实验四 DNA 限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳

EcoR I Restriction Enzyme

识别序列 ------G↓AATT C ------

------ C TTAA↓G ------

实验原理 --- 限制性内切酶及酶切反应

BamH I Restriction Enzyme

识别序列： ------ G↓GATC C ------

------ C CTAG↓G ------

Hind III Restriction Enzyme识别序列： ------ A↓AGCT T ------

------ T TCGA↓A ------

每一种限制性内切酶都有特定的反应条件：

pH 范围： 7.5~8.0 缓冲液组份 : Tris( 三羟甲基氨基甲烷）、 NaCl 、 MgCl2 、 温育温度： 37℃

反应体系：

DNA (1ug 或更少 ) 5ul 10 x Buffer 2ul Restriction Enzyme 3ul

H2O 10ul

Total 20ul

混匀， 37 度保温 30 分钟

实验原理 --- 琼脂糖凝胶电泳

电泳是在一个电场的作用下，在琼脂糖支电泳是在一个电场的作用下，在琼脂糖支持介质上，能将一个混合物分离成若干条区带持介质上，能将一个混合物分离成若干条区带（若干个组分）的过程。（若干个组分）的过程。

琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速、是一种简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。

琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。的电泳介质。

琼脂糖

琼脂糖凝胶的浓度与 DNA 分离范围

琼脂糖浓度 (%) 线型 DNA 分子的分离范围 (Kb)

0.3 5 ～ 60

0.6 1 ～ 20

0.8 0.8 ～ 10

0.9 0.5 ～ 7

1.2 0.9 ～ 6

1.5 0.2 ～ 3

12.0 0.1 ～ 2

电泳法的优点

凡是能带电的物质，都可以用电泳法分离。凡是能带电的物质，都可以用电泳法分离。 样品用量少。样品用量少。 设备简单。设备简单。 可在室温进行。可在室温进行。 操作简便，费时不多操作简便，费时不多 不同类型的电泳，有不同的用途。不同类型的电泳，有不同的用途。 改进或找到更好的支持介质，就有可能大大地提高分辩改进或找到更好的支持介质，就有可能大大地提高分辩

率。率。

1 、 TAE 电泳缓冲液 Tris-base 冰醋酸 EDTA

2 、琼脂糖凝胶（ 0.8% ） 琼脂糖： 0.8g TAE ： 100ml

试剂

3 、溴化乙锭 (ethidium bromide ， EB)

EB 染色液工作液浓度： 0.01~0.03mg/ml EB 是一种荧光染料，其扁平分子可嵌入核酸双链的碱

基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。

4 、 6 x Loading Dye

组成0.25% bromophenol blue （深蓝色）0.4% orange G （黄色）10mol/L Tirs-HCl (pH7.5), 50mol/L EDTA

使用量 5 份 DNA 样品溶液加 1 份 Blue / 6xLoading Dye

操 作 步 骤操 作 步 骤

一、酶切反应一、酶切反应

反应体系： λ － DNA 5ul

10 x Buffer 2ul

Hind III 3ul

H2O 10ul

Total 20ul

混匀， 37 度保温 30 分钟

二、电泳。

1 、电泳前的准备工作 轻轻刷干净电泳制胶的梳子，模板，电泳槽，用蒸馏水洗净晾干，把制胶槽放入模板中。

2 、制 胶 (1) 每组称取琼脂糖 0.24g, 倒入三角瓶，再往其中加入 30ml 电泳缓冲液，微波炉加热直到琼脂糖溶化。（ 2) 每组将琼脂糖液冷却到约 70 ,℃ 轻轻倒入胶槽，并插 上梳子。凝固约 30min.

(3) 取出梳子，把胶放在电泳槽中，准备电泳。

3 、点样和电泳

9 8 7 6 5 4 3 2 1

9 8 7 6 5 4 3 2 1

(1) 将酶切产物、自制 DNA 与 6 x Loading Dye 混 合，每个样品混合后体积均为 24ul 。 a. 自制 DNA 20ul + 4ul Loading Dye b. 酶切产物 20ul +4ul Loading Dye (2) 将标准 λDNA /Hand III 、 λDNA 、酶切产物、自

制 DNA 各 10ul 点入点样孔。(3) 电泳。(4)EB 染色 10min 。（注意不要污染实验室环境）

λ-DNA / Hind III Markers片段大小（ bp ）和电泳带型示意图

点样孔

23130

9416

6557

4361

23222027

4 、紫外分析仪下看胶

23130

23222027

9416 6557 4361

警告

胶染色和观察时一定要带手套！！！

EB （溴化乙锭）诱变！！！

结果记录与分析

绘制电泳图谱