微生物与环境检测实验——多管发酵法测量水中大肠菌群

一、目的要求

1 、学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法

2 、了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性

二、基本原理 若水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污染，然而肠道病原菌在水中易死亡、易变异，数量少，难检测，这就要找到一个合适的指示菌，此指示菌要求是：粪便中大量出的非病原茵，易检出。 最广泛应用的指示菌是大肠菌群，其特点： 好氧和兼性厌氧； 革兰氏阴性； 无芽胞的杆状细菌； 在乳糖培养基中 37℃ 培养 24 ～ 48h 能产酸产气。我国规定每升自来水中≤ 3 个；加氯消毒即供饮用水的水源水≤ 1 000 个；净化及加氯消毒后供饮用水的水源水≤ 10 000 个。

检查大肠菌群的方法有多管发酵法与滤膜法两种。多管发酵法又称水的标准分析方法，为我国大多数卫生单位与水厂所采用。多管发酵法包括：初步发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。

1 ．初步发酵试验利用大肠菌群能发酵乳酸而产酸产气的原理来检测。乳糖能起选择作用；德汉氏小管收集产生的气体；溴甲酚紫作为 pH 指示剂，产酸后即由紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽胞菌生长的作用。

1 、平板分离 平板分离使用 EMB( 伊红美蓝琼脂培养基 ) 。大肠菌群

发酵造成酸性环境时， EMB 中伊红与美蓝作为指示剂，结合成复合物，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色 ( 龙胆紫 ) 菌落。初发酵管 24h 内产酸产气和 48h产酸产气的均需在以上平板上划成分离菌落。

2 、复发酵实验 以上大肠菌群阳性的菌落的，再通过与第一步相同的原

理来进一步确认。

1 、培养基： 乳糖蛋白胨发酵管 ( 内有倒置小套管 ) ， 三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管 ( 内有倒置小套管 ) ， 伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。 2 、仪 器：干热灭菌锅，高压蒸汽灭菌锅，洁净工

作台，培养箱，灭菌吸管，灭菌试管，培养皿，灭菌三角瓶。

三、实验器材

四．操作步骤

1 ．培养基配置 (1) ．乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 乳糖 5g NaCl 5g 蒸馏水 1000ml 调 pH 至 7.2 ～ 7.4 1.6 ％溴甲酚紫乙醇溶液 1ml充分混匀，分装于有小倒管的试管中。 115℃ 灭菌 20min 。 (2) ．三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液具体配置方法同上，除水以外每组分量为原来 3 倍。

(3) ．伊红美蓝培养基： (EMB 培养基 ) 称取伊红美蓝琼脂干粉 35g ，加热溶化溶解于 100

0ml 水中， 116℃ 灭菌 30min 。灭菌后，冷却至 60℃ 左右时倒平板备用。

每升中含以下成分：蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氢二钾 2g 2% 伊红水溶液 20ml 0.65% 美蓝水溶液 10ml 琼脂 15g

2 ．自来水检查 (1) ．水样的采取：火焰烧灼水龙头 3min 灭菌，放水 5

min 后，以灭菌三角烧瓶接取水样，待分析。 (2) ．初发酵试验：在 2 个含有 50ml 三倍浓缩的乳糖

蛋白胨发酵烧瓶中，各加入 100ml 水样。在 10 支含有 5ml 三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入 10ml水样。混匀后， 37℃ 培养 24h 。 24h 未产气的继续培养至 48h 。

(3) ．平板分离：经 24h 培养后，将产酸产气及 48h 产酸产气的发酵管 ( 瓶 ) ，分别划线接种于伊红美蓝琼脂干板上。再于 37℃ 下培养 18 ～ 24h ，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片。革兰氏染色，镜检。

① ．深紫黑色、有金属光泽 ② ．紫黑色、不带或略带金眉光泽 ③ ．淡紫红色、中心颜色较深

(4) ．复发酵试验：经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽抱杆菌，则挑取该菌落的另一部分。重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落 1 ～ 3 个， 37℃ 培养 24h ，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。

证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管( 瓶 ) 数查表 2.3 ，即得大肠菌群数。

3 ．池水．河水或湖水等的检查 (1) ．水样的采取：取距水面 10 ～ 15cm 的深层水样，先将灭

菌的带玻璃塞瓶瓶口向下浸入，然后翻转过来，除塞后盛满水样，再从水中取出，即得所测水样。须及时检测，否则应放入后冰箱中保存。

(2) ．初发酵试验 ① ．将水样稀释成 10-1 、 10-2 。 ② ．分别吸取 1ml 10-1 、 10-2 的稀释水样和 1ml 原水样各注

入装有 10ml 普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中，另取 10ml 和 100ml 原水样，分别注入装有 5ml 和 50ml 三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中。

