硕 士 研 究 生

开题报告

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5’-5’- 氮杂脱氧胞苷联合放疗对鼻咽癌氮杂脱氧胞苷联合放疗对鼻咽癌RASSF1ARASSF1A 基因甲基化和表达的影响 基因甲基化和表达的影响

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研究生 ：邓岩

导 师：姚运红 副教授

时 间： 2005 年 8月 19 日

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开题报告开题报告

一、立题依据与研究现状二、实验目的三、技术路线四、主要实验方法五、预期结果六、经费预算七、时间安排

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立题依据立题依据第一部分第一部分

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立题依据立题依据

RASSF1A基因RASSF1A蛋白RASSF1A基因的高甲基化与肿瘤 5’- 氮杂脱氧胞苷

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RASSF1ARASSF1A基因基因 很早以来，医学研究人员就发现肿瘤患者 3p 染色

体出现等位缺失的现象 , （常见肺癌患者） , 于是推测该区域可能存在某种抑癌基因。

1998 年 ,Sekido 等在肺癌及乳腺癌细胞系的研究中发现 3p21. 3 存在一个 120kb 长的最小纯合缺少区。

2000 年 ,Dammann 等 [4 ] 使用酵母双相杂交筛选的方法自该区分离出一种能与 DNA 修补蛋白(XPA) 相互作用的候选 cDNA( 互补 DNA) , 其核苷酸序列的羧基端与鼠 RAS 效应蛋白 Nore1 和Maxp1 高度同源 , 遂命名为 RAS 区域相关家族 1 ,即 RASSF1 基因

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RASSF1ARASSF1A 基因基因 Ras 基因除了具有促进细胞生长、增殖的作用

外还具有一个非常重要的功能———抑制细胞生长、促进细胞凋亡和衰老。 RASSF1A 基因可能是 Ras 激活信号传导通路中一个非常重要的负向调节基因 , 在肿瘤的发生、发展、预后等方面具有重要意义。该基因主要存在 3 种不同的转录本，共同编码与 Ras 相关的同源区(RalGDS/AF26 ,RA) 。这三个转录本分别是：

RASSF1A 、 RASSF1B 、 RASSF1C

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RASSF1ARASSF1A

RASSF1A 含外显子 1α 和 2αβ, 其 cDNA 全长 1 873 bp , 含 340 个氨基酸的开放读码框 ,编码产物为相对分子质量为 38 800 的蛋白多肽 , 其 N 端与富含半胱氨酸的甘油二酯或佛波酯结合区高度同源 , 也被称作蛋白激酶 C 保守区 1 (protein kinase C conserved region 1 ,PKCC1) 。在正常组织中都有表达 , 但在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌、肾癌等肿瘤中存在较高的表达缺失。

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RASSF1BRASSF1B

RASSF1B 也含外显子 2αβ, 但其外显子1β 与转录本 A 不同 , 该转录本 cDNA 全长 1 664 bp , 可能仅编码 Ras 同源区(RA) 。主要表达于造血系统的组织细胞 ,在肿瘤中的表达缺失率不高 ,约 37.13 %

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RASSF1CRASSF1C

RASSF1C 外显子起自 1γ,无 2αβ, 全长117 kb , 编码含 270 个氨基酸的蛋白 ,但不含 PKCC1 区 , 相对分子质量为 32 000 。正常组织和肿瘤中都有较好的表达

因此， RASSF1A 基因可以成为一种研究的重要候选抑癌基因。表达产物是RASSF1A 蛋白

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RASSF1ARASSF1A 蛋白蛋白 RASSF1A 蛋白作为 Ras 效应蛋白家族中的一员 ,

主要以 GTP 依赖的方式结合 Ras 传导通路上游的 Ras/ GTP 而被激活发挥抑制细胞生长、促进细胞凋亡和衰老的功能。

研究发现 ,RASSF1A 蛋白的氨基酸序列除了包含RA 区、 PKCC1 区外还包含了一个 ATM(ataxia telangiectasia mutated) 蛋白的磷酸化位点， ATM参与细胞周期调控、有丝分裂中染色体重组、端粒长度监测及 DNA 损伤细胞学反应。

