第一大章 蛋白质

第一篇 生物分子的结构和化学

湖北大学生命科学学院 5楼 B-503室 : 027-50865613

yangyanyan@hubu.edu.cn

为什么要研究蛋白质 ? 蛋白质功能的多样性（ P72)

1. 催化作用：酶，生命活动的核心2. 调节：调节和控制各种生命活动。激素：胰岛素，生长素…3. 转运：血红蛋白和肌红蛋白运输氧；细胞色素 C 传递电子；离子通道4. 贮藏：作为生长发育的原料和能量5. 运动：肌球蛋白和肌动蛋白；细菌的鞭毛和纤毛蛋白 6. 结构成分：毛发中的角蛋白，肌腱中的胶原蛋白7. 支架作用：细胞骨架中的支架蛋白8. 预防和进攻：免疫反应中的抗体， 凝血酶，蛇毒毒素

蛋白质的结构组织一级结构 (Primary structure) ：多肽共价主链的氨基酸顺序二级结构 (Secondary structure) ：多肽链借助氢键排列成沿一维方向具有周期性结构的构象，如 α- 螺旋， β- 折叠三级结构 (Tertiary structure) ：多肽链借助各种次级键（非共价键）盘绕成具有特定肽链走向的紧密球状构象四级结构 (Quarternary structure) ：寡聚蛋白中各亚基之间在空间上相互关系或结合方式

..\..\Media\pdb\1GZX-Hb-OXY T STATE HAEMOGLOBIN.pdb

主要内容

第 2 章 蛋白质的构件——氨基酸第 3 章 蛋白质的通性、纯化和表征第 4 章 蛋白质的共价结构第 5 章 蛋白质的三维结构第 6 章 蛋白质的功能与进化

第 2 章 蛋白质的构件—氨基酸蛋白质的化学组成和分类蛋白质的水解- 氨基酸的一般结构氨基酸的分类 氨基酸的酸碱性质氨基酸的化学反应氨基酸的旋光性和光谱性质氨基酸混合物的分离分析

第 2 章 蛋白质的构件 - 氨基酸

一、蛋白质的化学组成和分类元素组成：

C （ 50）、H （ 7%）、O （ 23%）、 N （ 16%）、 S （ 0-3%），其它元素（ P 、 Na、 Fe、 Mg、 Ca ) 微量。

N 的含量平均为 16%—— 凯氏（ Kjadehl）定氮法的理论基础

蛋白质含量 = 蛋白氮 *6.25

一、蛋白质的化学组成和分类* 凯氏 (Kjedahl) 定氮法的计算：蛋白质含量 = 蛋白氮 × 6.25

•各个品牌奶粉中蛋白质含量为 15-20% ，蛋白质中含氮量平均为 16% 。以某合格牛奶蛋白质含量为 2.8% 计算，含氮量为0.44% ，某合格奶粉蛋白质含量为 18%计算，含氮量为 2.88% 。

•三聚氰胺含氮量为 66.6% ，是牛奶的151 倍，是奶粉的 23 倍。每 100g 牛奶中添加 0.1 克三聚氰胺，就能提高 0.4% 蛋

白质。

三聚氰胺奶粉事件

蛋 白 质 的 分 类1. 按化学结构（ P15, 表 2-1 ） 简单蛋白――蛋白质完全由氨基酸组成。核糖核酸酶

、胰岛素 缀（结）合蛋白――除了蛋白质部分外，还有非蛋白

质成分（辅基、配基）。如血红蛋白、核蛋白。

2. 按蛋白质的功能：酶、调节蛋白、转运蛋白、营养和贮存蛋白、防御蛋白质、收缩和游动蛋白、结构蛋白、支架蛋白、保护和开发蛋白等。

分子组成

简单蛋白（按溶解性）

缀合蛋白（按辅基）

清蛋白球蛋白

谷蛋白谷醇溶蛋白

鱼精蛋白组蛋白硬蛋白核蛋白糖蛋白与蛋白聚糖脂蛋白血红素蛋白、黄素蛋白磷蛋白金属蛋白

（ P.15 表 2-1 ）

蛋 白 质 的 分 类

3.蛋白质形状球状蛋白

纤维状蛋白 （按分子外形）

球状蛋白质――分子对称性佳，外形接近球状或椭球状，溶解度较好，能结晶。如血红蛋白、血清球蛋白。纤维状蛋白质――对称性差，分子类似细棒或纤维状。可溶性纤维状蛋白质――肌球蛋白。不溶性纤维状蛋白质――胶原、弹性蛋白。

二、蛋白质的水解酸水解 6 M HC1 ，真空， 112-116℃， 24 小时。 优点：不容易引起水解产物的消旋化。得到 L- 氨基酸； 缺点：色氨酸 Trp 被破坏，羟基氨基酸（丝氨酸 Ser, 苏氨酸

Thr ）部分被破坏，天冬酰氨 Asn ，谷氨酰胺 Gln 的酰胺基被水解。

碱水解 4 M NaOH ( 塑料小管 , 如 Teflon), 在 112℃ 水解 16 小时

。 多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并产生消旋现象；但色氨酸 Trp 是稳定的。

13

二、蛋白质的水解二、蛋白质的水解碱水解可产生消旋，水解产物氨基酸为消旋物；且引起精氨酸脱氨，生成鸟氨酸和尿素；但不破坏色氨酸 .

