На правах рукописи 

0 0 3 4 5 В 0  17 

Сивков Антон Юрьевич 

Исследование распространенности  штаммов Mycobacterium  tuberculosis  с 

множественной лекарственной  устойчивостью в Новосибирской  области 

03.00.03 — «молекулярная  биология» 

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой  степени 

кандидата биологических  наук 

0 * 1 * * ф 

Кольцово­ 2008 

Работа  выполнена  в  ФГУН  Государственный  научный  центр  вирусологии  и биотехнологии  «Вектор»  Федеральной  службы  по  надзору  в  сфере  защиты  прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России. 

Научный руководитель 

доктор биологических наук Татьков Сергей Иванович 

Официальные оппоненты: 

доктор биологических наук, доцент Тикунова Нина Викторовна, ФГУН  ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора кандидат биологических наук, Катохин Алексей Вадимович, ИЦиГ СО РАН 

Ведущая организация 

г. Новосибирск, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. 

Защита  состоится  «19»  декабря  2008  года  в  09­00  часов  на  заседании диссертационного  совета  Д.208.020.01  при  Государственном  научном  центре вирусологии  и  биотехнологии  «Вектор»  по  адресу:  ФГУН  ГНЦ  ВБ  «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (383)336­74­28. 

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор». Автореферат разослан «/7  » ноября 2008 года 

Ученый секретарь  ^ s  Z1 

диссертационного совета  ­Д^А  ~~  д.б.н. Л.И.Карпенко 

Общая характеристика работы 

Актуальность темы 

На  сегодняшний  день  около  трети  населения  инфицировано  микобактериями 

туберкулеза.  Особенно  опасными  являются  микобактерии  с  множественной 

лекарственной  устойчивостью  (МЛУ).  МЛУ  штаммы,  устойчивы  как  минимум  к 

изониазиду  и рифампицину.  Каждый  год  во  всем  мире  МЛУ  формами  туберкулеза 

заболевают около 400 тыс. лиц. 

При  неправильном  лечении  больных  МЛУ­формами  противотуберкулезными 

препаратами  второй  линии  у  пациентов  могут  быть  отселектированы  штаммы  М. 

tuberculosis  с  широкой  лекарственной  устойчивостью  (ШЛУ).  Такие  штаммы 

устойчивы  не только  к рифампицину  и изониазиду,  но и ко всем  фторхинолонам  и, 

как  минимум,  к  одному  из  трех  инъекционных  препаратов  второй  линии 

(капреомицину,  канамицину  или  амикацину).  В развитых  странах  с наилучшими  на 

сегодня  системами  диагностики  и лечения  туберкулеза  удалось  добиться  излечения 

больных ШЛУ­туберкулезом лишь в 30% случаев. 

По данным  ВОЗ, на  конец  2007  года  уже  в 41  стране  были  обнаружены  ШЛУ 

штаммы  М.  tuberculosis. В  России  эти  штаммы  также  получили  распространение. 

Только в Томской области в течение 2002­2005 гг. было выявлено 30 ШЛУ штаммов 

среди  исследованных  458 МЛУ изолятов (6,6%). Дальнейшее распространение  ШЛУ 

и  МЛУ  штаммов  угрожает  возникновением  эпидемии  туберкулеза,  для  лечения 

которого  доступных  на  сегодняшний  день  лекарственных  средств  будет 

недостаточно. 

В  2007  г  ВОЗ  приняла  программу  борьбы  с  распространением  МЛУ  и  ШЛУ 

туберкулеза  в  мире.  Среди  важнейших  целей  программы  ­ усиление  и  расширение 

надзора за МЛУ и ШЛУ туберкулезом, и поддержка  исследований, направленных на 

создание  новых  тест­систем  для  быстрого  выявления  лекарственно­устойчивого 

туберкулеза. 

Цели и задачи исследования 

Целью  данной  работы  являлось  исследование  распространенности  МЛУ 

штаммов М.  tuberculosis в Новосибирской области. 

3 

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи. 

1.  Оценить  возможность  определения устойчивости  микобактерий туберкулеза к 

рифампициігу с помощью биочипа. 

2.  Определить  доминирующие  механизмы  возникновения  и  распространения 

МЛУ­штаммов. 

3.  Выявить  очаги  заболеваемости  лекарственно­устойчивыми  формами 

туберкулеза на территории Новосибирской области. 

Научная новизна 

•  Впервые  в  Новосибирской  области  при  параллельном  исследовании 

лекарственной  устойчивости  к  рифампицину  чистых  культур  микобактерий 

туберкулеза  бактериологическим  методом  и  с  помощью  биочипа  было 

установлено, что результаты совпадают в 86% случаев. 

•  На  примере  штаммов,  циркулирующих  в  Новосибирской  области,  впервые 

продемонстрирована  возможность  использования  биочипа,  определяющего 

только  устойчивость  к  рифампицину,  для  выявления  МЛУ­изолятов  М. 

tuberculosis. 

•  Показано, что в Новосибирской области доминируют Пекинские штаммы, доля 

которых составляет не менее 48%. 

•  Впервые комбинацией двух методов генотипирования ­  IS6110 и MIRU ­  среди 

Пекинских  штаммов  в  Новосибирской  области  выявлены  две  генетических 

группы, в которых доминировали МЛУ изоляты (89 и 100% соответственно). 

•  В ходе изучения механизмов возникновения и распространения МЛУ штаммов 

М.  tuberculosis  молекулярно­генетическими  методами  установлено,  что 

устойчивые  изоляты  селектировались  в  ходе  лечения  и  к  2001­2003  гг 

получили  значительное  распространение  среди  населения  Новосибирской 

области, где сформировали очаги заболеваемости МЛУ формами туберкулеза. 

Практическая значимость 

Разработан  и  запатентован  способ  регенерации  биочипов,  позволяющий 

использовать один биочип до семи раз. 

4 

Путем  совмещения  двух  стадий  ПЦР  в  одной  пробирке  разработан  метод 

определения устойчивости к рифампицину, позволяющий снизить вероятность кросс­

контаминации  при  проведении  исследований,  значительно  удешевить  стоимость  и 

резко повысить производительность анализа. 

Показано,  что  положительный  результат  определения  лекарственной 

устойчивости  биочипом  может  быть  использован  при  принятии  решения  о  выборе 

противотуберкулезных  препаратов,  а  отрицательный  ­  нет.  Если  биочипом  изолят 

определяется,  как  чувствительный,  необходимы  дополнительные  исследования  его 

лекарственной устойчивости. 