RASSF1A 蛋白通过磷酸化 ATM 蛋白的 PI3K 位点活化来发挥抑制肿瘤的作用。

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RASSF1ARASSF1A 蛋白蛋白 1 、 RASSF1A 蛋白通过抑制 Ras 激活生长效应信号

的 传 导途径而发挥作 用 ; 另一 种 可 能机制则是RASSF1A 蛋白的失活导致 Ras 作用的失衡 , 使其主要发挥促进生长的作用。

2、 RASSF1A 蛋白可能是细胞周期蛋白 D1 (cyclin D1) 的抑制蛋白。 cyclin D1 对 RASSF1A 蛋白的活性非常敏感 , 活化 RASSF1A 蛋白能明显的抑制 cyclin D1 在细胞内积聚从而抑制细胞由 G1 期进入 S 期 ,对细胞增殖起负性调节作用。

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RASSF1ARASSF1A 蛋白蛋白3 、 RASSF1A 蛋白在分裂间期分布在

细胞微管 , 在有丝分裂期分布在细胞中心体和纺锤体 , 并最终通过细胞分化周期调控蛋白 20 ( cell division cycle control protein20 ,cdc20) 作用到促后期复合物 (anaphase promoting complex ,APC) 上 , 抑制 APC 磷酸化活性使细胞有丝分裂停滞在中后期

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RASSF1ARASSF1A 基因高甲基化与肿基因高甲基化与肿瘤瘤 现已明确RASSF1A 基因在肺癌等癌症中表达失活的机制

是由于其启动子区 CpG岛的特异性高甲基化所致。虽然抑癌基因的失活还可由突变所致 , 但对该基因的研究

结果表明 ,RASSF1A 基因的突变率在肺癌中还不及 10 %,而 RASSF1A 启动子区发生高甲基化的比率在小细胞肺癌、非小细胞肺癌系中分别高达 100 %和 63 %, 非恶性肺组织中无一例发生甲基化。

研究表明：不表达 RASSF1A 蛋白的 A549 肺癌细胞系经甲基化抑制剂处理并重新表达 RASSF1A 蛋白后 , 可减少其细胞克隆形成 , 抑制非贴壁性细胞生长 ; 而表达RASSF1A 蛋白的裸鼠移植肿瘤较对照组的肿瘤生长明显减慢。

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RASSF1ARASSF1A 基因高甲基化与肿基因高甲基化与肿瘤瘤

邵康 ,赫捷 ,程邦昌 , 等 RASSF1 基因不同转录本在肺癌组织中的转录表达及临床意义 . 中华肿瘤杂志 ,2003 ,25 (2) :1492153.研究还发现 RASSF1A 与淋巴结转移及 TNM 分期相关 , 伴淋巴结转移者或病期较晚的病例癌组织者 RASSF1A 的表达缺失均显著高于无淋巴结转移者 ( P < 0. 05) 及病期较早者 ( P < 0. 01)

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5’-5’- 氮杂脱氧胞苷氮杂脱氧胞苷DNA 甲基化修饰有多种方式，其中

DNA 胞嘧啶 C-5 位甲基转移酶 (DNA 甲基化酶 ) 识别 DNA 的 5′-CG-3′ 序列(CpG), 把 S腺苷甲硫氨酸 (SAM) 的甲基转移到胞嘧啶的 5位 , 生成 5甲基胞嘧啶 (5mC)[2] 。 DNA 甲基化抑制剂能逆转甲基化效应 ,包括防止甲基化 CpG的突变 , 重激活因甲基化抑制的基因等。

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5’-5’- 氮杂脱氧胞苷氮杂脱氧胞苷 这些抑制剂及其作用靶点较多。其中胞苷类似

