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新規医療開発に関わる統計学 (バイオインフォマティクス)
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新規医療開発に関わる統計学(バイオインフォマティクス)
坊農 秀雅(ぼうのう ひでまさ) 大学共同利用機関法人 情報・システム研究機構 ライフサイエンス統合データベースセンター
(DBCLS)
本講義の内容1. バイオインフォマティクスとは?!
2. NGSとは? できること!3. NGSデータ解析の概要!4. 具体的な解析例!5. データの解釈!6. データの再利用
2
1.バイオインフォマティクスとは?
(かつての)バイオインフォマティクス研究者の職種別分類
•アルゴリズム屋!–方法を考える人!–「NP完全」がキーワード!
•実装屋!–プログラムやツールを書く人!
•解析屋!–プログラムを使って実際に生データを相手に手を動かす人
数学的 抽象的
生物的 具体的Biologistの範疇
4
バイオインフォマティクスの範疇
シミュレーション
イメージ解析
!
パスウェイ解析
遺伝子発現解析
!
アミノ酸配列解析 塩基配列解析
さらに、臨床データ解析も5
2. NGS(Next Generation Sequencer)とは? -NGSでできること
DNA塩基配列解読の超高速化•かつてはSanger法 •最近は「次世代シーケンサー(NGS)」 ‒Illumina: Sequence By Synthesis
• http://www.youtube.com/watch?v=womKfikWlxM ‒Life Technologies(現 ThermoFisher Scientific) •ヌクレオチドがDNA鎖に取り込まれる過程でポリメラーゼによって放出される水素イオンを検出
• http://www.youtube.com/watch?v=MxkYa9XCvBQ ‒PacBio: 一分子・リアルタイム(SMRT®)検出
• http://www.youtube.com/watch?v=NHCJ8PtYCFc 7
MiSeq• Illumina社のデスクトップ次世代シーケンサ •群馬大学にも導入済み •最新の v3 試薬だと1runで ‒300塩基(base) ‒x 5000万リード ‒= 15 Gb(参考: ヒトハプロイドゲノム 約3Gb)
8
NGSでできること• RNA転写量測定!
–RNAseq(transcriptome sequencing)!• DNA結合タンパク質の結合配列の解析!
–ChIPseq(ヒストンや転写因子)!
• ChIPはChromatin immunoprecipitationの略!
•多型解析!–Exome(exon限定), Re-sequence!
•その他、塩基配列解読が伴うさまざまな応用9
NGSからの生データ•FASTQフォーマットのファイル ‒4行/readが基本単位 ‒MiSeq v3 •5000万リードx4行 •=2億行
•ファイルサイズも4Gbyte/file超 ‒FAT32フォーマットでは扱えない
•いわゆる「開く」ことが不可能10
SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 length=33 TGTCGGTCCAGCTCGGCCTTGGGCTCCGTTTTC +SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 length=33 -IIIIIIII8IIIIIIIIIII6IIIIIIIII9I @SRR001356.2 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33 TCTGAACCCGACTCCCTTTCGATCGGCCGCGGG +SRR001356.2 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGIIIIIII-III @SRR001356.3 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33 GTGGCAGCGTTTTTGGGCCCGCCGCTTGCCGTT +SRR001356.3 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33 IIIII&IIIIIIIIIIIIIIIIHI1IIIIIIII
3. NGSによるデータ解析の概要 トランスクリプトーム解析
(RNAseq)
RNAseqとは?•「次世代シーケンサを利用して、サンプル中の RNA の中身に関する情報を得るために cDNA をシーケンシングする方法」!–http://en.wikipedia.org/wiki/RNA-Seqより勝手に翻訳!
• Whole transcriptome shutgun sequencing (WTSS) や!
