СИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТЗАКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО «ВЕКТОР-БЕСТ»

Диагностика внутриутробных инфекций у новорожденных детей

методом полимеразной цепной реакции

Методические рекомендации для врачей

Томск, Кольцово2000

Автор–составитель:Малкова Елена Михайловна – д.м.н., старший научный со трудник

отдела ультраструктурных исследований и па то мор фо логии научно-ис-следовательского института молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Гришаева Ольга Николаевна – к.б.н., заведующая клинико-ди аг-нос тической лабораторией ЗАО «Вектор-Бест»

Под редакцией А.П. Помогаевой (д.м.н., профессора, зав. ка федрой детских инфекци-

онных болезней Сибирского государст вен ного медицинского университета)

Рецензенты:д.м.н., профессор К.В. Лавровак.м.н., доцент З.П. Кирьянова

Методические рекомендации одобрены Ученым Советом Сибирского госу-дарственного медицинского университета (14.03.2000 г.)

Методические рекомендации предназначены для практикую щих врачей, клинических ординаторов и интернов.

_________________________________________________________________________Подписано в печать 03.06.15. Бумага офсетная. Формат 60×84/16.

Усл.-печ. л. 4,42. Доп. тираж 1 000 экз._________________________________________________________________________

Отдел оперативной печати ЗАО «Вектор-Бест».630559 Новосибирская обл., п. Кольцово, а/я 121.

3

Основные представления о внутриутробных инфекциях

Внутриутробные инфекции (ВУИ) в настоящее время являют-ся наиболее актуальной и дискуссионной проблемой современной неонатологии. Новые вопросы в диагностике и лечении инфекци-онных процессов перинатального периода возникают при приме-нении современных методов диагностики, использующих молеку-лярно-биологические и генные технологии.

К внутриутробным относят инфекционные процессы, которые возникли вследствие анте- или интранатального инфицирования. Количество возбудителей инфекционных заболеваний, способных к вертикальной передаче, практически не ограничено.

Внутриутробные инфекции занимают от 10 до 61% в струк-туре младенческой смертности и относятся к группе заболеваний, диагностика которых связана с определенными трудностями. В связи с этим до настоящего времени не существует четких данных о частоте внутриутробных инфекций. Отсутствие специфических клинических проявлений, возможность появления вирусно-вирус-ных, вирусно-бактериальных и вирусно-бактериально-грибковых ассоциаций делают проблему точной верификации возбудителя и определения адекватных подходов к лечению полиэтиологичной перинатальной инфекции особенно актуальной.

4

Метод ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний

Для правильного и своевременного лечения заболеваний, вызываемых различными инфекционными агентами, необходи-мо установление точного диагноза. Для решения этой проблемы в последние годы применяются современные методы молекулярной биологии. В настоящее время метод амплификации нуклеиновых кислот полимеразной цепной реакцией (ПЦР) достаточно широко используется в практической медицине.

Выделение геномов инфекционных агентов с использовани-ем ПЦР является одним из наиболее достоверных методов лабо-раторной диагностики инфекционных заболеваний. Известно, что при проведении серологической диагностики возможно полу-чение ложноположительных результатов за счет существования антигенных перекрестов между белками различных вирусов и между вирусными и клеточными белками. Кроме этого у ново-рожденных продукция антител к определенным антигенам мо-жет отсутствовать. Специфичность диагностики методом иммуно-флюоресцентного анализа (ИФА) при исследовании клинических образцов у новорожденных детей часто снижается из-за присутс-твия различных контаминантов, а его чувствительность может оказаться недостаточной для обнаружения антигенов с низким уровнем продукции.

Метод ПЦР включает три стадии. На первой стадии при тем-пературе 94°С (или выше) происходит денатурация двойной цепи исследуемой ДНК (стадия денатурации). На второй стадии два олигонуклеотида-праймера, строго специфичные (гомологичные) к определенным участкам антипараллельных цепей исследуемой ДНК, связываются (образуют гибриды с помощью водородных свя-зей) с этими участками ДНК (стадия отжига). На третьей стадии при температуре 70–72°С с участием термофильной ДНК-поли-меразы и дезоксинуклеозид-5ў-трифосфатов происходит синтез новых цепей ДНК. Инициация синтеза ДНК происходит в местах связывания олигонуклеотидов-праймеров с исследуемой ДНК, матрицей для синтеза служат исходные цепи ДНК (стадия по-лимеризации). Таким образом, за цикл (три стадии) происходит удвоение каждой из двух антипараллельных цепей ДНК. Теоре-тически, при проведении 20 таких циклов происходит увеличение количества исходной ДНК примерно в миллион раз.

5

Основным достоинством метода является чрезвычайно вы-сокая чувствительность анализа – до 1 копии геномной ДНК возбудителя инфекции в исследуемой пробе в «nested»–вариан-те ПЦР (с «внутренней» и «внешней» парами олигонуклеотидов-праймеров). Чувствительность выявления ДНК в ПЦР с одной парой праймеров составляет обычно 30–100 копий генома в ис-следуемой пробе.

Возможности, заложенные в методе ПЦР, позволяют дости-гать максимальной специфичности анализа, то есть отсутствия перекрестных реакций со сходными микроорганизмами, способ-ности выявлять ДНК конкретного инфекционного агента в при-сутствии ДНК других микроорганизмов и ДНК организма-хозяи-на, а также проводить генотипирование. Соответствующий выбор олигонуклеотидов-праймеров, определяющих, в основном, специ-фичность анализа, позволяет ставить методики одновременного выявления ДНК близкородственных микроорганизмов. Досто-инством метода является то, что вследствие химического сродс-тва нуклеиновых кислот различных возбудителей, для диагнос-тики практически всех инфекционных заболеваний могут быть использованы один набор оборудования и незначительно отли-чающиеся (в основном структурой олигонуклеотидов-праймеров) наборы реактивов. Подготовка пробы и постановка анализа яв-ляются универсальной процедурой. К настоящему времени метод автоматизирован и позволяет получать результаты анализа в те-чение одного рабочего дня.

Область применения метода ПЦР в клинической диагностике:– ранняя диагностика инфекционных заболеваний у серонега-

тивных пациентов, когда лечение наиболее эффективно;– выявление персистирующих, латентных и рецидивирующих

форм инфекций;– контроль проведения лечения;– диагностика оппортунистических инфекций, часто протека-

ющих на фоне иммунодефицита, вследствие чего постановка диагноза только по результатам серологических исследований затруднена, из-за имеющихся несоответствий между парамет-рами иммунного ответа и течением заболевания;

– уточнение сомнительных результатов серологических исследо-ваний;

– эпидемиологические исследования;

6

– выявление наиболее патогенных штаммов инфекционных аген-тов;

– исследования инфекционности пулированных образцов крови и ее продуктов, применяемых в клинике;

– определение резистентности к лекарственным препаратам.Методы ДНК-диагностики незаменимы в пренатальной диа-

гностике наследственных заболеваний (муковисцидоза, фенилке-тонурии, гемофилии и пр.), а также при установлении отцовства.

Следует отметить, что широкое использование ДНК-диагнос-тики ни в коей мере не отменяет методы иммунохимических иссле-дований (ИФА, РИФ и др.), а дополняет их. Комплексное обследо-вание пациента различными методами дает возможность врачу по-лучить более полную информацию как о наличии инфекционного агента, так и об иммунном статусе пациента. Это позволяет более точно ставить диагноз и назначать соответствующее этиотропное лечение с последующим его контролем.

7

Организация работ по выявлению ДНК методом ПЦР

В связи с высокой чувствительностью метода существует опасность получения ложноположительных результатов в силу переноса через предметы и реагенты ДНК-матрицы и продуктов ПЦР- ампликонов, получаемых в больших количествах во многих пробирках в течение ежедневной работы. Причинами получения ложноположительных результатов являются три вида контами-наций:1. Перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обра-

ботки клинических образцов или при раскапывании реакцион-ной смеси), приводящая к появлению спорадических ложнопо-ложительных результатов;

2. Контаминация рекомбинантными плазмидами, содержащими клонированные последовательности детектируемого гена, час-то использующимися в качестве положительного контроля;

3. Контаминация продуктами амплификации (ампликонами) является наиболее частой причиной ложноположительных результатов, поскольку в процессе ПЦР-генодиагностики амп-ликоны накапливаются в больших количествах и очень легко переносятся с аэрозолями и через приборы.

Вследствие этого при проведении работ с использованием ме-тода ПЦР необходимо соблюдать следующие правила:

1. Территориально разделять различные стадии анализа, раз-мещая их в различных помещениях:

– помещение для подготовки проб;– помещение для постановки ПЦР;– помещение для детекции результатов ПЦР;– помещение для подготовки реагентов (пре-ПЦР, биохими-

ческая).2. Для каждой стадии анализа должен быть свой комплект

лабораторной одежды, автоматических пипеток, вспомогательных материалов и оборудования.