酶水解 不产生消旋作用，不破坏氨基酸；但水解不彻底。常用的酶有：胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶。

目的：部分水解，用于蛋白质肽谱分析或大蛋白质的一级结构分析。

三、 - 氨基酸的一般结构

除脯氨酸外，其他构成蛋白质的基本氨基酸均具有如下结构通式。各种氨基酸的区别在于侧链 R 基的不同。从蛋白质中分离出来的所有氨基酸（除甘氨酸外）都是 L-型的 - 氨基酸 .

COOH

C HH2N

R

- 氨基酸不变部分

可变部分

( 不带电形式 )

H2N—Cα—H

COOH

R

Cα 如是不对称 C （除 Gly ），则：

1. 具有两种立体异构体 [D-型和 L-型 ]

2. 具有旋光性 [左旋（ - ）或右旋（ +） ]

+H3N—Cα—H

COO-

R(两性离子形式 )

常见的蛋白质氨基酸（ P.17 表 2-2 ）不常见的蛋白质氨基酸：由多肽中相应的常见氨基酸修饰而来 (p19 图 2-7).

非蛋白质氨基酸：多数是蛋白质氨基酸的衍生物，也有 D- 型、 β-、 γ-、 δ-氨基酸。一些是重要的代谢中间物 ( 图2-8) 。

四、氨基酸的分类四、氨基酸的分类

20 种基本氨基酸的简写符号名称名称 NameName CodeCode CodeCode 名称名称 NameName CodeCode CodeCode

丙氨酸丙氨酸 AlanineAlanine AlaAla AA 亮氨酸亮氨酸 LeucineLeucine LeuLeu LL

精氨酸精氨酸 ArginineArginine ArgArg RR 赖氨酸赖氨酸 LysineLysine LysLys KK

天冬酰胺天冬酰胺 AsparaginAsparaginee

AsnAsn NN 甲硫氨酸甲硫氨酸 MethioninMethioninee

MetMet MM

天冬氨酸天冬氨酸 Aspartic Aspartic acidacid

AspAsp DD 苯丙氨酸苯丙氨酸 PhenylalaPhenylalaninenine

PhePhe FF

半胱氨酸半胱氨酸 CysteineCysteine CysCys CC 脯氨酸脯氨酸 ProlineProline ProPro PP

谷氨酰胺谷氨酰胺 GlutamineGlutamine GlnGln QQ 丝氨酸丝氨酸 SerineSerine SerSer SS

谷氨酸谷氨酸 Glutamic Glutamic acidacid

GluGlu EE 苏氨酸苏氨酸 ThreonineThreonine ThrThr TT

甘氨酸甘氨酸 GlycineGlycine GlyGly GG 色氨酸色氨酸 TryptophaTryptophanene

TrpTrp WW

组氨酸组氨酸 HistidineHistidine HisHis HH 酪氨酸酪氨酸 TyrosineTyrosine TyrTyr YY

异亮氨酸异亮氨酸 IsoleucineIsoleucine IleIle II 缬氨酸缬氨酸 ValineValine ValVal VV

不常见蛋白质氨基酸 4- 羟脯氨酸 5- 羟赖氨酸 ε-N-甲基赖氨酸 -羧基谷氨酸 磷酸丝氨酸 硒代半胱氨酸非蛋白质氨基酸

肌氨酸 β-丙氨酸 - 氨基丁酸 鸟氨酸 （尿素合成） 瓜氨酸

（ P.19 ）

构成蛋白质的 20种基本氨基酸按侧链 R极性可分为 3 类：非极性氨基酸、极性但不带电荷的氨基酸、带电荷的氨基酸。按 R 的化学结构也可分为 3 类：脂肪族氨基酸（ 15）、芳香族氨基酸（ 3 ）、杂环族氨基酸（ 2 ）。