• Transcriptome sequencingとも
12
RNAseq データ 解析の流れ1
予測転写単位ごとの(推定)発現量情報
SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 length=33!TGTCGGTCCAGCTCGGCCTTGGGCTCCGTTTTC!+SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 [email protected] 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33!TCTGAACCCGACTCCCTTTCGATCGGCCGCGGG!+SRR001356.2 2023DAAXX:5:1:123:476 [email protected] 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33!GTGGCAGCGTTTTTGGGCCCGCCGCTTGCCGTT!+SRR001356.3 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33!IIIII&IIIIIIIIIIIIIIIIHI1IIIIIIII
FASTQ
1.tophat (bowtie)
2.cufflinks
3.cummeRbund13
遺伝子アノテーション
ゲノム .fa
ゲノムアノテーション
.gtf
ゲノムに対する多重配列アラインメント
.bam
種々のデータフォーマット
14
ファイルフォーマット ファイル拡張子
1 FASTA .fa .fasta
2 FASTQ .fq .fastq
3 SRA/SRA-lite .sra .lite.sra
4 SAM/BAM .sam .bam
5 GTF(GFF) .gtf .gff
6 VCF .vcf
1. FASTA
• FASTAというプログラムで使われる配列データ形式!–プレーンテキスト。ファイル拡張子: .fa .fasta など!
• 1行目に“>”で始まる1行のヘッダ行!
• 2行目以降に実際のシーケンス文字列
15
>gi|5524211|gb|AAD44166.1| cytochrome b [Elephas maximus maximus]!LCLYTHIGRNIYYGSYLYSETWNTGIMLLLITMATAFMGYVLPWGQMSFWGATVITNLFSAIPYIGTNLV!EWIWGGFSVDKATLNRFFAFHFILPFTMVALAGVHLTFLHETGSNNPLGLTSDSDKIPFHPYYTIKDFLG!LLILILLLLLLALLSPDMLGDPDNHMPADPLNTPLHIKPEWYFLFAYAILRSVPNKLGGVLALFLSIVIL!GLMPFLHTSKHRSMMLRPLSQALFWTLTMDLLTLTWIGSQPVEYPYTIIGQMASILYFSIILAFLPIAGX!IENY
参考: http://ja.wikipedia.org/wiki/FASTA
2. FASTQ• NGSデータの配列データ形式のデファクトスタンダード!
–プレーンテキスト。ファイル拡張子: .fq .fastq など!
• 1行目に“@”で始まる1行のヘッダ行!
• 2行目に実際の塩基配列!
• 3行目に”+”!
• 4行目に2行目に記述した配列のクオリティ値
16
@SEQ_ID!GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT!+!!''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65
参考: http://ja.wikipedia.org/wiki/Fastq
3. SRA, SRA-lite
• FASTQ形式の代わりに使われている、NGS配列データ配布フォーマット!
–配列拡張子: .sra .lite.sra !
• SRA-toolkitを使ってFASTQを生成できる!–http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=software
17
fastq-dump -A SRR233129 SRR233129.lite.sra
4. SAM/BAM•ゲノムマッピングしたときに生成されるアラインメントのフォーマット!
–リファレンスゲノム配列に対するアラインメント!
• SAMはプレーンテキスト(ASCII)形式なのに対して、BAMはバイナリ(binary)形式!
18参考: http://genome.sph.umich.edu/wiki/SAM
1:497:R:-272+13M17D24M! 113! 1! 497! 37! 37M! 15! 100338662! 0! CGGGTCTGACCTGAGGAGAACTGTGCTCCGCCTTCAG! 0;==-==9;>>>>>=>>>>>>>>>>>=>>>>>>>>>>!XT:A:U! NM:i:0!SM:i:37! AM:i:0!X0:i:1!X1:i:0!XM:i:0!XO:i:0!XG:i:0!MD:Z:37!19:20389:F:275+18M2D19M! 99! 1! 17644!0! 37M! =! 17919!314! TATGACTGCTAATAATACCTACACATGTTAGAACCAT! >>>>>>>>>>>>>>>>>>>><<>>><<>>4::>>:<9!RG:Z:UM0098:1! XT:A:R! NM:i:0!SM:i:0!AM:i:0!X0:i:4!X1:i:0!XM:i:0!XO:i:0!XG:i:0!MD:Z:37!19:20389:F:275+18M2D19M! 147! 1! 17919!0! 18M2D19M! =! 17644!-314! GTAGTACCAACTGTAAGTCCTTATCTTCATACTTTGT! ;44999;499<8<8<<<8<<><<<<><7<;<<<>><<! XT:A:R! NM:i:2!SM:i:0!AM:i:0!X0:i:4!X1:i:0!XM:i:0!XO:i:1!XG:i:2!MD:Z:18^CA19!9:21597+10M2I25M:R:-209! 83! 1! 21678!0! 8M2I27M! =! 21469!-244! CACCACATCACATATACCAAGCCTGGCTGTGTCTTCT! <;9<<5><<<<><<<>><<><>><9>><>>>9>>><>! XT:A:R! NM:i:2!SM:i:0!AM:i:0!X0:i:5!X1:i:0!XM:i:0!XO:i:1!XG:i:2!MD:Z:35!
