

Các tác giả Balaraju và cộng sự (2008) đã nhân giống và tái sinh in vitro

thành công cây thuốc Vitex agnus-castus (Verbenaceae) bằng kỹ thuật nuôi

cấy mô tế bào thực vật từ mô phân sinh đỉnh trên môi trường 1/2 MS có bổ

sung 0,1 mg/l IBA. Cây thuốc Vitex agnus-castus cũng đang bị đe dọa

nghiêm trọng (Balaraju, 2008)

Năm 2008, các tác giả Nishritha, Sanjay cũng đã nhân giống in vitro thành

công loài Asparagus racemosus Willd, đem lại nhiều giá trị kinh tế lớn.

Cùng năm đó, Mukherjee và RoyChowdhury cũng đã nhân giống in vitro

loài Aloe Vera sp. (Mukherjee, 2008), (Nishritha, 2008)

Bên cạnh đó, tác giả Park và cộng sự (2009) cũng đã tái sinh thành công loài

Rehmannia glutinosan L.Journal quý hiếm, đang bị khai thác quá mức (Park,

2009)

Ngoài ra cũng còn nhiều loài cây quý khác cũng đã được nhân giống và bảo

tồn nguồn gen trong ống nghiệm như: Lawsonia inermis Linn (Lythraceae),

Sausurea lappa C.B.Clarke… (Arora, 1989), (Rout, 2001)

2.5. Phương pháp bảo tồn thực vật

Hai phương pháp bảo tồn cơ bản được áp dụng là: bảo tồn in situ và bảo tồn

ex situ

Bảo tồn in situ

Đây là biện pháp bảo tồn hiệu quả nhất, đặc biệt là với những loài cây bản

địa có phân bố tập trung và có khả năng tái sinh tự nhiên. Bảo tồn in situ

được đề xuất cho hầu hết các loại cay rừng nhiệt đới ở nước ta, bởi vì các

loài cây này thường là khó tạo thành rừng trồng đơn loài hoặc khó tái sinh

ngoài môi trường sống tự nhiên.

18

Bảo tồn in situ còn bao hàm cả các quần thể tái sinh nhân tạo bằng nguồn

hạt giống thu hái tại chỗ, thu hái từ nhiều cây mẹ mà không áp dụng có định

hướng. Điều này có ý nghĩa to lớn đối với việc xây dựng rừng giống cho các

loài cây có phân bố rải rác, như vậy quần thụ bảo tồn được dùng làm nguồn

cung cấp vật liệu giống cho tái sinh nhân tạo, cho trồng rừng, làm giàu rừng

và cải thiện di truyền. Hầu hết các loài cây bản địa đều cần được ưu tiên bảo

vệ theo hình thức bảo tồn in situ, song có hai vấn đề được quan tâm là:

- Có quy hoạch cụ thể và xác định các vùng cần bảo vệ cho mỗi loài sao cho

cá thể vẫn lưu giữ được toàn bộ biến dị di truyền của loài.

- Kết hợp bảo tồn với việc thu hái hạt giống phục vụ tái sinh tự nhiên, tái

sinh nhân tạo, xây dựng quần tụ bảo tồn mới (in situ và ex situ), xây dựng

giống và phục vụ trồng rừng (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1997)

Bảo tồn ex situ

Được thực hiện bằng cách tách rời cây hoặc vật liệu nhân giống ra khỏi vùng

phân bố tự nhiên để đưa vào các bộ sưu tập cây sống (Vườn thực vật), rừng

trồng với mục đích bảo tồn (quần tụ bảo tồn ex situ, ngân hàng hạt giống,

phấn hoa hay nuôi cấy mô) (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1997)

Ba nhiệm vụ chính của bảo tồn ex situ:

- Thu thập các mẫu gen tiêu biểu

- Duy trì chúng ở điều kiện tốt trong thời gian dài

- Làm tăng số lượng mẫu thu thập được (Havens, 1999)

Bảo tồn ex situ được áp dụng cho các loại cây trồng chủ yếu, các loài cây đó

biết rõ giá trị của chúng hoặc khi các quần thể tự nhiên không được bảo vệ

an toàn do tác động của sâu bệnh, lửa rừng và sự phá hoại rừng của súc vật

hoặc con người hoặc do bị tạp giao với các quần thể ngoại lai khác.

Khó khăn lớn nhất của bảo tồn ex situ là chi phí cao vì diện tích của quần thụ

bảo tồn được đề xuất là 10ha cho mỗi loài hoặc xuất xứ và được lượng biến

19

dị đủ lớn, nghĩa là thu hạt càng nhiều kiểu gen càng tốt (Nguyễn Hoàng

Nghĩa, 1997).

20

Phần 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu:

Cây Nưa

Vật liệu nghiên cứu:

- Nguyên liệu thực vật:

Hạt chín cây Nưa do Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật cung cấp.

