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UMR1388 INRA/INPT GenPhySE
Plateforme de Cytogénétique
CYTOGÉNÉTIQUE CLINIQUE CHEZ LES ANIMAUX D’ÉLEVAGE : BILAN DE LA PLATEFORME DE L’UMR INRA/INPT GENPHYSE
ATC le 10/09/2014
Plan :
Introduction :• Présentation de l’INRA• Présentation du département de Génétique
Animale• Présentation de la plateforme
La cytogénétique clinique à l’INRA• Bref historique• Les principaux résultats• Activité cytogénétique porcine
• Historique• Motivations • Principaux résultats
ATC le 10/09/2014
Activités de recherche : analyse des effets des anomalies sur la reproduction
• Analyse des produits méiotiques• Analyse du processus méiotique
Nouveaux projets :
• Analyse de la recombinaison and interférence• Analyse de l’infertilité mâle• Etude des points de cassure
ATC le 10/09/2014
INTRODUCTION
ATC le 10/09/2014
UMR1388 INRA/INPT GenPhySE
Plateforme de Cytogénétique
L’INRA est un organisme de recherche en agronomie fondé en 1946, placé sous le statut et sous la double tutelle des ministères de l’Enseignement supérieur et de la Recherche et du ministère de l'Agriculture, de l'Agroalimentaire et de la Forêt.
L'INRA mène des recherches finalisées pour une alimentation saine et de qualité, pour une agriculture durable et compétitive, et pour un environnement préservé et valorisé.
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L’INRA :
Le département de Génétique Animale :
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CT1 - le génome : structure fine et organisation fonctionnelle
CT2 - l'animal : leviers génétiques pour un élevage innovant et durable
CT3 - les populations animales : caractérisation, gestion et optimisation
Equipe CYTOGENE :
Plasticité du génome et de l’épigénome au cours de la gamétogenèse
Architecture nucléaire 3D et expression du génome
Caractérisation de la diversité génétique de l’abeille domestique
Anne Marie LOUSTAU
Responsable Qualité AI Inra
Nathalie MOUNEY
Resp Activité Bovins, autres espèces TR Envt
Anne CALGARO
Resp Activité Porcs TR Ex Envt
Alain PINTON
Responsable Plateforme de Cytogénétique IR Inra
Nathalie PRONO
Secrétaire AJT FR Envt
Nicolas MARY
TR Inra
Alain DUCOS
Pr Envt
CONTRÔLE CHROMOSOMIQUE DES POPULATIONS ANIMALES (porcs, bovins,
chevaux, sangliers…)
PROGRAMMES SCIENTIFIQUES Anomalies chromosomiques et
reproduction
Personnes impliquées dans les deux activités
PLATEFORME DE CYTOGENETIQUE (ISO 9001)
Périmètre de certification ISO 9001
Harmonie BARASC
IE ENVT
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http://www.envt.fr/node/327
Missions
Mission 2 : Programmes scientifiques « cytogénétique et reproduction »
Développer, dans la continuité de l’activité de contrôle, des programmes de recherche originaux dans le domaine de la « biologie de la reproduction »
Mission 1 : Contrôle chromosomique des populations animales
Apporter un service au monde de l’élevage par la recherche d’anomalies chromosomiques susceptibles d’avoir des répercussions sur la « qualité des reproducteurs »
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Missions
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Recherches “finalisées ”
Objectifs : Estimer les effets potentiels des anomalies chromosomiques
Recherches “académiques”
Objectifs : Apport de nouvelles connaissances sur le processus de méiose en présence d’anomalies chromosomiques et recherche des causes d’infertilité « mâle »
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La cytogénétique clinique à l’INRA
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UMR1388 INRA/INPT GenPhySE
Plateforme de Cytogénétique
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• Début de la cytogénétique animale dans les années 60
• 1964 : identification de la Rob 1/29 (bovin) et de la première translocation réciproque chez le porc
• Dans les années 70 développement des techniques de banding et établissement des premiers caryotypes standards
• L’association entre anomalies chromosomiques et troubles de la reproduction → développement de laboratoires de cytogénétique animale principalement en Europe