3. Работу на всех этапах проводить только с использованием одноразовых расходных материалов: пробирок, наконечников для пипеток и пр.

4. Необходима постоянная постановка отрицательных конт-рольных образцов как на реагенты для подготовки проб (выделе-ние ДНК), так и на реагенты для проведения ПЦР.

8

5. Работу должен выполнять специально обученный персонал, обладающий достаточной квалификацией в данной области.

К настоящему времени требования к организации работ в ПЦР-лабораториях обобщены и сформулированы в нормативных документах «Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимераз-ной цепной реакции. Основные положения» (Госсанэпиднадзор, 1995), и «Требования к планировке помещений и режиму работы в ПЦР-генодиагностической лаборатории» (методические рекомен-дации) (ЦНИИЭ, РНИПЧИ, ГИСК им. Л.А.Тарасевича), на осно-вании которых лицензируется деятельность таких лабораторий.

Эффективный путь в использовании и развитии методов гено-диагностики – это создание централизованных ПЦР-лабораторий, оборудованных и организованных в соответствии с необходимыми требованиями, и имеющих квалифицированный персонал.

Для получения правильных результатов ПЦР-анализа весь-ма важна организация забора клинических образцов, их хранения и транспортировки. Неправильный забор образцов, некачест-венное хранение и доставка может привести как к ложно-положительным, так и ложноотрицательным результатам, несмотря на безупречно проведенную процедуру анализа.

При различных инфекциях для анализа используют следую-щий клинический материал: кровь, сыворотку крови, форменные элементы крови, мочу, слюну, соскобы и мазки со слизистых, лик-вор, слезную жидкость, содержимое везикул, биоптаты органов и тканей.

Для исключения контаминации проб их забор производят только одноразовым инструментарием (шприцы, зонды, щеточки и пр.). Взятый материал помещают в одноразовые пробирки (типа «Эппендорф») или тщательно вымытые (хромовой смесью) стек-лянные флаконы, в некоторых случаях, в транспортную среду, пре-доставляемую ПЦР-лабораторией. При необходимости переноса образца используют автоматические микропипетки со сменными одноразовыми наконечниками. Каждый образец, для исключения взаимной контаминации, хранят и транспортируют в отдельном полиэтиленовом пакете.

Хранение образцов: до транспортировки в ПЦР-лаборато-рию отобранный биоматериал хранят при температуре 2–4°С не более 48 ч; для более длительного хранения (до 1 месяца) исполь-

9

зуют максимально низкую температуру. Необходимо минимизиро-вать время от забора образца до постановки ПЦР-анализа.

Транспортировка образцов осуществляется в сумках-холо-дильниках, термоконтейнерах, термосах с термопакетами, льдом или сухим льдом.

10

Диагностическое значение выявления ДНК возбудителей внутриутробных инфекций

в неонатальном периодеВерификация возбудителей инфекционных заболеваний в

педиатрической практике определяет тактику лечения пациента. Представление о некоторых видах бактерий как о непатогенных недопустимо, когда речь идет о плоде или новорожденном (Дэвис П.А., Готефорс Л.А., 1987).

Наиболее распространены среди патогенов, вызывающих раз-витие внутриутробных инфекций у новорожденных детей, вирус простого герпеса (ВПГ), цитомегаловирус (ЦМВ), вирус гепатита В (ВГВ), а также возбудителей хламидиоза (Chlamydia trachomatis), микоплазмоза (Mycoplasma hominis) и уреаплазмоза (Ureaplasma urealyticum). При одновременном обследовании методом ПЦР 180 новорожденных детей, находившихся на лечении в инфекци-онном отделении патологии новорожденных и недоношенных де-тей муниципальной детской больницы № 2 г. Новосибирска, были получены результаты, представленные в таблице 1.

Моноинфекции составили 40,4% от всего исследованного мате-риала, в 21,8% случаев в исследованных образцах выявлялась ДНК двух и более возбудителей. В 37,8% наблюдений результаты ПЦР были отрицательными в отношении исследованных инфекций.

11

Таблица 1Частота обнаружения ДНК возбудителей

у новорожденных детей методом ПЦР

Выявлена ДНК возбудителей Количество (в процентах)

Отрицательный результат 37,8

Моноинфекции:

ЦМВ 9,4

ВПГ 5,5

ВГВ 4,4

Mycoplasma hom. 6,6

Chlamydia trach. 12,2

Ureaplasma ureal. 0,6

Toxoplasma gondii 1,7

Смешанные инфекции:ВПГ + ВГВ 1,7

ВПГ + C.trachomatis 1,7

ВПГ + ЦМВ 2,2

ВПГ + ВГВ + C. trachomatis 1,1

ВПГ + C. trachomatis + M.hominis 1,7

ВПГ + ЦМВ + M. hominis 1,1

ВПГ + C.trachomatis + U. urealyticum 0,6

ВПГ + ЦМВ + M. hominis + C. trachomatis 1,1

ЦМВ + ВГВ 2,7

ЦМВ + M. hominis 1,1

ЦМВ + C. trachomatis 0,6

ЦМВ + C. trachomatis + U. urealyticum 0,6

ЦМВ + ВГВ + C.trachomatis 0,6

ВГВ + C. trachomatis 1,1

C. trachomatis + U. urealyticum 1,1

C. trachomatis + M. hominis 1,7

M. hominis + U. urealyticum 0,6

ВГВ + ВГС + M. hominis + C. trachomatis 0,6

Всего 100

12

Диагностическое значение выявления ДНК вируса гепатита В в неонатальном периоде

При исследовании этиологии внутриутробной инфекции у новорожденных детей возможно обнаружение ДНК ВГВ. Течение беременности осложняется возникновением угрозы прерывания, анемии, фетоплацентарной недостаточности, внутриматочной ин-фекции, хронической внутриутробной гипоксии плода, гестозом. Среди соматических заболеваний у женщин часто наблюдается са-харный диабет, хронический пиелонефрит, нейро-циркуляторная дистония. Отмечается патологическое течение родов

Среди детей, выделяющих ДНК ВГВ, тяжесть состояния при рождении обусловливается аспирацией околоплодных вод, асфик-сией в родах, развитием синдрома дыхательных расстройств (СДР) и симптомов интоксикации. Желтушность кожных покровов появ-ляется в течение первых двух суток жизни, однако уровень били-рубина не достигает критических цифр, не повышается уровень аминотрансфераз. Течение желтухи затягивается до 2-х месяцев. В общем анализе крови определяется умеренный лейкоцитоз, эо-зинофилия, лимфоцитоз.

При одновременной детекции ДНК ВГВ и ВПГ дети рожда-ются доношенными, при достаточном гестационном сроке, часто в состоянии асфиксии. В клинической картине преобладают симп-томы интоксикации, СДР, отмечается раннее появление желтухи и гепатоспленомегалии. Печень выступает из-под реберного края на 4,5–6,0 см, селезенка на 1,5–6,0 см. Повышается уровень ами-нотрансфераз. В общем анализе крови отмечается анемия, тром-боцитопения, лейкопения, лимфоцитоз. При выделении ДНК ВГВ и ВПГ трудно дифференцировать каким именно вирусом вызвано поражение печени и развитие фетального гепатита. Известно, что при внутриутробном герпесе часто развивается острый гепатит с гигантоклеточным метаморфозом гепатоцитов и купферовских клеток, поражение печени может иметь характер хронического ге-патита с исходом в мелкоузловой цирроз (Цинзерлинг А.В., Инди-кова М.Г., 1988; Hufert F.T. et al., 1995).

При выделении ДНК ВГВ и ЦМВ, а также сочетании их с хламидиозом, и одновременном выделении ДНК ВПГ и хламиди-оза, прослеживается тенденция к невынашиванию беременности (срок гестации 34-36 нед). В клинической картине преобладает СДР, рано появляется желтушное окрашивание кожных покровов

13

и выраженные признаки поражения центральной нервной сис-темы. Гепатоспленомегалии и повышения уровня аминотрансфе-раз не отмечается.

Мальчик Д. родился от второй беременности, протекав-шей с обострением хронического пиелонефрита, длительно текущим гестозом, внутриматочной инфекцией, фетоплацен-тарной недостаточностью и внутриутробной гипоксией плода. Мать ребенка работает врачом-стоматологом (группа риска по инфицированию ВГВ). Роды 1, самопроизвольные в 40 нед. В родах – преждевременное излитие околоплодных вод, вторич-ная слабость родовой деятельности. Масса ребенка 4150 г, дли-на 54 см. При рождении выявлена болезнь Дауна. В родильном доме отмечались проявления гнойного конъюнктивита, кожно-геморрагический синдром, желтуха до II степени, систоличес-кий шум в сердце. При поступлении в отделение ребенок наблю-дался с диагнозом: Болезнь Дауна. ВПС НК IIБ ст. Внутриут-робная инфекция: двусторонняя пневмония, тяжелая степень тяжести, ДН III ст.; двусторонний гнойный конъюнктивит; молочница. Гипотрофия II ст. Ребенок находился в отделении в течение 13 дней. При ПЦР-анализе выделена ДНК ВГВ, HBsAg – отрицательный.