Апробация работы и публикации 

Полученные  результаты  исследований  были  представлены:  на 

«Межрегиональной  научной конференции, посвященной  100­летию со дня рождения 

академика  АМН  СССР  СП.  Карпова»  (Томск,  Россия,  2003),  XIV  научной 

конференции­конкурсе  молодых  ученых  ГНЦ  ВБ  «Вектор»  (Новосибирск,  Россия, 

2003),  симпозиуме  «Интегративная  медицина  в  XXI  веке»  (Судак,  Украина,  2004), 

международной  конференции  «Развитие  международного  сотрудничества  в  области 

изучения  инфекционных  заболеваний»  (Новосибирск,  Россия,  2004),  Российской 

научно­практической  конференции  «Генодиагностика  инфекционных  болезней», 

(Новосибирск,  Россия,  2005),  «26th  Annual  Congress  of  the  European  Society  of 

Mycobacteriology»,  (Istanbul, Turkey, 2005), Российской  школе­конференции  молодых 

ученых  «Экотоксикология:  современные  биоаналитические  системы,  методы  и 

технологии»  (Пущино, Россия, 2006), III Российской конференции с международным 

участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока 

и  Крайнего  Севера»  (Новосибирск,  Россия,  2006),  конгрессе  «Биотехнология: 

состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007),  II Российско­Германской 

конференции форума Коха­Мечникова (Томск, Россия, 2007). 

По материалам диссертации был получен патент № 2270870 от 25.12.2003 «Способ 

регенерации нуклеотидных биочипов» Болдырев А.Н. Сивков А.Ю. Татьков СИ. 

5 

Личный вклад соискателя 

Диссертационная  работа  была  выполнена  соискателем  в  2002­2006  гг.  в 

лаборатории  разработки  новых  методов  диагностики  заболеваний  человека  ФГУН 

ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора  в рамках выполнения проектов МНТЦ №2019 и 

№1980, а также госпрограммы РФ (договор № 03/2512/1). 

На  разных  этапах  в  работе  принимали  участие  Татьков  СИ.,  Болдырев  А.Н., 

Боднев С.А.,  Туманов Ю.В., Кузьмичева  Г.А., Азаев  М.Ш., Смирнова  О.Ю., Ивлев­

Дунтау  А.П.,  Филипенко  М.Л.,  Рот  М.А.,  Цильковская  И.,  Ильичев  А.А.  Всем  им 

автор приносит искреннюю благодарность. 

Структура и объем диссертации 

Диссертация  изложена  на  152  страницах  машинописного  текста  и  состоит  из 

введения,  обзора  литературы,  главы  «Материалы  и  методы»,  главы  «Результаты  и 

обсуждение»,  заключения,  выводов  и  списка  литературы.  Библиография  включает 

160 работ:  18 ­  отечественных  авторов и  142 ­  зарубежных. Работа  иллюстрирована 

55 рисунками и включает 6 таблиц. 

Основное содержание работы 

Для  решения  поставленных  задач  были  сформированы  две  выборки 

клинических изолятов. 

1.  Коллекция  из  272  штаммов  была  создана  из  устойчивых  к  рифампицину 

изолятов,  выделенных  от  впервые  выявленных  или  ранее  лечившихся  больных 

туберкулезом из г. Новосибирска с 2000 по 2005 гг. 

Устойчивость  к  рифампицину  определяли  биочипом,  для  подтверждения 

точности  детекции  мутаций  в  гене  биочипом  у  60  изолятов  была  определена 

нуклеотидная последовательность высоковариабельной области гена гроВ. На данной 

выборке были опробованы модификации анализа мутаций биочипом. 

170  изолятов  из  272,  выбранные  методом  случайных  чисел,  были 

генотипированы  методом  IS6110  ПЦР. Также  170 изолятов  были использованы  для 

анализа  механизмов  распространения  лекарственно­устойчивых  изолятов  в 

г. Новосибирске. 

6 

2.  Репрезентативная  коллекция  была  образована  из  штаммов,  выделенных  от 

впервые выявленных  больных туберкулезом  из 30 районов Новосибирской области и 

городов Новосибирск, Бердск, Обь за период с 1  января 2003 по 1  января 2004 гг. 

Сбор  мокроты,  исследование  мазков,  бактериологические  посевы, 

производились  в  противотуберкулезном  диспансере  города  Новосибирска  и 

Новосибирском НИИ туберкулеза Росздрава. На каждый изолят М.  tuberculosis, были 

составлены  паспорта,  включающие  бактериологические  характеристики,  социально­

демографические и основные клинические параметры больных. 

Всего  за  2003  год  было  выявлено  1699  первичных  больных,  от  762  пациентов 

удалось  выделить  чистую  культуру  М.  tuberculosis,  у  всех  выделенных  культур 

определялась  устойчивость  к  противотуберкулезным  препаратам 

микробиологическим  методом. Результаты определения лекарственной  устойчивости 

удалось получить лишь для 607 культур. 

Данные  обо  всех  1699  первичных  случаях  использовались  для  анализа 

географического  распределения  лекарственно­устойчивых  форм  туберкулеза  по 

районам области. 

Для  оценки  генетического  разнообразия  штаммов  М.  tuberculosis  в 

Новосибирской области из 607 изолятов были выбраны методом случайных чисел 230 

изолятов, которые анализировались методами IS6110 ПДРФ и MIRU VNTR. 

Обе  коллекции  штаммов  исследовались  в  рамках  проекта  МНТЦ  №1980 

«Эпидемиология  лекарственно­устойчивого  туберкулеза  в  Западной  Сибири: 

генетическая  характеристика  лекарственно­устойчивых  изолятов  М.  tuberculosis и 

анализ  их распределения  в Новосибирской  области», руководитель  проекта  Ильичев 

А.А.  Проведение  проекта  №1980  было  одобрено  этическим  комитетом  ГНЦ  ВБ 

«Вектор» 28 мая 2001 г  (протокол №2 от 28 мая 2001 г.). 

7 

Географическое  распределение  заболеваемости  лекарственно­устойчивыми 

формами туберкулеза по территории Новосибирской области 

В  среднем,  заболеваемость  в  сельских  районах  Новосибирской  области  132 

случая на сто тыс. населения в  1,6 раза выше, чем средняя  заболеваемость по городу 

Новосибирску (82 случая на сто тыс. населения). 

Мы  исследовали  данные,  предоставленные  НИИ  туберкулеза,  и  проводили 

распределение  заболеваемости  и  множественной  лекарственной  устойчивости  по 

районам Новосибирской области (рис. 1). 

Рисунок  1. Заболеваемость туберкулезом  по районам Новосибирской области в 2003 году на 100000 населения. Цветом показан уровень заболеваемости по районам области. 

Распределение заболеваемости  по районам варьирует от 46 в Кочковском до 235 

(рис.  1)  случаев  заболевания  на  сто  тысяч  населения  в  Тогучинском  районах.  При 

переходе на районный уровень анализа отчетливо выявляется очаги заболеваемости: в 

четырех  районах  (Венгеровском,  Колыванском,  Коченевском  и  Тогучинском) 

заболеваемость  выше  200  случаев  на  сто  тысяч  населения,  причем  три  из  четырех 

районов примыкают к областному центру. 