• Depuis les années 90→ déclin de la cytogénétique animale clinique
Un peu d’histoire:
ATC le 10/09/2014ATC le 10/09/2014
Un peu d’histoire:
• 1968: établissement des premiers laboratoires de cytogénétique à l’INRA (Jouy en Josas : Paul Popescu et Toulouse : Roland Darré)
• 1971: identification de la Rob 1/29 en France
• 1986: décret rendant obligatoire l’analyse des taureaux avant leur utilisation en insémination artificielle
• 2009: obligation d’élever des sangliers présentant un caryotype à 36 chromosomes
• Entre 8000 et 10000 analyses chromosomiques réalisées chaque année (principalement chez le porc et le bovin)
• Ces analyses concernent généralement des individus à phénotype normal
• Les individus anormaux sont éliminés par les éleveurs• Les anomalies détectées sont généralement équilibrées
Aujourd’hui• Comme chez l’Homme, peuvent être responsables
d’anomalies congénitales, d’infertilité, de cancer…
Pertes économiques potentiellement importantes• Quelques laboratoires principalement en Europe réalisent des contrôles systématiques (Ducos et al., 2008)
ATC le 10/09/2014
Résultats dans l’espèce bovine
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Résultats dans l’espèce bovine
Rob 1/29Obligation de tester les taureaux avant IA
Baisse de la fertilité entre 3 and 5% (Gustavsson, 1969, 1971; Refsdal, 1976; Logue and Harvey, 1978; Dyren-dahl and Gustavsson, 1979; King et al., 1980, 1981; Popescu 1980; Schmutz et al., 1991; Wilson, 1991; Lonergan et al.,1994)
1700 analyses par an
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Résultats dans l’espèce bovine
Freemartinisme
Le freemartin est une femelle presque toujours stérile née d’une naissance gémellaire hétérosexuée.Cette anomalie apparait dans 90% des naissances comportant au moins un mâle et une femelle. Le diagnostic de freemartinisme est réalisé par la recherche de chimérisme leucocytaire XX/XY résultant de l’anastomose placentaire entre les jumeaux hétérosexués.
• Cattle
Autres anomalies
• Rcp(8;9)• Rcp(1;15)• Rcp(7;7) mosaic 10.7%
• Inv (29)
• 2n=60,XY; 61,XXY (16%)
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Résultats dans l’espèce bovine
Principales anomalies identifiées :±20rcp, 7inv, 50Rob±5 trisomies autosomalesAneuploïdies des chromosomes sexuels XXY, XY/XYY, XXX
Environ 400 analyses par an
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Résultats “sangliers”
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Résultats “chevaux”
2009 2010 2011 2012 20130
1
2
3
4
5
6
7
32
3
5
2
14
3
2
5
NX0
Analyse de femelles présentant des problèmes de reproduction
Principales anomalies identifiées :±10 rcp±10 trisomies autosomalesAneuploidies des chromosomes sexuels X0, XXX, XXY, XX/XY, XX sex reversal, XY sex reversal
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X
Y
Y
63, X0 / 65, XYY dans un cas de pseudohermaphrodisme mâlePaget et al. (2001)
Résultats “chevaux”
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Résultats “chiens”
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Cytogénétique dans l’espèce porcine
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Introduction: historique rapide
Initiation du contrôle chromosomique à grande échelle dès 19951997 : J. Rech. Porcine, 29, 375-382
• Présentation des objectifs, des premiers résultats
2002 : J. Rech. Porcine, 34, 269-275
• Résultats 1998-2002
2007 : J. Rech. Porcine, 39, 281-288
• Résultats 2002-2006
2012 : J. Rech. Porcine, 44, 43-44• Résultats 2007-2011
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Introduction: motivations
Anomalies chromosomiques:
• acquises (cancers …)
• constitutionnelles (malformations, problèmes de reproduction)
Anomalies déséquilibrées (ex : trisomies)
Anomalies équilibrées (structure)
Anomalies de structure constitutionnelles équilibrées
Chez les hétérozygotes troubles de la reproduction
• ♂
• ♂ et ♀
Perturbation de la spermatogenèse (azoospermie, oligozoospermie) Qualité de semence dégradée
Production de gamètes déséquilibrés
Baisse de la prolificité des conjointes de verrats porteurs
- 40% en moyenne (de -10% à -100%) pour les t. réciproques
Conséquences économiques importantes !