Состояние ребенка было тяжелым, он прогрессивно терял в весе (отмечался выраженный синдром рвоты и срыгиваний), желтуха уменьшилась и к 14 дню жизни купировалась. Однако нарастали легочно-сердечная и острая почечная недостаточ-ность. В возрасте 18 дней ребенок умер. Основной причиной смерти послужила болезнь Дауна в сочетании с врожденным пороком сердца и течением двусторонней гнойной пневмонии. При исследовании печени выявлены дистрофия и некроз гепа-тоцитов, полиморфноклеточная инфильтрация и склероз, характерные для хронического гепатита. Можно предполо-жить, что острый период гепатита протекал во время фе-тального периода.

Отсутствие HBsAg в крови беременных женщин можно объ-яснить недостаточной чувствительностью иммуноферментного анализа. Детекция ДНК ВГВ у новорожденных детей методом ПЦР может соответствовать или носительству вируса, или ла-тентному течению инфекции. Среди путей инфицирования ВГВ известна вероятность интра- и постнатального инфицирования

14

новорожденных детей при использовании препаратов, изготов-ленных из донорской крови.

Проведение выборочного исследования препаратов цельной крови, отмытых эритроцитов и свежезамороженной плазмы пока-зало их инфицированность различными вирусами. Всего исследо-вано 35 образцов, из них в 71,4% обнаружено присутствие ДНК ВГВ, ВПГ и ЦМВ, РНК вируса гепатита С (табл. 2 ).

Таблица 2 Выявление ДНК и РНК вирусов в образцах препаратов,

приготовленных из донорской крови (в абсолютных цифрах и процентах)

Результаты ПЦР-анализаКоличество образцов

в абс. цифрах в процентах

ВГВ 1 2,85

ВГС 9 25,7

ВПГ 2 5,7

ВГВ + ВПГ 2 5,7

ВГВ + ВГС 3 8,6

ВГВ + ВГС + ЦМВ 1 2,85

ВГС + ВПГ 2 5,7

ВГС + ЦМВ 5 14,3

отрицательные 10 28,6

Всего: 35 100

Использование в лечении новорожденных детей препаратов, изготовленных из донорской крови, значительно повышает риск постнатального инфицирования, изменяющего клиническую кар-тину внутриутробных инфекций и сопутствующих соматических заболеваний. Введение новорожденным детям препаратов, приго-товленных с использованием донорской крови, должно проводится по строгим показаниям и иметь разумные ограничения.

15

Диагностическое значение выявления ДНК вируса простого герпеса в неонатальном периоде

Герпес является самой распространенной хронической ви-русной инфекцией человека, существующей в организме пре-имущественно в латентной форме и протекающей у беременных женщин в бессимптомной форме. Из семейства герпевирусов па-тогенными для человека являются вирусы простого герпеса ти-пов 1 и 2, а также вирусы герпеса 3 (вирус ветряной оспы – гер-пес зостер), 4 (вирус Эпштейна-Барр) и 5 (вирус цитомегалии). Наибольшее значение по распространенности и тяжести вызы-ваемых ими поражений имеют вирусы простого герпеса. Факти-ческая частота неонатального герпеса остается неясной, однако очень высоки показатели смертности детей в этом возрастном периоде (Jones C.L., 1996).

Возможно трансплацентарное проникновение ВПГ в организм плода. Внутриутробный герпес часто сопровождается рождением недоношенного ребенка, при этом ВПГ обычно вызывает клини-чески выраженное заболевание новорожденных. По клиническим проявлениям выделяют диссеминированную (генерализованную) и локализованную (кожную, глазную, оральную, энцефалитичес-кую, с поражением печени) формы герпеса. Кроме этого, пораже-ние кожи при внутриутробном герпесе может проявляться в виде буллезного эпидермолиза.

У доношенных детей, выделяющих ДНК ВПГ из крови, при рождении отмечается синдром нарушенной адаптации, хрони-ческая внутриутробная гипоксия плода, аспирация околоплод-ных вод. Ухудшение состояния происходит в течение 1–2-х суток жизни и сопровождается развитием СДР, ранним появлением желтухи (до II–III степени), умеренной гепатомегалией, развити-ем симптомов интоксикации и нарушениями гемоликвородина-мики. Впоследствии развивается пневмония со среднетяжелым или тяжелым течением.

У недоношенных детей, выделяющих ДНК ВПГ из крови, со-стояние при рождении тяжелое или очень тяжелое. В клиничес-кой картине преобладают выраженный СДР, нередко требующий проведения искусственной вентиляции легких, желтуха, измене-ния со стороны нервной системы, проявляющееся в повышенной возбудимости, отказе от еды, судорогах, гипертензионно-гидроце-фальном синдроме. В дальнейшем у таких детей могут отмечаться

16

тяжелая энцефалопатия с развитием микроцефалии или гидро-цефалии, отставание в психическом развитии и явления детского церебрального паралича.

Для общего анализа крови характерны эозинофилия и моно-цитоз, реже развиваются лейкоцитоз, тромбоцитопения и анемия. При выделении ДНК ВПГ из мочи отмечается протеинурия, деск-вамация эпителия почечных канальцев, цилиндрурия.

Сочетанная детекция ВПГ и ЦМВ клинически проявляется в раннем неонатальном периоде развитием двусторонней пнев-монии, но течение заболевания носит затяжной, вяло текущий характер. Нередко родители обращаются к врачу после 1 месяца жизни с жалобами на длительно текущую желтуху, срыгивания, недостаточную прибавку в весе. Сочетание ВПГ и ЦМВ представ-ляет собой пример развития сочетанных инфекций, когда один из возбудителей препятствуют развитию другого. Манифестация ин-фекционного процесса может произойти при присоединении бак-териальной инфекции.

Детекция ДНК ВПГ (в сыворотке крови) и C.trachomatis (в моче) сопровождается патологическим течением беременности (угроза самопроизвольных родов, хроническая внутриматочная инфекция, гестоз, фетоплацентарная недостаточность) и родов (преждевременные роды, оперативные роды), тяжелым или сред-нетяжелым состоянием детей при рождении. В клинической кар-тине отмечается развитие СДР и ранней желтухи, перинатальное поражение центральной нервной системы. В общем анализе крови выявляются тромбоцитопения, лейкоцитоз, эозинофилия; в общем анализе мочи – протеинурия.

Наибольшие трудности в клинической диагностике и опреде-лении лечебной тактики вызывает сочетание инфекционных про-цессов и тяжелой врожденной патологии, в частности, врожденных пороков сердца.

Девочка К. родилась с массой 3260, длиной 51 см. Матери ре-бенка 29 лет, в соматическом анамнезе: добавочная хорда в по-лости левого желудочка, пролапс створок митрального клапана. Беременность II, роды 1. В первой половине беременности жен-щина перенесла ангину с лихорадкой. Во второй половине бере-менности диагностирован хламидиоз, бактериальный кольпит, хроническая внутриматочная инфекция, сочетанный поздний гестоз, хроническая вторичная субкомпенсированная фетопла-

17

центарная недостаточность. Роды в 39–40 недель, самопро-извольные. Оценка по шкале Апгар 7 / 7 баллов. В родовом зале отмечался разлитой цианоз кожных покровов и видимых слизис-тых оболочек. Дыхание 46 в 1 минуту, пульс 154 в 1 минуту. Аус-культативно: дыхание жесткое, хрипы не выслушивались; тоны сердца приглушены, акцент II тона и короткий систолический шум с эпицентром в третьем межреберье. Правые отделы сердца увеличены. Печень выступала из-под реберного края на 2,5 см. В дальнейшем состояние ребенка было очень тяжелым, сохранял-ся разлитой цианоз кожных покровов; одышка в покое достигала 74–82 дыхательных движений в 1 минуту; пульс 144–146 в 1 ми-нуту; печень выступала из-под реберного края на 4 см, селезенка – на 1 см. Отмечались проявления перинатальной энцефалопа-тии гипоксически-травматического генеза с преобладанием син-дрома гиповозбудимости. При проведении эхокардиографии выяв-лена транспозиция магистральных сосудов. При рентгенографи-ческом исследовании – двусторонняя мелкоочаговая пневмония, натальная травма шейного отдела позвоночника (дислокация С3 кпереди и отек мягких тканей). В общем анализе крови: лей-коцитоз (до 36,2×103 ), тромбоцитопения, ретикулоцитоз, эози-нофилия, сдвиг лейкоцитарной формулы влево; в общем анализе мочи: протеинурия. При ПЦР диагностике выявлены ДНК ВПГ в крови и C.trachomatis в моче. Комплексное лечение привело к стабилизации состояния ребенка. Учитывая наличие тяжелого порока сердца, родители ребенка настояли на проведении опера-ции. Девочка умерла в возрасте 19 дней при проведении коронаро-графии в специализированном лечебном учреждении.

