茶园土壤微生物群落结构变化动态的研究

报告人： 苏远科 报告人： 苏远科 指导老师指导老师 : : 刘波 研究员刘波 研究员

农业生物资源研究所

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论文概述

研究意义

研究内容

结论分析

技术路线

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论文概述磷脂脂肪酸 磷脂脂肪酸 (phospholipid fatty acid(phospholipid fatty acid ，， PLFA)PLFA) 图谱分析，在微图谱分析，在微生物群落动态分析上的应用十分广泛。磷脂是构成生物细胞膜的生物群落动态分析上的应用十分广泛。磷脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干重的主要成分，约占细胞干重的 55 ％。在细胞死亡时，细胞膜很快被％。在细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速代谢掉，因此它只在活细胞中存在 ，十降解，磷脂脂肪酸被迅速代谢掉，因此它只在活细胞中存在 ，十分适合于微生物群落的动态监测。另一个重要因素是脂肪酸具有分适合于微生物群落的动态监测。另一个重要因素是脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据。属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据。磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸部分提取出来，然后用磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸部分提取出来，然后用气相色谱分析，得出气相色谱分析，得出 PLFAPLFA 谱图。群落的微生物结构发生变化，谱图。群落的微生物结构发生变化，即可以通过谱图的变化得到快速有效的监测。即可以通过谱图的变化得到快速有效的监测。

本文就是利用本文就是利用 PLFAPLFA 图谱分析研究安溪不同树龄，海拔高度，季图谱分析研究安溪不同树龄，海拔高度，季节的茶园土壤微生物群落动态变化，从而对安溪茶园土壤微生物节的茶园土壤微生物群落动态变化，从而对安溪茶园土壤微生物群落结构及变化有一定的了解，对茶园生态建设提供理论指导。群落结构及变化有一定的了解，对茶园生态建设提供理论指导。

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研究意义安溪乌龙茶全国文明，茶香，茶色，茶味，都有独到之处，形成如安溪乌龙茶全国文明，茶香，茶色，茶味，都有独到之处，形成如此优良的品质和当地自然环境包括地理水文光照土壤等是分布不开的，此优良的品质和当地自然环境包括地理水文光照土壤等是分布不开的，在这种独特的环境中一定也孕育着独特的土壤微生物群落。茶园土壤在这种独特的环境中一定也孕育着独特的土壤微生物群落。茶园土壤微生物群落作为一种指标反映茶园土壤及茶树生长状况。对茶园生态微生物群落作为一种指标反映茶园土壤及茶树生长状况。对茶园生态建设有一定的指导意义。建设有一定的指导意义。目前在国内还很少人利用磷脂脂肪酸图谱分析对茶园土壤微生物群目前在国内还很少人利用磷脂脂肪酸图谱分析对茶园土壤微生物群落进行研究。所以本文应用落进行研究。所以本文应用 PLFAPLFA 分析法对不同树龄，海拔，季节的分析法对不同树龄，海拔，季节的茶园土壤微生物群落变化动态进行比较系统的研究，有一定理论意义茶园土壤微生物群落变化动态进行比较系统的研究，有一定理论意义和实用价值。和实用价值。

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研究内容

从安溪感德和西平两地，根据不同季节，不同树龄，不同海拔采集茶园土从安溪感德和西平两地，根据不同季节，不同树龄，不同海拔采集茶园土样。进行土壤磷脂脂肪酸提取及测定。 通过聚类分析主成分分析等统计学样。进行土壤磷脂脂肪酸提取及测定。 通过聚类分析主成分分析等统计学方法对磷脂脂肪酸图谱分析来研究茶园土壤微生物群落在不同季节，海拔方法对磷脂脂肪酸图谱分析来研究茶园土壤微生物群落在不同季节，海拔高度，及不同树龄情况下茶园土壤微生物群落动态变化及差异。高度，及不同树龄情况下茶园土壤微生物群落动态变化及差异。