四、氨基酸的分类四、氨基酸的分类

1. 氨基酸按 R 基极性分类

非极性氨基酸 : Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met

R 基具极性不带电荷的氨基酸 : Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln

R 基带正电荷的氨基酸 : Lys, Arg, His

R 基带负电荷的氨基酸 : Asp, Glu

http://www.people.virginia.edu/~rjh9u/aminacid.html

20 Amino Acids

Nonpolar,

hydrophobic

Polar, uncharged

Polar,

charged

2. 根据 R 基化学结构分类

（ 1 ）脂肪族氨基酸（ 15 ） ：Gly、 Ala、 Val、 Leu、 Ile、Met、

Cys；Arg、 Lys、 Asp、 Glu、 Asn、 Gln、

Ser、 Thr

（ 2 ）芳香族氨基酸： Phe、 Tyr

（ 3 ）杂环氨基酸： Trp、 His

杂环亚氨基酸： Pro

脂肪族氨基酸

甘氨酸 Glycine

H2N CH C

H

OH

O

（ R基）

脂肪族氨基酸

H2N CH C

CH3

OH

O

甘氨酸 Glycine

丙氨酸 Alanine

脂肪族氨基酸

甘氨酸 Glycine

丙氨酸 Alanine

缬氨酸 Valine

H2N CH C

CH

OH

O

CH3

CH3

脂肪族氨基酸

甘氨酸 Glycine

丙氨酸 Alanine

缬氨酸 Valine

亮氨酸 LeucineH2N CH C

CH2

OH

O

CH CH3

CH3

脂肪族氨基酸

甘氨酸 Glycine

丙氨酸 Alanine

缬氨酸 Valine

亮氨酸 Leucine

异亮氨酸 Ileucine

H2N CH C

CH

OH

O

CH3

CH2

CH3

脂肪族氨基酸

甘氨酸 Glycine

丙氨酸 Alanine

缬氨酸 Valine

亮氨酸 Leucine

异亮氨酸 Ileucine

甲硫氨酸 Methionine

H2N CH C

CH2

OH

O

CH2

S

CH3

脂肪族氨基酸

甘氨酸 Glycine

丙氨酸 Alanine

缬氨酸 Valine

亮氨酸 Leucine

异亮氨酸 Ileucine

甲硫氨酸 Methionine

半胱氨酸 Cysteine

H2N CH C

CH2

OH

O

SH

脂肪族氨基酸

精氨酸 Arginine

H2N CH C

CH2

OH

O

CH2

CH2

NH

C

NH2

NH

脂肪族氨基酸

精氨酸 Arginine

赖氨酸 LysineH2N CH C

CH2

OH

O

CH2

CH2

CH2

NH2

脂肪族氨基酸

天冬氨酸 Aspartate

H2N CH C

CH2

OH

O

C

OH

O

脂肪族氨基酸

天冬氨酸 Aspartate

谷氨酸 Glutamate

H2N CH C

CH2

OH

O

CH2

C

OH

O

脂肪族氨基酸

丝氨酸 Serine

H2N CH C

CH2

OH

O

OH

脂肪族氨基酸

丝氨酸 Serine

苏氨酸 Threonine

H2N CH C

CH

OH

O

OH

CH3

脂肪族氨基酸

天冬酰胺 Asparagine

H2N CH C

CH2

OH

O

C

NH2

O

脂肪族氨基酸

天冬酰胺 Asparagine

谷氨酰胺 Glutamine

H2N CH C

CH2

OH

O

CH2

C

NH2

O

杂环族氨基酸

脯氨酸 Proline

HN

C

OH

O

杂环族氨基酸

组氨酸 Histidine H2N CH C

CH2

OH

O

N

NH

芳香族氨基酸

苯丙氨酸

PhenylalanineH2N CH C

CH2

OH

O

芳香族氨基酸

苯丙氨酸

Phenylalanine

酪氨酸

Tyrosine

H2N CH C

CH2

OH

O

OH

芳香族氨基酸

苯丙氨酸

Phenylalanine

酪氨酸

Tyrosine

色氨酸

Trytophan

H2N CH C

CH2

OH

O

HN

五、氨基酸的酸碱性质

兼性离子 （偶极离子）氨基酸的解离性质 氨基酸的等电点

1.兼性离子

氨基酸在中性 pH 时，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化 (-NH3

+) 形式存在，羧基是以离解状态 (-COO-) 存在。

在不同的 pH 条件下，氨基酸的解离状态可随之发生变化（两性电解质）

COO-

C HH3N+

R

-pK1'

+

H+

H+

COOH

C HH3N+

R H+

H+

+

pK2'- COO

-

C HH2N

R

pH 强酸性 中性 强碱性净电荷 +1 0 -1

阳离子 兼性离子 阴离子 A+ （质子供体） A0 等电点 pI A- （质子受体）

2.氨基酸的解离性质

氨基酸解离曲线 (1)等电点 (Isoelectric Point, pI )

净电荷为零时的 pH值

pI = (2.34 + 9.6)/2 = 5.97

)( 2121

aa pKpKpI

甘氨酸甘氨酸的的等电点：：

侧链不含离解基团的中性氨基侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的酸，其等电点是它的 ppKKaa11和和ppKKaa22 的算术平均值。的算术平均值。

当 10mmolGly 溶于水（ pH=6 ）用标准 NaOH滴定，以摩尔数对 pH 作图（ B， pH9.60 为拐点）；若用标准若用标准 HCHCI

滴定，以摩尔数对 pH 作图（ A， pH2.34 为拐点）

A【 A0 =A+ 】

B【 A0 =A- 】

氨基酸解离曲线 (2)

)( 121

aRa pKpKpI

pI = (2.19 + 4.25)/2 = 3.22

谷氨酸谷氨酸的的等电点：：侧链含有可解离基团侧链含有可解离基团的氨基酸，其的氨基酸，其 pI值也值也决定于两性离子两边决定于两性离子两边的的 ppKK’’值的算术平均值的算术平均

值。值。

氨基酸解离曲线 (3)

)( 221

aRa pKpKpI

pI = (9.17 + 6.0)/2 = 7.58

组氨酸组氨酸的的等电点：： 侧链含有可解离基团的侧链含有可解离基团的氨基酸，其氨基酸，其 pI值也决定值也决定于净电荷为零的两性离子于净电荷为零的两性离子两边的两边的 ppKK’’ 值的算术平均值的算术平均

