ΜΑΘΗΜΑ ETY-494

«ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ»

Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Υλικών, Σχολή Θετικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο Κρήτης

Δρ. Γεώργιος Βλαστός (E-mail: vlastos@materials.uoc.gr)

Ιστοσελίδα Μαθήματος: http://www.materials.uoc.gr/courses/ETY494

Βιοϊατρική Μηχανική Βλαστοκυττάρων. Μέρος Α: Βασικές Έννοιες

Απώλεια κυττάρων και ιστού οργάνωνΑπώλεια κυττάρων και ιστού οργάνων

Γήρανση Χημοθεραπεία Σωματικό η ισχαιμικό τραύμα

Έμφραγμα του μυοκαρδίου Εγκεφαλικό Κάταγμα σπονδυλικής στήλης

Εκφυλιστικές ασθένειες Alzheimer Parkinson Διαβήτης Αρθρίτιδα Οστεοπόρωση Νεφρική ανεπάρκεια

2

Βιοϊατρική Μηχανική ΒλαστοκυττάρωνΒιοϊατρική Μηχανική ΒλαστοκυττάρωνStem Cell BioengineeringStem Cell Bioengineering

Στο άμεσο μέλλον οι θεραπείες με βλαστοκύτταρα θα αποτελούν όλο και περισσότερο κλινική πρακτική και ερευνητικό αντικείμενο.

Η Αναπαραγωγική Ιατρική (Regenerative Medicine) και η Ιστομηχανική (Tissue Engineering) συνδυάζουν τους κλάδους της Βιολογίας και της Βιοϊατρικής Μηχανικής για την ανάπτυξη βιολογικών υποκατάστατων, που σκοπός τους είναι η επαναφορά και η αναπαραγωγή ιστών και οργάνων του σώματος ύστερα από βλάβες.

Επειδή στην Αναπαραγωγική Ιατρική τα πρόδρομα και βλαστικά κύτταρα (progenitor and stem cells) καλλιεργούνται σε τρισδιάστατα ικριώματα (scaffolds) όπου τα κύτταρα προσκολλούνται και διαφοροποιούνται, τα βιοϋλικά που χρησιμοποιούνται παίζουν κρίσιμο ρόλο.

Ανάπτυξη δυνατότητας εφαρμογών Γενετικής Μηχανικής για γονιδιακή θεραπεία.

Αντιμετώπιση του προβλήματος έλλειψης δοτών οργάνων και παράνομου εμπορίου οργάνων κυρίως στον τρίτο κόσμο.

3

Nature Biotechnology, Vol. 18, 201-206, 2001

Τι είναι τα βλαστοκύτταρα;Τι είναι τα βλαστοκύτταρα;

Το βλαστοκύτταρο ορίζεται με 3 κριτήρια:

1. Αυτο-ανανέωση.

2. Δυνατότητα διαφοροποίησης σε πολλαπλούς κυτταρικούς τύπους.

3. Ικανότητα να επαναφέρει στην αρχική του μορφή ένα δεδομένο ιστό.

Το πλέον πρωτόγονο βλαστοκύτταρο στον οργανισμό είναι το γονιμοποιημένο ωάριο (fertilized oocyte or zygote).

Όταν το ωάριο διαιρείται, οι απόγονοί του ύστερα από δύο κυτταρικές διαιρέσεις αντιπροσωπεύουν τα ολοδυναμικά κύτταρα (totipotent cells) που δημιουργούν μια κοίλη κυτταρική μπάλλα την βλαστοκύστη (blastocyst) η οποία περιέχει μία συστάδα από κύτταρα που ονομάζεται εσωτερική κυτταρική μάζα (inner cell mass). Από αυτήν αναπτύσσεται το έμβρυο και παράγονται τα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα (πάνω).

Oι περισσότεροι ιστοί έχουν πολυδυναμικά κύτταρα (multipotent stem cells) που μπορούν να παράξουν περιορισμένες κυτταρικές σειρές (μέση).

Τα μονοδυναμικά βλαστοκύτταρα (unipotent stem cells) παράγουν ένα συγκεκριμένο τύπο κυττάρων (κάτω).

4

Goessler et al. Cells Tissues Organs 183:169–179, 2006

Προέλευση των βλαστοκυττάρωνΠροέλευση των βλαστοκυττάρων

Εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα (embryonic stem cells) Παίρνονται από την βλαστοκύστη του εμβρύου. Σε αργότερο στάδιο μπορούν να παρθούν πιο εξειδικευμένες κυτταρικές σειρές

όπως π.χ. τα εμβρυϊκά ενδοθηλιακά πρόδρομα κύτταρα (embryonic Endothelial Progenitor Cells, eEPC).

