第十三章 转基因技术与作物育种
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第十三章 转基因技术与作物育种
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第一节 作物的转基因技术
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一、植物转基因育种的程序 目的基因的获得 含目的基因重组质粒的构建 受体材料的选择 转化方法的确定和外源基因的转化 转化植株的鉴定与筛选 安全性评价与育种利用
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二、植物转基因方法概述 1. 农杆菌介导的遗传转化 2. 基因枪转基因 3. 花粉管通道法
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1. 农杆菌介导的遗传转化 Ti 质粒包括 5 个
区域1.LB 与 RB 之间的
T - DNA ,这断序列整合到基因组中; 2. 质粒转移区( PT ); 3. 冠瘿碱代谢区; 4. 复制原点; 5. 毒性区
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根瘤细胞的形成是因为土壤农杆菌中存在着一种诱导瘤细胞( Tumor-inducing) 的质粒 ,这种质粒称为 Ti 质粒;
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农杆菌介导的遗传转化方法研究及宿主范围的拓展
农杆菌较易侵染双子叶植物,对单子叶植物不敏感;通过改变以下条件,现已经获得水稻、小麦、玉米、甘蔗等转基因植株
1. 使用酚类物质诱导 vir 基因表达2. 广寄主范围农杆菌菌株的筛选3. 使用单子叶植物特异启动子和利用分生组织
与农杆菌共培养
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植株原位转化(in planta transformation)
植株抽真空 20 分钟,使细菌进入植物细胞间隙,或者将花朵抽真空让细菌进入,甚至直接用菌液浸泡植株
避免了细胞培养过程,单转化效率不高
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影响农杆菌转化的因素 农杆菌菌株 农杆菌菌株高浸染活力的生长时期 基因活化的诱导物 外植体的类型和生理状态 外植体的预培养 外植体的接种和共培养
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2. 基因枪转基因 通过高压气体等动力,高速发射包裹有重组
DNA 的金属颗粒,将目的基因直接导入受体细胞,并整合到受体上的方法
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带有目的基因的克隆载体
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氯化钙沉淀法制备微弹
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安上了微弹的基因枪
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基因枪轰击植物样品
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转化细胞的组织培养
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再生的转基因植株
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3. 花粉管通道法 是一种直接转化植物种质细胞的技术。它将基因工程技术和传统育种技术相结合,通过创造变异、选择变异、优化农艺性状,实现农作物的分子育种。
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( 1 )作物的开花习性及受精生物学(棉花)
棉花生殖器官的解剖结构• 花器结构:花器、雌蕊、子房、胚珠• 花粉管通道
棉花的开花习性和受精过程(略)
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( 2 )作物种质转化系统或生殖系统转化的机理(棉花)
双受精过程完成后,受精卵细胞的初次分裂需要充分的物质和能量积累。此时期的细胞尚不具备完整的细胞壁和核膜系统,细胞内外的物质交流频繁。通过花粉管通道渗透进入胚囊的外源 DNA 片断有可能进入受精卵细胞,并进一步地通过尚不明确的机理被整合进受体棉花的基因组中。
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( 3 )花粉管通道法对作物的转化 导入总 DNA
导入基因
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( 4 )花粉管通道法的优缺点 优点
• 不依赖于植物组织培养和诱导再生植株等一整套人工培养过程
• 花粉管通道是天然存在的,理论上讲,该方法可用于任何开花植物,从而极大地扩展了受体植物种和品种的范围。
• 转基因植株的鉴定方面,可以直接鉴定转基因植株,避免使用选择标记基因或报告基因
• 转化速度快,转化效率可达 1 %左右• 方法简便,适合大规模的遗传转化
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缺点• 进行外源基因转化的工作时间受受体作物自然花期的限制,同时必须充分了解每一种植物的开花受精生物学特性及其时间进程。
• 在田间进行操作,受环境条件的影响较大。• 操作的经验性很强,需要一定的技术摸索和技巧• 对单籽粒的小花农作物,操作难度大。
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( 5 )作物花粉管通道法的操作程序及影响因素(棉花)
影响转化率的因素• 掌握受体植物的受精过程及时间规律,是花粉管通道法转化的关键因素之一。棉花的株心孔道开放时间大约在授粉后 12- 28h 左右。因此一定要掌握导入 DNA 的时间。
• 供体 DNA 片断的纯度对转基因植株的获得及后代的表型变异有一定的影响
• 微注射时,既要保证子房能够获得足量的 DNA溶液,又要尽量减轻对子房的机械损伤及由膨压引起的伤害。
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第二节 转基因作物的遗传特点 外源基因整合的机制 整合后的外源基因在植株体内的表现 外源基因在后代中的遗传规律
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一、外源基因整合的机制 同源重组整合 位点特异性重组 转座作用 异常重组
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二、整合后的外源基因在植株体内的表现
转化频率 能否表达 表达水平 基因沉默:顺式失活、反式失活、共抑制
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三、外源基因在后代中的遗传规律
一个位点的整合: 3 : 1 二个位点的整合: 15 : 1 63 : 1
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第三节 转基因植物的应用
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第四节 转基因作物品种的选育 转基因作物育种目标的制订 转基因方法的确定及转基因植株的获得 转基因作物品种的选育