值。值。

当溶液浓度为某一 pH值时，氨基酸分子中所含的正负电荷正好相等，净电荷为 0 。这一 pH值即为氨基酸的等电点，简称 pI 。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。表 2-3 氨基酸解离常数、 pI 和比旋（ P.21 ）

3.氨基酸的等电点

侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK’1和 pK’2 的算术平均值：

pI = (pK1 +

pK’2 )/2

侧链含有可解离基团的氨基酸，其 pI值也决定于等电兼性离子两边的 pK 值的算术平均值。

酸性氨基酸： pI = (pK’1 + pK’R-COO- )/2

硷性氨基酸： pI = (pK’2 + pK’R-NH2 )/2

无论氨基酸侧链是否解离，其 pI值均决定于净电荷为零的等电兼性离子两边的 ppKK’’值算术平均值。

-羧羧羧羧羧羧羧（脱羧基反应、成盐、（脱羧基反应、成盐、成酯、成酰成酯、成酰氯、成酰胺反应氯、成酰胺反应））- 氨基参与的反应（与甲醛的反应，脱氨基和转氨基反应）-羧羧羧羧羧羧羧羧羧羧羧羧（茚三酮反应，成肽反应）（茚三酮反应，成肽反应）侧链基团的化学性质（羟基与巯基）

六、氨基酸的化学反应

（一） α-羧基反应成盐反应、成酯反应：Glu + NaOH Glu-Na +H2O氨基酸与无水乙醇的反应：保护羧基

成酰氯反应多肽合成中羧基的活化

成酰胺反应脱羧基反应脱羧酶（见氨基酸代谢）

脱羧反应

脱羧反应

用途：酶催化的反应。

CO2+H++R CH2 NH2R CHCOO-

NH3+

--羧基参与的反应羧基参与的反应

（二） α- 氨基反应与酰化试剂反应 氨基酸的氨基被酰氯或酸酐酰基化。 苄氧甲酰氯 (CBZ-Cl) CBZ-AA （用于氨基的保护试剂） 叔丁氧甲酰氯 (BOC-Cl) BOC-AA （用于氨基的保护试剂） 丹磺酰氯 (DNS ，有荧光，用于多肽链 NH2末端分析 ) DNS-AA （

用于多肽链 N末端的标记和微量氨基酸的定量测定）烃基化反应 2’4- 二硝基氟苯（ DNFB ）， Sanger 测定多肽 N－末端氨基酸的方

法。 苯异硫氰酸酯（ PITC ）， Edman 测定多肽 N－末端氨基酸的方法。

形成西佛碱 (Schiff’s base) 反应与亚硝酸反应 Van Slyke 法测定氨基氮的基础，用于氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定。

转氨基反应的中间体。脱氨基反应 (见氨基酸代谢 )

（（11

）酰化反应

）酰化反应

用途：用于保护氨基以及肽链的氨基端测定等。

R1 C X

O

+ H2N CH COO-

R2

X=-Cl, OH,-OCOR

OH-

CH COO-

R2

R1 C HN

O

- 氨基参与的反应

H2N—CH—COOH + + R

NCH3 CH3

O=S=O

Cl

5- 二甲氨基萘磺酰氯（ DNS-Cl ）

pH9.7 40℃

NCH3 CH3

O=S=O

HN—CH—COOH

R

DNS- 氨基酸

取代 DNFB测定蛋白质 N端氨基酸，灵敏度高

（（22

）烃基化反应

）烃基化反应

用途：是鉴定多肽 N-端氨基酸的重要方法。

CH2 CH2 Cl

S:

R1

S+

R1

CH2 CH2

Cl

H2N CH COO-

R2

R1SCH2NHCH(R2)COO-

- 氨基参与的反应

（ 3 ）与 2,4- 二硝基氟苯 (DNFB) 的反应

NO2

FO2N + HN—CH—COOH

R

NO2

O2N HN—CH—COOH

R

+ HF

弱碱性

DNP-氨基酸

(4) N端氨基酸与异硫氰酸苯酯（ PITC ）的反应

—N=C=S + N—CH—COOH

H

H R

PITC

—N—C—N—CH—COOHH H R

S PTC- 氨基酸

—N—C

H R

S

NC

CO PTH-氨基酸

pH8.3

无水 HF

重复测定多肽链 N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺

序自动分析仪”

（（55

）生成西佛碱的反应

）生成西佛碱的反应

用途：是多种酶促反应的中间过程。

HOCH2CHNH2

COOH

+

CH2OPO3-

C

CH2OH

O + H+

2CH2OPO3-

C

CH2OH

N+

H

HOCH2CH

COOH

+ H2O

- 氨基参与的反应

(Ser) (PEP)

（（66

））与亚硝酸反应

与亚硝酸反应

用途：范斯来克法定量测定氨基酸的基本反应。

NH2

R-CH-COOH + HNO2

OHR-CH-COOH + N2 + H2O

- 氨基参与的反应

（（77

）与甲醛发生羟甲基化反应

）与甲醛发生羟甲基化反应

pK'2 H+

COO-

CH2

NH2

COO-

CH2

NH3+

+

用途：可以用来直接测定氨基酸的浓度。

- 氨基参与的反应

(+OH-

)