- Dụng cụ: Dụng cụ nghiên cứu là các trang thiết bị như: box cấy vô trùng,

panh, kéo, dao cắt, đèn UV, cân kỹ thuật, cân phân tích, tủ sấy, hệ thống

giàn đèn, nồi hấp tiệt trùng, máy đo pH...(của các hãng chuyên dụng như:

Sanyo, Metler Toledo, Satorius...)

- Hóa chất: Môi trường MS sử dụng trong nghiên cứu gồm các muối đa

lượng và vi lượng, các chất hữu cơ và vitamin theo Murashige và Skoog

(1962), đường saccharose, agar, các chất kích thích sinh trưởng như BAP,

IAA, IBA...(của các hãng chuyên dụng như: Sigma, Merck, Invitrogen..)

Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 25 - 27oC và chế độ chiếu sáng 12h/12h

với cường độ chiếu sáng 2000lux, nồng độ pH môi trường nuôi cấy 5,8.

3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu:

Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Thực vật dân tộc - Viện sinh thái

và Tài nguyên sinh vật; Trại Thực nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh

học.

21

Thời gian nghiên cứu:

Từ tháng 08/2011 đến tháng 06/2012

3.3. Nội dung nghiên cứu

- Xác định điều kiện khử trùng hiệu quả với hạt chín

- Xác định công thức môi trường thích hợp tạo đa chồi in vitro

- Xác định công thức môi trường thích hợp tạo cây in vitro hoàn chỉnh

- Xác định giá thể thích hợp cho cây in vitro nuôi trồng ngoài tự nhiên

3.4. Phương pháp nghiên cứu

- Các chỉ tiêu nghiên cứu được chia thành các công thức thí nghiệm khác

nhau và có công thức đối chứng

- Số mẫu của mỗi công thức thí nghiệm lớn hơn hoặc bằng 30

- Thí nghiệm được lặp lại 2 lần

3.4.1. Tạo mẫu vô trùng

Có 2 phương pháp vô trùng mẫu: vô trùng bằng dung dịch javen 70% và vô

trùng bằng dung dịch HgCl2.

Phương pháp vô trùng bằng dung dịch javen 70%:

1. Rửa mẫu bằng nước xà phòng loãng;

2. Rửa 2 lần bằng nước cất dưới vô trùng;

3. Rửa trong cồn 700C (trong 1 phút );

4. Rửa bằng nước cất khử trùng 3 lần;

5. Khử trùng trong dung dịch javen 70%, lắc trong 10 phút;

6. Rửa 4 lần bằng nước cất vô trùng;

7. Thấm khô bằng giấy thấm đã khử trùng;

22

Phương pháp vô trùng bằng dung dịch HgCl2

1. Rửa mẫu bằng nước xà phòng loãng;

2. Rửa 2 lần bằng nước cất dưới vô trùng;

3. Rửa trong cồn 700C (trong 1 phút );

4. Rửa bằng nước cất khử trùng 3 lần;

5. Khử trùng trong dung dịch HgCl2 0,1%, lắc trong 10 phút;

6. Rửa 4 lần bằng nước cất vô trùng;

7. Thấm khô bằng giấy thấm đã khử trùng;

- Thu mẫu: Mẫu sau khi khử trùng được cấy vào môi trường MS. Sau

khoảng 30 ngày chồi non phát sinh in vitro, các chồi non này được sử dụng

làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.4.2. Tạo đa chồi in vitro

Môi trường sử dụng trong các thí nghiệm là môi trường MS + 30mg/l đường

saccharose + 8g/l agar và bổ sung các chất kích thích sinh trưởng (KTST)

với nồng độ khác nhau tùy theo mục đích của từng thí nghiệm với pH = 5,8.

Các chồi Nưa có kích thước 0,3 - 0,5 cm được cấy thẳng đứng trên môi

trường thạch.

Chỉ tiêu quan sát: số chồi phát sinh/mẫu.

Công thức thích hợp se được chọn để áp dụng cho các lần tạo đa chồi tiếp

theo.

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo đa chồi

Mục đích thí nghiệm: xác định nồng độ BAP đến khả năng tạo đa chồi cây

Nưa.

CT môi trường Nồng độ BAP

(mg/l)

23

ĐC 0

AMBA1 0,1

AMBA2 0,5

AMBA3 1,0

AMBA4 1,5

AMBA5 2,0

AMBA6 2,5

AMBA7 3,0

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng tạo đa

chồiMục đích thí nghiệm: khảo sát sự tác động đồng thời của BAP và NAA đến khả năng

phát sinh chồi và tăng trưởng của Nưa

CT môi trườngChất KTST

BAP (mg/l) NAA (mg/l)

ĐC 0 0

AMNA1 2 0,1

AMNA2 2 0,2

AMNA3 2 0,3

AMNA4 2 0,4

AMNA5 2 0,5

AMNA6 2 0,6

Trong thí nghiệm này, chất KTST BAP được bổ sung với nồng độ 2 mg/l.