5. GTF(GFF)• General Transfer Format. GFF(General
Feature Format)のversion2!
•ゲノムアノテーションのフォーマット!–例: ゲノム上のどこに遺伝子があるか
19参考: http://asia.ensembl.org/info/website/upload/gff.html
X! Ensembl! Repeat!2419108! 2419128! 42! .! .! hid=trf; hstart=1; hend=21!X! Ensembl! Repeat!2419108! 2419410! 2502! -! .! hid=AluSx; hstart=1; hend=303!X! Ensembl! Repeat!2419108! 2419128! 0! .! .! hid=dust; hstart=2419108; hend=2419128!X! Ensembl! Pred.trans.!2416676! 2418760! 450.19!-! 2! genscan=GENSCAN00000019335!X! Ensembl! Variation! 2413425! 2413425! .! +! .! !X! Ensembl! Variation! 2413805! 2413805! .! +! .
6. VCF• Variant Call Format!•配列の多型を記述するフォーマット
20参考: http://en.wikipedia.org/wiki/Variant_Call_Format
##fileformat=VCFv4.0!##fileDate=20110705!##reference=1000GenomesPilot-NCBI37!##phasing=partial!##INFO=<ID=NS,Number=1,Type=Integer,Description="Number of Samples With Data">!##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Total Depth">!##INFO=<ID=AF,Number=.,Type=Float,Description="Allele Frequency">!##INFO=<ID=AA,Number=1,Type=String,Description="Ancestral Allele">!##INFO=<ID=DB,Number=0,Type=Flag,Description="dbSNP membership, build 129">!##INFO=<ID=H2,Number=0,Type=Flag,Description="HapMap2 membership">!##FILTER=<ID=q10,Description="Quality below 10">!##FILTER=<ID=s50,Description="Less than 50% of samples have data">!##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description="Genotype Quality">!##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description="Genotype">!##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Read Depth">!##FORMAT=<ID=HQ,Number=2,Type=Integer,Description="Haplotype Quality">!#CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT Sample1 Sample2 Sample3!2 4370 rs6057 G A 29 . NS=2;DP=13;AF=0.5;DB;H2 GT:GQ:DP:HQ 0|0:48:1:52,51 1|0:48:8:51,51 1/1:43:5:.,.!2 7330 . T A 3 q10 NS=5;DP=12;AF=0.017 GT:GQ:DP:HQ 0|0:46:3:58,50 0|1:3:5:65,3 0/0:41:3!2 110696 rs6055 A G,T 67 PASS NS=2;DP=10;AF=0.333,0.667;AA=T;DB GT:GQ:DP:HQ 1|2:21:6:23,27 2|1:2:0:18,2 2/2:35:4!2 130237 . T . 47 . NS=2;DP=16;AA=T GT:GQ:DP:HQ 0|0:54:7:56,60 0|0:48:4:56,51 0/0:61:2!2 134567 microsat1 GTCT G,GTACT 50 PASS NS=2;DP=9;AA=G GT:GQ:DP 0/1:35:4 0/2:17:2 1/1:40:3
NGSに比べてマイクロアレイ• 2000年前後に使われ初めて、ある程度(技術として)枯れてきた!–参考: 公共データベースの登録数の推移!
–遺伝子発現バンク(GEO)目次 http://lifesciencedb.jp/geo/!
•本もそれなりに出ている
21
マイクロアレイ解析の流れ
遺伝子アノテーション
Genespringoligoprobeに対応する遺伝子ごとの発現量
22
マイクロアレイのデータ形式の実際•タブ区切りテキスト!
–数万(=スポットの数)行!
• (古い)Excelでも「開ける」!–Excel2003の行数制限内!
•コマンドライン操作なしで中身が直接見れる
23
データ解析に必要なものマイクロアレイ NGS(RNAseq)
解析ソフト +++ +++
遺伝子 アノテーション +++ +++
ゲノム アノテーション - ++
ゲノム配列 - ++
コマンドライン操作 + +++
計算機パワー + +++24
マイクロアレイとの違い: RPKM• Reads Per Kilobase per Million mapped reads!•ノーマライズした遺伝子発現量!
