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第六章 核酸化学Nucleic acid

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第一节 概述

核酸 (nucleic acid)

以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。

DNA （ Deoxyribonucleic acid) 脱氧核糖核酸 RNA （ Ribonucleic acid) 核糖核酸

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• 1868 年 Fridrich Miescher 从脓细胞中提取“核素” • 1944 年 Avery 等人证实 DNA 是遗传物质• 1953 年 Watson 和 Crick 发现 DNA 的双螺旋结构• 1966 年 Nirenberg 发现遗传密码• 1975 年 Temin 和 Baltimore 发现逆转录酶• 1981 年 Gilbert 和 Sanger 建立 DNA 测序方法• 1985 年 Mullis 发明 PCR 技术• 1990 年 美国启动人类基因组计划 (HGP) • 1999 年 中国加入人类基因组计划• 2001 年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架• Post-genome era/OMICS era

一、核酸的发现和研究工作进展

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二、核酸的分类及分布、功能

(deoxyribonucleic acid, DNA)

(ribonucleic acid, RNA)

脱氧核糖核酸

核糖核酸

90% 以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。

分布于胞核、胞液。

携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型 (genotype) 。

参与细胞内 DNA 遗传信息的表达。某些病毒 RNA 也可作为遗传信息的载体。

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第二节 核酸的分子组成

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一、元素组成主要元素组成： C 、 H 、 O 、 N 、 P(9~11%)

与蛋白质比较，核酸一般不含 S ，而 P 的含量较为稳定，占9-11% 。

二、基本构成单位：核苷酸 (nucleotide)

核苷酸由戊糖、磷酸和含氮碱三部分构成

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戊 糖 (pentose)

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1. 碱基 (base)

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胺式亚胺式互变异构

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酮式烯醇式互变异构

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碱基的结构特征碱基的结构特征

嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系，在紫外区有吸收（ 260 nm

左右）。

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2. 2. 核苷 核苷 (nucleoside)(nucleoside)

糖与碱基之间的 C-N 键，称为 C-N 糖苷键。

°ûà×ऺËÜÕ Äòà×ऺËÜÕÄñàÑßʺËÜÕÏÙàÑßʺËÜÕ

N

N

OH

HO

N

N

NH2

HO

N

N

OH

H2N

N

N

N

N

N

N

NH2

O

H

H

OH

H

OH

H

HOCH2 HOCH2 O

H

H

OH

H

OH

H

O

H

H

OH

H

OH

H

HOCH2 O

H

H

OH

H

OH

H

HOCH2

核糖核苷： AR, GR, UR, CR脱氧核苷： dAR, dGR, dTR, dCR

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3. 核苷酸 (ribonucleotide)

核苷和磷酸以磷酸酯键连接

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稀有核苷酸稀有核苷酸

核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。

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2 、稀有核苷酸：稀有碱基 / 核苷 / 核苷酸

3 、核苷酸的其他形式多磷酸核苷（ NDP 、 NTP)

环化核苷酸（ cAMP 、 cGMP 等）

辅酶或辅基（ NAD 、 NADP 、 FAD 、 CoA 等，均含有 AMP ）活性代谢物（ UDPG 、 CDP- 胆碱等）

1 、核苷酸的组成：含氮碱基、戊糖和磷酸。

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• ATP 分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。 ATP 水解时 , 可以释放出大量自由能。

• ATP 是生物体内最重要的能量转换中间体。 ATP 水解释放出来的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。

ATP

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cAMP 和 cGMP

cAMP(3’,5’- 环化腺苷酸 )

和 cGMP(3’,5’- 环化鸟苷酸 ) 的主要功能是作为细胞的第二信使。

cAMP 和 cGMP 的环状磷酯键是一个高能键。在 p

H7.4, cAMP 和 cGMP 的水解能约为 43.9 KJ/mol ，比 ATP 水解能高得多。

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第三节 核酸的分子结构第三节 核酸的分子结构

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一、一级结构（ primary structure ）一级结构是指核酸分子中核苷酸的排列顺序及连接方式。核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。1 、核苷酸的连接方式： 3, 5 磷酸二酯键2 、核酸的基本结构形式：多核苷酸链信息量： 4n

末端： 5’ 端、 3’ 端多核苷酸链的方向： 5’→3’