Introduction: motivations
ATC le 10/09/2014
ATC le 10/09/2014
Animal normal Animal transloqué hétérozygote
Quadrivalent méïotique(stade diacinèse- métaphase I)
ségrégation alterne ségrégation adjacente- 1
équilibré déséquilibré déséquilibrénormal
X
Zygote normal
normal
zygote transloquééquilibré
zygotes déséquilibrés
gamètes
mortalité embryonnaire
Animal normal Animal transloqué hétérozygote
Quadrivalent méïotique(stade diacinèse- métaphase I)
ségrégation alterne ségrégation adjacente- 1
équilibré déséquilibré déséquilibrénormal
X
Zygote normal
normal
zygote transloquééquilibré
zygotes déséquilibrés
gamètes
mortalité embryonnaire
Introduction: motivations
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• 1 verrat / 200 porteur d’anomalie
• Coût de la détection d’une anomalie :
200 x 60 € = 12 000 €
Coût du contrôle Coût de l’absence de contrôle
1. Coût direct : perte de porcelets (- 4 porcelets par portée)
LW / LF
• 90 doses / mois ( 110)• 40 portées / mois
P
• 190 doses / mois ( 220)• 80 portées / mois
Utilisation des verrats pendant 4 mois(le temps de constater l’hypoprolificité)
• 160 portées produites• manque 640 porcelets
~ 20 000 €
• 320 portées produites• manque 1280 porcelets
~ 40 000 €
2. Coût indirect : diffusion de l’anomalie
• 50% des descendants d’un porteur d’anomalie sont eux-mêmes porteurs de l’anomalie !
• La diffusion est potentiellement massive !
Introduction: motivations
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Organisation de la filière porcine
• Très large utilisation de l’ Insémination Artificielle (IA)
Potentielle dissémination des anomalies chromosomiques Mise en place d’un contrôle chromosomique
Sélection
Multiplication
Production
Races pures et lignées
Fabrication d’individus croisés : - cochettes parentales- verrats terminaux croisés
Porcs charcutiers croisés
95 élevages13 400 truies
330 élevages56 750 truies
9 000 élevages1 202 600 truies
IFIP, 2008
Matériels et méthodes:
Matériels et méthodes:
90% • jeunes verrats de race pure (6-10 mois)
3% • verrats hypoprolifiques
7% • analyses familiales
• 90% de ces animaux: 3 organismes de sélection
Cytogénétique classique (GTG) and FISH
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Leica GSL120
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Résultats
• Plus de 31000 individus analysés à ce jour (1700/an)
169 anomalies de structure 29 anomalies des chromosomes sexuels
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Résultats
Le plus important…
La fréquence des anomalies de structure équilibrées:
0,47%
Plus de 86% sont des translocations réciproques (baisse de prolificité de 40% en
moyenne)
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Recherche : analyse des effets des anomalies sur la
reproduction
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Plateforme de Cytogénétique
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Anomalies de structure constitutionnelles équilibrées
Chez les hétérozygotes troubles de la reproduction
• ♂
• ♂ et ♀
Perturbation de la spermatogenèse (azoospermie, oligozoospermie) Qualité de semence dégradée
Production de gamètes déséquilibrés
Introduction:
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Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques• 0,5% chez le porc
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Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques
Ségrégation alterne
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Facteurs influençant le comportement méiotique :
• Chromosomes impliqués