Nồng độ NAA tăng dần từ 0,1 - 0,6 mg/l. Sau thí nghiệm se kết luận ở mức

nồng độ nào thì mẫu cấy se phát sinh nhiều chồi nhất, hiệu quả nhất.

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và IAA đến khả năng tạo chồi

Mục đích thí nghiệm: khảo sát sự tác động đồng thời của BAP và IAA đến

khả năng tạo chồi

24

CT môi trườngChất KTST

BAP (mg/l) IAA (mg/l)

ĐC 0 0

AMIA1 2 0,1

AMIA2 2 0,3

AMIA3 2 0,5

AMIA4 2 0,7

AMIA5 2 0,9

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và IBA đến khả năng tạo đa

chồi

Mục đích thí nghiệm: đánh giá sự tác động đồng thời của BAP và IBA đến

khả năng tạo đa chồi.

CT môi trườngChất KTST

BAP (mg/l) IBA (mg/l)

ĐC 0 0

AMIB1 2 0,2

AMIB2 2 0,4

AMIB3 2 0,6

AMIB4 2 0,8

AMIB5 2 1,0

3.4.3. Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá, rễ để chuyển ra

ngoài trồng tự nhiên. Cây con phải khỏe mạnh, sức đề kháng tốt nhằm nâng

cao sức sống khi ra môi trường bên ngoài. Các chất kích thích sinh trưởng có

tác dụng tạo đa chồi được loại bỏ và thay vào đó là chất kích thích sinh

trưởng tạo rễ như NAA, IBA, IAA...

25

Các chồi có kích thước 3 - 4 cm được sử dụng để nghiên cứu tạo rễ cây Nưa

và được cấy thẳng đứng trên môi trường thạch.

Chỉ tiêu quan sát: số rễ/mẫu.

Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng tạo rễ

Mục đích thí nghiệm: khảo sát nồng độ IBA đến khả năng tạo rễ của Nưa

CT môi trường Nồng độ IBA (mg/l)

ĐC 0

ARIB1 0,1

ARIB2 0,2

ARIB3 0,3

ARIB4 0,4

ARIB5 0,5

ARIB6 0,6

Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến khả năng tạo rễ

Mục đích thí nghiệm: xác định nồng độ của IAA đến khả năng tạo rễ của cây Nưa

CT môi trường Nồng độ IAA (mg/l)

ĐC 0

ARIA1 0,1

ARIA2 0,2

ARIA3 0,3

ARIA4 0,4

ARIA5 0,5

ARIA6 0,6

Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ

26

Mục đích thí nghiệm: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng

tạo rễ của cây Nưa.

CT môi trường Nồng độ NAA (mg/l)

ĐC 0

ARNA1 0,1

ARNA2 0,2

ARNA3 0,3

ARNA4 0,4

ARNA5 0,5

ARNA6 0,6

3.4.4. Trồng cây trong bầu

Đây là một trong những giai đoạn quan trọng trong quá trình nhân giống in

vitro. Giai đoạn này cây non cần sự thích nghi dần với điều kiện bên ngoài

ống nghiệm. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 - 3 tuần, trong thời

gian này cây non phải được bảo vệ và chăm sóc tốt trước những yếu tố bất

lợi.

Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của các giá thể đến hiệu quả trồng cây trong bầu

Mục đích thí nghiệm: tìm ra giá thể thích hợp trồng cây Nưa trong bầu

Công thức Thành phần giá thể Tỷ lệ

1 Đất + Cát đen 1:1

2 Cát đen + Trấu hun 1:1

3 Trấu hun 1

4 Trấu hun + Đất 1:3

3.4.5 Các chỉ tiêu nghiên cứu

27

Để đánh giá và tìm ra được môi trường thích hợp nhất, các chỉ tiêu được sử

dụng như sau:

Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = x 100

Số chồi TB/mẫu =

Tỷ lệ chồi ra rễ =x 100

Số rễ TB/chồi =

Tỷ lệ cây sống (%) = x 100

Các số liệu được tính toán theo phương pháp phân tích thống kê toán học.

Quá trình xử lý được thực hiện trên máy vi tính theo chương trình Microsoft

Office Excel 2003.

28

Phần 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Tạo nguyên liệu vô trùng cây Nưa

Hạt Nưa sau khi khử trùng được cấy vào môi trường MS. Kết quả sau 30

ngày nuôi cấy đã thu được các chồi vô trùng, các chồi non được sử dụng làm

nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.

Bảng 1: Kết quả tạo nguyên liệu vô trùng từ hạt

Phương pháp

khử trùng

Số hạt

cấy

Số hạt

nhiễm

Tỷ lệ

nhiễm (%)

Số hạt

nảy mầm

Tỷ lệ nảy

mầm (%)

Javen 70% 85 27,0 31,8 31,0 53,45

HgCl2 (0,1) 72 16,0 22,2 25,0 44,64

Kết quả thu được ở bảng 1 cho thấy: phương pháp khử trùng bằng javen

70% tuy có tỷ lệ nhiễm cao hơn (31,8%) nhưng tỷ lệ này mầm cũng cao hơn

so với phương pháp khử trùng bằng HgCl2 (53,45%). Bên cạnh đó, HgCl2 là

một chất độc hại, có tác động không tốt đến sức khỏe. Vì vậy, trong thí

nghiệm này, chúng tôi chọn khử trùng bằng javen làm phương pháp khử

trùng để tạo nguyên liệu vô trùng cây Nưa.