При выделении ДНК ВПГ в сочетании с C.trachomatis и M.hominis у новорожденных детей отмечается неблагоприятное течение беременности у матерей с развитием фетоплацентраной недостаточности, гестоза, внутриматочной инфекции. Дети рожда-ются недоношенными, при сроке беременности 35–37 недель. Со-стояние при рождении средней степени тяжести. В клинической картине преобладает раннее и затяжное развитие желтухи, СДР, нарушения гемоликвородинамики. Дети длительное время нахо-дятся на лечении в стационаре прежде чем наступает клиническое улучшение.

Мальчик Ш., родился с массой 2900, длиной 49 см . Матери ребенка 28 лет, больна хронической пневмонией, хроническим

18

гастритом, хроническим пиелонефритом, вегето-сосудистой дистонией; отцу 34 года, болен туберкулезом легких. Беремен-ность шестая, два ребенка в семье умерли от врожденных поро-ков развития, один – от кишечной инфекции; одна беременность закончилась медицинским абортом. В течение настоящей бе-ременности отмечалась угроза самопроизвольного прерывания в 7, 16 и 32 недели; хроническая внутриматочная инфекция (кандидоз, гарднереллез); анемия; поздний гестоз; хроническая фетоплацентарная недостаточность; хроническая внутриут-робная гипоксия плода. Роды 4, программированные с примене-нием метода Крестеллера в 37 недель, осложнились травмой родовых путей I–II степени, двукратным нетугим обвитием пу-повины. Плацента 20,0×23,0 см, отечная, с кальцинатами. Пу-повина 75 см. Оценка по шкале Апгар 8/9 баллов. Состояние ре-бенка при рождении средней степени тяжести. С первых суток жизни появились срыгивания, обильное серозное отделяемое из носа, субиктеричность кожных покровов, систолический шум. На четвертый день жизни отмечался подъем температуры до 39,0°С. Во время нахождения в отделении сохранялись постоян-ные срыгивания, выраженное беспокойство, длительная жел-туха, а затем постоянный серый колорит кожных покровов, плоская весовая кривая. Реализация внутриутробной инфекции происходила в виде конъюнктивита и двусторонней пневмонии. При ПЦР-диагностике в крови выделены ДНК ВПГ, хламидий и микоплазм, кроме этого в моче выделена ДНК C.trachomatis. В общем анализе крови отмечались анемия, умеренный лейкоци-тоз, токсическая зернистость нейтрофилов, СОЭ – 36 мм/час. После получения результатов ПЦР в комплексное лечение были включены эритромицин и виферон. Положительная динамика в состоянии ребенка наметилась через 5 дней от начала лече-ния, в дальнейшем состояние ребенка стабилизировалось, выпи-сан домой с улучшением.

При детекции ДНК ВПГ, ЦМВ и M.hominis не определяется закономерности в течении заболевания и путях реализации внут-риутробной инфекции, так же как при одновременной детекции ДНК ВПГ, ЦМВ, хламидий и микоплазм. Как правило, развива-ются двусторонняя полисегментарная пневмония, гнойный конъ-юнктивит, длительно текущая конъюгационная желтуха и энце-фалопатия.

19

Мальчик Ж. родился в одном из районов области. Семья со-циально неблагополучная, роды домашние, сведений о течении беременности и родов не получено. Масса ребенка при рождении 2550, длина 50 см. Поступил в отделение в возрасте 1 месяц в очень тяжелом состоянии с массой тела 2300: сонливый, сосал вяло, срыгивал; кожные покровы серого цвета, тургор тканей значительно снижен, подкожножировой слой не определяется; дыхание жесткое 60–72 в 1 минуту; тоны сердца значительно приглушены, выслушивался систолический шум; живот вздут, печень выступала из-под реберного края на 3,5–4,0 см, селезенка – на 1,0–1,5 см. Во время пребывания в отделении диагностирована двусторонняя мелкоочаговая пневмония, гнойный менингоэнце-фалит, вентрикулит. При бактериологическом посеве из лик-вора выделена E.coli. При проведении компьютерной томографии выявлено расширение желудочковой системы (водопровод мозга и четвертый желудочек определялись в виде одной полости). Моз-говой плащ в лобных долях имел толщину 5 мм. В общем анализе крови отмечались анемия, умеренный лейкоцитоз, сдвиг лейко-цитарной формулы влево, СОЭ 32–60 мм/час. В общем анализе мочи протеинурия, цилиндрурия. После проведения обследова-ния, комплексного лечения и достижения относительной ста-билизации состояния ребенок переведен для дальнейшего лечения в центральную районную больницу, где умер через два месяца. В данном случае трудности диагностики и проведения адекватно-го лечения ребенка были связаны с поздним началом лечения и присоединением госпитальной инфекции.

20

Диагностическое значение выявления ДНК цитомегаловируса в неонатальном периоде

ЦМВ наиболее часто вызывает перинатальную вирусную ин-фекцию и встречается приблизительно у 1% всех инфицированных внутриутробно новорожденных (Adler S.P., 1992). Наиболее тяже-лыми отдаленными последствиями ЦМВИ являются врожденные пороки развития, глухота и умственная отсталость, а также разви-тие хронических заболеваний легких.

Вирус переносится при тесном контакте с инфицированными выделениями, а также трансплацентарно, через половые контак-ты, при переливании крови и пересадке органов. ЦМВ имеет ши-рокое распространение в популяции: антитела к вирусу обнаружи-ваются у 50–85% людей (Raynor B.D., 1993). Подобно ВПГ, ЦМВ способен реактивироваться и вызывать рецидив инфекции.

ЦМВ может проходить через плаценту в любой период бере-менности. Первичное инфицирование матери во время беремен-ности вызывает наиболее тяжелое течение врожденной ЦМВИ. Врожденная инфекция, вызванная рецидивом заболевания, про-текает менее тяжело, но приблизительно у 10% детей развиваются поздние осложнения (Daniel Y. et al., 1995). Популяционный скри-нинг беременных не дает желаемых результатов в диагностике ЦМВИ, так как современные лабораторные методы не дифферен-цируют первичную и вторичную инфекции (Raynor B.D., 1993).

Беременность может быть фактором риска для реактивации латентной ЦМВИ. Серонегативные беременные женщины имеют высокий риск развития первичной ЦМВИ с последующим внутри-утробным инфицированием плода. Даже если имеются антитела к ЦМВ это не предотвращает развития внутриутробной инфекции (Mijanovic D., 1992). Инфицирование в первом триместре беремен-ности ассоциируется с врожденными аномалиями центральной нервной системы и чувствительных нервов. Инфекция новорож-денных может развиваться при непосредственной контаминации в материнских родовых путях и при инфицировании через грудное молоко. Возможно инфицирование новорожденных ЦМВ при пе-реливании крови или использовании донорского молока.

Внутриутробная ЦМВИ проявляется мультисистемным по-ражением, вызывающим значительную тяжесть заболевания и смертность. Клиническое обследование наиболее часто выявляет петехии, гепато- и спленомегалию, пневмонию и неврологические

21

нарушения с дальнейшей задержкой психомоторного развития. Часто появляются интракраниальные кальцификаты, гипоплазия мозжечка, перивентрикулярная лейкомаляция, внутрижелудоч-ковые кровоизлияния, гидроцефалия, порэнцефалические кисты, микроцефалия. Для лабораторных показателей характерно уве-личение трансфераз, конъюгированная гипербилирубинемия и тромбоцитопения. Белок в спинномозговой жидкости повышен, что ассоциируется с поражением нервной системы и потерей слуха.

Одновременное выделение ДНК ЦМВ из крови и мочи сопро-вождается особенно тяжелым течением заболевания с цианозом кожных покровов, СДР, желтухой и гепатоспленомегалией, пора-жением центральной нервной системы.