8 

Характеристика  спектра  лекарственной  устойчивости  среди  впервые 

заболевших туберкулезом 

При  исследовании  устойчивости  циркулирующих  штаммов  микобактерий 

туберкулеза  у  607  изолятов,  (35%  случаев),  были  определены  профили 

резистентности выделенных штаммов. 

В  2003  г.  в  Новосибирской  области  было  выявлено  89  МЛУ­штаммов,  что 

составило  14,7%  от  всей  проанализированной  выборки.  Выявляемость  МЛУ 

значительно варьировала в зависимости района области (рис. 2). 

Рисунок  2.  Заболеваемость  в  процентах  МЛУ  туберкулезом  по  районам  Новосибирской области за 2003 г. Цветом отмечено распределение заболеваемости по районам области. 

Было  показано,  что  в  Сузунском  и  Северном  районах  сложилась  критическая 

ситуация и уровень МЛУ­штаммов у впервые выявленных пациентов, превысил 25%. 

Устойчивые к рифампицину  изоляты в 91% были устойчивы и к изониазиду, т.е. 

являлись  изолятами  с  МЛУ.  Следовательно,  в  нашем  регионе  выявление 

устойчивости  к рифампицину  любым  методом  с  вероятностью  около  90% поможет 

быстро определить МЛУ­штаммы М.  tuberculosis. 

9 

Применение биочипа, определяющего  устойчивость  к рифампицинѵ . для 

массового скрининга МЛУ­изолятов  микобактерий  туберкулеза 

Замена  двух­пробирочного  метода  наработки  меченого  фрагмента  для 

гибридизации на биочипе на однопробирочный 

Ранее  в  Институте  молекулярной  биологии  им.  В.А.  Энгельгардта  был 

разработан чип «ТБ­биочип (RIF)», позволяющий определять 30 типов мутаций в гене 

гроВ,  который  может  быть  использован  для  скрининга  рифампицин­  и  МЛУ­

устойчивых штаммов М.  tuberculosis. 

В  инструкции  к  биочипу,  предложенной  разработчиками  предлагалось  проводить 

синтез меченого фрагмента гена гроВ, используя две реакции ПЦР. Продукт первой из них 

переносился в новую пробирку, и проводилась вторая стадия ПЦР, в результате которой 

синтезировался анализируемый фрагмент вариабельной области гена гроВ. 

Стадия  переноса  ПЦР­продукта  из  одной  пробирки  в  другую  является 

потенциальным  источником  кросс­контаминаций  и  получения  ложных  результатов 

при проведении ПЦР­анализа. 

Риск  контаминации  можно уменьшить,  если  исключить  стадию  переноса  ПЦР­

продукта, совместив обе реакции в одной микропробирке. 

Мы разработали  способ совмещения двух последовательных ПЦР в одной. Были 

подобраны  соотношения  праймеров  и  температурно­временной  профиль 

совмещенной ПЦР, позволяющие получать совпадение флуоресцентных  изображений 

чипов,  полученных  как  по  протоколу,  рекомендованному  разработчиками,  так  и по 

протоколу, разработанному нами (рис. 3). 

•  •  * 

•  •  •  • 

•  •  * •  •  « 

•  *  • *  •  * 

•  • •  •  • 

• 

• 

§> 

•  • 

•  •  ' •  • • • • • • • • 

1  2 

Рисунок 3. Сравнение изображений биочипов, полученных по протоколу «ТБ­биочип (RIF)». 1­ в две стадии, 2 ­ в одну стадию. 

10 

Для  проверки  разработанного  протокола,  мы  определили  мутации  во  всех 

образцах  ДНК,  выделенных  из  272  изолятов  М.  tuberculosis, с  помощью  биочипа 

параллельно  по  обоим  протоколам  и  установили,  что  во  всех  случаях  оба  метода 

приводили  к получению одинаковых результатов. Совмещение обоих  раундов ПЦР в 

одной  микропробирке  позволило  снизить  риск  возникновения  контаминации  при 

проведении  ГТЦР,  снизить  расход  пластиковых  пробирок,  носиков,  значительно 

уменьшить  трудозатраты  при  анализе.  Применение  разработанного  нами  протокола 

представляется  более  предпочтительным,  чем  использование  методики, 

предложенной  создателями  набора  «ТБ­биочип  (RIF)»,  особенно  при  массовых 

анализах в ПЦР­лабораториях. 

Многократное использование биочипов путем их регенерации 

Для  снижения  стоимости  исследования  лекарственной  устойчивости  М. 

tuberculosis мы разработали способ многократного использования биочипов. 

Для  проверки  методики  регенерации  был  использован  ТБ­биочип.  Мы 

проверили  на нем ДНК №150 из банка изолятов М. tuberculosis  лаборатории.  Изолят 

имел мутацию  Ser531­Leu,  которая проявлялась четким сигналом в соответствующей 

ячейке  биочипа  (рис.  4А).  После  регенерации  сигналы  в  ячейках  биочипа  не 

проявились даже при экспозиции 5000 мс (рис. 4Б). 

Рисунок  4.  Фотография  изображения  прогибридизованного  биочипа.  А ­  до  регенерации. экспозиция 150 мс; Б ­  после проведения регенерации, экспозиция 5000 мс. 

Применение  регенерации  позволило  7  раз  использовать  1 биочип  без  потери 

качества  результатов  (рис.5.).  При  проведении  регенерации  больше  семи раз ячейки 

биочипа деградируют. 

11 

Методика регенерации  была проверена на МЛУ­биочипах, также разработанных 

в  Институте  молекулярной  биологии  им.  В.А.  Энгельгардта.  В  результате  было 

показано, что регенерация работает и на МЛУ­биочипах. 

На  выборке  из  50  изолятов  мы  сравнивали  результаты  анализа  мутаций  с 

помощью  ТБ­биочипов  до,  и  после  проведения  регенерации.  Мутации,  выявленные 

биочипами  после  регенерации,  совпали  с  мутациями,  выявленными  по  протоколу 

производителей биочипов. 

Г Д Е 

Рисунок 5. Фотографии изображений многократного применения биочипа после регенерации и  повторной  гибридизации.  А  ­  двукратное  применения  биочипа;  Б  ­  трехкратное применения биочипа; В ­ четырехкратное применения биочипа; Г ­ пятикратное применения биочипа; Д ­ шестикратное применения биочипа; Е ­ семикратное применения биочипа. 

Таким  образом,  разработанная  технология  регенерации  применима  для 

нуклеотидных  биочипов  и  позволит  резко  снизит  затраты  на  проведение 

исследований лекарственной устойчивости М.  tuberculosis. 

