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Marcatori molecolari

Caratteristiche e applicazioni

Luca Gianfranceschi e Rosanna Marino

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I marcatori molecolariStrumento per l’analisi genetica

Strumento non oggetto di studio

Molecolari biologia molecolare

Analisi genetica studio delle differenzegenetiche

Marcatori approccio indiretto

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Alcune definizioni

Marcatore genetico: Locus genico che identifica univocamente una regione cromosomica

Mappa genetica: Definisce le RELAZIONI LINEARI tra marcatori molecolari E’ IL RISULTATO DELL’ANALISI GENETICA

Distanza genetica: Stima della distanza esistente tra due marcatori calcolata sulla frequenza di ricombinazione- Si esprime in Centimorgan (cM)- 1cM = 1 ricombinante / 100 prodotti meiotici

Polimorfismo: Presenza di varianti alleliche per un dato gene o marcatore

Polimorfismo molecolare: Differenze evidenziabili a livello di DNA

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I marcatori molecolari sono UNIVERSALI

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I marcatori molecolari sonoEREDITABILI

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I marcatori genetici

► Marcatori morfologici► Problemi: 1) non sono molto numerosi

2) dipendono dalla specie (ploidia ecc.)

► Marcatori molecolari► Identificano polimorfismo a livello di DNA► Offrono la possibilità di coprire tutto il genoma► Sono applicabili universalmente

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Marcatore genetico ideale► Non influenzato dall’ambiente► Neutrale► Stabile► Facile da monitorare► Numeroso► Codominante► Polimorfico ► Presente in qualsiasi tessuto► Indipendente da sesso ed età► Analisi automatizzabile

N.B. Peccato che non ci sia !!

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Tecniche per la produzione di marcatori molecolari

► Ibridazione molecolare ► Southern blot

es. RFLP

► Amplificazione del DNA► PCR (Polymerase Chain Reaction)

RAPD, SSR o STR

► Approcci misti► Digestione enzimatica e amplificazione

CAPS, AFLP

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I marcatori RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)

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La reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction - PCR)

► Inventata da Kary Mullis nel 1985► Gli è valsa il Nobel nel 1993

Fondamenti:► Conoscenze sulla replicazione del DNA

- DNA polimerasi► Sintesi in vitro di DNA a sequenza specifica

- Oligonucleotidi ► Biologia dei batteri estremofili

- DNA polimerasi Taq ricavata da Thermus aquaticus

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I marcatori RAPD(Random Amplified Polymorfic DNA)

► Basati su PCR► Non sono necessari dati di sequenza► Automatizzabili► Oligonucleotidi (primer) sono corti e di sequenza casuale► Temperatura di annealing è bassa: 37°C► Richiedono poco DNA di partenza► La tecnica è facile

Problemi► Scarsa ripetibilità► Non sono locus-specifici► Non sono esportabili► Difficilmente confrontabili tra mappe e tra genotipi► Sono marcatori dominanti

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Analisi RAPD di 9 varietà di ciliegio

2000 bp

1500 bp

500 bp

I campioni 1 e 3 provengono dalla stessa varietà, così come i campioni 2 e 6; nella corsia 9 è stato usato DNA di amareno

1 2 3 4 5 6 7 8 9 M

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I microsatelliti o SSR(Simple Sequence Repeat)

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I microsatelliti o SSR(Simple Sequence Repeat)

Individuo 1

Individuo 2

Individuo 3

Individuo 4

Individuo 5

Individuo 6

1 2 3 4 5 6

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Analisi SSR di alcuni individui di una popolazione naturale

1

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4

5

6

Quanti alleli distinguete negli individui di questa popolazione?

-

+

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Individui della popolazione

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La tecnica degli AFLP

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Esempio di gel AFLP

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Analisi multiplex di marcatori

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Che cos’è uno SNP ?Che cos’è uno SNP ?•E’ una differenza, o polimorfismo,

di un singolo nucleotide nella sequenza di DNA esistente in alcuni individui della stessa specie.

• Il loro numero varia notevolmente a seconda della specie

In uomo c’è in media uno SNP ogni 300 nucleotidi

Che cos’è uno SNP ?Che cos’è uno SNP ?•E’ una differenza, o polimorfismo,

di un singolo nucleotide nella sequenza di DNA esistente in alcuni individui della stessa specie.

• Il loro numero varia notevolmente a seconda della specie

In uomo c’è in media uno SNP ogni 300 nucleotidi

...C C ...C C AA T T G A C... T T G A C...

...C C ...C C GG T T G A C... T T G A C...

……G G G G TT A A C T G... A A C T G...

……G G G G CC A A C T G... A A C T G...

Gli SNP(single nucleotide polymorphism)

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Perché utilizzare gli SNPs

►Sono la base molecolare della maggior parte delle differenze tra individui

►Possono contribuire alla suscettibilità a malattie e all’adattabilità delle specie

►Sono presenti in un elevato numero e sono distribuiti lungo tutto il genoma

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Impieghi dei marcatori molecolari

► Analisi di paternità

► Diagnosi di anomalie genetiche

► Analisi forensi

► Identificazione di QTL e geni utili

► Miglioramento delle specie vegetali ed animali

► Studio della struttura, evoluzione e biodiversità delle popolazioni

► Studi di epidemiologia

► Tracciabilità dei prodotti animali e/o dei GMO

► Conservazione della natura

► Studi di filogenesi ed evoluzione

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi

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Programma di queste esercitazioni► LUNEDÌ

► Introduzione sui marcatori molecolari e loro usi► Estrazione del vostro DNA dalle cellule della mucosa

boccale► MARTEDÌ

► Spiegazione teorica sulla PCR e sull’uso che ne faremo► Amplificazione specifica di tre sequenze del vostro genoma

1. Marcatore altamente polimorfico D1S80 sul cromosoma 12. Marcatore Y-GATA-A7.2 sul cromosoma Y3. Marcatore HUAMEL sul gene dell’amelogenina sulla

regione omologa dei cromosomi X e Y► Preparazione dei gel di agarosio

► MERCOLEDÌ► Elettroforesi dei prodotti di PCR sul gel di agarosio► Protocollo semplificato per l’estrazione di DNA da Kiwi► Analisi e discussione dei risultati ottenuti