ДНК ЦМВ выделена из образцов крови и мочи мальчика В., поступившего по направлению участкового педиатра из области в возрасте 2 месяцев с внутренней окклюзионной гидроцефали-ей в стадии декомпенсации, смешанным тетрапарезом. Ребенок наблюдался фельдшером, окружность головки не измерялась. При поступлении состояние очень тяжелое. Окружность головы 43 см, окружность груди 35 см. Кости черепа по краям размяг-чены, выражена венозная сеть на голове. Ребенок сам не сосал, кормился через зонд. При компьютерной томографии выявлена атрофия всех структур головного мозга, толщина коры менее 6 мм. В данном случае имело место преимущественное пораже-ние вирусом центральной нервной системы. Известно, что гене-рализованная ЦМВИ может вызвать органические поражения головного мозга после внутриутробного цитомегаловирусного энцефалита с исходом в гидроцефалию, микрогирию, интерсти-циальный фиброз (Лещинская Е.В. и др., 1985).

При выявлении ДНК ЦМВ только в крови или только в моче со-стояние детей расценивается как средней степени тяжести, клиничес-кие симптомы аналогичны описанным выше, течение заболевания ха-рактеризуется монотонностью и торпидностью к проводимой терапии.

При развитии клинической картины ЦМВИ у новорожден-ных детей не следует исключать вероятность постнатального ин-фицирования, особенно при отсроченной реализации инфекции или одновременном течении соматического заболевания.

Мальчик В. родился с массой 3600, длиной 55 см. Матери ребенка 20 лет, страдает циститом, хроническим аднекси-том, носитель ВПГ. Беременность 3, предыдущие закончились

22

медицинскими абортами. Течение беременности осложнилось в 6 и 21–22 недели угрозой прерывания, в 22 недели – обострением герпеса, в 37–38 недель – острой респираторной вирусной инфек-цией. Роды 1 в 40 недель, в родах – первичная слабость и дискоор-динация родовой деятельности, оперативное родоразрешение.

Состояние ребенка при рождении удовлетворительное. Оценка по шкале Апгар 8/9 баллов. Ребенок выписан из родиль-ного дома на 10 день жизни в связи с осложнением послеопераци-онного периода у матери. На 12 день после родов мать ребенка госпитализирована в центральную районную больницу в связи с подъемом температуры и появлением выраженных симптомов интоксикации. Ребенок оставался дома с бабушкой, переведен на кормление коровьим молоком. Появилось беспокойство, частая рвота. Через 5 дней мать вернулась домой и продолжила кор-мить ребенка грудным молоком, но ребенок оставался беспокой-ным, плохо сосал, срыгивал створоженным молоком, голос стал сиплым, появилась мраморность кожных покровов. Участковый врач направил ребенка в стационар с диагнозом: пилоростеноз. При обследовании в хирургическом отделении выявлены гипер-калиемия, гипонатриемия. Мальчику проводилось лечение соль-теряющей формы адреногенитального синдрома. После относи-тельной стабилизации состояния для дальнейшего обследования и лечения переведен в отделение патологии новорожденных. При поступлении состояние ребенка тяжелое, общий цианоз кожных покровов. На слизистой оболочке полости рта проявления мо-лочницы. В акте дыхания участвовала вспомогательная муску-латура. Частота дыхательных движений 48 в 1 минуту. Дыха-ние жесткое, проводилось по всем легочным полям. Тоны сердца приглушены, пульс 120 в 1 минуту, систолический шум. Живот вздут, печень выступала из-под реберного края на 3 см, селезенка – на 1 см. В динамике, несмотря на лечение адреногенитального синдрома, развивалась дистрофия, усугублялась неврологическая симптоматика, появился гипертермический синдром. При про-ведении ПЦР-диагностики ДНК ЦМВ выделена из образцов крови и мочи, одновременно ДНК ЦМВ выделена в пробах крови, мочи и слюны матери. Течение заболевания осложнялось и присоедине-нием госпитальной флоры, при этом из различных биологических субстратов были выделены Candida tropicans, E.coli haemoliticy, Streptococcy pyogenenis, Klebsiella pneumoniae. В возрасте 2,5 ме-

23

сяцев ребенок умер. При патологоанатомическом исследовании установлено наличие двух основных патологических процессов: генерализованной ЦМВИ и адреногенитального синдрома. Не ис-ключено, что источником инфицирования матери, явилось пере-ливание ей в послеоперационный период препаратов, изготовлен-ных с использованием донорской крови, и развитие острой формы ЦМВИ. Вероятность данного пути инфицирования обсуждается в значительном количестве публикаций последних лет (Сliment C. et al., 1992; Galea G., Urbanic S.J., 1992; Harrison C.R., Sawyer P.R., 1992; de Stasio G., 1992; Raynor B.D., 1993; Bowden R.A., 1995). В нашем наблюдении, инфицирование ребенка произошло пост-натально, через материнское молоко.

ЦМВИ часто комбинируется с другими бактериальными и вирусными заболеваниями. В частности, сочетание ЦМВИ и хла-мидийной инфекции проявляется рождением недоношенного ре-бенка, вялым течением пневмонии и желтухой II–III ст., сохраня-ющейся в течение первого месяца жизни.

При одновременном выделении ДНК ЦМВ и микоплазмы состояние может оставаться средней степени тяжести и не тре-бует длительного пребывания ребенка в стационаре. В клини-ческой картине преобладают пневмония и перинатальная энце-фалопатия.

Сочетание ЦМВ, хламидий и уреаплазм проявляется сеп-тическим шоком через несколько часов после рождения, требует проведения интенсивной терапии. Помимо развития пневмонии, отмечается острая почечная недостаточность и грубые неврологи-ческие нарушения.

24

Диагностическое значение выявления ДНК хламидий в неонатальном периоде

Chlamydia подобно вирусам являются облигатными внут-риклеточными паразитами, их выживание зависит от внутрик-леточного роста и размножения, а их жизнедеятельность мо-жет протекать в любых клетках организма-хозяина. Chlamydia представляют собой неподвижный грамотрицательный организм и занимают промежуточное место между бактериями и вируса-ми. Из трех видов возбудителей, относящихся к роду Chlamydie, C.trachomatis передается половым путем и вызывает заболева-ния новорожденных.

Хламидиоз занимает ведущее место среди урогенитальных инфекций и характеризуется широкой распространенностью, субъективно-асимптомным течением, многоочаговостью пора-жения, склонностью к диссеминированию. Вероятность переда-чи хламидийной инфекции ребенку от больной матери состав-ляет 40–70%.

Принято считать, что клинически у новорожденных заболева-ние проявляется в виде конъюнктивитов, назофарингитов, брон-хитов, пневмонии, гастроэнтеритов, проктитов, вульвитов, уретри-тов, а также менингитов, миокардитов и реактивных артритов.

При детекции ДНК хламидий заболевание часто сопровож-дается быстрым развитием СДР на фоне мекониальной аспира-ции, что можно объяснить не только химическим характером поражения респираторной ткани загрязненными околоплодны-ми водами, но и большим количеством возбудителя, проникшем непосредственно в легкие новорожденного ребенка. У детей, аспирировавших околоплодные воды, и у недоношенных ново-рожденных дыхательные расстройства в клинической картине заболевания выступают на первый план: одышка, участие вспо-могательной мускулатуры в акте дыхания, мелкопузырчатые хрипы в легких. У наименее зрелых недоношенных детей забо-левание протекает по типу СДР, требующего оксигенотерапии. Течение заболевания осложняется длительным сохранением фетальных шунтов и нарастанием сердечно-легочной недоста-точности.

В настоящее время признана роль C. trachomatis в развитии неонатальной пневмонии (Numazaki K. et al., 1992; Sollecito D. et al., 1992). Приобретение этого микроорганизма происходит во

25

время прохождения плода через родовые пути. Позднее разви-тие пневмонии, вызванной С.trachomatis, может быть связано с относительно низкой вирулентностью. Отмечены случаи разви-тия хламидийного конъюктивита у новорожденных, извлечен-ных путем кесарева сечения, что свидетельствует о возможной трансмембранной или трансплацентарной передаче инфекции (Shariat H. et al., 1992).

Инфекция, вызванная С.trachomatis, сопровождается разви-тием затяжной пневмонии с выраженной дыхательной недостаточ-ностью (до III ст.), нарушениями гемоликвородинамики, желтуш-ным окрашиванием кожных покровов. В случаях проведения ИВЛ для ПЦР-диагностики могут использоваться трахеобронхиальные аспираты. Наличие ДНК С.trachomatis в трахеобронхиальных ас-пиратах отражает развитие пневмонии. Характерно течение двус-торонней пневмонии и перинатального поражения центральной нервной системы, гнойного конъюнктивита, кардиопатии, реже фетального гепатита.

Диагноз хламидийной инфекции не всегда устанавливается своевременно, что приводит к неадекватной терапии и формирова-нию персистирующей или латентной инфекции, способствующей развитию вторичного иммунодефицита и аутоиммунных заболе-ваний. По данным литературы известно, что латентное течение хламидийной инфекции у ребенка не исключает возможность продуктивной репродукции хламидий в клетках и тканях ЦНС и экстраневрально, следствием чего может явиться развитие астено-вегетативного синдрома, судорожных и ликвородинамических на-рушений (Серопегин А.Д., 1995).