4.2. Tạo đa chồi

Trong môi trường nghiên cứu in vitro khi bổ sung các chất kích thích sinh

trưởng như auxin, cytokinin, gibberellin se kích thích sự sinh trưởng phát

triển và phân hóa của các cơ quan, từ đó tạo nên sức sống tốt cho các mô và

tổ chức. Tuy nhiên, mỗi loài thực vật lại thích hợp với một loại và nồng độ

chất kích thích sinh trưởng khác nhau. Vì vậy, nên sử dụng phối hợp các

chất kích thích sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy để cho hiệu quả tối ưu

nhất.

29

Việc tìm ra công thức môi trường với nồng độ và tỷ lệ chất kích thích sinh

trưởng phù hợp với từng loài cây, từng giai đoạn phát triển là bước rất quan

trọng trong qui trình nhân giống in vitro.

4.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo đa chồi

BAP có vai trò quan trọng trong việc hình thành đa chồi. Chúng tôi tiến

hành thử nghiệm các công thức tạo đa chồi với các nồng độ BAP khác nhau.

Kết quả được thể hiện ở bảng 2 sau 30 ngày nuôi cấy.

Bảng 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo đa chồi

CTMTBAP (mg/l) Số chồi cấy Số chồi tạo

thành

Hệ số nhân chồi

ĐC 0 30 35 1,2

AMBA1 0,1 30 45 1,5

AMBA2 0,5 30 75 2,1

AMBA3 1,0 30 97 2,8

AMBA4 1,5 30 137 3,9

AMBA5 2,0 30 180 5,1

AMBA6 2,5 30 183 5,2

AMBA7 3,0 30 189 5,4

Kết quả ở bảng 2 cho thấy: môi trường AMBA1 và AMBA2 có hệ số nhân

chồi thấp nhất (1,5 và 2,1). Các môi trường AMBA5, AMBA6 và AMBA7

đều cho hệ số nhân chồi cao, lần lượt là 5,1; 5,2 và 5,4. Tuy nhiên môi

trường AMBA5 cho tỷ lệ mô sẹo thấp nhất, các chồi phát sinh khỏe mạnh,

đồng đều nhất.

Vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi chọn môi trường AMBA5 (2 mg/l

BAP) là môi trường thích hợp tạo đa chồi cây Nưa.

30

4.2.2. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng tạo đa chồi

Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các

hệ thống nuôi cấy. Khi tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì se phát sinh mô sẹo hoặc

hình thành rễ. Ngược lại se dẫn tới phát sinh chồi và chồi nách.

Chúng tôi tiến hành thử nghiệm các công thức tạo đa chồi với các tổ hợp của

BAP và NAA ở các nồng độ khác nhau. Kết quả thể hiện rõ ở bảng 3 sau 30

ngày nuôi cấy.

Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng tạo đa chồi

CTMTBAP

(mg/l)

NAA

(mg/l)

Số chồi

cấy

Số chồi tạo

thành

Hệ số nhân

chồi

ĐC 0 0 30 52 1,7

AMNA1 2 0,1 35 160 4,6

AMNA2 2 0,2 35 198 5,7

AMNA3 2 0,3 35 172 4,9

AMNA4 2 0,4 35 164 4,7

AMNA5 2 0,5 35 153 4,4

AMNA6 2 0,6 35 134 3,8

Kết quả ở bảng 3 cho thấy: các môi trường AMNA3, AMNA4, AMNA5 và

AMNA6 tuy có nồng độ NAA tăng dần (từ 0,3 - 0,6 mg/l) nhưng hệ số nhân

chồi lại giảm dần (từ 4,9 đến 3,8). Môi trường AMNA2 có nồng độ NAA là

0,2 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất (5,7).

Vì vậy, trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn môi trường AMNA2 (2 mg/l

BAP + 0,2 mg/l NAA) là môi trường thích hợp tạo đa chồi cây Nưa.

4.2.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IAA đến khả năng tạo đa chồi

Củ Nưa được chia thành các phần nhỏ có đường kính khoảng 0,5 cm, cấy

vào môi trường dinh dưỡng MS có bổ sung BAP và IAA ở các nồng độ khác

nhau.

31

Sau 30 ngày nuôi cấy, tiến hành quan sát, thu thập và phân tích số liệu, kết

quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 4.

Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và IAA đến khả năng tạo đa chồi

CTMTBAP

(mg/l)

IAA

(mg/l)

Số chồi

cấy

Số chồi tạo

thành

Hệ số nhân

chồi

ĐC 0 0 30 52 1,7

AMIA1 2 0,1 30 121 4,0

AMIA2 2 0,3 30 172 5,7

AMIA3 2 0,5 30 167 5,6

AMIA4 2 0,7 30 155 5,2

AMIA5 2 0,9 30 142 4,7

Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp

BAP và IAA đến khả năng tạo chồi của cây Nưa. Nồng độ BAP được giữ

nguyên là 2 mg/l, nồng độ của IAA thay đổi theo hướng tăng dần từ 0,1 mg/l

đến 0,9 mg/l trên các công thức môi trường nuôi cấy.

Kết quả thu được ở bảng 2 cho thấy, sau 30 ngày nuôi cấy, môi trường

AMIA2 có hệ số nhân chồi cao nhất 5,7. Do vậy chúng tôi lựa chọn công

thức môi trường thích hợp nhất tạo đa chồi cây Nưa ở thí nghiệm này là

AMIA2 (2,0 mg/l BAP + 0,3 mg/l IAA).

4.2.4. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến khả năng tạo đa chồi

Trong thí nghiệm này chúng tôi chọn nồng độ BAP là 2 mg/l, còn nồng độ

IBA thay đổi theo hướng tăng dần từ 0,2 mg/l đến 1,0 mg/l trên các công

thức môi trường nuôi cấy.

Sau 30 ngày nuôi cấy kết quả thu được thể hiện qua bảng 5.

32

Bảng 5: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và IBA đến khả năng tạo đa chồi

CTMTBAP

(mg/l)

IBA

(mg/l)Số chồi cấy

Số chồi

tạo thành

Hệ số nhân

chồi

ĐC 0 0 30 40 1,3

AMIB1 2 0,2 40 165 4,1

AMIB2 2 0,4 40 179 4,5

AMIB3 2 0,6 40 170 4,3

AMIB4 2 0,8 40 163 4,1

AMIB5 2 1,0 40 142 3,6

Kết quả thu được ở bảng 5 cho thấy: Các môi trường đều cho tỉ lệ mẫu tạo

chồi là 100%. Với môi trường AMIB2 có nồng độ IBA là 0,4 thì hệ số nhân

chồi là cao nhất, đạt 4,48.

Vì vậy trong thí nghiệm này chúng tôi lựa chọn môi trường thích hợp tạo đa

chối cho cây Nưa là môi trường AMIB2 (2 mg/l BAP + 0,4 mg/l IBA).

Qua 4 thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng

đến khả năng tạo đa chồi cây Nưa chúng tôi tổng hợp lại ở bảng sau đây.

Bảng 6: Kết quả tổng hợp thí nghiệm tạo đa chồi cây Nưa

CTMT Hệ số nhân chồi

AMBA5

(2 mg/l BAP)5,1

AMNA2

(2 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA)5,7

AMIA2

(2 mg/l BAP + 0,3 mg/l IAA)5,7

AMIB4

(2 mg/l BAP + 0,4 mg/l IBA)4,5

Từ kết quả bảng 6 cho thấy ở công thức môi trường AMNA2 và AMIA2 đều

cho hệ số nhân chồi cao (5,7). Còn hai môi trường AMBA5 và AMIB5 cho

33

hệ số nhân chồi lần lượt là 5,1 và 4,5. Kết hợp với quan sát mẫu thực tế thu

được về sự phát triển của chồi chúng tôi thấy môi trường AMNA2 cho tỷ lệ

mô sẹo ít hơn và các chồi phát triên đồng đều hơn.

Vì vậy, qua 4 thí nghiệm trên chúng tôi chọn môi trương AMNA2 (2mg/l

BAP + 0,2 mg/l NAA) là môi trường thích hợp nhất để tạo đa chồi cây Nưa.

4.3. Tạo cây hoàn chỉnh

Kích thích tạo rễ là khâu cuối cùng của giai đoạn nghiên cứu in vitro. Các

chất kích thích IBA, IAA, NAA đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia

tế bào và hình thành rễ.

4.3.1. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng hình thành rễ cây Nưa

Sử dụng các chồi nhận được từ môi trường nhân đa chồi có chiều dài từ 4 - 5

cm cấy vào môi trường có chất kích thích ra rễ để xác định môi trường thích

hợp để tạo rễ cây Nưa.

Trong thí nghiệm chúng tôi sử dụng IBA ở các nồng độ khác nhau, thay đổi

từ 0,1 mg/l đến 0,6 mg/l để nghiên cứu ảnh hường của IBA đến khả năng tạo

rễ cây Nưa. Kết quả sau 20 ngày nuôi cấy thu được ở bảng 6.