–100万リード数マップされたとき、転写産物を1000塩基長としたときのマップされたリード数!
• FPKMもほぼ同じ!–Fragments Per Kilobase of exon per Million
mapped fragments!– !
• Reference: Nat Methods, 5(7):621-628.25
RNAseq データ解析の流れ2•リファレンスゲノム配列がないとき!–transcriptome の de novo
assembly!•「UniGeneを自分で作る」!
–現状、より膨大な計算時間が
• immature • state-of-the-art
26
4. 具体的な解析例
The cat way•理化学研究所の二階堂愛さんのブログ!
–http://cat.hackingisbelieving.org/lecture/ !
!
!
!
•オープンソースソフトウェア!–Tuxedo suite!
• bowtie,tophat,cufflinks!–R + Bioconductor
28
cuffdiff -p 24 ensembl_gene.gtf ! -L iPS_01,iPS_02,hESC_01,hESC_02,Fibroblast_01,Fibroblast_02! -o results iPS_01.bam,iPS_2.bam hESC_1.bam,hESC_2.bam Fibroblast_01.bam,Fibroblast_02.bam!
tophat -p 8 -r 100 -o output_dir/iPS_01 bowtie2_indexes/mm9 iPS_01_1.fastq iPS_01_2.fastq
RNAseq データ 解析の流れ1
ゲノムに対する多重配列アラインメント
.bam
ゲノムアノテーション
.gtf
予測転写単位ごとの(推定)発現量情報
SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 length=33!TGTCGGTCCAGCTCGGCCTTGGGCTCCGTTTTC!+SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 [email protected] 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33!TCTGAACCCGACTCCCTTTCGATCGGCCGCGGG!+SRR001356.2 2023DAAXX:5:1:123:476 [email protected] 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33!GTGGCAGCGTTTTTGGGCCCGCCGCTTGCCGTT!+SRR001356.3 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33!IIIII&IIIIIIIIIIIIIIIIHI1IIIIIIII
FASTQゲノム .fa
29
遺伝子アノテーション
1.tophat (bowtie)
2.cufflinks
3.cummeRbund
統計解析環境R
• Rを使ったトランスクリプトーム解析!–(Rで)マイクロアレイデータ解析!
• http://www.iu.a.u-tokyo.ac.jp/~kadota/r.html
–(Rで)塩基配列解析 • http://www.iu.a.u-tokyo.ac.jp/~kadota/r_seq.html!
!
• トランスクリプトーム解析 by 門田幸二 from 共立出版 –http://www.kyoritsu-pub.co.jp/bookdetail/9784320123700
30
有償のソフトウェアの利用
•CLC Genomics workbench!•Agilent!
–Avadis NGS!–GeneSpring!
•TIBCO Spotfire
31
RNAseq データ 解析の流れ1
ゲノムに対する多重配列アラインメント
.bam
ゲノムアノテーション
.gtf
予測転写単位ごとの(推定)発現量情報
SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 length=33!TGTCGGTCCAGCTCGGCCTTGGGCTCCGTTTTC!+SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 [email protected] 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33!TCTGAACCCGACTCCCTTTCGATCGGCCGCGGG!+SRR001356.2 2023DAAXX:5:1:123:476 [email protected] 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33!GTGGCAGCGTTTTTGGGCCCGCCGCTTGCCGTT!+SRR001356.3 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33!IIIII&IIIIIIIIIIIIIIIIHI1IIIIIIII
FASTQゲノム .fa
1.tophat (bowtie)
2.cufflinks
3.cummeRbund32
遺伝子アノテーション
統合TVに動画チュートリアルが
• CLC Genomics Workbench でショートリードのマッピングを行う!–http://togotv.dbcls.jp/20110628.html
33
RNA-seq by Avadis NGS
• http://togotv.dbcls.jp/20111124.html 34
ChIP-seq by Avadis NGS
• http://togotv.dbcls.jp/20120626.html35
GeneSpring
36• https://www.youtube.com/user/GeneSpringTV
Spotfireによるcuffdiff出力の可視化
37
% cuffdiff -p 8 Caenorhabditis_elegans.WBcel215.69.gtf -L N2,UV -o cuffdiff SRR454084.bam SRR454085.bam
RNAseq データ 解析の流れ1
ゲノムに対する多重配列アラインメント
.bam
ゲノムアノテーション
.gtf
予測転写単位ごとの(推定)発現量情報
SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 length=33!TGTCGGTCCAGCTCGGCCTTGGGCTCCGTTTTC!+SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 [email protected] 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33!TCTGAACCCGACTCCCTTTCGATCGGCCGCGGG!+SRR001356.2 2023DAAXX:5:1:123:476 [email protected] 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33!GTGGCAGCGTTTTTGGGCCCGCCGCTTGCCGTT!+SRR001356.3 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33!IIIII&IIIIIIIIIIIIIIIIHI1IIIIIIII
FASTQゲノム .fa
1.tophat (bowtie)
2.cufflinks
3.cummeRbund38
遺伝子アノテーション
5. データの解釈
発現解析• 2つの状態を比べた時に遺伝子発現が!–上がった遺伝子群!–下がった遺伝子群!