土样采集地点选择

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技术路线土样采集和保存

土样磷脂脂肪酸提取和测定

测量数据处理和汇总

不同季节茶园土壤磷脂脂肪酸分析

不同树龄茶园土壤磷脂脂肪酸分析

不同海拔高度茶园土壤磷脂脂肪酸分析

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磷脂脂肪酸提取方法及步骤

KO

H

甲醇溶液和4g

的

新鲜土样加到50m

l

的

离心试管中，混合均匀

在37

℃下温育1h(

脂肪

酸释放，并甲脂化，样

品10min

涡悬1

次)

加入3ml 1.0m

ol/L的醋

酸溶液中和pH

值，充

分摇匀。

加10ml

正己烷，使磷

脂脂肪酸（P

LFA

）转

到有机相中，800r/m

in

离心，

将上层正己烷转到试管

中，在N

2

气流下挥发

掉溶剂

用1ml

体积比为1:1

的

正己烷:

甲基丁基醚溶

液溶解,

用作G

C

分析。

碱裂解与甲脂化 中和 脂肪酸萃取 脂肪酸提取 GC 分析

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土样编号 海拔（ m ） 茶园树龄（年） 备注

1 600 3 剑斗后山茶场老茶园改造

2 600 3 剑斗后山茶场老茶园改造新土

3 500 3 剑斗仙荣村

4 700 3 感德槐杨茶园

5 700 3 感德槐杨茶园新土

6 800 3 感得槐东村大岭

7 500 4 剑斗仙荣村

8 800 5 感德槐东村大岭

9 800 8 感德槐东村大岭

10 800 15 感德槐东村大岭

11 500 22 剑斗仙荣村

12 500 22 剑斗仙荣村新土

13 700 22 感德槐杨茶园

14 700 22 感得槐杨茶园新土

15 700 25 剑斗黄壤土

16 500 15 感德仙荣新土

17 800 10 感德槐东村大岭新土

不同海拔高度茶园土壤微生物 PLFAs 生物标记分析

土样采集时间地点及生境类型

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不同海拔高度茶园土壤微生物 PLFAs 生物标记分析

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

500 600 700 800 海拔高度(m)

生物标记总量

(PL

FA

s)图 1 不同海拔茶园土壤磷脂脂肪酸生物标记总量比较

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0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

500 600 700 800 海拔高度（m）

三种不同脂肪酸生物标记含量（

PF

LA

s ）

16:00

18:3W6C (6,9,12)

TBSA 10ME18:0

图 2 不同海拔茶树根际土壤细菌，真菌，放线菌特征性磷脂脂肪酸标记含量的变化

不同海拔高度茶园土壤微生物 PLFAs 生物标记分析

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20:0020:1ω9C

a 17:1ω9C10Me18:012:0 3OH13:0 2OH15:0 3OH

i15:1 G16:1 2OH

17:0010 Me 17:0i17:0 3OH18:0 2OH

19:0 10 Me

14:1ω5C16:0 N ALCOHOL

i15:0 3OHi15:1 F

17:0 CYCLO12:00

14:00

18:3ω6C (6,9,12)15:0

cy19:0ω8C

i16:017:0 A18:00

16:0 10Me16:00

18:1ω9Ci15:0

16:1ω5Ci17:0

16:0 A

18:1ω7C

类型一其特征为磷脂脂肪酸生物标记为不完全分布且分布量低

类型二其特征是磷脂脂肪酸生物标记完全分布、在各海拔平均

分布量较高

不同海拔高度茶园土壤微生物 PLFAs 生物标记分析

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当欧氏距离为 10 左右时，可将不同海拔茶园的磷脂脂肪酸生物标记分成两个大的类群。

类型Ⅰ包括脂肪酸标生物标记 20:00 、 20:1ω9C 、 a17:1ω9C 、 12:00 、10Me 18:0 、 12:0 3OH 、 13:0 2OH 、 14:00 、 14:1ω5C 、 15:0 3OH 、i15:0 3OH 、 i15:0F 、 i15:1 G 、 16:0 N ALCOHOL 、 16:1 2OH 、 17:00 、 10Me 17:0 、 cy17:0 、 i17:0 3OH 、 18:0 2OH 、 18:3ω(6,9,12) 、10Me 19:0 ，其特征为磷脂脂肪酸生物标记为不完全分布且分布量低；