Bảng 7: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ

CTMTIBA

(mg/l)

Số chồi

cấy

Số chồi ra

rễ

Tỷ lệ chồi

tạo rễ (%)

số rễ

TB/chồi có

rễ

ĐC 0 30 0 0 0

ARIB1 0,1 45 16 35,6 1,6

ARIB2 0,2 45 21 46,7 2,3

ARIB3 0,3 45 28 62,2 2,5

ARIB4 0,4 45 35 77,8 3,4

ARIB5 0,5 45 39 86,7 4,6

34

ARIB6 0,6 45 45 100,0 5,7

Kết quả ở bảng 6 cho thấy, chồi Nưa có thể tạo rễ trên tất cả môi trường có

chất kích thích, trừ môi trường đối chứng MS không có chất kích thích sinh

trưởng nên chôi nuôi cấy không xuất hiện rễ.

Tuy nhiên trên môi trường có chất kích thích sinh trường là IBA thì tỉ lệ ra

rễ ở môi trường ARIB1 và ARIB2 (tương ứng với các nồng độ IBA 0,1; 0,2

mg/l) là tương đối thấp chỉ đạt 35,6% và 46,7%.

Môi trường ARIB6 có tỉ lệ ra rễ cao nhất đạt 100%, vì vậy trong thí nghiệm

này chúng tôi lựa chọn môi trường ARIB6 (0,6 mg/l IBA) là môi trường

thích hợp để tạo rễ.

4.3.2. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ

Chúng tôi thử nghiệm sự ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sự

hình thành rễ cây Nưa với nồng độ khác nhau, từ 0,1 - 0,6 mg/l IAA.

Sau 20 ngày nuôi cấy, kết quả thu được ở bảng 8.

Bảng 8: Ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ

CTMTIAA

(mg/l)Số chồi cấy

Số chồi ra

rễ

Tỷ lệ chồi

tạo rễ (%)

số rễ

TB/chồi

ĐC 0 30 0 0 0

ARIA1 0,1 40 9 22,5 2,1

ARIA2 0,2 40 15 37,5 2,8

ARIA3 0,3 40 22 55,0 3,7

ARIA4 0,4 40 34 85,0 4,6

ARIA5 0,5 40 40 100,0 5,5

ARIA6 0,6 40 40 100,0 5,8

35

Kết quả ở bảng 7 cho thấy: Các môi trường ARIA1; ARIA2 ( tương ứng

nồng độ IAA 0,1 mg/l và 0,2 mg/l) có tỉ lệ chồi tạo rễ thấp, chỉ đạt 22,5% và

37,5%.

Trong khi đó, môi trường ARIA5 và ARIA6 đều có tỉ lệ chồi tạo rễ là 100%.

Nhưng môi trường ARIA6 có số rễ trung bình\chồi cao hơn (5,8). Vì vậy

chúng tôi lựa chọn môi trường ARIA6 (0,6 mg/l IAA) là môi trường thích

hợp để tạo rễ.

4.3.3. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ

Trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi sử dụng chất kích thích sinh trưởng

NAA ở các nồng độ khác nhau là: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 ( mg/l) để

nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến sự tạo rễ ở cây Nưa.

Kết quả thu được sau 20 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 9.

Bảng 9: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ

CTMTNAA

(mg/l)

Số chồi

cấySố chồi ra rễ

Tỷ lệ chồi tạo

rễ (%)

số rễ

TB/chồi

ĐC 0 30 0 0 0

ARNA1 0,1 40 37 92,5 4,6

ARNA2 0,2 40 40 100 5,4

ARNA3 0,3 40 40 100 6,2

ARNA4 0,4 40 40 100 6,9

ARNA5 0,5 40 40 100 7,5

ARNA6 0,6 40 40 100 7,9

Kết quả ở bảng 9 cho thấy tất cả các công thức môi trường đều cho tỉ lệ ra rễ

cao (trừ môi trường đối chứng MS) thấp nhất là môi trường ARNA1 (0,1

mg/l NAA) có tỉ lệ chồi tạo rễ là 92,5%; các môi trường còn lại đều có tỉ lệ

chồi tạo rễ 100%.

36

Vì vậy chúng tôi lựa chọn môi trường ARNA2 (0,2 mg/l NAA) là môi

trường tạo rễ thích hợp nhất.

Qua ba kết quả ở bảng 7, bảng 8 và bảng 9 cùng thực tế quá trình làm thí

nghiệm chúng tôi rút ra kết luận như sau: môi trường ARIB6 (0,6 mg/l IBA)

là môi trường thích hợp nhất để tạo rễ cây Nưa.

4.4. Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống của cây trong bầu

Cây con có đầy đủ thân, lá và rễ được đưa ra trồng trong bầu, giai đoạn này

cần phải có chế độ chăm sóc đặc biệt, phải đảm bảo được độ ẩm và ánh sáng

vừa phải để cây con thích nghi dần với điều kiện tự nhiên.

Kết quả thống kê sau 15 ngày trồng cây trong bầu được trình bày ở bảng 10.