氨基酸的甲醛滴定法

R—CH—COO-

NH3+

R—CH—COO-

NH2

+ H+ OH- 中和滴定

HCHO

R—CH—COO-

NHCH2OHHCHO

R—CH—COO-

N(CH2OH)2

(+OH-)

（（88

）脱氨基和转氨基反应

）脱氨基和转氨基反应 用途：酶催化的反应。

R CH COO-

NH3+

R CH COO-

O

+ NH4+

CH COO-

NH3+

CH2CH2COO-+

CH3

C O

COO-

CH3

C

COO-

NH3++C COO-

CH2CH2COO-

O

- 氨基参与的反应

（三）（三） -- 氨基和羧基共同参与的反氨基和羧基共同参与的反应应

氨基酸与茚三酮反应生成紫色化合物 , 在570nm波长可定量测定应用：纸层析或柱层析分离氨基酸后的显色剂，定性或定量测定氨基酸 （蓝紫

色）

（ 1 ）与茚三酮的反应： Pro 产生黄色物质（ 440nm 波长） ，其它AA 反应为蓝紫色，在 570nm （蓝紫色）可定量测定（几 μg ）。

（ 570nm波长）

（测压法）

（（22

）成肽反应

）成肽反应 用途：是多肽和蛋白质生物合成的基本反应。

H2N C

R1

H

C OH

O

H N

H

C COOH

R2

H

+H2O

N

H

C COOH

R2

H

H2N C

R1

H

C

O-

ëļü

-- 氨基和羧基共同参与的反应氨基和羧基共同参与的反应

（四）侧链 R 基参加的反应 蛋白质的化学修饰：在较温和的条件下，以可控制的方式使蛋白质与某种试剂起特异性的反应，以引起蛋白质中个别氨基酸侧链或功能团发生共价化学改变化学修饰是蛋白质结构和功能研究的重要方法。 Cys ：巯基 -SH Pauly 反应：与重氮化合物结合生成桔黄色化合物 His ：咪唑基与重氮苯磺酸反应生成棕红色化合物。 Arg ：胍基与 1,2-环己二酮反应。 Trp ：吲哚基被 N-溴代琥珀酰亚胺氧化。 Met ：甲硫基与烃化试剂如甲基碘形成硫盐。

（羧甲基半胱氨酸）

二硫硝基苯甲酸

1. 半胱氨酸和二硫键

2. Cys-SH与卤化烷反应生成稳定的烷基衍生物

Cys-SH + ICH2COO- Cys- S-CH2COO- + I-

3. Cys-SH 的 Ellman 氏反应二硫硝基苯甲酸 (Dithionitrobenzonic acid, DTNB, Ellman 氏试剂 ) 发生硫醇—二硫化物交换

应 用： λmax= 412 nm, 比色法定量测定— SH

λmax= 412 nm

4. Cys-SH 的氧化反应巯基在空气中的氧化反应： Cysteine 氧化成 Cystine Cys-SH + Cys-SH Cys-S-S-Cys

—SH 和— S—S— 被过甲酸氧化成— SO3H ： Cys-S-S-Cys + 6HCOOOH 2Cys- SO3H +

6HCOOH

过甲酸氧化O2

5. Cys-SH 的还原反应—S—S— 被巯基化合物还原成— SH ：巯基化合物：巯基乙醇 (mercaptoethanol) ，巯基乙酸 ( mercaptoacetic acid) ，二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT) ，二硫赤藓糖醇(dithioerythritol) 。

巯基与蛋白质的活性有关，二硫键在稳定蛋白质的构象上有很大的作用。

巯基化合物还原

侧链基团的化学性质

巯基（ -SH）的性质

1

作用：这些反应可用于巯基的保护。

-OOC CHCH2 SH

NH3+

CH2OCCl

O

-OOC CHCH2 S

NH3+

OCCH2

OCH2Cl

CH2-OOC CHCH2 S

NH3+

ICH2CNH2

O

CH2CNH2

O

-OOC CHCH2 S

NH3+

七、氨基酸的旋光性和光谱性质

•蛋白质氨基酸都是 L-型•蛋白质碱水解时得到的都是 D-型和 L-型的外消旋混合物

（一）氨基酸的旋光性和立体化学

构型 (configuration) ：立体异构体中取代原子或基团在空间的取向 (P6)

构象 (conformation) ：取代基团的单键旋转时可能形成的不同的立体结构 (P8)

（二）氨基酸的光谱性质

Lambert-Beer 定律 Io ：入射光强度 I ：透过光的强度 A ：吸光度 T ：透光率， T=I/Io ε ：摩尔消光系数 L ：吸收池光径 (cm) C ：样品的摩尔浓度

CLTI

IA O

1lglg

氨基酸的紫外吸收光谱 远紫外区（ λ <220nm ）：都有吸收近紫外区（ 220-300nm ）：

λmax(nm)

Molar absorbance ε(M-1cm-1)

Phe 257 197

Tyr 275 1420

Trp 280 5600

氨基酸的光谱性质构成蛋白质的 20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在红外区和远紫外区 ( <200nm)均有光吸收。在近紫外区 (200-400nm)只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有吸收光的能力。色氨酸的 max＝ 280nm， 280=5.6x103;