Στο νωτιαίο μυελό βρίσκουμε διάφορα είδη εφήβων βλαστοκυττάρων (adult stem cells)

Τα κυκλοφορούντα ενδοθηλιακά πρόδρομα κύτταρα (circulating endothelial progenitor cells).

Τα αιματοποιητικά βλαστοκύτταρα (hematopoetic stem cells, HSC). Τα μεσενχυμικά βλαστοκύτταρα (mesenchymal stem cells, MSC). Τα πολυδυναμικά έφηβα πρόδρομα κύτταρα (multipotential adult progenitor

cells, MAPC) είναι υποκατηγορία των μεσενχυμικών βλαστοκυττάρων.

5

Goessler et al. Cells Tissues Organs 183:169–179, 2006

Ανθρώπινη εξέλιξη και βλαστοκύτταρα Ανθρώπινη εξέλιξη και βλαστοκύτταρα (video)(video)

Human embryonic development depends on stem cells. During the course of development, cells divide, migrate, and specialize. Early in development, a group of cells called the inner cell mass (ICM) forms. These cells are able to produce all the tissues of the body. Later in development, during gastrulation, the three germ layers form, and most cells become more restricted in the types of cells that they can produce.

6

Mesoderm

Blood Islands

Undiffer- entiated

VasculogenesisMouse day 7.5

Blood cells

Chorion

Allantois

Exocoelomic Cavity

Amniotic Cavity

Ectoderm

MesodermEndoderm

Endocardium

Ectoplacental Cone

1st Aortic ArchAmnion

Endoderm

Endothelialcells

Hatzopoulos et al. Development 125:1457-1468, 1998

Vasculogenesis signifies de novo formation of bloodvessels from angiogenic precursor cells. Later inembryogenesis, the vascular tree grows by sprouting, celldivision, migration and assembly of endothelial cells derivedfrom pre-existing vessels through a process termedangiogenesis

The vascular system arises early in embryogenesis to meet the nutritional needs of the developing organism. At E7.5 in the mouse, the extraembryonic mesodermal cells of the yolk sac aggregate into clusters that constitute the initial stage of blood island formation. Shortly thereafter, blood islands differentiate into an external layer of endothelial cells and an inner core of blood cells . At about the same time, embryonic cells of the proximal lateral mesoderm assemble into pre-endocardial tubes that connect anteriorly togenerate cardiac endocardium around the anterior intestinal portal.

Embryo day 7.5

Isolation of embryonic Endothelial Progenitor Cells Isolation of embryonic Endothelial Progenitor Cells (eEPCs)(eEPCs)

Properties of embryonic EPCs 1. Unlimited stem-cell like growth

2. Amenable to genetic engineering

3. Early isolation: a panel of “WT” and “KO” eEPCs

4. Plasticity - in vivo potential

Primary eEPC lines

Hatzopoulos et al. Development 125:1457-1468, 1998

Παραγωγή εμβρυϊκών κυτταρικών σειρών στο Παραγωγή εμβρυϊκών κυτταρικών σειρών στο εργαστήριο εργαστήριο (video)(video)

The inner cell mass (ICM) cells of blastocyst-stage early human embryos can be removed and cultured. These cells can be grown in the lab indefinitely. Various growth factors cause these cells to develop into a variety of differentiated cells, such as muscle or nerve cells.

9

Gene induction: effector genesGene induction: effector genes

10

Angiogenesis

VEGFR-1

VEGFR-2

Tie-1

Tie-2

Eph-B4

ephrin-B2

VEGF-A

Ang2

TGF

TGF RII

Alk-1

SCL

CBF

Coagulation

Thrombomodulin

vWF

Tissue Factor

thrombin receptor

eNOS

PECAM-1

Atherosclerosis

ApoE

glutathione peroxidases

oxidative stress-induced protein

transthyretin

M-CSF

Inflammation

E-selectin

P-selectin

VE-cadherin

VCAM-1

Toll-like R2

Toll-like R4

CXCR 2, and 8

CCR 1, 3, 5 and 8

NF-B

Hatzopoulos et al. Development 125:1457-1468, 1998

A: Host B: Donor (eEPCs) C: Incorporation

EMBRYONIC EPCs FORM VASCULAR STRUCTURES EMBRYONIC EPCs FORM VASCULAR STRUCTURES IN VIVOIN VIVO

Hatzopoulos et al. Development 125:1457-1468, 1998

eEPCs express key genes for eEPCs express key genes for vascular formation and endothelial vascular formation and endothelial

cell functioncell function

- Undifferentiated+ Differentiated eEPCs

Induced genesHatzopoulos et al. Development 125:1457-1468, 1998

Βλαστική ετερογένεια στους ιστούς και Βλαστική ετερογένεια στους ιστούς και λειτουργικότητα των βλαστοκυττάρων γιά ανανέωσηλειτουργικότητα των βλαστοκυττάρων γιά ανανέωση