Сравнение результатов определения лекарственной  устойчивости  при  массовом 

скрининге биочипами и микробиологическим методом 

Чтобы  определить  возможность  определения  устойчивости  микобактерий 

туберкулеза  к  рифампицину  с  помощью  биочипа  мы  исследовали  резистентность 

изолятов,  выделенных  от  больных  в  Новосибирской  области  двумя  методами. 

Лекарственная  устойчивость  была  выявлена  у  всех  изолятов  методом  абсолютных 12 

концентраций  на  твердой  питательной  среде  Левенштейна  ­  Йенсена.  Параллельно 

выделялась ДНК всех изолятов, и анализировалась  ТБ­биочипами.  Оказалось (Рис.6), 

что в 86% случаев мутация  в гене гроВ маркировала  случаи  наличия у микобактерии 

устойчивости  к  рифампицину.Наиболее  часто  встречающейся  мутацией,  оказалась 

Ser531­Leu. Также были выявлены мутации L51 IP, D516V, H526Y и L533P (рис.6.). 

4°о 

15°° 

•  SER531>LEU 

•  LEU511>PRO 

D  HIS526>TYR 

DASP516>VAL 

57°o 

•  Остальные  мутации 

•  нет  мутаций но есть устойчивость 

Рисунок 6. Выявленные с помощью биочипа мутации в гене гроВ. 

На  основании  распространенности  мутаций  среди  рифампицин­устойчивых 

изолятов  можно  заключить,  что  подавляющее  большинство  (83,2%)  штаммов 

обладает  настолько  высокой  лекарственной  устойчивостью  к  рифампицину,  что 

включение  этого  антибиотика  в  различные  схемы  лечения  туберкулеза  становится 

бесполезным. 

Для  проверки  надежности  определения  мутаций  с  помощью  биочипа,  из  272 

образцов  ДНК  были  случайным  образом  отобраны  60, у  которых  была  определена 

последовательность  ДНК  вариабельной  области  гена  гроВ.  Полученные  данные 

показали,  что  все  мутации,  присутствующие  в  гроВ генах  исследованных  изолятов, 

были определены биочипом без ошибок. 

Ранее  различными  исследователями  было  показано,  что  у  95%  устойчивых 

штаммов  присутствует  мутация  в гене  гроВ. Мы показали, что у  15% устойчивых  к 

рифампицину  изолятов  не обнаруживались  мутации  в гене. Это на  10% больше, чем 

можно было бы ожидать. 

13 

У  культур  М.  tuberculosis,  для  которых  обоими  методами  были  получены 

противоречивые  результаты  по  резистентности,  была  повторно  определена 

устойчивость  к рифампицину.  Полученные  результаты  совпали  с первоначальными.  В 

результате  анализа  изображений  биочипов  «сомнительных  культур»  было  выявлено, 

что  в них  присутствуют  как  сильные  сигналы  в мутантных  кодонах,  так  и,  сравнимые 

с ними  по интенсивности  сигналы  в немутантных  кодонах  (Рис.  7.). 

Такие  образы  биочипов  можно  объяснить  присутствием  в  культуре  смеси  двух 

штаммов:  чувствительного  и  резистентного  типа  (смешанной  культурой)  и 

соответствующей  геномной ДНК  в анализируемом  с помощью  биочипа  образце. 

Смешанные  культуры  могли  возникнуть  либо  в  результате  кросс­контаминации 

в  лаборатории,  либо  изначально  присутствовать  в  образце  мокроты,  полученной  от 

больного.  В  настоящее  время  для  выявления  смешанных  культур  применяются 

генотипирование  по  IS6110  ­  локусам,  сполиготипирование  или  VNTR.  Доля  кросс­

коитаминаций  в лабораториях  изменяется  в  широких  пределах  ­  до  65%. Однако  для 

лабораторий  развитых  стран  она  значительно  ниже:  в  Лондоне  ­  0,93%,  в  Дэнвере 

(США)  ­  12­14%. В  Российских  лабораториях,  доля  кросс­контаминаций  может  быть 

еще  выше, достигать 33%. 

Другим  источником  появления  устойчивых  штаммов  в  организме  больного 

может  служить  спонтанный  мутагенез.  Резистентность  к  рифампицину  может 

появляться  с  частотой  10"s на  одно  клеточное  делении,  причем  частота  мутирования 

различных  кодонов  гена  гроВ  одинакова  и не зависит от генотипа  микобактерий. 

Рисунок  7.  Пример  фотографии  биочипа  с  одинаковыми  сигналами  дикого  типа  и  мутации. Красным отмечены сигналы, маркирующие дикий тип и мутацию Ser­Leu в 531 кодоне гена гроВ. 

14 

Возникновение  мутаций  в гене гроВ влияет  на фитнес  микобактерии,  т.е. на ее 

способность  к  росту  и  распространению  в  популяции.  Так,  например,  мутации 

His526—>Tyr и His526—>Arg уменьшают скорость деления, a Ser531 ­Leu ­ пет. Причем, 

влияние мутаций на фитнес не зависит от генотипа М.  tuberculosis. 

Микробиологические  методы  «настроены»  на  выявление  даже  1% устойчивых 

микобактерии  в  анализируемом  образце,  а  биочип,  видимо,  её  не  обнаруживает.  В 

результате  возникает  разночтение  данных  по  резистентности  культур  клинических 

изолятов.  В.А.  Фирсовой  было  показано,  что  при  определении  устойчивости  М. 

tuberculosis  напрямую  из  мокроты  биочипом  результаты  совпадают  с  методом 

абсолютных концентраций только в 50% случаев. 

Таким  образом,  если  биочипом  показано  отсутствие  устойчивости,  то  изолят 

необходимо  подвергать дополнительному  исследованию  с помощью  ПЦР реального 

времени  или  иным  методом  для  детектирования  небольшой  примеси  устойчивого 

штамма в образце. 

Анализ генотипов микобактерии туберкулеза методом IS6110 ПЦР типирования 

в г. Новосибирске 

Для  определения  генотипов  устойчивых  изолятов  из  272  изолятов  методом 

случайных  чисел  были  отобраны  170  изолятов.  Они  были  прогенотипированы 

методом  IS6110  ПЦР­типирования.  В  результате  анализа  результатов 

генотипирования  было  построено  филогенетическое  древо. Выборка  разделилась  на 

две части (Рис. 8.). Изоляты, входящие в группу ABCDEFGHI, составляют 68,83% от 

всей выборки. Эта группа имеет клональную  структуру  и генотипы, входящие в нее, 

демонстрируют  большую  гомологию  между  собой.  Генотипы  В  и  G доминируют  в 

популяции,  на  их  долю  приходится  19,4 и 38,24% выборки  соответственно.  Вторая 

группа,  состоящая  из  генотипов,  не  вошедших  в  кластер  ABCDEFGHI, 

продемонстрировала  небольшую  гомологию  между  входящими  в  нее  генотипами. 