–例: ヒト培養細胞で低酸素刺激して発現が2倍上がった遺伝子100個中20が転写因子。これは有意?!•ヒトには約三万個の遺伝子に約千ほどの転写因子。!• 30,000 x 20/100 = 6,000 なので…!
• GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)40
DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)
41
42
43
44
45
© 2013 DBCLS Licensed under CC 表示 2.1 日本
#NGLSBI
© 2014 DBCLS Licensed under CC 表示 2.1 日本
RefEx: 遺伝子発現 リファレンスデータセット
•臓器ごとの発現比較を4つの実験手法とBodyParts3Dで!–正常組織・臓器における遺伝子発現のリファレンス!–再利用可能で有用なパブリックデータの活用例!
•「組織特異的遺伝子」検索機能の実装
46
EST Classical Expressed Sequence Tags
GeneChip Affymetrix’s microarray
CAGE Cap Analysis of Gene Expression
RNAseq Transcriptome Sequencing
http://RefEx.dbcls.jp/
© 2013 DBCLS Licensed under CC 表示 2.1 日本
#NGLSBI
© 2013 DBCLS Licensed under CC 表示 2.1 日本© 2013 DBCLS Licensed under CC BY 2.1JAPAN 47http://RefEx.dbcls.jp/
© 2013 DBCLS Licensed under CC 表示 2.1 日本
#NGLSBI
© 2013 DBCLS Licensed under CC 表示 2.1 日本© 2013 DBCLS Licensed under CC BY 2.1JAPAN 48
© 2013 DBCLS Licensed under CC 表示 2.1 日本
#NGLSBI
© 2013 DBCLS Licensed under CC 表示 2.1 日本© 2013 DBCLS Licensed under CC BY 2.1JAPAN 49
RefExのデータはどこから?
•オリジナルは公共データベース!–そこから使いやすく加工して提供!
!
•それ以外のデータも再利用したい?
50
6. データの再利用
公共NGSデータベース: SRA
公共遺伝子発現データベース
ゲノムブラウザからの利用
データ登録
SRA(Sequence Read Archive)• NGSのデータベース(除くヒト個人のデータ)!
• NCBI/EBI/DDBJによって維持管理!–DDBJはDRAとも呼称
52
Image generated by http://sra.dbcls.jp/
NBDCヒトデータベース
http://humandbs.biosciencedbc.jp/
53http://sra.dbcls.jp/
遺伝子発現データベース• GEO(NCBI)とArrayExpress(EBI)!
–http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ –http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/
• RNAseqデータはこちらにも登録がある!–Transcriptome analysisとも!
!
•必要なデータを見つけづらい
54
GEO目次
55
UCSC Genome Browser!は再利用可能データの宝庫
‘Track’を追加56
http://genome.ucsc.edu/
多くのTrackは隠されている
57
カスタマイズしよう
58
59
60
‘default tracks’で元に戻せる
61
自分のデータもSRAへ登録•論文掲載の必須条件になっていることも!•データを他の研究者に再利用してもらうことが研究の価値を高める上でとても大事!!
•日本だとDRA(DDBJ)へ!•日本語でのやりとり
62
http://www.ddbj.nig.ac.jp/63
データ登録
64
DRA video tutorial
65http://trace.ddbj.nig.ac.jp/dra/video.html
復習は統合TVで
66
•動画によるDBやツールのチュートリアル ‒ 各DBやツール名、
•統合データベース講演会AJACSの動画も •YouTubeでも •約750の動画 (アップデート込)
66
で検索
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