类型Ⅱ包括磷脂脂肪酸生物标记 a15:0 、 i15:0 、 16:00 、 10Me 16:0 、a16:0 、 i16:0 、 16:1ω5C 、 a17:0 、 i17:0 、 18:00 、 18:1ω7C 、 18:1ω9C 、 cy19:0ω8C ，其特征是磷脂脂肪酸生物标记完全分布、在各海拔平均分布量较高

不同海拔高度茶园土壤微生物 PLFAs 生物标记分析

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序号 海拔（米） Simpson(J) Shannon(H)

均匀度 BRILLOUIN

McIntosh(Dmc)

1 500 0.88 3.59 0.88 3.58 0.65

2 600 0.88 3.54 0.91 3.53 0.66

3 700 0.78 2.81 0.81 2.80 0.53

4 800 0.90 3.84 0.87 3.83 0.69

Simpson(J) 、 Shannon(H) 、 BRILLOUIN 、 McIntosh(Dmc) 多样性指数之间的相关系数大于 0.90, 表明这几个指数的互换性较高，选择其中一个就行。特征值分析结果表明，选择第一主成份，含有总体信息量的 93% 。从主成分分析因子得分可知，影响第一主成份的主要因素是 Simpson(J) （得分 0.81 ）和均匀度（得分 0.10 ）因而，微生物群落多样性指数的分析可以使用 Simpson(J) 和均匀度。

不同海拔高度茶园土壤微生物 PLFAs 生物标记分析

不同海拔茶园土壤 PLFAs 丰富度及均匀度分析

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图 4 不同海拔茶树根际土壤微生物群落 shannon 多样性指数

shannon 指数则较多反映群落中常见的物种，从图四可见，海拔 800 米处的茶树根际土壤的 Shanon 指数 3.84 明显高于海拔 500 米的 3.59 、 600 米的 3.54 和 700 米的 2.81 ，说明海拔 800 米处茶树根际土壤中的微生物丰富度高于其 它 3 个海拔处茶树根际土壤的微生物，而 500 米和 600 米海拔的茶树根际土壤微生物丰富度相当， 700 米海拔的茶树根际土壤微生物丰富度较低；

Shannon(H)

3. 59 3. 542. 81

3. 84

0

1

2

3

4

5

500 600 700 800 m/海拔高度（ ）

shannon

不同海拔高度茶园土壤微生物 PLFAs 生物标记分析

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0. 75

0. 8

0. 85

0. 9

0. 95

500 600 700 800m/海拔（ ）

均匀度指数

图 5 不同海拔茶树根际土壤微生物群落均匀度指数

从均匀度指数 看，海拔 600 米茶树根际土壤均匀度指数 最高，其次是海拔 800 米的茶树根际土壤，接下来是海拔 500 米的茶树根际土壤，而海拔 700 米的茶树根际土壤均匀度指数最低。均匀度是微生物 组成和分布量的综合体 现，不同海拔茶树根际土壤均匀度的明显 差异说明，各海拔茶树根际土壤的微生存在丰富的多样性。

不同海拔高度茶园土壤微生物 PLFAs 生物标记分析

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各海拔茶树根际土壤 PLFAs 总量 800 米海拔最大， 700 米最小。

细菌脂肪酸标记 16:0 相对生物量在海拔 800 米处为最高值，海拔 800 米处（ 16291 ） > 海拔 500 米处（ 7733 ） > 海拔 600 米处（ 7165 ） > 海拔 700 米处（ 4994 ）。

真菌脂肪酸标记 18:3ω6c(6,9,12) 的相 对生物量大小依次为 ：海拔 600 米处（ 1210 ） > 海拔 500 米处（ 1067 ） > 海拔 800 米处（ 648 ） > 海拔 700米处（ 0 ）。

