高产琥珀酸大肠杆菌的代谢工程

导师：赵学明 教授报告人：王白云

目录

第一部分

第二部分

第三部分

研究背景

课题方案与进度安排

课题创新点及预期结果

石油工业风光不再，生物技术初生牛犊

一、研究背景

琥珀酸是一种大规模的工业原料。 2004年，美国能源部将其列为 12 种最具市场潜力的生物基有机酸之一。（ McKinlay J B,Vieille C, Zeikus J G. Prospects for

a bio-based succinate industry. Appl Microbiol Biotechnol,2007,76(4):727-740 ）

产琥珀酸常见菌株： Actinobacillus succinogenes （琥珀酸放线杆菌） Anaerobiospirillum succiniciproducens （产琥珀酸厌氧螺菌） Mannheimia succiniciproducens （曼海姆产琥珀酸菌） Corynebacterium sp （谷氨酸棒杆菌） Zymomonas mobilis （运动发酵单胞菌） Saccharomyces cereviseae （酿酒酵母） Escherichia coli （大肠杆菌）

a 、大肠杆菌厌氧混合酸发酵代谢图， b 、基因改造后的大肠厌氧发酵代谢图

James B. McKi nlay & C. Vieille & J. Gregory Zeikus Prospects for a bio-based succinate industry 。 Appl Microbiol Biotechnol (2007) 76:727– 740

大肠菌株

基因型琥珀酸产量

（ mM）

琥珀酸得率（ mol/

mol）参考文献

NZN111W1485，△ pflB ，△ ld

hA ，过表达 mdh108 0.98

Chatterjee et al., 2001;Millard et al., 1996; Stols and Donnelly,

1997

AFP111W1485，△ pflB ，△ldhA ，△ ptsG ，过

表达豆根瘤菌 pyc

841 1.68 Vemuri et al.(2002a,b)

SBS550MG

△ldhA , adhE, iclR ,ackA-pta ； 过表达乳酸菌 pyc ，枯草芽孢

杆菌 citZ

339 1.61Sanchez et al.(2005a), Coxet al. (2006)

KJ060

E.Coli C△ldhA,adhE ， ackA ， focA ， pflB ；

pck*;pstI 失活

733 1.41 Jantama K, et al. (2008)

KJ073

Ecoli C△ldhA,adhE ， ackA ， focA ， pflB ，

mgsA ， poxB; pck*;pstI 失活

668 1.2 Jantama K, et al. (2008)

乙醛酸循环的激活

研究策略

1 、竞争途径2 、葡萄糖转运3 、 CO2 固定

4 、 ATP 与辅因子

存在问题： 主要关注与减少辅因子 NADH 使用入手，而没有试图增加 NADH 的提供。

节流 开源

二、课题方案与进度安排

实验方案 1 、竞争途径的敲除

2 、糖运输系统的进化与修饰3 、羧化途径

4 、 PP 途径与 udhA5 、乙醛酸循环

6 、 TCA 氧化臂

NADPH+NAD+ NADP+NADHudhA

sdhA

进度安排

建立平台菌株

前期

葡萄糖转运途径进化与修饰

中期

适当扰动PP 途径并优化发酵工艺

后期

三、创新点与预期结果

创新点

3G-6-P 2F-6-P+G-3-P+6NADPH+3CO2

3 3

2 11 1

11 1

过表达 udhA

三、创新点与预期结果

预期结果： 本课题的目标是获得能够相对高产琥珀酸的大肠杆菌工程菌。经过实验方案的改造，采用两阶段发酵并进行发酵工艺优化，最后努力做到在发酵罐中的产量达到 80g/L 。