Bảng 10: Ảnh hưởng của giá thể đến cây trồng trong bầu

Loại giá thể Tỉ lệSố cây

trồngSố cây sống

Tỷ lệ sống

sau 15 ngày

(%)

Đất + Cát đen 1:1 150 120 80,0

Cát đen + Trấu hun 1:1 150 134 89,3

Trấu hun 1 150 145 96,7

Trấu hun + Đất 1:1 150 143 95,3

Từ kết quả ở bảng 10 chúng tôi rút ra nhận xét như sau:

Các loại giá thể đều cho tỉ lệ cây sống cao, trong đó cá thể đất + cát đen là

loại giá thể cho tỉ lệ cây sống thấp nhất (80,0%), với số cây sống sót là 120

cây.

Giá thể cát đen + trấu hun và giá thể trấu hun + đất cho tỉ lệ cây sống cao

hơn là 89,3% và 95,3% với 134 và 143 cây sống sót.

Cá thể trấu hun cho tỉ lệ cây sống là cao nhất, tương ứng 96,7%, số cây sống

là 145 cây. Tuy nhiên, giá thể trấu hun quá nhẹ và tơi xốp là môi trường

37

thích hợp cho cây con phát triển nhưng không phù hợp trong việc vận

chuyển.

Vì vậy, chúng tôi lựa chọn giá thể thích hợp nhất để trồng cây Nưa là giá thể

trấu hun + đất.

38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Kết luận

1. Bước đầu đã nhân cây Nưa bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

2. Môi trường thích hợp để tạo đa chồi cây Nưa là môi trường AMNA2 (MS

+ 30 g/l đường saccharose + 8g/l agar + 2 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA) với hệ

số nhân chồi là 5,7.

3. Môi trường tốt nhất để tạo cây hoàn chỉnh là môi trường ARIB6 (MS + 30

g/l đường saccharose + 8 g/l agar + 0,6 mg/l IBA) với tỉ lệ tạo rễ là 100%, số

rễ trung bình/chồi là 5,8 và cây sinh trưởng phát triển tốt nhất.

4. Giá thể thích hợp để trồng cây sau in vitro cho cây Nưa là trấu hun + đất

với tỉ lệ cây con sống là 95,3%.

Đề nghị

Tiếp tục nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của cây Nưa nuôi cấy in

vitro ở ngoài tự nhiên.

39

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học

thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp Hà Nội.

2. Lê Xuân Đắc, Hà Hồng Hải, Đào Thị Thu Hà, Nguyễn Thanh Danh, Lê

Thị Xuân, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình (2004). Nhân nhanh và bảo tồn

cây Màng tang (Litsea verticillata) được tìm thấy ở Vườn Quốc gia Cúc

Phương bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, Tạp chí Công nghệ

sinh học, 2(4): 479-486.

3. Phạm Hoàng Hộ (1993), Cây cỏ Việt Nam, tập 2(2), NXB Montréal. 528.

4. Nguyễn Hoàng Nghĩa (1997), Bảo tồn nguồn gen cây trồng, NXB Nông

Nghiệp Hà Nội.

5. Hoàng Thị Sản, Hoàng Thị Bé (2006), Phân loại học thực vật, NXB Đại

học Sư Phạm.

6. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô t ế bào thực vật nuôi cấy và

ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

7. Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, NXB Nông

nghiệp, Hà Nội.

8. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005), Công nghệ sinh

học (tập 2), NXB Giáo dục, Hà Nội.

9. Lê Thị Xuân, Schemluck M, Mai Văn Trì (1996), Cây Thông đỏ Lâm

Đồng (Taxus walli chiana) một nguồn nguyên liệu quý để sản xuất các

thuốc chữa ung thư nhóm Taxoid, Tạp chí hóa học, 34(1), Tr.80-81.

10. Võ Châu Tuấn, Huỳnh Minh Tư, Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Ba

kích, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Đà Nẵng - Số 5(40).2010, 191-

196).

11. Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học.

526-527.

40

Tài liệu tiếng nước ngoài:

12.Chun-Lin Long, Heng Li, Zhiqin Ouyang, Xiangyun Yang, Qin Li and

Bruce Trangmar (2003), Strategies for agrobiodiversity conservation and

promotion: a case from Yunnan, China Biodiversity and Conservation,

12(6): 1145-1156.

13. Hejnowicz Z, Barthlott W (2005). Structural and mechanical

peculiarities of the petioles of leaves of Amorphophallus (Araceae). Am.

J. Bot. 92(3): 391-403.

14.Jianbin Hu, Jianwu Li (2008), Morphogenetic pathway in petiole derived

callus of Amorphophallus albus in vitro. Acta Physiologiae Plantarum,

30: 389-393.

15.Suzuki H, Oomizu S, Yanase Y, Onishi N, Uchida K, Mihara S, Ono K,

Kameyoshi Y, Hide M (2010), Hydrolyzed Konjac glucomannan

suppresses IgE production in mice B cells. Int Arch Allergy Immunol,

152(2):122-30.

16. Tamura M, Tsushida T, Shinohara K (2005), Konjac Glucomannan

Consumption May Enhance Equol Production in Mice. Food Science and

Technology Research, 11(4): 376-379.

