利用毛細管電泳分離羥基苯甲酸: 研究 pKa 值對分離的影響

指導老師 : 林萬寅 教授 郭家銘 老師 林似津 老師研究學生 : 一年誠班 16 彭冠嘉 一年誠班 20 楊陞

電泳簡介• 電泳 : 利用電壓分離分析物，由於各物質的遷移速率有差別，故電泳是分離物質的常用方法。

利用電泳進行DNA 定序

毛細管電泳（ Capillary electrophoresis ）簡介• 毛細管電泳 : 在毛細管中進行電泳，因移動速率不同而達到分離不同分子的目的。

內徑 : 50 m使用長度 : 50 cm

電泳 - 分子量對遷移速率影響

電泳 - 分子帶電量對遷移速率影響

+++ + ++

++

++ ++

+

+

速率正比於 帶電量 / 質量

使用毛細管的優點 :1.分離操作時間短 ( 最快幾秒內就完成 )

2.操作容易自動化3.樣品使用量少 , 溶劑消耗少→汙染較少4.分離效率高5.表面積大 , 散熱容易

毛細管電泳分離效率高毛細管電泳

壓力驅動( 一般是 HPLC)

EOF( 電滲透流 )

壓力

光源 (UV): 分析物吸收光，有吸收度可被偵測

偵測器

訊號較集中

管壁帶動

摩擦力或附著力有可能和其他訊號重疊

高壓電供應

+ ─+

電腦

偵測器

緩衝溶液

樣品槽

緩衝溶液

電泳示意圖緩衝溶液可以提供穩定的 ph 值

毛細管毛細管到樣品槽吸取樣品毛細管再到緩衝溶液去跑

毛細管內的遷移

-CD 的作用原理

+ =Analyte Cyclodextrin

有一些 OH 的官能基會有親水性

COOH

OH

COOH

OH

COOH

OH

2.97 4.06

9.92

4.48

9.32

羥基苯甲酸異構物

pKa1

分子量： 138

解離常數

pKa2

對para-

間meta-

鄰ortho-

水楊酸

pH 值對解離的影響HA↔H++A-

= log[A-][HA]

pH pKa-

-log [H+] – log [A-]/[HA] = -log Ka

⇒ pH- log [A-]/[HA] = pKa

Ka = [H+][A-]/[HA]

A + B C+D平衡常數 K = [C][D]/[A][B]

pH 值對解離的影響= log

[A-][HA]

pH pKa-3-hydroxybenzoic acid 的 pKa1 = 4.06 、 pKa2 = 9.92

當 pH=6 ，則不帶電與帶一負電的離子比例約為 1 : 100

當 pH=8 ， 則不帶電與帶一負電的離子比例約為 1 : 10000 帶一負電與帶二負電的離子比例約為 100 : 1

當 pH=10 ，則帶一負電與帶二負電的離子比例約為 1 : 1

當 pH=12 ，則帶一負電與帶二負電的離子比例約為 1 : 100

pH 值的變化

5 10

Abs

orba

nce

at 2

00 n

m /

mA

U

Migration Time / min

omp

o m p

pH6

12

7

8

9

1011

Buffer: 10 mM phosphate, + 21 kV, 200 nm

Sample: 10 ppm mix o-, m-, p-hydroxybenzoic acid

- +

pka1 p 4.48 m 4.06 o 2.97

pka2 m 9.92 p 9.32

5 10

Abs

orba

nce

at 2

00 n

m /

mA

U

Migartion Time / min

Buffer: pH 9, 10 mM phosphate, + 21 kV, 200 nm

Sample: 10 ppm mix o-, m-, p-hydroxybenzoic acid

[-CD]0 mM

1 mM

2 mM

3 mM

4 mM

5 mM

pm o

m po

β-CD 的影響

- +

結論1. 我們發現改變 pH 值 會造成遷移速度的改變甚至是異構物之間遷移順序的改變2. 加入 -CD 也會造成遷移順序的改變，這可能是因為不同異構物與 -CD 作用力有差異所造成

心得 : 我學到的事

致謝

台大化學研究所郭家銘博士生台大化學系林萬寅教授本校化學林似津老師

現在要先預祝大家…