• Taille des fragments transloqués…
• Sexe
• Fond génétique
Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques
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• rcp (12;14)(q13;q21)
• rcp (3;15)(q27;q13)
SSC12
SSC14
der14 der12
SSC 3SSC 15
der 15
der 3
Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques
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• Mâles :
alternate/ adjacent 1 adjacent 2 3:1 diploïd/4:0
adjacent-1 alternate/adjacent-1 adjacent-2 3:1alternate
• Femelles :
Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques
• Effet du sexe sur la ségrégation méiotique
Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques
ATC le 10/09/2014
Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques
ATC le 10/09/2014
• Pas de variabilité inter- ou intra-individuelle
Production de gamètes déséquilibrés: translocations réciproques
ATC le 10/09/2014
N der(3)
N der(16)
N der(3)
N der(16)
N der(3)
N der(16)
N
N der(16)
NN
N der(16)
N
Porcelet avec un caryotype déséquilibré2n=38, XX (ou XY), der16 t(3;16)(q23;q22)
Verrat transloqué
t(3;16)(q23;q22) and palatoschisis (fentes palatines)
Ducos et al., 2004
Production de gamètes déséquilibrés: translocations Robertsoniennes
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déséquilibréséquilibrés
der(13;17)
13 17
Alterne Adjacente 3:0
• 0,013% chez le porc
Production de gamètes déséquilibrés: translocations Robertsoniennes
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Production de gamètes déséquilibrés: inversions
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• 0.03%-0,06% chez le porc
Inversion Péricentrique Inversion
Paracentrique
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Production de gamètes déséquilibrés: inversions
SSC2 normal SSC2 inversé
région inversée : 36 %
p1.1
q2.1
SSC2 normal SSC2 inversé
région inversée : 23 %
SSC2 normal SSC2 inversé
région inversée : 8 %
p1.1q1.1
inv(2)(q1.3;q2.5)
inv(2)(p1.1;q2.1)
inv(2)(p1.1;q1.1)
inv(1)(q1.2;q2.4)
inv(1)(p2.1;q2.10)
inv(1)(p2.4;q2.9)
* * *
SSC1 inverséSSC1 normal SSC1 normalSSC1 normal SSC1 inverséSSC1 inversé
région inversée : 20 %
région inversée : 71 %
région inversée : 85,5 %
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Production de gamètes déséquilibrés: inversions
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Taux de gamètes recombinés <5%
Production de gamètes déséquilibrés: inversions
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Troubles de la spermatogenèse
Anomalies de structure constitutionnelles équilibrées
Chez les hétérozygotes troubles de la reproduction
• ♂
• ♂ et ♀
Perturbation de la spermatogenèse (azoospermie, oligozoospermie) Qualité de semence dégradée
Production de gamètes déséquilibrés
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• Des anomalies du spermogramme sont observées dans 50% des couples infertiles (Huynch et al., 2002)
• La prevalence des anomalies chromosomiques est plus élevée chez les hommes presentant des spermogrammes anormaux (21X, azoospermies ; 7X oligospermies) (Mau-Holzmann, 2005)
Troubles de la spermatogenèse
ATC le 10/09/2014
• Les remaniements peuvent conduire à des anomalies de la méiose responsables de troubles de la spermatogenèse (Van Assche 1996; Martin, 2008)
1) Association des chromosomes remaniés avec le bivalent XY:
propagation de l’inactivation du chromosome X aux segments autosomiques associés (Jaafar et al., 1993)
transcription de gènes du chromosome X (Lifschytz and Lindsley, 1972)
