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Concepción, 16 de abril 2015
JM Sayagués
Técnicas para la detección de anomalías
cromosómicas. Aplicaciones de la técnica de
Hibridación in situ Fluorescente (HISF) en
hemopatías malignas
Alteraciones genéticas+
Factores ambientalesNeoplasia
Hemopatías malignas Alteración genética aislada(Alteración primaria)
Alteraciones genéticas asociadas ala transformación del clon inicial
(Alteraciones secundarias)Tumores sólidos
Introducción
• Estandarización de la técnica de Arrays Genómicos• Significado biológico y pronóstico de los cambios genómicosanalizados mediante arrays genómicos en los LEZM
MetodologíaHipótesis y Objetivos
Resultados y Discusión
Introducción
Célula neoplásica
Introducción
Citogenética convencional
Hibridación in-situ fluorescente
Hibridación Genómica Comparada
Micro-arrays
5-10 Mb
2.5-5 Kb
BASEsimple
Ultra-secuenciación
t(9;22)(q34;q11)
1960: Cromosoma PhiladelphiaLeucemia Mieloide Crónica
Limitaciones:-Sólo células en división- Selección clonal-Interpretación subjetiva- pequeño nº de células- sensibilidad
Citogenética Convencional
Nowell PC & Hungerford D A. A minute chromosome in humanchronic granulocytic leukemia. Science 142:1497. 1960
AT C G
CA
TG C
G
Células
Sonda
Hibridación in situ fluorescente
Identificación y localización desecuencias de ADN
1) Células en suspensión- Interfase: metanol/ácido acético (3/1 v/v)
- Metafase:Leucocitos estimulados (Fitohemaglutinina)Tratamiento con ColcemidTratamiento hipotónicoFijación
2) TejidosIncluidos en parafinaFrescosCongelados
Hibridación in situ fluorescente
Disgregación mecánica
1) TRATAMIENTO ENZIMÁTICO
Pepsina
Biotina Digoxigenina
Avidina oEstreptavidina Anti-digoxigenina
A C TG TA GT G C A T C A TG A G
A C TG TA GT G C A T C A TG A G
3) REVELADO/VISUALIZACIÓN
2) DESNATURALIZACIÓN E HIBRIDACIÓN
Sonda
Hibridación in situ fluorescente
- MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
. LÁMPARA:100 W, 200 horas
. OBJETIVO: 100X INMERSIÓN
. FILTROS: Simples, dobles y triples
-CONTABILIZAR SEÑALES
. 200 CÉLULAS
Hibridación in situ fluorescente
Sondas para FISH
Centroméricas LibreríasLocus
específicasTeloméricas
Tamaño y la localización de secuencias que identifican
Síndrome Down
NORMAL TRISOMIA
Anomalías cromosómicas•Numéricas: ganancias y pérdidas cromosómicas
•Estructurales: Deleciones, amplificaciones, inversionesy translocaciones
Tipos de alteraciones cromosómicas
DELECIONES
AMPLIFICACIONES
.
.......
.
.....
Alteraciones estructurales
INVERSIONES
Alteraciones estructurales
TRASLOCACIÓN
Traslocación equilibrada entre dos cromosomas
q
p
Fusión
Alteraciones estructurales
FISH: Limites de detección
La sensibilidad de la técnica depende del:
• Diseño y tamaño de la sonda• Muestra• % de células tumorales en la muestra• Patrón de normal – alterado• Número de células analizadas
En general se asume un cut-off del 4% (100 – 200 núcleos)
– Trisomía 18 en mucosa gástrico• 100 núcleos: 5,7% (0,9 + 3 x 1,16)• 500 núcleos: 3,7% (0,8 + 3 x 0.9)
– Trisomía 8 en LMC:• 200 núcleos: 3%• 500 núcleos: 1,8%
– Trisomía 12 en LLC:• 1,8 – 2.2 % (Seoul National University Institute)
Trisomías
FISH: Límites de detección
Cuneo et al. Haematológica, 1998; 83: 21-26Bunn et al. Blood, 2003; 101:1941-1949
FISH: Límites de detección
• En general se asume un cut-off del 10% (100 núcleos)