酪氨酸的 max＝ 275nm， 275=1.4x103;

苯丙氨酸的 max＝ 257nm， 257=2.0x102; ：摩尔吸光系数

八、氨基酸混合物的分离分析基于氨基酸的酸碱性质和极性大小进行分析分离。常用的分析分离方法有： 滤纸层析、薄层层析分配柱层析离子交换层析：阴 / 阳离子交换树脂高效液相层析电泳分离

色谱法的发展历史1. 色谱法早在 1903年由俄国植物学家茨维

特分离植物色素时采用，色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带，这种方法因此得名为色谱法（原理为吸附层析）。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，但“色谱”二字仍被人们沿用至今。

2. 1941年英国学者 A. J. P. Martin 和 R. L.

M. Synge, 用硅胶柱分离氨基酸，提出“分配层析”（色谱塔板理论）。

• Martin, A. J. P., and Synge, R. I. M.

(1941). Biochem. J., 35, 1358.

层析法的原理及特点 层析也称色谱，是一种分离分析技术 , 其原理是基于试样混合物的溶解度性质，分离过程也就是试样中各组分在色谱分离柱或其他形式的两相间不断进行的分配过程。 所有的层析系统都由互不相溶的两个相组成：其中一相固定不动，称为固定相固定相 Stationary phase ；

可以是固相固相、液相液相或固固 -- 液混合相液混合相（半液体）； 另一相是携带试样混合物流过固定相的流体流体（气体或液体），称为流动相流动相 Mobile phase ，可以是液相或气相，可以充满固定相固定相的空隙中，并能流过固定相固定相。。

分配层析 混合物组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位： g / mL ）比，称为分配系数，用 K d 表示，即：

分配系数 Kd：当一种溶质在两个给定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值。

分配系数是色谱分离的依据。

M

s

c

cK 组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度

分配层析柱层析：柱子里填充不溶性基质（如纤维素、淀粉等），水被基质吸附形成固定相，与水不互溶的溶剂（如苯酚、正丁醇等）作为流动相。由填充物构成的柱床相当于无数连续板层（ P.27 图 2-16）。洗脱时，流动相移动，氨基酸混合样品在两相间连续分配，各种样品因 Kd 不同以不同的速度向下移动得以分离，分别收集洗脱液（ eluate)用茚三酮显色可定量（图 2-17）。纸层析：固定相：滤纸吸附的水；流动相：有机溶剂薄层层析：支持剂（纤维素粉、硅胶、氧化铝粉等）

分配柱层析 当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序向下移动，由固定相中流出。

与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。 两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础

分配层析逆流分布原理：将一定量样品加入一定容量的两相溶剂中，经多次移位萃取分配而达到分离混合物的目的。取一系列试管（分布管），向 1 号管加入互不相溶的二种溶剂，U （流动相）； L （固定相），上下二相体积相等。加入混合物： 物质 A （ Kd=1 ）

（假设总量各为 64份）物质 B （ Kd=3 ）达平衡后将 1 号管上相 U 转移到 2 号管（内已含同体积

新下相），转移到 2 号管的样品在上、下相中再分配…同时向 1 号管内加入同体积新下相样品也将重新分配…若同样将上相 U 连续向 3,4,5…号管转移，其分布曲线 （ P.27 图 2-15）

多次萃取过程A （ 6

4）K = 1 B （ 6

4）K = 3

32 48

32 16

16 16 12 36

16 16 4 12

8 16 8 3 18 27

8 16 8 1 6 9

4 12 12 4 0.75 6.75 20.25 20.25

4 12 12 4 0.25 2.25 6.75 6.75

2 8 12 8 2 0.19 2.25 10.1 20.2 15.2

2 8 12 8 2 0.06 0.75 3.4 6.8 5.1

平衡1

转移 1U--2

转移 2U--3

转移 3

转移 4

色谱分离过程1. 当样品由流动相携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附 ;

2. 随着流动相的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中解吸附 ;

3. 解吸附的组分随着流动相向前移动时又再次被固定相溶解或吸附 ;

4. 随着流动相的流动，吸附、解吸附的过程反复地进行，从而得到分离。

色谱法分类分类方法分类方法 名称名称

固定相和流动相的固定相和流动相的物理状态物理状态

气相色谱（气相色谱（ GCGC ）） 气气 -- 固色谱（固色谱（ GSCGSC ）） 气气 -- 液色谱（液色谱（ GLCGLC ））液相色谱（液相色谱（ LCLC ）） 液液 -- 固色谱（固色谱（ LSCLSC ）） 液液 -- 液色谱（液色谱（ LLCLLC ））

超临界色谱：流动相 超临界色谱：流动相 CO2CO2

实验技术实验技术 柱色谱：填充柱，空管柱（毛细管）柱色谱：填充柱，空管柱（毛细管）开床试：纸层析，薄层层析开床试：纸层析，薄层层析

分离原理分离原理

凝胶色谱：固定相为凝胶，类似于分子筛凝胶色谱：固定相为凝胶，类似于分子筛 吸附色谱：固定相是吸附剂（如硅胶、氧化铝等），利用吸附吸附色谱：固定相是吸附剂（如硅胶、氧化铝等），利用吸附剂对不同物质吸附能力的差异而分离剂对不同物质吸附能力的差异而分离