3 、表示方法：结构式、线条式、文字缩写

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碱基组成分析—— Chargaff 规则： [A] = [T] ；[G] [C]

碱基的理化数据分析： A-T 、 G-C 以氢键配对较合理 DNA 的 X- 线衍射图谱分析

DNA 双螺旋结构的研究背景

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二、 DNA 的空间结构1. DNA 的二级结构（ secondary structure ）(1) 碱基组成规则 (Chargaff 规则 )

[A]=[T] ， [G]=[C] ； [A]+[G]=[T]+[C]( 嘌呤与嘧啶的总数相等 )

有种属特异性无组织、器官特异性

不受年龄、营养、性别及其他环境等影响

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DNA 分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链 (简称 DNA 单链 )组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为 5′ 端→ 3′ 端，而另一条链的方向为 3′ 端→ 5′ 端。

(2) DNA 双螺旋 (double helix model) 结构要点

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嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成 90° 角。

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螺旋横截面的直径约为 2nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为 0.34 nm，每 10 个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈的高度）为 3.4 nm。

34Å

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维持两条 DNA 链相互结合的力是链间碱基对形成的氢键。碱基结合具有严格的配对规律 :A 与 T结合， G与 C结合，这种配对关系，称为碱基互补。A和 T之间形成两个氢键， G与 C之间形成三个氢键。

在 DNA 分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。

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螺旋表面形成大沟 (major g

roove) 及小沟 (minor groov

e) ，彼此相间排列。小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别 DNA 碱基序列的基础。

氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。

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其他螺旋形式

Z-DNA （左手双螺旋） A-DNA

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(3)DNA 双螺旋的稳定性

• DNA 双螺旋结构在生理条件下很稳定。• 维持这种稳定性的因素包括：两条 DNA 链之间形成的氢

键，碱基堆积力。• 双螺旋结构内部形成的疏水区，消除了介质中水分子对

碱基之间氢键的影响；• 介质中的阳离子（如 Na+、 K+和 Mg2+）中和了磷酸基团

的负电荷，降低了 DNA 链之间的排斥力等。• 改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。

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天然存在的 DNA 分子最显著的特点是很长，分子质量很大，一般在 106～ 1

010 。大肠杆菌染色体由 400万碱基对 (ba

sepair ， bp) 组成的双螺旋 DNA 单分子。其长度为 1.4×106nm ，相当于 1.4

mm ，而直径为 20nm ，相当原子的大小。黑腹果蝇最大染色体由 6.2×107bp 组成，长 2.1cm多瘤病毒的 DNA 由 5100bp 组成 ，长 1.7mm

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2.DNA 的三级结构

双螺旋进一步扭曲 , 形成一种比双螺旋更高层次的空间构象。包括：线状 DNA 形成的纽结、超螺旋和多重螺旋、环状 DNA 形成的结、超螺旋和连环等

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连环数 (L) ：一条链绕另一条链缠绕次数

扭转数 (T) ： DNA 双螺旋圈数

超螺旋数 (W) ：超螺旋数

L=T+W

10nt/圈为能量最低状态， <10 时形成右手（负）超螺旋；>10 时形成左手（正）超螺旋。

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3. DNA 在真核生物细胞核内的组装

核小体 (nucleosome) ： 由 DNA 和组蛋白构成。

DNA ：以左手螺旋缠绕在组蛋白上 ---1.8圈（ 146 bp)

组蛋白核心 ---八聚体 H2B ,H2A ,H3 ,H4

H1组蛋白在核小体之间的连接 DNA 上（ 54bp）

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DNA 的存在形式 --- 染色质（体）

7 fold

6 fold

40 fold

5 fold

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4. DNA 的功能

DNA 的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。

基因从结构上定义，是指 DNA 分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。

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三、 RNA 的分子结构

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1. RNA 的结构特点

• RNA 是单链分子，因此在 RNA 分子中，嘌呤的总数不一定等于嘧啶的总数。

• RNA 分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，不能形成双螺旋的部分，则形成单链突环。这种结构称为“发夹型”结构。

• 在 RNA 的双螺旋结构中，碱基的配对情况不象 DNA 中严格。 G 除了可以和 C 配对外，也可以和 U 配对。G-U 配对形成的氢键较弱。不同类型的 RNA, 其二级结构有明显的差异。

• tRNA 中除了常见的碱基外，还存在一些稀有碱基，这类碱基大部分位于突环部分 .