• Sin embargo, los intervalos calculados son inferiores:
– Monosomía 7: 5% en SMD
– Monosomía 6: 6.86% en Linfoma B
– Monosomía 13: 8,2% en mieloma (200 núcleos)
Monosomías
Imashuku et al. Haematological, 2003; 88:(11) ECR31Sietske et al. Blood, 2000; 96: 3569-3577
FISH: Límites de detección
Deleciones• Deleción P16:
– 3.1% - 200 núcleos (Woo et al. J Korean Med Sct, 2005;20: 30-41)
• Deleción ATM:– 5% (Salido et al. Haematologica, 2003; 88: 11)– 6.5% (Goorrha et al. Genetic in Medicine, 2004; 6: 48-53)
• Deleción RB1:– 5.3% - 200 núcleos (Avet-Loiseau et al. Blood, 1999; 94: 2583-89)
• Deleción TP53:– 10% (Chang et al. Blood, 2005; 105: 358-60)– 8.6% (Ackermann et al. British J Haematol, 2003; 103; 1161-63)
FISH: Límites de detección
Translocaciones
• Sonda: S-BRC/ABL Dual Color• Patrón de normalidad: 2R2V• Patrón de translocación: 1R1V1F• Cut-off: 10%
• Sonda: D-BRC/ABL Dual Color• Patrón de normalidad: 2R2V• Patrón de translocación: 2F1F1R• Cut-off: 1%
• Sonda: Break-Apart• Patrón de normalidad: 2F• Patrón de translocación: 1F1V1R• Cut-off: 1.7%
Wen et al.J. Clinical Pathology 2007;46: 47-71
Varella-García et al.Genet Mol Biol 2003; 21: 1415-57
Van der Burget el tal.Leukemia, 2011; 13: 2107-12
BAC-
arra
y
ADN referenciaADN tumoralCantidades =
Pérdida
Sin cambios
Ganancia
Array-Hibridación Genómica Comparada
0.50
Inte
nsid
adfluo
resc
encia
NormalDeleción Amplificación
1
1.25
1.50
0.75
aCGH vs. FISH
No requiere células en divisiónAnaliza globalmente el genomaAlta especificidadProcedimiento semiautomatizadoElevado nivel de resolución
VENTAJAS
No detecta alteraciones recíprocas30% de células tumoralesHibridación de alta calidadPolimorfismos
LIMITACIONES
Array-Hibridación Genómica Comparada
¿Es útil el diagnósticocitogenético en el estudio de
leucemias y linfomas?
Clasificación OMS
Año 2000. Sociedad europea y americana de hemopatología
Clasificación de la Leucema Mieloblástica Aguda (LMA):
Criterios
Morfológicos
Genéticos
Inmunofenotípicos
Clínicos
Clasificación OMS de las Leucemias agudas mieloblásticasAño: 2000
Buen pronóstico
Mal pronóstico
Clasificación OMS: Leucemia mieloblástica agudaAño: 2008
- 90% se clasifican como LMA M2- 10% de las LMA de novo, jóvenes- Pronóstico favorable: Buena respuesta a la
QT (ARA-C a altas dosis de citarabina;arabinosido de citosina)
- Frecuente asociación con otras anomalíasgenéticas: del(9q22), –Y
Proteína de fusión RUNX1-RUNX1T1
LMA con t(8;21) (q22;q22) RUNX1-RUNX1T1
LMA con t(15;17) (q22;q12)
8 % de las LMA, fundamentalmente en jóvenes. Pronóstico favorable: buena respuesta a ATRA Morfológicamente: Blastos muy granulados Bastones de Auer (astillas) MPO +++
Hipergranular o LAP “típica” Hipogranular
bastones de Auer Nucleos bi-lobulados
q22
q12RARα
PML
t(15;17)(q22;q12)
PML-RARαProteína de fusión
LMA con t(15;17) (q22;q12)
Inv (16) y t (16;16) (p13;q22) CBFβ-MYH11
Incidencia: 12% de todas las LMA Morfológicamente:
• Diferenciación granulocítica y monocítica• Presencia de población EF anormal en MO• Ocasionalmente sin eosinofilia
90% se clasifican como LMA M4Eo
Pronóstico favorable:↑ tasas de RC y SLE con QT (ARA-C ↑ dosis)
Proteína de fusión (CBFβ-MYH11)
- 16p: Se han descrito 10 transcritosdiferentes, el más frecuente es eltipo A (88%)- Parece ↓ la cantidad de CBF activo ycompetir contra él, dando unaacumulación de multímeros CBFβ-MYH11/CBFα en el núcleo