17. Geoge EF (1993), Plant propagation by tissue culture (2), Exegetics Ltd,

Edin.

18. Daniel Lineberger R. (1980), Tissue culture of woody plants, Texas

A&M University, College Station.

19. Ning-Zhen Huang, Chuan-Ming Fu, Zhi-Guo Zhao, Feng-Luan Tang,

Feng Li (2007), Tissue culture and rapid proliferation of Morinda

officinalis How, Botany, Guangxi Zhuangzu Autonomous Region and the

Chinese Academy of Sclences, Guilin 541006, China.

20. Wei LJ, Lu P and Su WP (2006), Tissue culture and rapid propagation of

Morinda officinalis How, Plant Physilogy Comunication, 42 (3), pages

475.

41

21. Nandi SK, Kumar A, and Palni L M S (2002), Role of plant tissue

culture in biodiversity conservation and economic development,

Gyanodaya Prakashan.

22. Balaraju K, Agastian P, Preetamraj JP, Arokiyaraj S, Ignacimuthu S

(2008), Micropropagation of Vitex agnus catus (Verbenaceae) - A

valuable medicinal plant. In Vitro Cellular & Development Biology -

Plant, 44(5):436 - 441.

23. Mukherjee A, RoyChowdhury B (2008), In vitro Propagation of Aloe

Vera sp. TIG Research Journal, 1(2): 116 - 119.

24. Nishritha B, Sanjay S (2008), In vitro propagation of high value

medicinal plant: Asparagus racemosus Willd, In vitro cellular &

Developmental Biology – Plant, 44(6): 525 - 532.

25. Park SU, Kim YK, Lee SY (2009), Improved in vitro plant regeneration

and micropropagation of Rehmannia glutinosa L. Journal of Medicinal

Plants Research, 3(1): 031 - 034.

26. Arora R, Bhojwani SS (1989), In vitro propagation and low temperature

storage of Saussurea lappa CB Clarke - An endangered medicinal plant.

Plant Cell Rep, 8: 44- 47.

27. Rout R, Das G, Samantaray S, Das P (2001), In vitro micropropagation

of Lawsonia inermis (Lythraceae). Publication: Revista de Biologia

Tropical.

28. Havens K, Guerrant E, Maunder M (1999), Strategies for survival: Ex

situ plant conservation. Report of a research symposium held at the

Chicago Botanic Garden, BG Journal, 3(3).

29. Marzio L, Del Bianco R, Donne MD, Pieramico O, Cuccurullo F

(August 1989). "Mouth-to-cecum transit time in patients affected by

chronic constipation: effect of glucomannan". Am. J.

Gastroenterol. 84 (8): 888-91

30. Passaretti S, Franzoni M, Comin U, et al. (1991). "Action of

glucomannans on complaints in patients affected with chronic

42

constipation: a multicentric clinical evaluation". Ital J Gastroenterol

23 (7): 421-5.

31. Walsh DE, Yaghoubian V, Behforooz A (1984). "Effect of glucomannan

on obese patients: a clinical study"), (Arvill A, Bodin L (March

1995). "Effect of short-term ingestion of konjac glucomannan on serum

cholesterol in healthy men”

32. Gallaher DD, Gallaher CM, Mahrt GJ, et al. (October 2002). "A

glucomannan and chitosan fiber supplement decreases plasma cholesterol

and increases cholesterol excretion in overweight normocholesterolemic

humans”

33. Chen HL, Sheu WH, Tai TS, Liaw YP, Chen YC (February

2003). "Konjac supplement alleviated hypercholesterolemia and

hyperglycemia in type 2 diabetic subjects-a randomized double-blind

trial"

34. Murashige T, Skoog F (1962), A revised medium for rapid growth and

bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol Plant, 15: 475 - 497.

Tài liệu trên Internet:

35.http://skhcn.hue.gov.vn/Portal/?

GiaoDien=11&ChucNang=341&NewsID=20110324153307.

36.http://vienhoahoc.ac.vn/PrintPreview.aspx?ID=414.

37.http://www.baomoi.com/8X-bao-ton-gien-nhieu-giong-cay-quy/

79/3777758.epi

43

PHỤ LỤC

Các thành phần cơ bản của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)

Thành phần khoáng đa lượng Nồng độ (mg/l)

NH4NO3 1650

KNO3 1900

CaCl2.2H2O 440

MgSO4.7H2O 370

KH2PO4 170

Thành phần khoáng vi lượng Nồng độ (mg/l)

MnSO4.H2O 23,3

ZnSO4.7H2O 8,6

H3BO3 6,2

KI 0,83

Na2MoO4.2H2O 0,25

CuSO4.5H2O 0,025

CoCl2.6H20 0,025

Na2EDTA 37,3

FeSO4.7H2O 27,8

Vitamin Nồng độ (mg/l)

Thiamine HCl 0,1

Nicotinic Acid 0,5

Pyridoxine HCl 0,5

Glyxine 2,0

44