Эти  группа  скорее  всего  состоит  из недавно  появившихся  штаммов, либо  имевших 

распространение в прошлом. 

С  помощью  метода  ПДРФ  по  IS6110,  а  также  в  результате  соотнесения 

профилей  IS6110  ПЦР  с  данными,  опубликованными  Мокроусовым  И.В.  было 

15 

показано, что рифампицин­устойчивые  изоляты в Новосибирске, входящие в кластера 

В, G и М, по ряду генетических признаков относятся к Пекинским штаммам. 

1,13% 

?5,ДВСЈ ft

Ј3,83% 

2.95% 

5,93% 

1.77% 

1.Ш 1/7% 

3,STX 

4.12% 

47% 

Іій) 

19.4% (1.7 IK 131 IS 

?,3?.4I.M.Jo.+5.J7.SJ. Юі.' 103.112.113.123.  IS . СТ. І­ЭЭ 133, 131,13?, 1С. IJ3. 1+3.1С 157.  1­3,  t i l ,  К .  V35.  / 

;,аэ% 2,35? 

1,Ш 3.5Я 

33,83? 

40,€% 

0,53% 

33,2*% 

j fP D 

О S3?. 

і­  К,», І І , ; І ,К,».З; ,Ж, ess,», ei.«.c<.«:,ffi.67.*ii.::.;5,;4.eo.s:. а,? і ,я,»,еі ,«4і ,«,м,»: ,  га, т .  кг.іи.і іб.  і г .  і із.па.іг,  i:t. I»,  CS.IS.IS,  I»,  |И,І»,Ш.1И, 11*. 131.1С 155. l#.  K». 163.161. I*. .кт.е*. IT;. Z?.s 

• # H 

+ И.Г7.», 

­Cr.3i3J.3C! 

1й 'iN 

t lT'iD 

DM 

p 

­ (B.r ,  I ? ; . I : I ' ) R 

­a.;o.;;.7'.j.j*,tOT 

{JS S. 121  ) W 

Рисунок 8. Сводное филогенетическое древо  170 изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в г. Новосибирске. Латинскими буквами справа обозначены генотипы изолятов, В процентах на ветвях древа указан процент гомологии между изолятами, находящимися в ветви. 

16 

Исследование  механизмов  возникновения  и  распространения  МЛУ­штаммов 

М. tuberculosis 

Увеличение доли резистентных  изолятов  М. tuberculosis среди  циркулирующих 

штаммов  может происходить либо  в результате  селекции устойчивых  мутантов при 

лечении,  либо  при  инфицировании  устойчивыми  штаммами.  При  преобладании 

селекционного  механизма  следует  ожидать  равномерного  распределения  мутаций 

Ser531­^Leu  (ген  гроВ)  среди  кластеров  изолятов  М.  tuberculosis.  В  случае 

преобладания  инфицирования  устойчивыми  мутантами  М.  tuberculosis,  должны 

выделяться  некоторые  кластеры,  в  которых  доля  штаммов  с  данными  мутациями 

будет статистически достоверно выше. 

Для  определения  механизмов  распространения  МЛУ­штаммов  М. tuberculosis 

нами было проанализировано распределение частоты встречаемости  мутаций в генах 

гроВ  среди  генотипов,  выявленных  при  анализе  170  изолятов  из  Новосибирска. 

Достоверность  различия  частот  встречаемости  мутаций  в  различных  кластерах 

оценивали по критерию хи­квадрат. 

В  результате  анализа  достоверности  различия  частот  появления  мутации 

Ser531 ­>Leu в гене гроВ в популяции больных из Новосибирска, установлено: 

­ частота появления  мутации среди  кластеризующихся  штаммов  М.  tuberculosis 

(66,7%,  кластер  ABCDEFGHI,  рис.  8.)  достоверно  выше,  чем  частота  у 

некластеризующихся  изолятов  (35,9%,  кластер  JKLMNOPQRSTUVWXYZ,  рис.  8.), 

устойчивых к рифампицину (критерий хи­квадрат, Р=0,05); 

­ в кластере  G встречаемость данной  мутации достоверно  выше, чем в среднем 

по выборке ­ 75% (критерий хи­квадрат, Р=0,001); 

­ в кластере В частота мутации  Ser53ILeu достоверно не отличается от средних 

значений  по  выборке  (хи­квадрат,  Р=0,45).  Аналогично  и  для  остальных 

малочисленных кластеров. 

Следовательно,  мутация  Ser531Leu  в  гене  гроВ  встречается  у  изолятов  всех 

идентифицированных  генотипов, однако намного чаще в кластере G. Такой характер 

распределения  мутации  согласуется  с  предположением  о  доминировании 

распространения,  а  не  селекции,  в  формировании  популяции  рифампицин­

17 

устойчивых  изолятов  и мы  можем  предположить,  что  штаммы  М.  tuberculosis  из  этого 

кластера  ранее  приобрели  маркерную  мутацию  резистентности  к  рифампицину  и 

теперь  активно распространяются  в популяции  города  Новосибирска. 

Популяционное  исследование  лекарственно­устойчивого  туберкулеза  в 

Новосибирской  области 

Генотипирование  выборки  методом  IS6110  ПДРФ 

Для  оценки  генетического  разнообразия  штаммов  М.  tuberculosis  в 

Новосибирской  области  была  создана  рандомизированная  выборка  из  230  изолятов, 

из которой  в результате  генотипирования  удалось  проанализировать  173  изолята, 

По полученным  результатам  типирования  с использованием  критерия  UPGMA  и 

метода  объединения  ближайших  соседей  было  построено  древо  филогенетического 

родства  штаммов  М.  tuberculosis,  (рис. 9). 

Рисунок  9.  Распределение  типов  лекарственной  устойчивости  по  кластерам  ПДРФ  древа. Черными  квадратами  показаны устойчивость  штамма  к противотуберкулезному  препарату. В первой  строке  ­  устойчивость  к  изониазиду,  во  второй  ­  к  рифампицину,  в  третьей  ­  к стрептомицину,  в  четвертой  ­  к  канамицину,  в  пятой  ­  к  этамбутолу,  в  шестой  ­  к протиопамиду. Красным цветом отмечено расположение на древе генотипов с МЛУ. Желтым отмечен кластер МЛУ­штаммов. 

Было  выявлено  157  генотипов.  24%  изолятов  кластеризованы.  Ветвь  №  2, 

образована  штаммами,  имеющими  типичный  для  штаммов  Beijing  ПДРФ  ­  профиль. 