Cr. 16q22: gen del factor-β (CBFβ)Cr. 16p13: cadena pesada de la miosina (MYH11)
CBFβ/MYH11
LMA con alteraciones de 11q23 (MLL)
• Incidencia: 5-6% de todas las LMA• Involucrado en proliferación, supervivencia y
diferenciación de célula madre hematopoyéticapluripotencial
• Reordenado en LMA de novo, LMA secundaria y LLA• Pronóstico adverso / controvertido• Más frecuente en:
NiñosLMA 2arias a tratamiento con inhibidores de la
topoisomerasa II• Morfología:
Diferenciación mielomonocítica o monocítica(M4-M5)
FABt(4;11) M4t(6;11) M4/M5t(9;11) M5at(10;11) M5at(11;19)/MLL-ELL M4t(11;19)/MLL-ENL M4/M5a
t(9;11) (p21;q23)
LA MÁS FRECUENTE
73 translocaciones y 54 genes
Grupo de riesgo Alteración genética Supervivencia5 años Recaída
Favorable t(8;21), t(15;17), inv(16) 70% 33%
IntermedioNormal, +8, +21, +22, del(7q), del(9q),Reordenamientos MLLOtras anomalías numéricas y/o estructurales
48% 50%
Desfavorable -5, -7, inv(3)/t(3;3), Cariotipos complejos (≥3alteraciones), t(6;9) 15% 78%
Estratificación pronóstica de las LMAs
Brunning RD, et al.: Acute myeloid leukaemia with recurrent genetic abnormalities. In: Jaffe ES, Harris NL, Stein H, et al.,eds.: Pathology and Genetics of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Lyon, France: IARC Press, 2008. WorldHealth Organization Classification of Tumours, 3, pp 81-7. s
Las alteraciones citogenéticas definen el subtipo de LMAsy la estrategia terapéutica de los pacientes
LMA cariotipo normal: Estudio de mutaciones génicas
Mrozek et al, Blood. 2007;109:431-448Schlenk et al, N Engl J Med 2008;358:1909-1918
Mutaciones en CEBPA, Significado clínico:•Sólo en pacientes con cariotipo normal, sin FLT3-ITD ni mutaciones en NPM1.
Gen Incidencia ImpactoLMA-CN pronóstico
FLT3-ITD 45% AdversoNPM1 46-62% FavorableCEBPA 15-19% Favorable
Citogenética en SMD
Lee GR, et al. Wintrobe’s clinical haematology:Volume 1. 10th Ed. Baltimore: Williams &Wilkins, 1999:145-69.
Anemia Trombocitopenia Neutropenia
Multipotent stem cells
Lymphoid stem cellsMyeloid stem cells
Erytrocytes
Megakaryoblast Myeloblast
ThrombocytesB lymphocytedeveloping
in bone marrow
T lymphocytedevelopingin thymus
Erytroblast
Basophil Eosinophil Neutrophil Monocyte
Citopenias
Anomalías cromosómicas más frecuentes en SMD
FISH: no reemplaza cariotipo.
Indicación imprescindible: aldiagnóstico, escasas o nulasmetafases o cromosomas de pobrecalidad.
Tejido de elección: MO (SP siblastos 10-20%)
Núcleos a examinar por FISH:200
Sondas imprescindibles: 5p15;5q31; cen7; 7q31, cen8
Sondas opcionales: 20q;p53(17p13); cromosoma Y
Haase D et al. Blood 2005;106:232a
Riesgo favorable: del(5q), del(20q), -YRiesgo intermedio: +8, del(7q)Riesgo adverso: -5, -7, cariotipos complejos
SMD con del(5q): Lenalidomida
Fenaux et al. Blood 2011;118:3765–3776.
CORREGIR LAS CITOPENIASDisminuir o evitar las trasfusiones
Disminuir las infeccionesDisminuir las hemorragias
Mejorar Calidad de Vida Aumentar la Supervivencia
Lenalidomida en 5q-Las alteraciones citogenéticas en SMD definen el
pronóstico y tratamiento de los pacientes
Alteraciones cromosómicas en LLA-B
T. Szczepanski, et al. Lancet Oncology, 2010; 11:880-889
Alteraciones cromosómicas en LLA-B
T. Szczepanski, et al. Lancet Oncology, 2010; 11:880-889
Las alteraciones cromosómicas en LLA-B marcan el protocolo de tratamientoen función del pronostico citogenético de los pacientes.