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一、转基因作物目标的制订 依据市场经济的需要和生产发展前景 依据不同的自然环境、栽培条件,抓主要矛盾
落实具体性状目标 要考虑品种搭配 要充分考虑到转基因作物,尤其是外源目的基因对人类健康和环境安全的影响
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二、转基因方法的确定及转基因植株的获得
方法:农杆菌介导,基因枪,花粉管通道 受体品种选择
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三、转基因作物品种的选育 纯系育种 回交育种 杂交育种 杂种品种
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第五节 转基因作物的生物安全性
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NEWS
2006年 3月 14日上午 10 时,国际环保组织绿色和平在京宣布,在亨氏婴儿营养米粉中发现未经政府批准的转基因稻米成分。消费者纷纷要求退货,亨氏被迫召回涉嫌转基因米粉。。。
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二、转基因生物是柄“双刃剑” 转基因生物给人类创造了巨大的经济和社会效益的同时,也可能给人类带来极大的潜在或现实危害。
康奈尔大学斑蝶事件 加拿大“超级杂草”事件 墨西哥玉米事件
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转基因生物的潜在危害( 1 ) 对生态环境的影响:植物的“转基因逃逸” 种苗的散失 /残缺组织的再生 花粉的传播
《转基因生物安全》
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“转基因逃逸”造成的危害: 诱发害虫和野草的抗性问题 诱发基因转移跨越物种屏障 诱发自然生物种群的改变 基因污染 食物链的破坏
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转基因生物的潜在危害( 2 ) 转基因食品的安全性问题: 毒性问题 过敏性反应问题 抗药性问题 有益成分问题
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转基因安全隐患的缘由( 1 ) “实质等同”概念的误导 “实质等同”( substantial equivalence )是将 GMO 与非 GMO 进行比较,如果没有发现二者有显著差别,就认为该 GMO 是安全的。
不科学的审批程序与“不可预测效应”
《转基因生物安全》
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基因工程的非精确性 外源基因插入的随机性——性状的随机性 外源基因插入的非精确性——不可预测 启动子与标记基因——稳定性差
转基因安全隐患的缘由( 2 )
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缺乏识别不可预知效应的科学实验 动物毒性实验 评价程序中生长条件的相似
转基因安全隐患的缘由( 3 )
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三、转基因生物的安全评价 过敏性评价:
Mol.Nutr.Food Res. , 2004, 48,413-423
“Should a new protein be
considered as an allergen?”
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抗生素标记性基因: 评价内容: 在人和农场动物肠道中转移 在土壤中向微生物的潜在水平转移 培育无抗性标记基因的转基因植物已成为基
因工程育种的重要目标。
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意料外改变影响分析: Non-targeted approach DNA analysis. Gene expression analysis Proteomics. Chemical fingerprinting
The Plant Journal , 2001 , 27(6), 503-528
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四、转基因生物安全的新思维
转基因生物环境影响评价: 主题:生物安全性 重点:生物多样性安全、生态环境质量、人类健康安全
要点:“基因漂移”危害和转基因生物的毒性和过敏性
难点:不确定性因素太多
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转基因的抗虫玉米的花粉撒在了马利筋杂草上面,而北美斑蝶要吃这种杂草,结果吃了这种叶子斑蝶,就毒死了幼虫。斑蝶蝴蝶是北美一种珍稀濒危动物,所以
在当时在全世界都引起了很大的反响。 1999年5月,康奈尔大学的一个研究组在《Nature》杂志上发表文章,声称转基因抗虫玉米的花粉飘到一种名叫 "马利筋 " 的杂草上,用马利筋叶片饲喂美国大斑蝶,导致44%的幼虫死亡。事实上,这一实验结果在科学上没
有说服力。因为试验是在实验室完成的,且没有提供使用花粉量的数据。 现在这个事件也有了科学的结论:
第一,玉米的花粉非常重,扩散不远,在玉米地以外5米,每一平方厘米马利筋叶片上只找到一个玉米花粉。
第二,2000年开始在美国三个州和加拿大进行的田间试验都证明,抗虫玉米花粉对斑蝶并不构成威胁,实验室试验中用10倍于田间的花粉量来喂大斑
蝶的幼虫,也没有发现对其生长发育有影响。 斑蝶减少的真正原因,一是农药的过度使用,二是墨西哥生态环境的破坏.
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有人认为,外源基因的导入可能会造就某种强势生物,从而破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样性。 1995年,加拿大首次商业化种植了通过基因工程改造的转基因油菜。但在种植后的几年里,其农田便出现了对多种除草剂具有耐抗性的野草化的油菜植株,即超级杂草。如今,这种杂草化油菜在加拿大的草原农田里已非常普遍。因为一些转基因油菜籽在收获时掉落,留在了泥土中,来年它们又重新萌发。如果在这片田地上种下去的不是同一个物种,那么萌发出来的油菜就变成了一种不受欢迎的野菜,而且这种能够同时抵御三种除草剂的野草化的油菜不但很难铲除,而且还会通过交叉传粉等方式,污染同类物种,使种质资源遭到
破坏。 应当指出的是,“超级杂草”并不是一个科学术语,只是一个形象化的比喻,目前并没有证据证明已经有“超级杂草”存在。同时,基因漂流并不是从转基因作物开始,而是历来都有。如果没有基因漂流,就不会有进化,世界上也就不会
有这么多钟的植物和现在的作物栽培品种。 二
、转基因生物是柄“双刃剑”
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2001年发现的一种墨西哥玉米基因污染的问题是比较重要的。还有《自然》 2001年曾经发表文章,关于墨西哥玉米遭到转基因玉米污染的事件。墨西哥本身不种植转基因的玉米,而且有法规规定不允许种植,但是它进口美国的转基因玉米用做饲料。结果可能是有些农民拿转基因玉米去种,种完之后就污染了当地的玉米。墨西哥是玉米的原产地。如果玉米原产地的遗传多样性受到污染,本地的玉米遗传结构受到破坏,产生的污染问题是很严重的。这件事对中国也有很大的启示。中国现在进口转基因大豆,而中国是大豆的原产地,很有可能转基因的大豆会对中国当地原产的大豆,发生遗传污染。因此,现在国家对转基因的大豆控制还是比较严格,不允许种植。