13

Rando AT, Nature 2006

Διαφοροποίηση ανθρώπινων εμβρυϊκών Διαφοροποίηση ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων βλαστοκυττάρων (video)(video)

As a human embryo develops, its cells become progressively restricted in the types of specialized cells that they can produce. Inner cell mass (ICM) cells of the blastocyst can make any type of body cell. Gastrula-stage cells can give rise to the cells of a given germ layer. Later, cells become even more restricted. For example, the pancreatic bud of the endoderm layer can only make the cells of the pancreas.

14

Επίδραση των αυξητικών παραγόντων σε Επίδραση των αυξητικών παραγόντων σε οστεομυϊκούς ιστούςοστεομυϊκούς ιστούς

15

Για την καλλιέργεια και διαφοροποίηση βλαστοκυττάρων και μοσχευμάτων βλαστοκυττάρων χρησιμοποιούνται εξωτερικοί αυξητικοί παράγοντες όπως οι κυτοκίνες. Αυτές σπρώχνουν τα βλαστοκύτταρα να διαφοροποιηθούν σε συγκεκριμένη κατεύθυνση, χρησιμοποιώντας την ανασυνδυαζόμενη τεχνολογία DNA. Οι αλληλεπιδράσεις των πρωτεϊνών με τα κύτταρα και τα μηχανικά ικριώματα όπου εδράζονται τα κύτταρα, έχουν μεγάλη σημασία γιά την αναπαραγωγή του ιστού.

Goessler et al. Cells Tissues Organs 183:169–179, 2006

Μεταγραφικοί παράγοντες που χαρακτηρίζουν τη διαφοροποιήση Μεταγραφικοί παράγοντες που χαρακτηρίζουν τη διαφοροποιήση των εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων σε κύτταρα της καρδιάςτων εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων σε κύτταρα της καρδιάς

16

Srivastava & Ivey, Nature 2006

AcLDL and Lectin staining of EPCs isolated from human peripheral blood after 6 days in culture on glass slides in DMEM supplemented with 20% FBS and 100 g/mL ECGS (Initial density of MNCs: 8.75x105 cells/well)

AcLDL Ulex Europaeus

EPCs Fibronectin

AcLDL / Ulex Europaeus

Double Staining

AcLDL Ulex Europaeus AcLDL / Ulex Europaeus

Double Staining

Rat VSMCs

Negative Control

Human microvascular ECsPositive Control

AcLDL Ulex Europaeus AcLDL / Ulex Europaeus

Double Staining

AcLDL Ulex Europaeus AcLDL / Ulex Europaeus

Double Staining

EPCs Gelatin

20% FBS EBM+ Single Quots

Adherent cells after 2 weeks on 24-well fibronectin coated culture

plates (8.75x105 MNCs/well)

20% FBS DMEM + 100 μg/mL ECGS

Τα εμβρυϊκά πρόδρομα βλαστοκύτταρα είναιΤα εμβρυϊκά πρόδρομα βλαστοκύτταρα είναι ανοσοπρονομιούχα ανοσοπρονομιούχα (immunoprivileged)(immunoprivileged)

Τα εμβρυϊκά πρόδρομα βλαστοκύτταρα είναι ανοσοπρονομιούχα (immunoprivileged) και έτσι μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε θεραπείες και να μην απορρίπτονται σαν μόσχευμα, κάτι που συμβαίνει με άλλους τύπους κυττάρων, μετά από μέτρηση με Κυτταρομετρία Ροής (Flow Cytometry, Fluorescent Activated Cell Sorting; FACS).

Σε υποξικές συνθήκες έχουμε ανεβασμένη έκφραση του VEGF σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης. Το VEGF αυξάνει την αγγειογένεση και ασκεί πολλαπλασιαστική και αντι-αποπτωτική επίδραση στύς όγκους και στα ενδοθηλιακά κύτταρα των όγκων.