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2. 信使 RNA 的结构与功能

(1) 真核生物 mRNA 的结构特点

大多数真核 mRNA 的 5´ 末端均在转录后加上一个 7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的 C´2 也是甲基化，形成帽子结构： m7GpppNm- 。

2. 大多数真核 mRNA 的 3´ 末端在转录后加上一多聚腺苷酸 (polyA) 结构（ 20-250nt) 。

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mRNA 核内向胞质的转运mRNA 的稳定性维系翻译起始的调控

帽子结构和多聚 A尾的功能

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(2) 真核生物 mRNA 成熟过程

hnRNA (heterogeneous nuclear RNA)

Polycistronic mRNA

Prokaryote

Eukaryote

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（ 3 ） mRNA 的功能

把 DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，转录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。

DNA

mRNA

蛋白

转录

翻译

原核细胞

细胞质

细胞核

DNA

内含子外显子

转录

转录后剪接转运

mRNA

hnRNA

翻译蛋白

真核细胞

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3. tRNA 的结构与功能

(1) tRNA 的一级结构特点 含 10~20% 稀有碱基，如

DHU

3´ 末端为 - CCA-OH

5´ 末端大多数为 G

具有 TC

NH

NH

O

O

H

H

H

H

双氢尿嘧啶 (DHU) 假尿嘧啶 ()

次黄嘌呤 (I)

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(2) tRNA 的二级结构----- 三叶草形

氨基酸臂 DHU 环 反密码子环： 额外环 TΨC 环

与 mRNA 的三联体密码互补配对，称为反密码子（ anticodon ）

3` 末端的 CCA-OH 单链用于连接该 tRNA 转运的氨基酸

识别氨酰 -tRNA合成酶

核糖体识别结合位点

I

II

III

IV

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(2) tRNA 的三级结构----- 倒 L 型

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(3) tRNA 的功能：活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的合成。

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4. rRNA 的结构与功能

原核生物（以大肠杆菌为例） 真核生物（以小鼠肝为例）

小亚基 30S 40S

rRNA 16S 1542 个核苷酸 18S 1874 个核苷酸蛋白质 21 种 占总重量的 40% 33 种 占总重量的 50%

大亚基 50S 60S

rRNA 23S5S

2940 个核苷酸120 个核苷酸

28S5.85S

5S

4718 个核苷酸160 个核苷酸120 个核苷酸

蛋白质 33 种 占总重量的 30% 49 种 占总重量的 35%

核糖体的组成

(1)rRNA 的功能 :组成核蛋白体，作为蛋白质合成的场所。

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5. 其他小分子 RNA

除了上述三种 RNA 外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子 RNA ，统称为非 mRNA 小 RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs), 或非编码蛋白质的 RNA(non-coding RNA, ncRNA) 。 种类：核内小 RNA ；核仁小 RNA ；胞质小 RNA ；催化性小 RNA ；小片段干涉 RNA

功能：参与 hnRNA 和 rRNA 的加工和转运。 ncRNA 在在基因表达以及应激信号传导等方面起着重要的调节作用。因此，有人也将其称为调节 RNA （ regulatory RNA ）。

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小片段干扰 RNA （ siRNA ）：一些小的双链 RNA 可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使 mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为 RNA干扰（ RNA interference ， RNAi ，也译作 RNA干预或干涉）。

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RNAi 的作用机制：1 ）在起始步骤，生物宿主将外源基因表达的双链 RNA进行切割，产生具有特定长度（ 19-21

nt ）和序列的小片段 siRNA ；

2 ） siRNA 双链结合一个核酶复合物从而形成 RNA诱导沉默复合物（ RISC ）。 RISC通过碱基配对定位到同源 mRNA 转录本上，并在距离 siRNA3' 端 1

2 个碱基的位置切割 mRNA 。

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第四节 核酸的理化性质

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一、核酸的一般理化性质

1 、 DNA 白色纤维状固体， RNA 白色粉末状固体，都微溶于水，不溶于乙醇，因此常用乙醇来沉淀 DNA ； DNA溶液黏度大于 RNA ；

2 、 DNA难溶于 0.14mol/L 的 NaCl溶液，可溶于 1~2

mol/L 的 NaCl溶液， RNA 则相反，可据此分离二者；3 、特征颜色反应 D－核糖＋浓盐酸＋苔黑酚 绿色； D－ 2－脱氧核糖＋酸＋二苯胺 蓝紫色

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4 、 两性解离：核酸含酸性的磷酸基团，又含弱碱性的碱基，为两性电解质，可发生两性解离；核酸相当于多元酸， pI 1~2 。

