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CYTOBAND-BASED GENE SET ENRICHMENT ANALYSIS DETECTED SPARCL1 AS A MOLECULAR MARKER OF COLORECTAL CANCER

LIVER METASTASIS

结直肠癌肝转移负相关基因： SPARCL1的发现与功能研究

葛维挺，虞舒静，胡涵光，张航，陈华溶，郑树

浙江大学医学部附属第二医院肿瘤研究所，教育部恶性肿瘤预警与干预重点实验室

研究背景 大肠癌是常见的恶性肿瘤之一

－－发病率 3 ～ 5 位－－死亡率 4 ～ 5 位

大肠癌肝转移 －－ 治疗失败的主要原因之一 肝脏－－远处转移的最主要转移部位 预后较差，中位生存期为 5 ～ 10 个月 大肠癌死亡病人（尸检） 可发现 36 ％～ 81 ％

的肝转移

研究目的• 寻找肿瘤转移相关标志物• 原发灶与转移灶特性相似• 转移决定于原发灶

• 通过比较伴肝转移和无转移的肠癌原发灶来寻找转移相关基因

Brabletz T, Nature Rev Cancer 2005

材料与方法

组织类型 病例数无转移肠癌组织 13

伴肝转移肠癌组织 12

基因表达谱数据，芯片类型： Affymetrix

伴肝转移肠癌原发灶组织：经病理证实有肝转移灶

无转移肠癌组织：手术后经随访三年以上无复发或转移

• GSEA ： Gene Set Enrichment Analysis ，基因富集分析方法

• 一种生物信息学方法，用来确定一组预先定义的基因在两组表型不同的样本间是否有表达差异。

• 预定义的基因：如属于同一Pathway 的基因 , 定位于同一Cytoband 的基因

• 本研究中用来发现基因表达存在差异表达的染色体区带

Subramanian et. al, PNAS, 2005

• 基因表达谱数据的GSEA 分析表明：

• 4q22 为肠癌肝转移相关染色体显带，所包含的基因在无转移和伴肝转移肠癌间表达差异显著

• SPARCL1 基因为4q22 中最重要的基因（权重最高）

无转移肠癌　　伴肝转移肠癌

SPARCL1 基本情况• 定位于人类染色体 4q22 ，基因大小为 35 kb ，由 11 个外

显子和 10 个内含子组成• mRNA 长度是 3 kb ，编码 664 个氨基酸，蛋白质分子量

约为 71 kDa ，存在多个糖基化位点• 分泌型的基质细胞糖蛋白，参与多项机体生理过程，如细胞

黏附，细胞增殖，肌肉分化以及 B 淋巴细胞成熟等• 在非小细胞肺癌、转移性前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、慢性

粒细胞白血病中表达下调，在肝癌中表达上调

• SPARCL1 mRNA 的定量， SPARCL1 蛋白的免疫组化• 无转移肠癌 , 伴肝转移肠癌 , 肝转移组织中表达情况

SPARCL1 基因低表达与肠癌肝转移有关

• 表达低：伴肝转移肠癌肝转移灶

• 表达高：无转移肠癌

• 差异显著， P=0.007无转移肠癌

SPA

RC

L1

mR

NA

伴肝转移肠癌

肝转移灶

组织中 SPARCL1 mRNA 定量分析

SPARCL1 蛋白低表达与肠癌肝转移有关

• 表达低：伴肝转移肠癌肝转移灶

• 表达高：无转移肠癌

• 差异显著， P=0.004

• SPARCL1 蛋白表达差异与 mRNA 一致

无转移肠

癌

伴肝转移肠

癌

肝转移

灶

空白 H&E SPARCL1

SPARCL1 蛋白的免疫组化分析

SPARCL1 表达载体构建及抗体制备• 构建带有 His 标签的原核表达载体 pET-22b-SPARCL1

• 构建用于真核表达的逆转录病毒载体 pLXSN-SPARCL1

• 合成多肽作为抗原，制备兔多克隆抗体及鼠单克隆抗体

SPARCL1 蛋白重组表达和纯化• pET-22b-SPARCL1 转化感受态大肠杆菌

E.coli(BL21(DE3)/Polys)

• 扩大培养并以 IPTG 诱导重组蛋白表达• Ni2+金属螯合层析柱纯化

SPARCL1功能研究• 肠癌细胞系中高表达 SPARCL1• 不影响：细胞周期和增殖能力• 影响： 迁移和侵袭能力

细胞周期实验 细胞增殖实验 细胞迁移实验

SPARCL1 蛋白表达与预后

• 生存分析

• 175 例结直肠癌病人

• P = 0.025

• SPARCL1 表达高者预后好

SPARCL1 表达与生存时间

结合其他标志物判断预后

• 多标志物生存分析• P53 、 MAPK 、 E-cadherin

、 MSH2 、 ADCY-2 、 Shp2、 SPARCL1

• 遗传算法• 支持向量机• P53+SPARCL1 的模

型可更好判断预后120100806040200

MONTHS

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

Cum

Surv

ival

Survival Functions

P<0. 001

good prognosi s n=94

bad prognosi s n=37

SPARCL1 基因的低表达与肠癌肝转移有关SPARCL1 基因可能通过抑制细胞的迁移能力影响肿瘤转移

SPARCL1 表达高低可帮助判断肠癌病人的预后，结合经典肿瘤标志物如 P53 构建的多标志物模型可更好判断预后

SPARCL1 为分泌型蛋白，是潜在血清标志物 肿瘤原发灶的分子事件是导致转移的主要因素

• 郑树• 葛维挺

芯片分析， mRNA 定量分析• 虞舒静

免疫组化，预后分析• 胡涵光

抗体制备，真核表达，细胞实验，动物实验

• 张航动物实验，相关通路分析

• 陈华溶融合蛋白表达与纯化， ELISA

谢谢