В  среднем  по  выборке  встречаемость  МЛУ­штаммов  равна  21,4%.  В  составе  ветви 

№2,  был  выявлен  кластер  с  содержанием  в  нем  МЛУ­штаммов  60,7%. Генотип  этого 

кластера  статистически  значимо  чаще  ассоциирован  с  множественной  лекарственной 

устойчивостью  (р<0,00001, по критерию  хи­квадрат). 

18 

Генотипирование выборки методом VNTR 

Чтобы  проверить,  не  являются  ли  обнаруженные  нами  кластеры  на  древе 

генетически  неоднородными, мы воспользовались  вторым  методом  генотипирования 

по  12  MIRU  и  3  ETR  локусов  дополнительно.  В  результате  было  построено 

филогенетическое древо (рис. 10.). 

Рисунок  10.  Распределение  штаммов  с  множественной  лекарственной  устойчивостью  по ветвям  VNTR  древа.  Черными  квадратами  показаны  устойчивость  штамма  к противотуберкулезному  препарату. В первой строке ­ устойчивость к изониазиду, во второй ­  к рифампицину.  в третьей ­  к стрептомицину,  в четвертой  ­  к канамицину, в пятой ­  к этамбутолу, в шестой  ­ к протионамиду. Красным цветом отмечено расположение на древе генотипов с МЛУ. Желтым отмечен кластер МЛУ­штаммов. 

В  популяции  было  выявлено  117  генотипов.  32%  изолятов  кластеризовано. 

Древо содержит  17 кластеров. В результате распределения  были выявлены 2 кластера 

в древе,  в которых  встречаемость  МЛУ­штаммов  статистически  значимо  отличалась 

от среднего по выборке. 

Кластер, в который входят  VNTR генотипы 2023325183[524|Іли334524  (индексами 

обозначены  возможные  значения  кода  в данном локусе)  содержит  71,4% штаммов с 

множественной  лекарственной  устойчивостью.  Среднее  по  выборке  содержание 

МЛУ­штаммов  ­  21,4%.  Частота  встречаемости  МЛУ  в  этом  кластере  значимо 

отличается от среднего (р<0,00001, по критерию хи­квадрат). 

Второй  кластер  ­  генотип  223325177535424.  В  этом  кластере  содержится  75% 

штаммов с МЛУ, что более чем в 3 раза превышает среднее значение по всей выборке 

(р<0,00001, по критерию хи­квадрат). 

19 

Таким  образом,  наличие  данных  генотипов  позволяет  ожидать  с  вероятностью 

0,71  или  0,75  соответственно  у  клинических  изолятов  наличие  множественной 

лекарственной устойчивости. 

Выявление штаммов Beijing сполиготипированием 

Для оценки наличия  в исследуемой  выборке  штаммов Beijing,  были случайным 

образом отобраны 24 изолята и определены их сполиготипы. Было показано, что  18 

изолятов  относятся  к  группе  Пекинских  штаммов,  а  6  ­  нет.  Изучая  расположение 

Пекинских  и не Пекинских штаммов на ветвях дендрограммы было установлено, что 

ветвь №2 в IS6110 ПДРФ древе и ветви №2 и 4 в VNTR древе, скорее всего, состоят 

из Пекинских штаммов. 

Ранее  выявленные  нами  кластеры  с высоким  содержанием  МЛУ  (71  и 75% по 

VNTR,  или  60,7%  по  ІБбПО­ПДРФ)  также  входят  в  ветви,  сформированные 

Пекинскими штаммами. 

Мы  не  обнаружили  достоверного  различия  между  частотами  встречаемости 

МЛУ  у  Пекинских  и  остальных  штаммов.  Тем  не  менее,  Пекинские  штаммы 

неоднородны  и  в  них  есть  генотипы,  однозначно  ассоциированные  с  высоким 

уровнем МЛУ­изолятов в них. 

Анализ выборки двумя методами генотипирования  одновременно 

В  работе  были  использованы  VNTR  и  IS6110  ПДРФ:  эти  методы  оценивают 

вариабельность  разных  участков  генома,  а  значит,  построение  филогенетического 

древа по результатам обоих методов увеличит дискриминирующую силу анализа. 

При  построении  древа  использовался  пакет  Bionumerics  (Applied  Math)  и 

статистические  веса  результатов  обоих  методов  генотипирования  считались 

равнозначными. В результате исследуемая выборка разбилась на 5 ветвей (рис. 11.). 

Анализ  распределения  изолятов  с  установленными  сполиготипами  по  ПДРФ­

VNTR древу  выявил, что  ветвь №2  (рис.  П.),  которая  содержала  83 изолята  (48%), 

видимо, образована Пекинскими штаммами. 

20 

Рисунок  11.  Распределение  лекарственной  устойчивости  и  места  жительства  по  ветвям ПДРФ­VNTR  древа.  Черными  квадратами  показаны  устойчивость  штамма  к противотуберкулезному препарату. В первой строке ­ устойчивость к изониазиду, во второй ­  к рифампицину,  в третьей ­  к стрептомицину,  в четвертой  ­  к канамицину, в пятой  ­  к этамбутолу, в шестой ­  к протионамиду. Красным цветом отмечено расположение на древе генотипов с МЛУ. Желтым отмечен кластер МЛУ­штаммов. Светло­синим цветом помечены изоляты,  совпавшие  по  генотипу,  профилю  лекарственной  устойчивости  и  району проживания. 

Исследование  распределения  лекарственной  устойчивости  по  ветвям 

объединенного  дерева  позволило  выявить  две  ветви,  в  которых  уровень  МЛУ  был 

статистически  выше,  чем  в среднем  по выборке  (89% и  100%, критерий  хи­квадрат, 

р<0,00001).  В  этих  ветвях  относительная  доля  МЛУ­штаммов  была  выше,  чем  в 

аналогичных ветвях, выявленных IS6110­ или VNTR­методами. 

Таким образом, для штаммов М. tuberculosis, циркулирующих  в Новосибирской 

области,  недостаточно  использовать  для  исследования  эпидемиологических  связей 

только  один  метод  типирования.  Необходимо  применять  не  менее  двух  методов 

генотипирования,  использующих  разные  системы  маркеров,  и  учитывать 

дополнительную  информацию  (место  проживание  больного,  спектр  лекарственной 

устойчивости и т.п.). 

21 

Выводы: 

1.  Установлено, что в 86% образцов чистых культур М.  tuberculosis результаты 

определения  устойчивости  «ТБ­биочипом»  совпадают  с  результатами 

определения микробиологическим методом. 

2.  Показано, что «ТБ­биочип» может быть использован для  выявления МЛУ­

штаммов,  так  как  91%  изолятов,  устойчивых  к  рифампицину,  также 

резистентен и к изониазиду. 