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二、核酸的水解1 、酸水解糖苷键比磷酸酯键更易发生酸水解；嘌呤糖苷键酸中最易被打开

2 、碱水解糖苷键比磷酸酯键更易发生酸水解；由于 RNA 中 2‘-OH参与形成环磷酸酯， RNA更易发生碱水解

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3 、酶水解核酸酶的分类

底物：核糖核酸酶 (RNase) ，脱氧核糖核酸酶 (DNase)

作用方式：内切酶和外切酶

磷酸二酯键断裂方式：

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核糖核酸酶类

牛胰核糖核酸酶 （ RNase I)

Py Pu Py Py Pu Py

作用位点：嘧啶核苷 -3’-磷酸与其他核苷酸间的连键

核糖核酸酶 T1 （ RNase T1)作用位点： 3’ 鸟苷酸与其他核苷酸 5‘-OH 的连键

A G U G C A

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脱氧核糖核酸酶类

牛胰脱氧核糖核酸酶 （ DNase I)

将 dsDNA 或 ssDNA切成 5’- 磷酸为末端的寡聚核苷酸

限制性内切酶 (restriction endonuclease)

5’ GAATTC 3’

3’ CTTAAG 5’

EcoR I

E. coli strainEnzyme number

Hind II 5̀ G-T-Py-Pu-A-C C-A-Pu-Py-T-G 5̀

5̀ G-T-Py C-A-Pu + Pu-A-C

Py-T-G 5̀

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三、紫外吸收 最大吸收波长： 260nm 核酸定量分析 核酸定性分析

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1. DNA 或 RNA 的定量OD260=1.0 相当于

50μg/ml 双链 DNA

40μg/ml 单链 DNA （或 RNA ）20μg/ml寡核苷酸

2.判断核酸样品的纯度DNA纯品 : OD260/OD280 = 1.8

RNA纯品 : OD260/OD280 = 2.0

OD260 的应用

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四、变性、复性、分子杂交

1 、 DNA 变性（ DNA denaturation ）DNA 变性是指在理化因素作用下， DNA 分子中的氢键断裂，碱基堆积力遭到破坏，双螺旋结构解体，双链分开形成单链的过程。

方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。

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变性后其它理化性质变化： OD260增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲线改变；生物活性改变

DNA 变性的本质是双链间氢键的断裂 , 一级结构不变

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（ 1 ）增色效应： DNA 变性时其溶液 OD260增高的现象。

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当 DNA 的稀盐溶液加热到 80-100℃时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。

（ 2） DNA的热变性

融解温度（ melting temperature, Tm ） ：DNA 热变性过程中，紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度称 为 融 解 温 度 （ Tm ）或解链温度、变性温度。

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影响 Tm值的因素离子强度

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DNA 的性质和组成： GC 含量越高， Tm越大

（ G+C)% = （ Tm-69.3 ） ×2.44

在 pH7.0, 0.165 mol/L NaCl溶液中

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2. DNA 复性DNA 复性 (renaturation) 的定义 : 在适当条件下，变性DNA 的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。热变性的 DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火 (annealing) 。减色效应（ hypochromic effect ） : DNA 复性时，其溶液 OD260降低。

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DNA 复性过程中，如果将不同种类的 DNA单链分子或 RNA 分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基 配 对 ， 在适宜的条件（温度及离子强度）下，可以在不同的分子间形成杂化双链 (heteroduplex) 。这种现象称为核酸分子杂交。

核酸分子杂交 (hybridization)

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核酸分子杂交的应用

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第五节 核酸的研究方法

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一、核酸的分离提纯和定量测定1. DNA 的分离 真核生物中的染色体 DNA 常与碱性蛋白结合成核蛋白（ DNP ）形式存在于核内。 浓盐法： 用浓盐（ 1MNaCl ）提取出 DNP ； 用氯仿 / 异丙醇，除去蛋白质； 冷乙醇沉淀出 DNA ；