Для общего анализа крови характерны анемия, тромбоци-топения, лейкопения, эозинофилия, моноцитоз. Выделение ДНК С.trachomatis из мочи сопровождается протеинурией, лейкоциту-рией, цилиндрурией, десквамацией почечного эпителия.

При одновременном выявлении ДНК С.trachomatis и M.hominis течение беременности часто сопровождается угрозой прерывания в течение всего гестационного периода. В первую не-делю жизни развивается двусторонняя мелкоочаговая пневмония, конъюгационная желтуха (II ст.), кардиопатия, перинатальное по-ражение центральной нервной системы.

26

Диагностическое значение выявления ДНК микоплазм и уреаплазм в неонатальном

периодеВ последние годы в отечественной и зарубежной литературе

появились сообщения о внутриутробной микоплазменной инфек-ции, которая чаще проявляется в виде пневмоний, но может носить и генерализованный характер. Существует связь инфицирования микоплазмами со спонтанными абортами, преждевременными ро-дами, а также с малой массой тела детей при рождении. Мико-плазмы широко распространены в природе и некоторые их виды патогенны для человека (M.pneumoniae, M.hominis, Ureaplasma urealyticum). Микоплазмы не окрашиваются по Граму, окрашива-ются по Гимзе и характеризуются выраженным полиморфизмом (кокки, палочки, нитевидные формы). U.urealyticum представляет собой Т-группы штаммов микоплазм, образующих маленькие ко-лонии в среде с добавлением мочевины.

Диагностика микоплазм с использованием ПЦР позволяет установить этиологическое и патогенетическое значение мико-плазм в патологии неонатального периода (Abele-Horn M. et al., 1996). Статистически выявлена значительная связь между уровнем колонизации U.urealyticum и M.hominis и преждев-ременными родами, а также дородовым (более 24 часов) изли-тием околоплодных вод. При этом несколько чаще колониза-ция отмечается у детей, перенесших эпизоды апноэ (Rudd P.T, Carrington D., 1984).

В целом, внутриутробная инфекция микоплазменной этио-логии характеризуется средне тяжелым течением с постепенным нарушением состояния ребенка и развитием СДР, вяло текущей пневмонии, гнойного конъюнктивита, реже – гнойного омфалита, желтушности кожных покровов, нарушений гемоликвородина-мики различной степени выраженности, кардиопатией. В общем анализе крови отмечается анемия, лейкоцитоз или лейкопения, эозинофилия, моноцитоз.

U.urealyticum признана как важный потенциальный па-тоген недоношенных новорожденных (Horowitz S. et al., 1992; Sanchez P.J., 1993;), рожденных через естественные родовые пути. В то же время указывается, что неонатальная колонизация не связана с низким гестационным возрастом, малым ростом и весом при рождении (Fullana M.A. et al., 1992). Инфицирование

27

беременных женщин U.urealyticum ассоциируется с неблагопри-ятным исходами беременности такими как ранние выкидыши, мертворождение, недоношенность, неонатальная заболеваемость и смертность.

Существуют следующие пути передачи U.urealuticum от ма-тери к новорожденному ребенку: 1) внутриутробно трансплацен-тарно через материнскую кровь или вторично восходящим путем из родовых путей; 2) в родах при прохождении через родовые пути; 3) постнатально по горизонтальному пути, возможна нозокомиаль-ная передача. Частота вертикальной передачи увеличивается при хориоамнионитах, особенно если U.urealyticum выделяется из ам-ниотической жидкости (Eschenbach D.A. et al., 1993).

Инфекция, вызываемая U.urealyticum, играет важную роль в развитии ранней бронхолегочной дисплазии у недоношенных де-тей и других хронических заболеваний легких даже после лече-ния сурфактантом (Dyke M.P. et al., 1993). Одним из механизмов повреждения является стимуляция выхода провоспалительных цитокинов из легочных фибробластов (Stancombe B.B. et al., 1993). По данным Horowitz S. и соавт. (1992), бронхолегочная дисплазия развивается у 40% интубированных новорожденных с эндотрахе-ально идентифицированным уреаплазмозом.

U.urealyticum может вызвать неонатальную бактериемию, пневмонию и менингиты, а также остеомиелит. Клинически уре-аплазменная пневмония у недоношенных часто сочетается с бо-лезнью гиалиновых мембран, лейкопенией, тромбоцитопенией и развитием СДР.

При сочетании ДНК U.urealyticum и M.hominis диагностику инфекционного процесса могут затруднять врожденные пороки развития.

Девочка П. родилась с массой 3000, длиной 49 см. Матери ре-бенка 26 лет, страдает желчно-каменной болезнью, хронической железодефицитной анемией, ожирением II степени, поливален-тным аллергозом. Во время беременности выявлены хламидиоз и уреаплазмоз. Беременность I, протекала с патологическими прибавками в весе, гестозом, внутриматочной инфекцией, хро-нической внутриутробной гипоксией плода. Роды I, в 38 недель, в родах – обвитие пуповиной по типу портупеи. Состояние при рождении ребенка тяжелое, на третий день жизни девочка пере-ведена в отделение патологии новорожденных. При поступлении

28

состояние тяжелое. Отмечается вялость, плохо сосет; цианоз кожных покровов; одышка до 72 в 1 минуту, ослабленное дыхание по всем легочным полям; расширение левых отделов сердца, выра-женный систолический шум, проводящийся экстракардиально. При эхокардиографии выявлен дефект межжелудочковой пере-городки с лево-правым шунтированием. При нейросонографии – внутренняя гидроцефалия. На рентгенографии грудной клетки: признаки двусторонней пневмонии; на рентгенографии шейного отдела позвоночника: атланто-окципитальный блок с дислока-цией С1 кпереди, расширение С2-С3. При ПЦР-диагностике выде-лены ДНК U.urealyticum и M.hominis. Девочка осмотрена невро-патологом, выставлен диагноз: Перинатальная энцефалопатия смешанного генеза, острый период, средней степени тяжести, гипертензионно-гидроцефальный синдром в стадии компенса-ции, верхний смешанный парапарез, нижняя пирамидная недо-статочность, повышенная нейро-рефлекторная возбудимость. Проведено два курса лечения вифероном, на 20 день жизни ребе-нок выписан домой с улучшением.

Ассоциации выделенных возбудителей, включая вирусные инфекции, описанные ранее, с кокковой или бациллярной мик-рофлорой (грамотрицательной – St.aureus, E.coli, P.aeruginosa, K.pneumoniae), а также с Сandida albicans, как правило, вызыва-ют наиболее тяжелое течение заболевания, требующее дополни-тельной медикаментозной нагрузки на пациента. Риск развития нозокомиальных инфекций увеличивается при наличии сопутс-твующих заболеваний неинфекционного происхождения и боль-шого числа манипуляций, таких как интубация, искусственная вентиляция легких, инфузионная терапия, кормление через зонд, за счет нарушения целостности слизистых оболочек и создания пу-тей для проникновения инфекции в кровяное русло (Дэвис П.А., Готефорс Л.А., 1987).

29

ЗаключениеИнфекционные заболевания, возникающие во время бере-

менности, обусловливают внутриутробное инфицирование плода, приводящее к ранней детской смертности и возникновению по-роков развития. Чаще всего женщины болеют бессимптомно (без выраженных клинических проявлений). Необходимо проведение целенаправленной пренатальной диагностики для выявления ла-тентных инфекционных процессов у беременных женщин.

При изучении анамнеза следует обращать внимание на лихо-радочные состояния, наличие хронических воспалительных заболе-ваний. Характерной особенностью течения инфекционного процес-са является угроза самопроизвольного прерывания беременности, обусловленная воспалительными изменениями в плаценте и матке. Как признак внутриутробной инфекции и повышения вероятности инфицирования плода можно рассматривать патологию плаценты: предлежание, приращение, отслойку, разрыв сосудов пуповины.

Наиболее часто течение беременности при развитии внутри-утробной инфекции сопровождается угрозой самопроизвольного выкидыша, хронической фетоплацентарной недостаточностью, хронической внутриматочной инфекцией, развитием хронической внутриутробной гипоксии плода. В наших исследованиях, при на-блюдении в женской консультации большинство женщин обследо-валось на носительство возбудителей внутриутробных инфекций различными методами (ИФА-диагностика, бактериоскопическое исследование мазков). 48 беременных из 180 (26,7%) оказались носителями герпеса, цитомегалии, хламидиоза и уреаплазмоза. Однако результаты исследования беременных женщин совпали с результатами ПЦР-диагностики у детей только в 16 случаях (табл. 3). Небольшое количество совпадений можно связать как с оши-бочными результатами ИФА-диагностики в ряде случаев, так и с непредсказуемостью вертикальной передачи возбудителей внут-риутробных инфекций при высокой серопозитивности женщин (Воропаев Е.В. и др., 1999).