物 5氮杂脱氧胞苷的作用机制已很清楚 , 目前已进入临床实验阶段，用于白血病治疗。其他化合物大多停留在临床前实验阶段。

5‘氮杂胞苷、 5’氮杂脱氧胞苷和胞苷结构类似 ,它们能与 DNA 甲基化酶共价结合 ,降低酶的生物 活性。但此类化合物体内体外实验均有细胞毒和致突变作用。

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•鼻咽癌是一种多因素参与的多基因遗传性疾病。然而，研究 RASSF1A 基因的甲基化与鼻咽癌的转移关系的文章不很多，因此，本研究旨在从一个新的角度反映鼻咽癌的本质

研究现状

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研究现状 Lo KW, Kwong J , Hui AB , et al. High frequency of

promoter hypermethylation of RASSF1A in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Res ,2001 ,61 :387723881. ：分析了 4 例鼻咽癌移植瘤标本、 4 株鼻咽癌细胞系和 21 例原发性鼻咽癌标本 , 发现RASSF1A 基因 5′Cp G 岛的完全甲基化率在移植瘤中为 100 %(4/ 4) , 在鼻咽癌细胞系中为 75 %(3/ 4) , 在原发性鼻咽癌中为 66.17 %(14/ 21) , 在正常鼻咽上皮没有甲基化 , 基因突变只在原发性鼻咽癌中发现 2 个 ,

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研究现状 在有高度甲基化的细胞系和移植瘤中发现有

RASSF1A 基因的高表达缺失 , 在用甲基化抑制剂5′氮杂脱氧胞苷(5′2aza22 ,deoxycytidine)处理后 ,RASSF1A 基因重新表达并显著抑制细胞的生长和增殖。

Chow 等将野生型 RASSF1A 基因转染到RASSF1A 基因缺陷型的鼻咽癌细胞 C66621 中 , 发现重新表达 RASSF1A 蛋白的鼻咽癌细胞C66621 能显著减少其细胞克隆形成 , 抑制非贴壁性细胞生长。

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以上资料表明：

1. RASSF1A 基因是鼻咽癌的一个非常重要的候选抑癌基因 , 启动子区的高度甲基化至少是其失活的主要机制之一。（当然，基因缺失的作用不可忽视。）

2. RASSF1A 基因表达低下是鼻咽癌的晚期转移的重要事件，可能是伴随性改变，甚至是鼻咽癌发生转移的主导因素

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第二部分第二部分

实验目的实验目的

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实验目的

1. RASSF1A 基因的高甲基化和RASSF1A 基因的表达在鼻咽癌转移方面有无统计学意义

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实验目的

2.通过 5’-氮杂脱氧胞苷联合放疗对 RASSF1A 基因的表达的影响，研究该药物、放疗各自的疗效和联合疗效

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第三部分第三部分

技术路线技术路线

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鼻咽癌细胞系接种裸鼠

RASSF1A基因甲基化水平及其在鼻咽癌细胞系表达

5’-氮杂脱氧胞苷处理

检测 RASSF1A基因甲基化水平

分析比较其差异性

RASSF1A基因及蛋白表达

放疗 空白对照5’氮杂脱氧胞苷联合放疗

鼻咽癌组织 正常组织

免疫组织化学

检测 RASSF1A蛋白

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主要实验方法

（一）甲基化特异性 PCR（MSP） MSP 法原理 : 单链 DNA 的胞嘧啶 (C) 可被亚硫酸氢盐

脱氨基转变为尿嘧啶 (U), 而 5 甲基胞嘧啶 (5 mC) 则不能被修饰 , 仍保持为 5 甲基胞嘧啶 (5 mC), 根据 5 甲基胞嘧啶与胞嘧啶修饰后的不同 , 发生甲基化与未发生甲基化 DNA 的上游引物之间的差别为胞嘧啶 (C) 变为胸腺嘧啶 (T), 下游引物的差别为鸟嘌呤 (G) 变为腺嘌呤 (A) 。据此设计甲基化(p16m) 等位基因特异引物和非甲基化 (p16u) 引物 , 用这两对引物对同一模板进行扩增来检测待扩增片段的甲基化状况。能用 p16m 引物扩增的 , 说明了该扩增片段已发生了甲基化 ,能用 p16u 引物扩增的 , 说明了该扩增片段没发生甲基化 , 如用两对引物都能扩出 , 则说明了该扩增片段存在部分程度的甲基化。本研究所扩增的片段位于启动子和第一外显子 , 其引物序列见表