从以上丰富度指数和均匀度指数 看

海拔 800 米茶树根际土壤微生物种类最多，海拔 700 米的茶树根际土壤微生物种类最低。

海拔 600 米茶树根际土壤均匀度指数 最高，其次是海拔 800 米的茶树根际土壤，接下来是海拔 500 米的茶树根际土壤，而海拔 700 米的茶树根际土壤均匀度指数 最低。

结论分析结论分析

不同海拔高度茶园土壤微生物 PLFAs 生物标记分析

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茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究

土样 地点 生境类型 时间 时间 时间 时间

01 安溪感德 4 年茶园土海拔 770m

2008.3.19 2008.5.05. 2008.8.05 2008.11.12

Ck 安溪感德4 年茶园土

海拔 770m 新土

2008.3.19 2008.5.05. 2008.8.05 2008.11.12

02 安溪感德 8 年茶园土海拔 770m

2008.3.19 2008.5.05. 2008.8.05 2008.11.12

03 安溪感德 15 年茶园土海拔 770m

2008.3.19 2008.5. 05. 2008.8.05 2008.11.12

04 安溪感德 未开垦林地土 2008.3.19 2008.05.05 2008.8.05 2008.11.12

土样采集时间地点及生境类型

农业生物资源研究所

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

501

502

503

ck 504

土样编号

磷脂脂肪酸总量

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

501

502

503

ck 504

土样编号c1

6:00

脂肪酸标记量

图 6. 5月份不同树龄茶树根际土壤微生物磷脂脂肪酸标记总量比较

图 7. 5月份不同树龄茶树根际土壤细菌磷脂肪酸标记 C16:00 比较

茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究

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02000400060008000

1000012000140001600018000

501

502

503

ck 504

土样编号

脂肪酸生物标记量

18:1 ω9c

18:3 ω6c(6,9,12)合计

0

500

1000

1500

2000

2500

501

502

503

ck503

504

土样编号脂肪酸生物标记含量

10Me18:0

图 8. 不同树龄茶树根际土壤真菌磷脂脂肪酸标记 18:1ω9c 及 18:3ω6c(6,9,12) 比较

图 9. 不同树龄茶树根际土壤放线菌磷脂脂肪酸标记 10Me18:0比较

茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究

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对不同土样整体做聚类分析

欧氏距离 6 左右区分茶园土壤和对照及原始林地土壤

茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究

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类群一含量平均在1500-2000 比较 少但是较稳定

类群二含量平均在3000-3500比较丰

富

幻灯片 23类群三含量最丰富均在 550

0-7000

幻灯片 24类群四含量最少，少于 1000

且变化较大

茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究

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类群 脂肪酸类型 微生物种类 4年树龄 8年树龄 15年树龄

类群一

14:00 746 1026 1685

cy17:0 革兰氏阴性细菌 Gram-neg

ative bacteria1314 1508 1383

20:00 955 1973 1571

a17:0革兰氏阳性性细菌Gram-positive bacteria

0 3060 3261

a16:0革兰氏阳性性细菌 Gram-p

ositive bacteria1809 1980 2358

16:1 2OH 2215 2516 2164

10Me 18:0 放线菌 2074 2343 2062

18:1 ω7c 厌氧细菌 Anaerobes 2703 3235 2568

茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究

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类群二

a15:0革兰氏阳性性细菌Gram-positive bacteria

2637 3702 4231

10Me16:0 硫酸盐还原细菌 Sulfate-r

educing bacteria2450 3412 4192

i15:0 细菌 Bacteria in general 2901 3358 3670

i17:0 好氧细菌 Aerobes 3382 3851 3587

i16:0革兰氏阳性性细菌 Gram-

positive bacteria3428 3941 4480

16:1 ω5c 甲烷氧化菌 Methane-Oxi

dizing bacterial3668 3225 5975

通过 spss对上表 格差异显著性分析发现类群 2 的脂肪酸标记 差异是显著。 P＜ 0.05 ，且与树龄正相关 既是类群二的磷脂脂肪酸标记 随着树龄增大而增大。

茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究

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类群三

18:00 嗜热解氢杆菌 4700 6561 6514

18:1 ω9c 真菌 Fungi 7118 7733 7451

cy19:0ω8c伯克霍尔德菌 Burkh

olderia cepacia4983 6308 6594

茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究

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类群四

a14:0 0 0 1571

a17:1 w9c a17:1 w9c 0 0 1640

15:00 细菌 Bacteria in general 624 0 1186

i14:0 0 0 361

i15:1 G 0 0 111

15:0 3OH 革兰氏阴性细菌 Gram-n

egative bacteria0 0 681

i17:0 3OH 497 0 0

10 Me 17:0 0 431 486

18:3ω6c(6,9,12)

真菌 Fungi 323 788 750

17:00 节杆菌 474 645 660

茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究

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脂肪酸类型 4 8 15 脂肪酸类型 4 8 15

14:00 746 1026 1685 10Me 18:0 2074 2343 2062

a15:0 2637 3702 4231 18:1 ω7c 2703 3235 2568

16:00 23230 31370 32052 18:1 ω9c 7118 7733 7451

10Me16:0 2450 3412 4192 18:3ω6c(6,9,12) 323 788 750

a16:0 1809 1980 2358 20:00 955 1973 1571

i16:0 3428 3941 4480 18:3ω6c(6,9,12) 323 788 750

17:00 474 645 660 18:00 4700 6561 6514

cy19:0ω8c 4983 6308 6594 cy17:0 1314 1508 1383

17:00 474 645 660

i17:0 3382 3851 3587

不同树龄茶园土壤中两类不同 趋势的脂肪酸标记

茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究

农业生物资源研究所

01000200030004000500060007000

14:00

a15:0

10Me16:0

a16:0

i16:0

17:00

cy19:0ω8c

脂肪酸类型

脂肪酸生物标记量

4 8 15

随着树龄有递增趋势的几种磷脂脂肪酸生物标记 4 、 8 、 15 分别代表不同树龄的茶园土样

茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究

农业生物资源研究所

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

10Me 18:0

18:1 ω7c

18:3ω6c(6,9,12)

20:00

18:3ω6c(6,9,12)

18:00

cy17:0

17:00

i17:0 脂肪酸类型

脂肪酸生物标记量

4 8 15

不同树龄茶园土壤中几种 随着树龄先增加后 减少趋势的脂肪酸生物标记

茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究

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结论与分析 不同树龄茶园土壤微生物磷脂脂肪酸标记与树龄有极显著相关性 (p<0.05) ，随着树龄增长 4 年到 8 年 15 年茶园土壤微生物的总量有 所增加但是这种增长趋缓。有文 章称茶树生长超过 50 年土壤微生物总量会下降 其中细菌的 增加是 对磷脂脂肪酸总量贡献最大，真菌和放线菌的磷脂脂肪酸标记含量是先增长后减少。发现 14:00 、 a15:0 细菌生磷脂脂肪酸特征性物标记， 16:00假单胞杆菌磷脂脂肪酸生物标记 a16:0 、 i16:0革兰氏阳性性细菌磷脂脂肪酸生物标记 cy19:0ω8c 、伯克霍尔德菌生物标记，随着树龄有递增趋势。 而一部分例如 10Me 18:0 是放线菌磷脂脂肪酸生物标记， 18:1ω7C 是厌氧细菌磷脂脂肪酸生物标记， 18:1 ω9c 、 18:3ω6c(6,9,12) 真菌磷脂脂肪酸特征性生物标记， 18:00嗜热解氢杆菌磷脂脂肪酸特征性生物标记， cy17:0 、 i17:0革兰氏阴性细菌磷脂脂肪酸特征性生物标记。随着树龄增加先增加后 减少的趋势。还有一 部分变化不明显 。

茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究

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季节变化对茶园土壤微生物群落影响研究

土样 地点 生境类型 春 夏 秋 冬

01 安溪感德 4年茶园土海拔 770m 2008.3.19 2008.5.05. 2008.8.05 2008.11.12

Ck 安溪感德4年茶园土海拔 770m新土

2008.3.19 2008.5.05. 2008.8.05 2008.11.12

02 安溪感德 8年茶园土海拔 770m 2008.3.19 2008.5.05. 2008.8.05 2008.11.12

03 安溪感德 15年茶园土海拔 770m 2008.3.19 2008.5. 05. 2008.8.05 2008.11.12

04 安溪感德 未开垦林地土 2008.3.19 2008.05.05 2008.8.05 2008.11.12

土样采集时间地点及生境类型

农业生物资源研究所

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

3月 5月 8月 11月 月份

脂肪酸生物标记总量

PLFA

s

1

2

3

4

ck

不同月份茶树根际土壤微生物脂肪酸标记总量 PLFAs 比较

1 、 2 、 3 分别代表树龄 4 年 8 年和 15 年的茶园土壤， ck没有种 植茶树的梯田壁上的土壤， 504代表未开发的 原始林地土壤。

季节变化对茶园土壤微生物群落影响研究

农业生物资源研究所

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

3月 5月 8月 11月 月份

c16:

00脂肪酸生物标记含量

1

2

3

4

ck

图 13 不同月份茶树根际土壤细菌磷脂肪酸标记 C16:00 比较

1 、 2 、 3 分别代表树龄 4 年 8 年和 15 年的茶园土壤， ck没有种 植茶树的梯田壁上的土壤， 504代表未开发的 原始林地土壤。

季节变化对茶园土壤微生物群落影响研究

农业生物资源研究所

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

3月 5月 8月 11月 月份

真菌脂肪酸生物标记量

1

2

3

4

ck

图 14 不同月份茶树根际土壤真菌磷脂脂肪酸标记 18:1ω9c 及 18:3ω6c(6,9,12) 比较

1 、 2 、 3 分别代表树龄 4 年 8 年和 15 年的茶园土壤， ck没有种 植茶树的梯田壁上的土壤， 504代表未开发的 原始林地土壤。

季节变化对茶园土壤微生物群落影响研究

农业生物资源研究所

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

3月 5月 8月 11月 月份

脂肪酸

10M

e18:

0 生物标记量

1

2

3

4

ck

图 15 不同月份茶树根际土壤放线菌磷脂脂肪酸标记 10Me18:0 比较

季节变化对茶园土壤微生物群落影响研究

农业生物资源研究所

不同季节土壤微生物群落变化很大，在不同季节土壤微生物群落变化很大，在 88 月份土壤微生物的总量和种类 都是月份土壤微生物的总量和种类 都是最多的，脂肪酸总量最多的，脂肪酸总量 88 月分是其他月份的月分是其他月份的 2~32~3 倍。从脂肪酸标记量数目看倍。从脂肪酸标记量数目看 88

月份平均在月份平均在 4343 个左右其他几个月份脂肪酸数目在个左右其他几个月份脂肪酸数目在 20~2520~25 ，也就是说，也就是说 88 月份月份微生物量是最多，最丰富。这与前人研究一致。在夏季土壤湿润，光照充足，微生物量是最多，最丰富。这与前人研究一致。在夏季土壤湿润，光照充足，土壤中的有机 质分解比较 快，土壤营养比较充 沛，造成土壤微生物活动旺盛，土壤中的有机 质分解比较 快，土壤营养比较充 沛，造成土壤微生物活动旺盛，繁殖迅速。所以土壤中微生物数 目多且种类丰富。通过显著性分析不同月份繁殖迅速。所以土壤中微生物数 目多且种类丰富。通过显著性分析不同月份脂肪酸数据差异显著脂肪酸数据差异显著 pp ＜＜ 0.010.01

结论分析结论分析

季节变化对茶园土壤微生物群落影响研究

感谢各位专家提出宝贵意见感谢各位专家提出宝贵意见

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