Leucemia linfática crónica
D13S25
Cr. 12
La del(13q) es la alteraciónmás frecuente en la LLC
Leucemia linfática crónica
Del(11)(q21)
ATM
P53
del(17p)
La pérdida de ATM se asocia con- Edad joven- Masas ganglionares- Mala respuesta a fludarabina- Mal pronóstico
(n=325)
Del(13q)
Meses
Del(11q)
+12
Del(17p)
36 72 108 144 180
20
40
60
80
100
00
Lancet Oncol. 2015 Feb;16(2):169-76. Döhner et al N Engl J Med 2000; 343: 1910
SUPERVIVENCIA Y CITOGENÉTICA
Leucemia linfática crónica
P<0.001
Las alteraciones citogenéticas en LLC definen el pronóstico de los pacientes
Mieloma múltiple
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1415 16 17 18 19 20 21 22 X
Anomalías numéricas en el MMTrisomías
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 131415 16 17 18 19 20 21 22 X Y
Monosomías
p
q
Anomalías estructurales en el MM
Todos los MM tienen alteraciones genéticas
Gutiérrez et al, Haematologica 2000 y Leukemia 2001
del(13q)
Evolución clonal en Mieloma múltiple
“Acquired genetic events collaborate withinitiating events to drive disease progression”
Morgan et al, Nature Reviews in Cancer 2011
(50%)(50%)
Mieloma múltiple
Alteraciones primarias
IGH Translocaciones (50%)• t(11;14) CCND1 (20%)• t(4;14) FGFR3 (15%)• t(6;14) CCND3 (4%)• t(14;16) MAF (4%)• t(14;20) MAFB
Hiperdiploidia (50%)• Trisomías de los cromosomas3, 5, 7, 9, 11, 15, 19, 21
Alteraciones secundariasDeleciones• Deleción 1p (20%) CDKN2C,• Deleción 6q (33%)• Deleción 8p (25%)• Deleción 13q (44%) RB1, DIS3• Deleción 11q (7%) BIRC2/BIRC3• Deleción 14q (38%) TRAF3• Deleción 16q (35%) WWOX• Deleción 17p (8%) TP53
Ganancias+1q (40%) CKS1B, ANP32E
Iniciación Progresión
Alteracionesinnatas
2p DNMT3a3p JPO27p ULK4
Morgan et al, Nature Reviews in Cancer 2011
Mieloma múltiple
t(4;14)(p16;q32) del(17p13.1) (P53)
t(4;14) (n=29)
No t(4;14) (n=231)
P<0.0001
Ove
rall
surv
ival
120100806040200
100
80
60
40
20
0
P53 normal (n=238)
Deleción P53 (n=22)
P<0.0001
100
80
60
40
20
0
806040200 100Gutierrez NC et al. Leukemia 2007, Walker et Blood 2010
Blood. 2015 Jan 9. pii: blood-2014-11-612069.
del(1p32) +1q21 (CKS1B)
Linfoma de células del manto
t(11;14)(q14;q32)
Paneles de utilidad para linfomas
2524232221
161514131211.2
11.2121314.114.32122232431
32
3334353637
2
ALK2625242322
21
1413
12
11.213.1
2122
242526.126.2
272829
13.3
23
3
BCL6
23222112
11.211.2121321.121.221.3
22
23
824
131211.211.2121321
222324
31
32
14IgH
11.2
15
141312
12
1314
2122
232425
11
CCND1API2 21
11.311.2
11.2
12
2223
18
BCL2MALT1
ALK split
BCL6 split
c-MYC/IgH fusion
BCL2/IgH fusion
MALT1/API2 fusion
CCND1/IgH fusion
2524232221
161514131211.2
11.2121314.114.32122232431
32
3334353637
2
ALK2524232221
161514131211.2
11.2121314.114.32122232431
32
3334353637
2
ALK2625242322
21
1413
12
11.213.1
2122
242526.126.2
272829
13.3
23
3
BCL6
2625242322
21
1413
12
11.213.1
2122
242526.126.2
272829
13.3
23
3
BCL6
23222112
11.211.2121321.121.221.3
22
23
824 MYC
131211.211.2121321
222324
31
32
14IgH
11.2
15
141312
12
1314
2122
232425
11
API2 21
11.311.2
11.2
12
2223
18
BCL2MALT1
ALK split
BCL6 split
c-MYC/IgH fusion
BCL2/IgH fusion
MALT1/API2 fusion
CCND1/IgH fusion
ALK split
BCL6 split
c-MYC/IgH fusion
BCL2/IgH fusion
MALT1/API2 fusion
CCND1/IgH fusion
Los reordenamientos cromosómicos contribuyenal diagnóstico diferencial de linfomas
Conclusiones
-La FISH es especialmente útil para la identificación deanomalías estructurales como la t(12;21), t(8;21), t(8;14),inv(16) y reordenamientos a nivel de 11q23, que pueden pasarinadvertidas cuando se emplea citogenética convencional.
-Las alteraciones citogenéticas contribuyen al diagnóstico(LMAs, LLA y LNH) pronóstico (LMAs, SMD, LLA, y MM) y a laestrategia terapéutica (LMA, SMD, LLA, LLC y MM) depacientes con leucemias y linfomas.
Gracias
Por
Vuestra Atención