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2. RNA 的分离因为 RNase 无处不在而得 RNA提取分离更为困难。•所有玻璃器具都应高温灭菌，不能高温高压的用 0.1％焦碳酸二乙酯（ DEPC ）处理•破碎细胞时使用强变性剂，如胍盐，使酶失活；•在 RNA 反应体系内加入 RNA 酶的抑制剂；目前最常用的 RNA制备方法有两个： 1 ）用酸性胍盐 /苯酚 /氯仿抽提：少量制备 RNA 。 2 ）用胍盐 /氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心：大量制备 RNA

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3. 核酸的定量测定

定糖法 RNA ：核糖→ 糠醛 绿色物质（ 670-68

0nm ）

DNA ：脱氧核糖 + 二苯胺 兰色物质（ 595-620nm ）

苔黑酚

紫外吸收法

1 个 A～ 50μg/ml 双链 DNA

～ 40μg/ml RNA 或单链 DNA

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定磷法 核酸含磷量为 9.5%

1g 磷相当于 10.5g 核酸

琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭能插入 DNA 分子的碱基对间形成复合物 在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与 DNA 含量成正比

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二、核酸的沉降特性与超速离心

不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度离心可以将不同构象 DNA 、 RNA 与蛋白质区分开来。

石蜡油

蛋白质

开环 / 线性 DNA

环形 DNA

超螺旋 DNA 或 R

NA

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8M CsCl ， 45000 rpm ， 16h

密度梯度： 1.80g/ml→1.55g/ml

平衡时：浮力密度 =CsCl密度 =离心力

ρ=ρ0 +4.2ω2（ r2 - r02） × 10-10

ρ0：标准 DNA浮力密度

ρ ：浮力密度（未知）ω ：角速度（弧度 /秒） r ：样品到转轴的距离

核酸密度测定

G-C 含量与 DNA 的浮力密度之间关系

ρ=0.1 xG-C + 1.658

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三、核酸的凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳：用于大片段 DNA 的分离，精度低，但分离范围广；

聚丙烯酰胺凝胶电泳：小片段核酸分离

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Sanger测定 DNA 核苷酸序列的方法： DNA合成终止法（双脱氧 DNA 链合成终止法）。

四、核酸的核苷酸序列测定1.DNA 的酶法测定

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DNA 序列分析仪：

四色荧光基团标记的 dNTP

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2. DNA 的化学法测序：

由 Maxam 和 Gilbert所发明。 其基本原理是用特异的化学试剂作用于 DNA 分子中的不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用 4 组不同的特异反应，可使末端标记的 DNA 分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱

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4 组特异的反应如下：

（ 1 ） G 反应：用硫酸二甲酯 DMS 使鸟嘌呤上的 N7原子甲基化，加热引起鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在此处断裂

（ 2 ） G+A 反应：用甲酸使 A 和 G 嘌呤环上的 N原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂

（ 3 ） T+C 反应：用肼使 T 和 C 的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基

（ 4 ） C 反应：当有盐存在时，只有 C 与肼反应，并被哌啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂

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硫酸二甲酯（ G ）： *ACTTCG*ACTTCGACAG

甲酸（ G+A ）： *A*ACTTCG *ACTTCGA *ACTTCGACA*ACTTCGACAG

肼 /NaCl （ C ）： *AC *ACTTC*ACTTCGA C*ACTTCGACAG 肼（ C+T ）： *AC *ACT *ACT T *ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG

从下往上读： CTACGTA ，末端 G 不能读出。

32P *ACTTCGACAG

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五、聚合酶链式反应 (PCR)

1995 年 K.Mullis发明。基本步骤为：•设计一对引物以便有效扩增所需要的 DNA 序列，并尽量减少可能产生的非特异产物•优化反应体系：包括适量模板、引物、 4 种 dNTP 、 Taq

DNA 聚合酶和适量 Mg2+

•选择 3 个温度进行热循环：变性 94℃， 45－ 60s ；退火，根据引物的 Tm ， 1min ；延伸， 72℃， 1min 。循环•扩增完成后取出一定量的反应产物，检测扩增结果：先进行凝胶电泳，用溴化乙啶染色，紫外光下检测结果

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Thermal Cycler Steps

Cycling: Repeat steps 1 through 3 (20 - 40 times)

Extend primers, yielding new double-stranded DNA

Anneal primers to single-stranded DNA

Denature double-stranded DNA

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