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（一）甲基化特异性PCR（MSP）

引物引物序列 bp p16m( 上游 )5′ TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC 3′150

p16m( 下游 )5′ GACCCCGAACCGCGACCGTAA 3′ 150

p16u( 上游 )5′ TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT 3′ 151

p16u( 下游 )5′ CAACCCCAAACCACAACCATAA 3′ 151

PCR: 反应总体积 50μl, 包括经亚硫酸钠修饰后的模板 DNA 约 50ng,引物各 300dNTP1.25mmol/L,1.25UDNA 聚合酶 ,1*

PCR 缓 冲 液 (16.6mmol/L 硫 酸 铵 、 67mmol/L Tris HClpH8.8 、 10mmol/L2- 巯基乙醇 67mmol/LMgCl2) 反应条件为95℃热启动 15m, 然后于 95℃30s 、 60℃30s 、 72℃30s 各循环 35次 , 最 后 于 72℃ 延 伸 10min, 同 时 以 正 常 人 外 周 血 淋 巴 细 胞(PBI)DNA 作为阴性对照 [3], 以水作为空白对照。取扩增产物于 2%琼脂糖凝胶中电泳 , 凝胶成像系统观察 , 拍照。

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主要实验方法 （一）逆转录 PCR 1、 抽提鼻咽组织和鼻咽癌细胞株总 RNA， 42oC 完成 2 、 引 物 Oligo （ dT ） 15 ： 正 义 引 物 5’-

TCTGGGGCGTCGTGCGCAAA-3’; 反 义 产 物 5’-GAACCTTGATGAAGCCTGTG-3’

3、  内对照：甘油醛 -3-磷酸脱氢酶（ GAPDH）

4 、  扩增产物在 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙啶（小心，强烈致瘤剂）染色

5 、  测定 RASSF1A 和 GAPDH 基因产物条带吸光度的相对比值。该比值表示 RASSF1A 基因的相对表达强度。

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主要实验方法

5’ 氮杂脱氧胞苷 5 aza CdR1.0μmol/L（ 可 以 采 用 的 浓 度 分 别 为0.1,0.5,1.0,2.0,5.0μmol/L ）

免疫组织化学技术放疗 DT36Gy/18 次

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第四部分第四部分

预期结果预期结果

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1. 未用 5’ 氮杂脱氧胞苷与放疗前测甲基化正常组织程度低，鼻咽癌组织甲基化程度高，能与转移能力正相关

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2. 未用 5’ 氮杂脱氧胞苷与放疗前测RASSF1A 表达正常组织高，鼻咽癌组织低，表达能力与转移能力负相关

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3. 用 5’ 氮杂脱氧胞苷与放疗后

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  5’ 氮杂脱氧胞苷与放疗组

5’ 氮杂脱氧胞苷组 放疗组 空白对照

组RASSF1A 较高 较高 较高 低

甲基化 较低 较低 较低 高

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第五部分第五部分

经费预算经费预算

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编号

项目 经费(元 )

1 RT-PCR 与 MSP 12000 元

2 免疫组织化学 3000 元 3 细胞培养基本材料及裸鼠 7000 元 4 放射材料和药物、器材等 2000 元

合计： 24000 元

具体花费视实验情况决定

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时间安排 2005 、 11 ～ 2006 、完成临床资料的收集及实验准备工作（技术准备，预实验） ；

2006 、 3～ 2007 、 3 完成鼻咽癌细胞的氮杂脱氧胞苷与放疗处理并测定甲基化 、 RASSF1A表达 ；

整理数据，进行统计学分析 2007 、 4～ 2007 、 5 撰写毕业论文，准备答辩

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