Результаты, представленные в таблице 3, свидетельствуют о том, что частота выявления заболевания в значительной степени зависит от используемых диагностических методов. ПЦР в диа-гностике инфекций у беременных женщин не применялась. Из-вестно, что внутриутробные инфекции во время беременности не имеют клинических проявлений, диагностика их чрезвычайно за-

30

труднена и возможна лишь в результате сочетания клинических и лабораторно-инструментальных методов исследования (Сидорова И.С. и др., 1997). Следует отметить, что установление хроничес-кого носительства ВПГ и ЦМВ у беременных является принципи-ально важным для ранней диагностики этиологии развивающейся внутриутробной инфекции.

Таблица 3Совпадение результатов исследования беременных

на наличие внутриутробных инфекций и результатов ПЦР-диагностики у новорожденных

(в процентах)

Внутриутробная инфекция

Количество исследований

1 группа 2 группа 3 группа

Герпес – – –

Цитомегалия 1,4 2,6 –

Гепатит В – – –

Хламидиоз 8,2 5,1 –

Микоплазмоз 4,1 2,6 –

Уреаплазмоз – 5,1 –

Токсоплазмоз – – –

Примечание: 1 группа – моноинфекции; 2 группа – сочетанные инфекции; 3 группа – отрицательные результаты ПЦР

Клиническая картина моно- и микстинфекций у новорож-денных детей не имеет специфических признаков и выявляет наличие выраженной дыхательной недостаточности с развитием пневмонии, раннее и затяжное течение желтухи, неврологические нарушения вплоть до развития менингита и менингоэнцефалита. Наиболее тяжело внутриутробные инфекции протекают у недоно-шенных детей, а также у доношенных детей при выявлении воз-будителя одновременно в плазме крови и моче. Дети чаще рож-даются в состоянии асфиксии и, соответственно, состояние их при рождении расценивается как тяжелое.

Среди основных клинических синдромов в первые часы и дни после рождения преобладают: СДР, желтуха, нарушения гемоликвородинамики. Дыхательная недостаточность сохраня-

31

ется длительное время в связи с развитием пневмонии. Жел-тушное окрашивание кожных покровов, видимых слизистых оболочек и склер появляется в первые сутки жизни ребенка и сохраняется более двух недель. Характерным является разви-тие отечного синдрома. Гепатоспленомегалия чаще отмечается у детей с выявленными сочетанными внутриутробными инфек-циями. Развитие фетального гепатита также преобладает при сочетанных инфекциях.

Трудности в диагностике создает одновременное развитие сердечно-сосудистой недостаточности, обусловленной врожденны-ми пороками сердца и сосудов или кардиопатией. Врожденные по-роки развития, включая генетические синдромы, достаточно часто отмечаются при внутриутробных инфекциях.

Использование молекулярно-биологического метода в диа-гностике ВУИ у новорожденных детей позволяет выявлять соче-танные и латентные инфекции, отслеживать персистенцию воз-будителей в организме. Специфичность и высокая чувствитель-ность метода дает возможность проводить этиопатогенетическое лечение. Оптимальным методом, обеспечивающим обнаружение нескольких возбудителей в одной пробе, является ПЦР, при этом должны учитываться клиническая картина заболевания и резуль-таты ИФА.

Особое внимание хотелось обратить на интерпретацию резуль-татов ПЦР-диагностики. Можно утверждать, что метод является абсолютно достоверным при диагностике хламидийной инфекции. ДНК возбудителя была выделена и в сыворотке крови, и в моче, а элементарные тельца C.trachomatis покидают клетку и проника-ют в биологические субстраты только при активном размножении возбудителя. C.trachomatis представляет угрозу для ребенка даже в минимальных количествах, выявляемых молекулярно-биологи-ческими методами. Однако латентное течение других рассматри-ваемых инфекций настолько опасно развитием отсроченных ос-ложнений, что положительные результаты ПЦР-анализа должны учитывать при сопоставлении с клинической картиной для назна-чения терапии и разработки планов диспансерного наблюдения за больными. Необходимость терапии латентных форм заболеваний у новорожденных при детекции ДНК возбудителей определяется способностью многих из них длительно сохраняться в условиях иммунокомпетентного организма (персистировать с сохранением

32

патогенных свойств). При изменении иммунного статуса макроор-ганизма происходит быстрое восстановление вирулентности, кото-рое становится основой рецидивирующего характера хронических инфекций и возможной инвалидизации ребенка.

Предупреждение серьезных последствий у новорожденных детей зависит от ранней диагностики и своевременного лечения (Jenkins M., Kohl S., 1992). В последние годы применяется лечение неонатального герпеса ацикловиром и видарабином. Несмотря на токсичность данных препаратов, их назначение оправдывается тя-желыми неврологическими расстройствами, возникающими после перенесенного заболевания (Baker D.A., 1992; Le Gall M.A. et al., 1992; Whitley R.J., 1993).

Лечение хламидиоза у новорожденных проводится эритро-мицином в дозе 50 мг/кг/сут, внутривенно, двукратно, в течение 7–10 дней.

Наличие различных ассоциаций возбудителей, выявленных при ПЦР-диагностике, ставит перед исследователями и клиницис-тами дополнительные вопросы, поскольку проблема лечения сме-шанных инфекций не только неоднозначна, но и сложна в плане лечебного воздействия на пациента. А если учитывать, что речь идет о новорожденных детях, то проблема неадекватного медика-ментозного воздействия становится особенно актуальной.

Необходимо проводить подбор лекарственных средств, обла-дающих широким спектром действия. Такими препаратами яв-ляются интерфероны (противовирусные и иммуномодулирующие препараты). Интерфероны – естественные факторы неспецифичес-кой защиты организма и медиаторы иммунитета. Система интер-ферона направлена на распознавание и элиминацию чужеродной генетической информации. Эффективность применения интер-феронов объясняется ингибированием процессов транскрипции и трансляции с прекращением репликации вирусов (антивирусный эффект) и торможением размножения клеток (антипролифератив-ный эффект). В связи с этим интерфероны рассматриваются как универсальный фактор неспецифической резистентности. Опыт применения препарата Виферон-1 по 1 свече (150000МЕ) 2 раза в день в течение 7 дней показал его эффективность при сочетанных инфекциях у новорожденных, что подтверждено контролем ПЦР.

Внутриутробные инфекции у новорожденных сопровождают-ся неспецифическими клиническими симптомами, зачастую не

33

позволяющими установить этиологию заболевания. Врач-неона-толог в своей деятельности должен стремиться не только к про-ведению симптоматической терапии, но и к этиопатогенетичес-кому воздействию. Выбор предлагаемой стратегии представлен в схеме 1 и показывает, что применение метода ПЦР в диагностике внутриутробных инфекций у новорожденных позволяет лечить за-болевание препаратами направленного действия. В случае отри-цательных результатов ПЦР встает вопрос о дифференциальной диагностике заболеваний инфекционного и неинфекционного ге-неза, вызывающих аналогичные клинические проявления.

Рассматривая схему 2, следует отметить, что лечение с пос-ледующим контролем динамики создает условия для исключения дальнейшей хронизации заболевания, значительно снижающей качество жизни новорожденных детей в будущем. Применение целенаправленной терапии внутриутробных инфекций в отделе-нии патологии новорожденных как препаратами противовирусной направленности (ацикловир), антибиотиками, воздействующими на внутриклеточных возбудителей (эритромицин, сумамед), так и препаратами интерферона (виферон) позволяет получать обнаде-живающие положительные результаты. Поражение центральной нервной системы при внутриутробном инфицировании делает ак-туальной проблему наиболее ранней верификации возбудителя и назначения этиопатогенетического лечения с целью предотвраще-ния инвалидизации детей.

Сочетанная патология при внутриутробных инфекциях часто оказывается несовместимой с жизнью, несмотря на все использо-ванные возможности интенсивной терапии и реанимации. Следу-ет отметить, что в связи с высоким риском развития отсроченных осложнений, свойственных ряду внутриутробных инфекций, лече-ние новорожденный детей должно проводиться даже при выделе-нии латентных возбудителей.

34

Схема 1Выбор стратегии этиопатогенетического лечения

у новорожденных детей при внутриутробных инфекциях

35

Схема 2Тактика лечения инфекционных заболеваний

у новорожденных

36

Список литературы1. Воропаев Е.В., Матвеев В.А., Черновицкий М.А., Жаворонок

С.В. Герпесвирусная инфекция, краснуха при врожденных пороках развития // Рос. вестн. перинатол. и пед. – 1999. – № 3. – С. 55.