分配色谱：固定相为液体，利用溶质在固定相和流动相中溶解分配色谱：固定相为液体，利用溶质在固定相和流动相中溶解度的差异而分离；流动相极性小于固定相极性的为正相色谱，度的差异而分离；流动相极性小于固定相极性的为正相色谱，流动相极性大于固定相极性的为反相色谱流动相极性大于固定相极性的为反相色谱

离子交换色谱：固定相为离子交换材料，利用离子交换材料与离子交换色谱：固定相为离子交换材料，利用离子交换材料与流动相中的样品离子进行可逆的离子交换而分离流动相中的样品离子进行可逆的离子交换而分离

亲和色谱：利用生物分子的亲和力分离亲和色谱：利用生物分子的亲和力分离 ------------

目的目的 分析型色谱，半制备型色谱，制备型色谱分析型色谱，半制备型色谱，制备型色谱

（二）离子交换层析

离子交换层析（ ion-exchange chromatography)

是一种基于氨基酸电荷行为的层析方法。层析柱中填充的是离子交换树脂（具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯 -苯二乙烯等不溶性高分子化合物）。阳离子交换树脂含有的酸性基团（如 -SO3H 、 -SO3Na+

、 -COOH ）可解离出 H+ 、 Na+ ，溶液中的其它阳离子可与之发生交换而结合在树脂上；同样，阴离子交换树脂含有的碱性基团（ -NH3OH等）可解离出 OH-，溶液中的阴离子可和 OH-发生交换而结合在树脂上。（ P.28）

（二）离子交换层析法

阳离子交换树脂含有的酸性基团可解离出Na+ 或H+

，溶液中带正电荷物质可与之交换而结合到树脂上；而阴离子交换树脂含有的碱性基团可解离出OH- ，溶液中带负电荷物质可与之交换而结合到树脂上。

ARBBRA

BRA

ARBK

ARBBRA

阴离子交换：]][[

]][[

阳离子交换：

94

离子交换层析法分离氨基酸分离氨基酸混合物常使用强酸型阳离子交换树脂。交换柱中的树脂先用碱处理成钠型，将氨基酸混合液上柱，在同一 pH 时，各种氨基酸解离带电荷不同，与树脂的亲和力也不同，用洗脱液可将各种氨基酸以不同的速度洗脱下来。先用离子交换色谱分离，再用茚三酮柱后衍生测定思考：在 pH 2-3 时，

Asp 和 Lys混合液在此层析柱中，哪个先洗脱下来？

氨基酸与树脂间的亲和力，主要决定于它们之间的静电吸引，其次是氨基酸侧链与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水相互作用。

在 pH3左右，氨基酸与阳离子交换树脂间的亲和力次序是碱性氨基酸 > 中性氨基酸 > 酸性氨基酸。则洗脱下来顺序是：？ < ? >？

在 pH3时 , pI10, pI6 ， pI3的氨基酸混合物的分离情况？

离子交换层析

97

离子交换色谱法的原理Sample

application

and wash

ElutionEquilibration Regeneration

-

-- -

--

- --

-- - -

--

- --

- -

-- --

--

-

-

- --

-

--

- -

-- --

- -- --

-- -

-- --

-- -

-

---

- -- -

-

-- -

-

+

+

+

+++

+

+

+++ +

+

+

++++ +

+

+

++ + +

+

+

++ +

anionexchangerbead

--

--

--

- -

---

纸层析

双相纸层析

氨基酸的应用

1.医药工业 氨基酸输液 必需氨基酸： Thr 、 Val 、 Leu 、Ile、 Lys 、 Trp 、 Phe 、 Met 半必需氨基酸： Arg 、 His是幼儿所必需的。

治疗药剂精氨酸：对治疗高氨血症、肝机能障碍等疾病颇有效果；天冬氨酸：钾镁盐可用于恢复疲劳；治疗低钾症心脏病、肝病、糖尿病等；半胱氨酸：能促进毛发的生长，可用于治疗秃发症；甲酯盐酸盐可用于治疗支气管炎等；组氨酸：可扩张血管，降低血压，用于心绞痛，心功能不全等疾病的治疗。

2.化学工业维生素 B6: 可采用丙氨酸或天冬氨酸为原料合成。

叶酸：需要用谷氨酸为原料合成。氨基酸表面活性剂：酰基谷氨酸钠、十六烷基 -L-赖氨酰 -L-赖氨酸甲酯二盐酸、月桂酰 -L-精氨酸乙酯盐酸等具有较强的抗菌杀菌活性，且无刺激性。聚合氨基酸：聚谷氨酸甲酯可用于作为合成皮革的表面处理剂；聚天冬氨酸或聚谷氨酸的二烷基酯与磷酸高级烷基酯结合得到化合物可作为可塑剂、稳定剂等。