3.  Усовершенствована  технология использования биочипа за счет совмещения 

двух  последовательных  стадий  ПЦР  в  одной  пробирке,  многократной 

регенерации, позволяющая значительно удешевить процесс. 

4.  В  ходе  изучения  механизмов  возникновения  и  распространения  МЛУ 

штаммов  М.  tuberculosis  молекулярно­генетическими  методами 

установлено, что устойчивые  изоляты  селектировались  в ходе  лечения  и к 

2001­2003  гг  получили  значительное  распространение  среди  населения 

Новосибирской  области,  где  сформировали  очаги  заболеваемости  МЛУ 

формами туберкулеза. 

5.  Различными  методами  типирования  установлено,  что  в  Новосибирской 

области  доминируют  штаммы  Пекинского  семейства,  и  их  доля  превышает 

48%. 

6.  Выяснено,  что  Пекинские  штаммы,  циркулирующие  в  Новосибирской 

области,  генетически  неоднородны.  Впервые  комбинацией  двух  методов 

генотипирования ­  IS6110 и VNTR ­  среди Пекинских  штаммов  выявлены 

две  генетических  группы,  в  которых  частота  встречаемости  МЛУ  (89  и 

100% соответственно) была достоверно выше, чем в среднем по выборке. 

7.  Показано, что для выявления  эпидемиологических  связей  между больными 

недостаточно  использовать  только  один  из  методов  генотипирования.  В 

Новосибирской  области  комбинация  IS6110  и  MIRU  дает  достаточное 

разрешение  для  определения  эпидемиологических  связей  между 

конкретными больными. 

22 

Список статей, опубликованных по теме диссертации: 

1.  Мокеева  А.В.,  Орешкова  С.Ф.,  Попова  А.Г.,  Сивков  А.Ю.,  Туманов  Ю.В., 

Азаев М.Ш., Татьков СИ., Ильичев А.А. // Генетический  полиморфизм  клинических 

штаммов микобактерий туберкулеза, циркулирующих  на территории  Новосибирской 

области, Вестник РАМН, №1, 2005. с.20­23. 

2.  Татьков  СИ.,  Норкина  О.В.,  Филипенко  М.Л.,  Сивков  А.Ю.,  Болдырев  А.Н., 

Азаев М.Ш.,  Киншт  В.Н.,  Курунов  Ю.Н.,  Краснов  В.А.,  Медведева  Е.В., 

Баранова О.И.,  Ивлев­Дунтау  А.П., Боднев  С.А.,  Блинова  Л.Н., Пасечников  А.Д.  // 

Молекулярно­генетическая  характеристика  устойчивых  к  рифампицину  и/или 

изониазиду  изолятов  Mycobacterium  tuberculosis,  выделенных  в  Новосибирской  и 

Томской областях, Вестник РАМН, №7,2005, с. 26­36. 

3. Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Азаев М.Ш., Боднев С.А., Медведева Е.В., Баранова 

О.И.,  Ивлев­Дунтау  А.П.,  Блинова  Л.Н.,  Пасечников  А.Д.,  Татьков  СИ  // 

Определение  причин  распространения  MDR­штаммов  на  основе  анализа  популяции 

рифампицин­  и/или  изониазид­устойчивых  изолятов М.  tuberculosis. Молекулярная 

генетика, микробиология и вирусология, №2,2006, с. 20­25. 

4.  Татьков  СИ.,  Сивков  А.Ю.,  Болдырев  А.Н.,  Смирнова  О.Ю.,  Туманов  Ю.В., 

Медведева  Е.В.,  Ивлев­Дунтау  А.П.,  Стрелис  А.К.,  Новицкий  В.В.,  Уразова  О.И., 

Воронкова О.В. // Результаты применения  биочипов для определения  лекарственной 

устойчивости  М.  tuberculosis в Новосибирской  и  Томской  областях.  Молекулярная 

генетика, микробиология и вирусология, №4, 2007, с. 9­15. 

5.  Воронкова  О.В.,  Новицкий  В.В.,  Уразова  О.И.,  Татьков  СИ.,  Сивков  А.Ю., 

Рябова Е.А.,  Хасанова  P.P.  //  Генетическая  гетерогенность  штаммов  М. tuberculosis, 

циркулирующих  на  территории  Томской  области.  Эпидемиология  и 

Вакцинопрофилактика, №2,2007, с. 21­27. 

Список патентов, оформленных по теме диссертации: 

Болдырев  А.Н.  Сивков  А.Ю.  Татьков  СИ.  Способ  регенерации  нуклеотидных 

биочипов. Патент № 2270870 от 25.12.2003 

23 

Доклады и тезисы конференций: 

1.  Сивков  А.Ю.,  Болдырев  А.Н.,  Татьков  СИ.  Анализ  популяции  рифампицин 

устойчивых  изолятов  М.  tuberculosis модифицированным  методом  определения 

мутаций  в  гене  гроВ  с  помощью  биочипов.  Труды  конф.  «Межрегиональная 

научная  конференция  посвященная  100­летию  со дня рождения  академика  АМН 

СССР СП. Карпова», Томск 7­10 октября 2003 г. 

2.  Сивков  А.Ю.,  Цильковская  И.В.,  Болдырев  А.Н.,  Татьков  СИ.  Исследование 

филогенетических  связей  между  изолятами  М.  tuberculosis в  г.  Новосибирске  с 

помощью метода обратной IS6110 ПЦР. Труды конф. «Межрегиональная  научная 

конференция  посвященная  100­летию  со  дня  рождения  академика  АМН  СССР 

СП. Карпова», Томск 7­10 октября 2003 г. 

3.  Болдырев  А.Н.,  Сивков  А.Ю.,  Туманов  Ю.В.,  Татьков  СИ.  Использование 

полимеразной  цепной  реакции  для  одновременного  определения 

инфицированное™ пациента туберкулезом и устойчивости к рифампицину. Труды 

конф.  «Межрегиональная  научная  конференция  посвященная  100­летию  со  дня 

рождения академика АМН СССР СП. Карпова», Томск 7­10 октября 2003 г. 

4.  Сивков А.Ю., Болдырев А.Н., Азаев М.Ш., Медведева Е.В., Дунтау А.П., Туманов 

Ю.В., Татьков СИ.  Оценка эффективности  применения  биочипа для  определения 

изолятов  устойчивых  к  рифампицину.  Труды  конф.  «Межрегиональная  научная 

конференция  посвященная  100­летию  со  дня  рождения  академика  АМН  СССР 

СП. Карпова», Томск 7­10 октября 2003 г. 

5.  Сивков  А.Ю.  Анализ  популяции  рифампицин  устойчивых  изолятов  М. 

tuberculosis  модифицированным  методом  определения  мутаций  в  гене  гроВ  с 

помощью биочипов. XIV научная конференция­конкурс молодых ученых ГНЦ ВБ 

«Вектор» 26­27 июня 2003г. 