2) Présence des protéines BRCA1, ATR and H2AX sur les régions non appariées et génétiquement réprimées (Turner et al., 2005 ; Homolka et al., 2007, 2012)
Troubles de la spermatogenèse
ATC le 10/09/2014
Troubles de la spermatogenèse
ATC le 10/09/2014
Troubles de la spermatogenèse
rcp(7p+;13q-)
(Gustavsson et al., 1988)
(Oliver-Bonet et al., 2004)
• anomalies d’appariement des chromosomes en particulier dans les régions des points de cassure (Luciani and Guichaoua, 1990)
• association des régions non appariées avec le bivalent sexuel apparié uniquement par les régions pseudo-autosomale
ATC le 10/09/2014
Troubles de la spermatogenèse
ATC le 10/09/2014
Troubles de la spermatogenèse
Présence des protéines BRCA1, ATR and H2AX sur les régions non appariées et génétiquement réprimées (Turner et al., 2005 ; Homolka et al., 2007, 2012)
Turner et al. 2005
ATC le 10/09/2014
Troubles de la spermatogenèse : translocation Y/1 chez le porc
ATC le 10/09/2014
RNA/DNA FISH
Troubles de la spermatogenèse : translocation Y/1 chez le porc
ATC le 10/09/2014
Troubles de la spermatogenèse : verrat 38,XY/39,XXY
- cellules XXY dans le testicule mais seulement les cellules XY entrent en division de méiose-Méiose perturbée: spermatogenèse anormale environnement testiculaire inapproprié
ATC le 10/09/2014
Oligo-, Astheno-, Térato-spermique (19.106/ml)
Spermatogenèse fortement perturbée
Troubles de la spermatogenèse : translocation 1/14 chez le porc
ATC le 10/09/2014
Troubles de la spermatogenèse : translocation 1/14 chez le porc
SCP1+SCP3SCP3γH2AXCentro
Q + NO T + A
SSC1
SSC14der1
der14
Poster H. Barasc
ATC le 10/09/2014
Troubles de la spermatogenèse : translocation 1/14 chez le porc
SSC1: 293,925,712
der14
SSC1
der1
SSC1, BAC CH242- 298E5
SSC14: 148,080
der14
der1
SSC14
SSC14 , BAC SBAB-234D5
Poster H. Barasc
ATC le 10/09/2014
Troubles de la spermatogenèse : translocation 1/14 chez le porc
1 2
3 4
• der 1: PCR entre les primers 1 4
• der 14: PCR entre les primers 3 2
PERSPECTIVES
ATC le 10/09/2014
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Plateforme de Cytogénétique
ATC le 10/09/2014
Identification de remaniements chromosomiques et étude de leurs effets sur la reproduction
Analyse de nouveaux cas identifiés lors du contrôle sur la plateforme
donner un conseil plus documenté aux éleveurs
Analyse des effets des anomalies
Analyse de la recombinaison et de l’interférence chez le porcs(N. Mary)
• Acquisition de données de référence, étude de l’effet de la race, de l’âge…
• A partir de ces données, analyser les effets des anomalies chromosomiques sur la recombinaison
Analyse de la recombinaison méiotique
ATC le 10/09/2014
Analyse de la recombinaison méiotique
MLH1
SCP3
Centromeres
Analyse de l’infertilité mâle (génétique et épigénétique)
• Analyse CGH de verrats présentant des qualités de semence dégradées
1895 CNVs detectés plus de délétions que de duplicationsCorrélation nombre de délétions/concentration
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 X Y0
20
40
Distribution of the CNVs
del
dup
Chromosomes
CN
Vs
nu
mb
ers
200 210 220 230 240 250 260 270 2800
0.5
1
1.5
2
2.5
3
R² = 0.767626596526906
correlation sperm concentration/deletions numbers
deletions numbers
log
(co
nce
ntr
atio
n)
Caractérisation des points de cassure séquençage verrats transloqués
Analyse des intéractions des régions de points de cassure au cours de la méiose
Analyse des points de cassure
Merci de votre attention
ATC le 10/09/2014
http://www.envt.fr/node/327http://www.envt.fr/node/541
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Plateforme de Cytogénétique