2. Дэвис П.А., Готефорс Л.А. Бактериальные инфекции плода и новорожденного. – М.: Медицина, 1987. – 496 с.

3. Лещинская Е.В., Мартыненко И.Н., Демидова С.А. и др. По-ражение центральной нервной системы у детей при цитоме-галии // Вопр. охр. мат. – 1985. – № 5. – С. 61–65.

4. Серопегин А.Д. Неврологические аспекты хламидийной ин-фекции: Автореф. дис. ... канд.мед.наук. – С.-Петербург, 1995.

5. Сидорова И.С., Макаров И.О., Сидоров А.А. и др. Особеннос-ти течения беременности и исходы родов при внутриутроб-ном инфицировании плода // Рос. вест. перинат. и педиатр. – 1997. – № 1. – С. 15–20.

6. Цинзерлинг А.В., Индикова М.Г. Герпетическая инфекция (простой герпес) // Арх. патол. – 1988. – Вып. 12. – С. 3–12.

7. Abele-Horn M., Wolff C., Dressel P. et al. Polymerase chain reaction versus culture for detection of Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis in the urogenital tract of adults and the respiratory tract of newborns // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. – 1996. – Vol. 15. – № 7. – P. 595–598.

8. Adler S.P. Cytomegalovirus and pregnancy // Curr. Opin. Obstet. Gynecol. – 1992. – Vol. 4. – № 5. – P. 670–675.

9. Baker D.A., Herpes simplex virus infection // CARR. OPIN. OBSTIHI. Ginecology. – 1992. – Vol. 4. – № 5. – P. 676–681.

10. Bowden R.A. Transfusion-transmitted cytomegalovirus infecion // Hematol. Oncol. Clin. North. Am. – 1995. – Vol. 9. – № 1. – P. 155–166.

11. Climent C., Velez R., Capriles J.A. Cytomegalovirus infection // Bul. Asoc. Med. P.-R. – 1992. – Vol. 84. – № 1. – P. 31–33.

12. Daniel Y., Gull I., Peyser M.R., Lessing J.B. Congenital cytomegalovirus infection // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. – 1995. – Vol. 63. – № 1. – P. 7–16.

13. Dyke M.P. Grauaug A., Kohan R. et al. Ureaplasma urealyticum in a neonatal intensive care population // J. Paediatr. Child. Health. – 1993. – Vol. 29. – № 4. – P. 295–297.

37

14. Eschenbach D.A. Ureaplasma urealyticum and premature birth // Clin. Infect. Dis. – 1993. – Vol. 17. – Suppl. 1. – P. S100–106.

15. Fullana M.A., Ureaplasma Urealiticum and Mycoplasma hominis incidence and clinical significance of their isolation in the perinatal period// Ann. ESP. Pediatr. – 1992. – Vol. 36. – № 4. – P. 285–288.

16. Galea G., Urbanik S.J. The incidence and consequences of cytomegalovirus transmission via blood transfusion to low birth weight, premature infants in north east Scotland // Vox. Sang. – 1992. – Vol. 62. – № 4. – P. 200–207.

17. Harrison C.R., Sawyer P.R. Spesial issues in transfusion medicine // Clin. Lab. Med. – 1992. – Vol. 12. – № 4. – P. 743–757.

18. Horowitz S., Landau D., Shinwell E.S. et al. Respiratory tract colonization with Ureaplasma urealyticum and bronchopulmonary dysplasia in neonates in Southern Israel // Pediatr. Infect. Dis. J. – 1992. – Vol. 11. – № 10. – P. 847–851.

19. Hufert F.T., Diebold T., Ermisch B. et al. Liver failure due to disseminated HSV-1 infection in newborn twin // Scand. J. Infect. Dis. – 1995. – Vol. 27. – № 6. – P. 627–629.

20. Jenkins M., Kohl S. New aspects of neonatal herpes // Infect. Dis. Clin. North. Am. – 1992. – Vol. 6. – № 1.- P. 57–74.

21. Jones C.L. Herpes simplex virus infection in the neonate: clinical presentation and management // Neonatal Netw. – 1996. – Vol. 15. – № 8. – P. 11–15.

22. Le Gall M.A., Boccara J.F., Francoual C. et al. Neonatal herpes: recurrence after treatment with acyclovir // Pediatrie Bucur. – 1992. – Vol. 47. – № 6. – P. 445–449.

23. Mijanovic D. Cytomegalovirus infections and pregnancy // Srp. Arh. Celoc. Lec. – 1992. – Vol. 120. – № 9-10. – P. 293–295.

24. Numazaki K., Chiba S., Umetsu M. Detection of IgM antibodies to Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumonia, and Chlamydia psittaci from Japanese infants and children with pneumonia // In. Vivo. – 1992. – Vol. 6. – № 6. – P. 601–604.

25. Raynor B.D. Cytomegalovirus infection in pregnancy // Semin. Perinatol. – 1993. – Vol. 17. – № 6. – P. 394–402.

26. Rudd P.T., Carrington D. A prospective study of chlamydial, mycoplasmal, and viral infections in a neonatal intensive care unit // Arch. Dis. Child. – 1984. – Vol. 59. – P. 120–125.

38

27. Sanchez P.J. Perinatal transmission of Ureaplasma urealyticum: current concepts based on review of the literature // Clin. Infect. Dis. – 1993. – Vol. 17. – Suppl. 1. – P. S107–111.

28. Shariat H., Young M., Abedin M. An interesting case presentation: a possible new route for perinatal acquisition of Chlamydia // J. Perinatol. – 1992. – Vol. 12. – № 3. – P. 300–302.

29. Stancombe B.B., Walsh W.F., Derdak S. et al. Induction of human neonatal pulmonary fibroblast cytokines by hyperoxia and Ureaplasma urealyticum // Clin. Infect. Dis. – 1993. – Vol. 17. – Suppl. 1. – P. S154–157.

30. de Stasio G. Transfusion risks and alternatives to transfusion // Recenti. Prog. Med. – 1992. – Vol. 83. – № 6. – P. 321–329.

31. Sollecito D., Midulla M., Bavastrelli M. et al. Clamydia trachomatis in neonatal respiratory distress of very preterm babyes: biphasic clinical picture // Acta Paediatr. – 1992. – Vol. 81. – № 10. – P. 788–791.

32. Whitley R.J. Neonatal herpes simplex virus infections // J. Med. Virol. – 1993. – Suppl. 1. – P. 13–21.

ОглавлениеОсновные представления о внутриутробных инфекциях .............. 3Метод ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний ............... 4Организация работ по выявлению ДНК методом ПЦР ................. 7Диагностическое значение выявления ДНК возбудителейвнутриутробных инфекций в неонатальном периоде .................. 10Диагностическое значение выявления ДНК вируса гепатита В в неонатальном периоде ............................................... 12Диагностическое значение выявления ДНК вируса простого герпеса в неонатальном периоде ........................ 15Диагностическое значение выявления ДНК цитомегаловируса в неонатальном периоде .................................. 20Диагностическое значение выявления ДНК хламидий в неонатальном периоде .................................................................. 24Диагностическое значение выявления ДНК микоплазм и уреаплазм в неонатальном периоде ........................................... 26ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................ 29СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................ 36

НАБОРЫ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ И ПЦР-ДИАГНОСТИКИ

В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов А, В, С. D, E;

TORCH-инфекций; инфекций, передаваемых половым путем; паразитарных и желудочно-кишечных заболеваний; клещевых

инфекций, аутоиммунных и системных заболеваний; беременности и ее мониторинга; выявления опухолевых маркеров и гормонов;

НАБОРЫ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ КЛИНИЧЕСКОЙ БИОХИМИИ

глюкоза, холестерин, мочевина, мочевая кислота, креатинин, общий белок, белок в моче, альбумин, билирубин,

щелочная фосфотаза, АЛТ, АСТ, ЛДГ, ГГТ, железо, a-амилаза, кальций, хлориды, фосфор, триглицериды, гемоглобин гемихромным методом

и др.

Максимальный выбор диагностической продукции!

Представительства:Москва: (495) 710-76-96; С.-Петербург: (812) 495-55-99;Ростов-на-Дону: (863) 295-15-61; Уфа: (347) 246-23-34;Екатеринбург: (343) 372-90-50; Хабаровск: (4212) 335-946;Нижний Новгород: (831) 272-35-47 Киев (10 380 44) 220-04-04

ЗАО «Вектор-Бест»630117, г. Новосибирск-117, а/я 492

тел.: (383) 332-37-58, 332-36-34 тел./факс: 332-67-49, 332-67-52e-mail: vbmarket@vector-best.ru Internet: http://www.vector-best.ru

Закрытое акционерное общество «Вектор-Бест»

Международные сертификаты ISO 9001 и ISO 13485