③ ．混匀， 37℃ 培养 24h ，观察细菌产酸产气情况。 (3) ．平板分离实验 将产酸产气 ( 阳性 ) 发酵管分别接种于 EMB 上， 37℃ 下培养 1

8 ～ 24h ，观察是否为阳性菌落。 (4) ．复发酵实验：（同上），查表 2-4 ， 2-5 。

五．实验结果1 ．自来水 100 ml 水样的阳性管数是多少？ 10 ml水样的阳性管数是多少 ? 查表－ 2.1 得每升水样中大肠菌群数是多少 ?

2 ．池水、河水或湖水 阳性结果记“ +” ，阴性结果记“ -” 。水样管溶液 /ml

现象发酵结果

初发酵 平板分离 复发酵

100

10

1

10-1

10-2

查表－ 2.2 得每升水样中大肠菌群数是多少 ?查表－ 2.3 得每升水样中大肠菌群数是多少 ?

实验日程安排周一1 、领取器材500ml 三角瓶 ×1 （取自来水） 150ml 具塞三角瓶 × 1 （取湖水） 250ml 三角瓶 ×4 （ 1 个无菌水、 2 个自来水初发酵、 1 个湖水初

发酵）试管 × 25 （ 10 支自来水初发酵， 4 支湖水初发酵， 3 支配湖水梯

度， 8 支预留复发酵）9cm 培养皿 ×8 （预留复发酵）1ml 移液管 ×3 （配湖水梯度用）10ml 移液管 ×3 （ 1 支配培养基用， 1 支自来水， 1 支湖水）试管架 ×1记号笔 × 1

2 、配培养基（ 1 ）普通浓度蛋白胨培养基 200ml 每支试管分装 10ml ，装入德汉氏小管，共 10 支。其中 3 支

湖水初发酵， 7 支预留复发酵。（ 2 ） 3 倍浓度蛋白胨培养基 400ml 1> 每个 250 ml 三角瓶中分装 50ml ，装入德汉氏小管，共 3

个。其中 2 个自来水初发酵， 1 个湖水初发酵。 2 > 每支试管分装 5ml ，装入德汉氏小管，共 11 支。其中 10

支自来水初发酵， 1 支湖水初发酵。（ 3 ）无菌水 250ml 三角瓶中装入蒸馏水 150ml ，灭菌待用。

3 、灭菌（ 1 ）干热灭菌 培养皿 ×8 1ml 移液管 ×3 10ml 移液管 ×3 500ml 三角瓶 ×1 150ml 具塞三角瓶 × 1（ 2 ）湿热灭菌 试管 ×25 250ml 三角瓶 ×4

1 、采样 自来水 湖水（九曲桥）2 、接种 （ 1 ）自来水 2 个 50ml 三倍培养基三角瓶中分别接 100ml 水样 10 支 5ml 三倍培养基试管中分别接 10ml 水样（ 2 ）湖水 1 个 50ml 三倍培养基三角瓶中接 100ml 水样 1 支 5ml 三倍培养基试管中接 10ml 水样 3 支 10ml 普通培养基试管中分别接入 10-1 稀释、 10-2 稀释、原水样各 1ml3 、培养： 37 摄氏度培养箱中培养4 、配 EMB 培养基 100ml ，装入 250ml 三角瓶中灭菌。取出后在洁净工作

台上倒入无菌培养皿中，制成 EMB 平板

周二：初发酵实验

1 、观察 24h 初发酵实验结果，并记录产酸产气结果。未产酸产气的继续培养至 48 h 。阳性管记“ +” ，阴性管记为“ -” 。

2 、初发酵阳性管划线接种到 EMB 平板中， 37 度倒置培养。

周三：平板分离

周四：观察平板分离结果，染色，复发酵实验1 、取培养 24h 的 EMB 平板观察，挑选出具有以下特征的菌落 ① ．深紫黑色、有金属光泽 ② ．紫黑色、不带或略带金眉光泽 ③ ．淡紫红色、中心颜色较深2 、挑取符合特征的菌落其中一小部分做革兰氏染色观察，是否为革兰氏阴性、无芽胞的杆状细菌，是则记为阳性。3 、在阳性平板中挑取涂片观察过的菌落 1-3 个接种到复发酵培养基中。

1 、观察复发酵结果，确认阴性或者阳性。2 、查表计算出水样中大肠菌群数量。3 、清洗平板、试管等实验器材并归还。

周五：观察复发酵结果

周六个别初发酵需 48h 的观察实验结果