营养强化剂；谷氨酸钠－味精；天冬氨酸钠：可用于清凉饮料，能增加清凉感并使香味浓厚爽口；天冬氨酰苯丙氨酸甲酯－甜味素 APM

3.食品工业

4. 农业杀虫剂：刀豆氨酸、 5-羟色氨酸可使南方毛虫拒食而死；半胱氨酸可杀死黄瓜蝇；甘氨酸乙酯衍生的二硫代磷酸盐具有较强的杀蚜虫和杀螨效果；杀菌剂： N-月桂酰缬氨酸可作为治疗稻瘟病； -1 ， 4环己二烯丙氨酸能抑制黑穗病毒、稻瘟病等；除草剂：如 N-3,4二氮丙氨酸，硫代氨基酸酯等；

5.化妆品工业氨基酸能调节皮肤 pH的变动，对细菌有防护作用，也可作为皮肤、毛发的营养成分，增加皮肤、毛发的光泽。防止皮肤干燥的自然保湿因子的主要成分是甘氨酸、羟基丁氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸等游离氨基酸。在化妆品中添加天冬氨酸或其衍生物以及一些维生素，可防止皮肤老化。

练习题写出 20种基本氨基酸的单字母和三字母缩写符号根据氨基酸基团的 pK 值，分析计算下列氨基酸的pI值： Ala, Asp, Arg将含有Asp(pI=2.98)、 Gly(pI=5.97)、 Leu(pI=5.98)和 Lys(pI=9.74)的 pH 3.0柠檬酸缓冲液，加到预先用同样缓冲液平衡过的 Dowex-50阳离子交换树脂中，随后用该缓冲液洗脱此柱，这 4 种氨基酸将按什么顺序洗脱下来？分析原因。

思考题构成蛋白质的氨基酸的结构、性质？氨基酸的水解，兼性离子及等电点的概念？用一句话概括等电点的计算方法电泳分离氨基酸混合物的原理？某氨基酸的 pI为 10，在 pH为 4 的电泳缓冲液中向哪极移动？若 pI为 4 呢？离子交换树脂分为两种，阳离子和阴离子交换树脂的可交换离子各是？固定离子是？分配层析的原理？氨基酸用甲醛法进行滴定的原理。

思考题

分配层析

固定相与流动相分配系数 Kd：当一种溶质在两个给定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数 Kd 。逆流分布原理：将一定量样品加入一定容量的两相溶剂中，经多次移位萃取分配而达到分离混合物的目的。K 灰色= ∞ K 红色= 0

(1)

(1)

与茚三酮反应

与茚三酮反应

用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。

CC

CO

O

O

茚三酮C

CC

O

O

OH

OHH2O

H2O 水合茚三酮

CO2NH2RCHO ++++C

CC

O

O

H

OHH2N CHCOOH

RCC

CO

O

OH

OH

+2NH3

CC

CO

O

CC

C

O

O-NH4+

N H2O2++C

CC

O

O

O

CC

CO

O

H

HO

（三）（三） -- 氨基和羧基共同参与的反应氨基和羧基共同参与的反应

氨基酸与碱作用生成相应的盐。氨基酸的碱金属盐能溶于水 , 而重金属盐则不溶于水。

（2

）成盐反应

11．． --羧基参与的反应羧基参与的反应

（（33

）形成酯的反应

）形成酯的反应 用途：是合成氨基酸酰基衍生物的重要中间体。

R2OH+R CH COO-

NH3+

+ H2OR CHCOOR2

NH2.HCl

11．． --羧基参与的反应羧基参与的反应

（（44

）形成酰卤的反应

）形成酰卤的反应

用途：这是使氨基酸羧基活化的一个重要反应。

PCl3, PCl5 or SOCl2R CHCOO-

NHPG

R CHCOCl

NHPG

11．． --羧基参与的反应羧基参与的反应

叠氮化反应

叠氮化反应

用途：常作为多肽合成活性中间体。

R CHCOOCH3

NHPGR CHCOONHNH2

NHPG

CH3OH

NH2NH2

R CHCON3

NHPGHNO3

H2O,N2

--羧基参与的反应羧基参与的反应

4

．侧链基团的化学性质

羟基的性质1

作用：可用于修饰蛋白质。

-OOCCHCH2OH

NH3+ F POCH(CH3)2

O

OCH(CH3)2

+

-OOCCHCH2O

NH3+

POCH(CH3)2

O

OCH(CH3)2

二异丙基氟磷酸酯

4

．侧链基团的化学性质

巯基（ -SH）的性质

作用：氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键形成或断裂。

-OOC CHCH2 SH

NH3+

-OOC CHCH2 SH

NH3+

-OOC CH

NH3+

CH2

S

S

CH2

NH3+

CH-OOC

胱氨酸

4

．侧链基团的化学性质

巯基（ -SH）的性质

作用：与金属离子的螯合性质可用于体内解毒。

-OOC CHCH2 SH

NH3+

+ COO-HO-Hg+

-OOC CHCH2 S

NH3+

Hg+ COO-

4

．侧链基团的化学性质

巯基（ -SH）的性质

作用：可用于比色法定量测定半胱氨酸的含量。

H3NCHCH2S-COO-

+S

SNO2

NO2

CO2H

CO2H

+

+COO-

H3NCHCH2S

CO2HNO2

-S-NO2

COO-HS-+

硝基 苯甲酸二硫化合物 (DTNB)