18

Wei et al. Cancer Cell, 2004

Προοπτικές χρήσης των βλαστοκυττάρωνΠροοπτικές χρήσης των βλαστοκυττάρων

Η έρευνα στα ανθρώπινα βλαστοκύτταρα συναντά βιοηθικά εμπόδια, γι’ αυτό και έχει αναπτυχθεί πολύ η έρευνα στα βλαστοκύτταρα ποντικού που είναι γενετικά κοντά στον άνθρωπο.

Επίσης χρησιμοποιούνται συχνά ανθρώπινα έφηβα βλαστοκύτταρα τα οποία αν και λίγα σε αριθμό, είναι αυτόλογα, μπορούν να παρθούν από το αίμα και το νωτιαίο μυελό και βοηθούν να ξεπεραστούν τα βιοηθικά διλλήματα που υπάρχουν με την χρήση εμβρύων.

Πρόσφατες ανακαλύψεις που μετατρέπουν π.χ. τα δερματικά κύτταρα σε άλλους τύπους κυττάρων, προβλέπεται να χρησιμοποιούνται ευρύτατα στο μέλλον για την Αναπαραγωγική Ιατρική.

19

Embryonic endothelial Embryonic endothelial progenitorprogenitor cell cell (eEPC) homing in ischemic/hypoxic (eEPC) homing in ischemic/hypoxic areasareas

Tα εμβρυϊκά ενδοθηλιακά βλαστοκύτταρα έχουν την ιδιότητα να καταφεύγουν σε ισχαιμικές/υποξικές περιοχές της κυκλοφορίας.

Προωθούν την δημιουργία νέων αγγείων και βελτιώνουν την αποκατάσταση των ιστών μετά από έμφραγμα του μυοκαρδίου.

Μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν κυτταρικό όχημα γιά γονιδιακή θεραπεία.

Δεν γνωρίζουμε το μηχανισμό του homing.

Είναι πιθανό τα βλαστοκύτταρα να εκφράζουν παράγοντες που λόγω αυτών να έλκονται στις ισχαιμικές περιοχές.

20

Kupatt et al. FASEB, 2005

Τεχνική μικροσυστοιχίας Τεχνική μικροσυστοιχίας DNA (video)DNA (video)

Dr. Melton describes the process used to extract DNA from a cell and to analyze it on a gene chip. Also featured on the DVD Potent Biology: Stem Cells, Cloning, and Regeneration, available free from HHMI.

21

Εκκρινόμενοι παράγοντες από τα εμβρυϊκά Εκκρινόμενοι παράγοντες από τα εμβρυϊκά ενδοθηλιακά πρόδρομα κύτταραενδοθηλιακά πρόδρομα κύτταρα (eEPC) (eEPC)

22

23

...συνέχεια

24

...συνέχεια

Ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα σε καλλιέργειαΑνθρώπινα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα σε καλλιέργεια (video)(video)

Cell cultures derived from human embryonic stem cells can reproduce indefinitely and also differentiate into specialized cell types, including beating heart cells. Also featured on the DVD Potent Biology: Stem Cells, Cloning, and Regeneration, available free from HHMI.

25

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) is performed looking through a microscope and using small glass pipettes to handle human eggs and to remove and transfer nuclei from one cell to another. SCNT is used to produce clones of cells with the same genetic background as the donor nucleus. Also featured on the DVD Potent Biology: Stem Cells, Cloning, and Regeneration, available free from HHMI.

26

Μεταφορά πυρήνα σωματικού κυττάρουΜεταφορά πυρήνα σωματικού κυττάρου (video) (video)

ΕπόμενοΕπόμενο σεμινάριο: Μηχανική Βλαστοκυττάρωνσεμινάριο: Μηχανική Βλαστοκυττάρων..Μέρος Β: Κλινικές εφαρμογέςΜέρος Β: Κλινικές εφαρμογές

Στο επόμενο μάθημα θα ασχοληθούμε με κλινικές εφαρμογές της Μηχανικής Βλαστοκυττάρων.

Θα επικεντρωθούμε στις εφαρμογές στο καρδιοαγγειακό σύστημα.

Τρόποι έκχυσης βλαστοκυττάρων στο σώμα.

Γονιδιακή Μηχανική. Επισκόπηση των σημαντικότερων

μελετών σε ζώα και ανθρώπους. Προβλήματα τεχνικής και ηθικής

φύσεως...

27