6.  Боднев  С.А.,  Сивков  А.Ю.  Метод  КбПОПЦР:  Быстрый  и  доступный  способ 

эпидемиологического  исследования  распространения  и  циркуляции  штаммов  М. 

tuberculosis.  XIV  научная  конференция­конкурс  молодых  ученых  ГНЦ  ВБ 

«Вектор» 26­27 июня 2003г. 

24 

7.  Сивков  А.Ю.,  Болдырев  А.Н.,  Ивлев­Дунтау  А.П.,  Блинова  Л.Н.,  Пасечников 

А.Д.,  Татьков  СИ.  Система  для  быстрого  выявления  лекарственно­устойчивых 

изолятов  М.  tuberculosis  с  помощью  биочиповой  технологии.  Симпозиум 

«Интегративная медицина в XXI веке», Судак 2004 г. 

8.  С.И.Татьков,  А.Н.Болдырев,  А.Ю.Сивков,  С.А.Боднев,  Г.А.Кузьмичева, 

О.Ю.Смирнова,  М.Ш.Азаев,  Ю.В.Туманов,  А.П.Дунтау,  Е.В.Медведева, 

Г.М.Лисиченко,  Ю.Н.Курунов,  В.А.Краснов,  О.И.Уразова,  А.К.Стрелис, 

О.В.Сурикова,  М.Л.Филиппенко,  Л.Н.Блинова,  А.Д.Пасечников  Генотипический 

анализ  MDR­штаммов  М.  tuberculosis,  распространенных  на  территории 

Новосибирской  и  Томской  областей.  Международная  конференция  «Развитие 

международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний», 

8­10 сентября 2004 г. ГНЦ ВБ «Вектор». 

9.  Sivkov A.Yu., Tatkov  S.I,  Evaluation  oligonucleotide  chips  for  detection rifampin and 

isoniazid  resistant  M.  tuberculosis 26lh  Annual  Congress  of  the  European  Society  of 

Mycobacteriology Istanbul, Turkey in June 26­29, 2005. 

10. СИ. Татьков, А.Ю. Сивков, Г.А. Кузьмичева,  О.Ю. Смирнова, М.Л. Филипенко, 

М.А.  Рот,  А.В.  Свистельник,  Г.М.  Лисиченко,  В.А.  Краснов,  K.D.  Eisenach 

Изучение  разнообразия  штаммов  М.  tuberculosis, распространенных  в  сельских 

районах  Новосибирской  области,  методами  RFLP6110,  MIRU  и 

сполиготипирования  //  Российская  научно­практическая  конференция 

«Генодиагностика  инфекционных  болезней»,  Новосибирская  обл.,  санаторий 

«Сосновка», 25­27 октября 2005 г. 

И.А.Ю.  Сивков, А.Н. Болдырев, Е.В. Медведева, А.П. Ивлев­Дунтау,  СИ.  Татьков 

Применение  олигонуклеотидных чипов для определения штаммов М.  tuberculosis, 

устойчивых  к рифампицину  и/или изониазиду  // Российская  научно­практическая 

конференция  «Генодиагностика  инфекционных  болезней»,  Новосибирская  обл., 

санаторий «Сосновка», 25­27 октября 2005 г. 

12. А.Ю. Сивков, А.Н. Болдырев, Е.В. Медведева, А.П. Ивлев­Дунтау, Л.Н. Блинова, 

СИ.  Татьков  Определение  причин  распространения  MDR­штаммов  на  основе 

анализа  популяции  рифампицин­  и/или  изониазид­устойчивых  изолятов  М 

tuberculosis  II  Российская  научно­практическая  конференция  «Генодиагностика 25 

инфекционных  болезней»,  Новосибирская  обл.,  санаторий  «Сосновка»,  25­27 

октября 2005 г. 

13.А.Ю.  Сивков,  О.Ю.  Смирнова,  М.Л.  Филипенко,  М.А.  Рот,  СИ.  Татьков. 

Исследование  структуры  популяции  микобактерий  туберкулеза  в  Новосибирской 

области  //  III  Российская  конференция  с  международным  участием  «Проблемы 

инфекционной  патологии  в  регионах  Сибири,  Дальнего  Востока  и  Крайнего 

Севера», г.Новосибирск, 27­29 сентября 2006 г. 

14. СИ.  Татьков,  А.Ю.  Сивков,  А.Н.  Болдырев,  О.Ю.  Смирнова,  Ю.В.  Туманов 

Результаты применения биочипов для определения лекарственной устойчивости М. 

tuberculosis  в  Новосибирской  и  Томской  областях//  III  Российская  конференция  с 

международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, 

Дальнего Востока и Крайнего Севера», г.Новосибирск, 27­29 сентября 2006 г. 

15.Воронкова  О.В.,  Новицкий  В.В.,  Уразова  О.И.,  Стрелис  А.К.,  Татьков  СИ., 

Сивков  А.Ю.,  Рябова  Е.А.,  Наследникова  И.О.,  Колоколова  О.В.  Особенности 

молекулярной  эпидемиологии туберкулеза  в Томской области // Сборник тезисов 

II  Российско­Германской  конференции  форума  Коха­Мечникова  9 ­ 1 2  сентября 

2007, Томск, с.8­9. 

16. Сивков  А.Ю.,  Болдырев  А.Н.,  Смирнова  О.Ю.,  Туманов  Ю.В.,  Татьков  СИ. 

Результаты  применения  биочипов  для  определения  лекарственной  устойчивости 

М.  tuberculosis  в  Новосибирской  и  Томской  областях  //  Сборник  тезисов  II 

Российско­Германской  конференции  форума  Коха­Мечникова  9 ­ 1 2  сентября 

2007, Томск, с.12­13. 

П.Татьков  СИ.,  Сивков  А.Ю.  Оценка  распространенности  генотипа  Beijmg 

микобактерий  туберкулеза  в  Новосибирской  области  и  его  вклад  в  формирование 

пула лекарственно­устойчивых изолятов // Сборник тезисов II Российско­Германской 

конференции форума Коха­Мечникова 9­12  сентября 2007, Томск, с. 14­15. 

18. Филипенко М.Л., Рот М., Штейгер Н., Татьков СИ., Сивков А.Ю. Сравнительный 

анализ  различных  методов  идентификации  штаммов  Mycobacterium  tuberculosis 

пекинской  семьи  //  Сборник  тезисов  II  Российско­Германской  конференции 

форума Коха­Мечникова 9­12  сентября 2007, Томск, с.238­239. 

26 

Сивков Антон Юрьевич 

Исследование распространенности  штаммов Mycobacterium  tuberculosis  с 

множественной лекарственной  устойчивостью в Новосибирской  области 

Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук 

Подписано в печать 10.11.2008. 

Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. 

Типография Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН