Novas Estratégias no

Diagnóstico MicrobiológicoProf. Dr. Rodrigo Cayô da SilvaSetor de Biologia Molecular, Microbiologia e Imunologia

Departamento de Ciências Biológicas - DCB

Instituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas - ICAQF

Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP, Campus Diadema

II CONGRESSO MINEIRO DE EPIDEMIOLOGIA,

PREVENÇÃO E CONTROLE DE INFECÇÕES

5° CONGRESSO MINEIRO DE INFECTOLOGIA

Belo Horizonte, 2019

DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES

• Cultura– Cultura tradicional em meios de cultura (bactérias

cultiváveis)

• Testes imunológicos– Látex

• Sorologia– Bactérias não cultiváveis

• Proteômica

– Técnica de MALDI-TOF MS: identificação diretamente do espécime clínico

• Biologia Molecular

DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES

• Cultura– Cultura tradicional em meios de cultura (bactérias

cultiváveis)

• Testes imunológicos– Látex

• Sorologia– Bactérias não cultiváveis

• Proteômica

– Técnica de MALDI-TOF MS: identificação diretamente do espécime clínico

• Biologia Molecular

Aplicações da Biologia Molecular

❖Diagnóstico das Infecções

❖Identificação Bacteriana

❖Estudo dos mecanismos de resistência

❖Avaliação epidemiológica

❖Estudo do Microbioma

SENSIBILIDADE ESPECIFICIDADE RAPIDEZ

Biologia Molecular: Metodologias

• Técnicas para detecção de fragmentos de DNA ou RNA específicos

❖ Amplificação do DNA ou RNA alvo

• PCR convencional e PCR em tempo Real

❖ Amplificação do DNA ou RNA alvo + sondas marcadas

• Luminex

• Micro Array

• Sequenciamento genético

❖ Sequenciamento de parte do genoma ou genoma completo

• Estudo da clonalidade

❖ PFGE e Diversilab

dATP

dCTP

dGTP

dTTP(nucleotideos)DNA polimerase termoestável

(Taq polimerase)

DNA molde

Oligonucleotídeos

iniciadores

(primers – foward e reverse)

Tampão

Mg2+

Replicação do DNA

❖ Processo de duplicação semiconservativo

❖ Cada molécula DNA serve como molde

❖ Síntese nova molécula mediada por DNA polimerase

❖ Regra de pareamento de bases

Taq polimerase

Primers

Tampão

Água

94ºCDENATURAÇÃO

72ºCEXTENSÃO

50-55ºCANELAMENTO

ETAPAS DA PCR

1. Adição de reagentes

2. Alternância de temperaturas

(Termociclador)

30-40 CICLOS

DNA

dATP

dCTP

dGTP

dTTP

(nucleotídeos)

http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/produtos/equipamentos-de-diagnostico/products/molecular-diag/intro-pcr/

PCR convencional✓ DNA molde

✓ dNTPs

✓ MgCl2✓Taq DNA Polimerase

✓ Primers

TERMOCICLADOR

Evolução - Revolução

DIAGNÓSTICO MOLECULAR POR PCR EM TEMPO REAL:

❖ Amplificação e detecção ocorrem na mesma etapa

❖ Sistema de fluorescência indica resultados positivos

❖ Detecta um ou mais alvos (multiplex)

❖ Mais rápido que o convencional

❖ Reduz chances de contaminação, tubo fechado

❖ Análise qualitativa e quantitativa

❖ Sensível e específico

Sondas

• Probe de Hidrólise (TaqMan)

• Hairpin (molecular beacon probe)

• Probes adjacentes

• Scorpion primers

Intercalantes Fluorescentes

• SYBR Green 1

• SYTO9

• EvaGreen

PCR em Tempo Real

Quasar 670Fam Cal Fluor Orange TAMRA ROX

Sistema Taq Man

Aumento da intensidade de fluorescencia

Sistema Taq Man

PCR em Tempo RealPlateau

Fase Exponencial

Baseline

Threshold

A molécula emite maior intensidade de fluorescência quando ligado à dsDNA;

portanto aumentando a emissão de acordo com a formação dos produtos de PCR.

SYBR GREEN

Instrumentos: PCR em Tempo Real

• As reações da PCR ficam emrotação contínua durante a corrida(400 RPM).

• Força G mantém os reagentes nabase do tubo (remove bolhas e condensação).

• Detecção uniforme da florescencia (Normalizador de fluorescência).

• Não necessita de calibração optica• Cinco canais de fluorescência +

HRM• Simples manuseio do equipamento

e do software

Amostras em rotação contínua durante a corrida

• 400 RPM

Aquisição de dados em alta velocidade

• todas as amostras lidas em uma rotação (0.15 sec)

Força G mantém os reagentes na base do tubo

• remove bolhas e condensação

• não forma pellet

Movimentação contínua: sem variação

• uniformidade térmica e óptica

400 RPM

Ventilação movimenta o ar

na câmara

Câmara selada para reter

o ar

Mecanismo de Aquecimento

Note: orifícios no

rotor permitem a

circulação do ar

Resistência ligada

Ar frio

Ventilação direciona o ar

para dentro da câmara

Ventilação em volta da

câmara

Abertura de ventilação se abre

para saída do ar quente

Mecanismo de Resfriamento

Resistência

desligada

Note: orifícios

permitema

circulação do ar

Câmara de reação

PMT Detector

LEDs

Lens

Filtros de detecção

Spindle/Motor Assembly

Mecanismo de DetecçãoDetecção

QIAGEN Rotor-Gene Q

(Corbett Rotor-Gene 6000)

❖ Reação feita em tubos

❖ Econômica

❖ Simples manuseio do

equipamento e

software

❖ Bom para laboratórios

com quantidade e

variedade

Alvos: Genes de

Resistência

Cepheid: Smartcycler

❖ Reação feita em tubos especiais

❖ Cada espaço funciona

independentemente como

diferentes equipamentos

❖ Bom para laboratórios com

variedade de exames

❖ Reduz contaminação

Prep Amostra +Extração DNA

2 horas

Prep PCR

0.5 hours

PCR

1.5 hours

Tempo Total

4 horas

Extração Prep PCR Amplificação

“Teste Tradicional”

Prep teste

2 min

PCR

30-60 min

Tempo Total

≈1 hour

Realizado na mesma área/sala

Teste “Amostra – Resultados”

1. Extração e Purificação de Ácidos Nucleicos

2. Amplificação

3. Detecção e Análise

3 INSTRUMENTOS

ou ou ou

Evolução - Revolução

GeneXpert

GX-1

GX-16

GeneXpert Infinity-48

GeneXpert®

ModuleGX-2 GX-4

Fácil

Manuseio

Rápidas

Respostas

Acurácia

Resultados

Melhor Aproveitamento dos Benefícios da Biologia Molecular

Cartucho

❖ Diagnóstico

• Doenças Infecciosas

• Oncologia

• Genética

❖ Testes feitos no mesmo cartucho

• Extração

• Amplificação

• Detecção

❖ Mesma base de cartucho para todos os

testes realizados no Sistema GeneXpert®

Vortex + dispensar a amostra no

cartucho

2

Inserir o cartucho no aparelho e

começar a corrida

3

Inserir o swab no reagente de

eluição

1

Trabalho Manual Total <1 Minuto

GeneXpert

Valor Clínico: Tempo de liberação dos resultados

é crucial

TIME TO RESULT

Cepheid vs. PCR e Cultura

Cepheid

PCR

PCRCultura

VA

LOR

CLÍ

NIC

O

0 12 hrs 1 dia 2 dias

Articles that look at time to result as crucial to maximizing diagnostic value:

1. Lance R. Peterson, M.D., Donna M. Hacek, M.T. (A.S.C.P.), Ari Robicsek, M.D., Case Study: An MRSA Intervention at

Evanston Northwestern Healthcare, printed in The Joint Commission Journal on Quality and Patient Safety Volume 33

Number 12, December 2007

2. Lance R. Peterson, M.D., Rapid Diagnosis of Community-Acquired MRSA, printed in Clinical Updates in Infectious

Diseases, Volume Issue 3, October 2008

3. Eli N. Perencevich, MD, MS et al., SHEA Guideline: Raising Standards While Watching the Bottom Line: Making a

Business Case for Infection Control, Infection Control and Hospital Epidemiology, Volume 28, Number 10, October

2007

Saúde da

Mulher

GBS

Infecções

Relacionadas a

Assistência a Saúde

Doenças

Infecciosas

Críticas

Teste CLIA-

Waived

(Point of Care)

Oncologia &

Genética

MRSA/SA BC

SA Nasal Complete

vanAfor VRE

MRSA/SA SSTI

MRSA C. difficile

Flu HemosILFII & FV

Virologia

• 11 Testes Disponíveis nos EUA

• 12 Testes Disponíveis Fora dos EUA– Incluíndo MDR-Tuberculosis e BCR-ABL

EV

C. diff/Epi

MTB/RIF

CE-IVD

BCR-ABLMonitor

CE-IVD

GeneXpert

EV Flu

MTB/RIF

Infecções

Relacionadas a

Assistência a Saúde

Doenças

Infecciosas

Críticas

Teste CLIA-

Waived

(Point of Care)

Oncologia &

Genética

Virologia

Microbial ID

Candidemia

HIVQuant HCV Quant

MRSA/SA BC

SA Nasal Complete

vanAfor VRE

MRSA/SA SSTI

MRSA C. difficile

C. diff/Epi Norovirus

Gastro B Panel

BCR/ABLMonitor

V2

HemosILFII & FV

BCR/ABLMonitor V1

Breast CA RX Strat

Breast Cancer

MetastasisRisk

SA

CT/NG

Flu A/B Panel

MRSA/SA SSTI EBV Quant

BKV

HBV Quant

HCV Genotype

Group A Strep

VaginitisGroup A

Strep

MDROVAP

MRSA/SA

VAP Gram Negative

RSV

CMV Quant

VZV

CE-IVD

CE-IVD CE-IVD

CE-IVD CE-IVDCE-IVD

Vaginitis/Vaginosis

CE-IVD

CE-IVD

46 Testes Disponíveis

Bladder Cancer Monitor

CE-IVD

BladderSympt

GBS CT/NG

HPV

CE-IVD

CT

VaginitisVaginosis

CE-IVD

HSV TypingLesion

Saúde da

Mulher

CE-IVD

GeneXpert

Xpert® MRSA NxG

Xpert® SA Nasal Complete

Xpert® MRSA/SA BC

Xpert® MRSA/SA SSTI

Xpert® C. difficile

Xpert® C. difficile/Epi

Xpert® vanA

Xpert® Carba-R

Xpert® Norovirus

Xpert® Xpress Strep A

Xpert® Xpress Flu

Xpert® Xpress Flu/RSV

Xpert® MTB/RIF

Xpert® EV

Xpert® Ebola†

Xpert® CT/NG

Xpert® TV

Xpert® GBS

Xpert® GBS LB

Xpert® MRSA NxGmethicillin-resistant Staphylococcus

aureus (MRSA)Active MRSA surveillance testing in 45 minutes

Xpert® SA Nasal Complete methicillin-resistant Staphylococcus

aureus (MRSA)e Pre-surgical testing for S. aureus and MRSA in about an hour

Xpert® MRSA/SA BCmethicillin-resistant Staphylococcus

aureus (MRSA)

Detection of MRSA and S. aureus in positive blood cultures in

about an hour

Xpert® MRSA/SA SSTImethicillin-resistant Staphylococcus

aureus (MRSA)

Detection of MRSA & S. aureus skin and soft tissue infections in

about an hour

Xpert® C. difficile Clostridium difficile Detection of Clostridium difficile in just over 30 minutes*

Xpert® C. difficile/Epi Clostridium difficileDetection and differentiation of Clostridium difficile & the

epidemic 027 strain in 45 minutes

Xpert® vanAVancomycin-resistant Enterococcus

spp.

On-demand testing to assist with VRE surveillance in just over

30 minutes*

Xpert® Carba-R Gram-negative bacilli

Detection of the carbapenem-resistance genes encoding KPC,

NDM, VIM, OXA-48 and IMP in 48 minutes from isolates, rectal

swabs, or perirectal swabs

Xpert® Norovirus NoravirusRapid identification and differentiation of Norovirus GI and GII

in less than one hour*

Xpert® Xpress Strep A Rapid detection of Group A Streptococcus DNA in as soon as

18 minutesGroup A Streptococcus

Xpert® Xpress Flu Rapid detection of Flu A and Flu B in as soon as 20 minutesInfluenza A

Influenza B

Xpert® Xpress Flu/RSVRapid detection and differentiation of Flu A, Flu B, and RSV in

as soon as 20 minutes

Influenza A

Influenza B

Xpert® MTB/RIF Mycobacterium tuberculosisDetection of MTB and rifampin resistance mutations in

less than two hours

Xpert® EV Fast molecular diagnostic testing for enterovirus in 2.5 hours 1 Enterovirus

Xpert® Ebola† Detection of Ebola Zaire virus in 98 minutes Ebola Zaire Virus

Xpert® CT/NGDetection of Chlamydia trachomatis and Neisseria

gonorrhoeae infections in 90 minutes

Chlamydia trachomatis

Neisseria gonorrhoeae

Xpert® TVDetection of Trichomonas vaginalis in male and female

specimens in as soon as 40 minutes*

Trichomonas

vaginalis

Xpert® GBSIntrapartum screening for Group B streptococcus during

labor/delivery in 35 minutes* Group B Streptococcus

Xpert® GBS LBAntepartum screening from LIM broth for Group B

streptococcus in 35 minutes*Group B Streptococcus

• Cartucho detecta 5 famílias de genes que conferem resistência aos carbapenêmicos

‒ blaKPC

‒ blaNDM

‒ blaVIM

‒ blaOXA-48

‒ blaIMP-1 subgroup

• Amostra: Swab Retal

• TAT: 48 minutos

ALL KPCs ALL VIMS All NDMS OXA-48

OXA-162

OXA-163

OXA-204

IMP 1 IMP 6

IMP 25IMP 3

IMP 10 IMP 30

IMP-1

subgroup

BD MAX™:

Amostra Resultados

• Único Sistema “amostra – resultado” ABERTO

• Profissional pode padronizar e definir os protocolos (Standardize User-Defined Protocol: UDPs)

• Consegue extrair DNA e RNA na mesma corrida

• Multiplex com detecção de 5 cores diferentes

• Laboratório pode padronizar a análise de resultados:– Amplificação de curvas em tempo real– Interpretação da curva de PCR– Análise por curva de dissociação (melting curve)– Resultados quantitativos

BD MAX™:

Única etapa manual: pipetar a amostra

BD MAX™:

BD MAX™:

Reagentes: Sistema Aberto

Reagentes de Extração e PCR

Extração

BD MAX™:

Modo aberto

Preparação da Amostra

BD MAX™:

*

BD MAX™:

“Layout”

BD MAX™:

Cartucho onde o PCR acontece

Colocar reagentes, amostras e cartão do PCR no BD MAXTM

Criar a lista de trabalho com identificação do teste e amostras

Fechar a porta do aparelho para começar a corrida

BD MAX™:

Tecnologia Microarray:

• Permite identificar, em uma mesma matriz, milhares de alvos diferentes

• Vários painéis multiplex vem sendo desenvolvidos usando esta metodologia

K.pneumoniae de

infecção de ferida

E.coli de fezes

NDM-1

CTX-M1

SHV-12

CMY-4

Exemplo de Resultados:

Verigene(Nanosphere)

Gram-positivos

Gram-negativos

Leveduras

FilmArray® Respiratory Panel 20 patógenos respirtatórios

Bordetella pertussis

Chlamydophila pneumoniae

Mycoplasma pneumoniae

Adenovirus

Coronavirus 229E

Coronavirus HKU1

Coronavirus OC43

Coronavirus NL63

Human Metapneumovirus

Human Rhinovirus/Enterovirus

Influenza A Influenza

A/H1

Influenza A/H1-2009

Influenza A/H3

Influenza B

Parainfluenza 1

Parainfluenza 2

Parainfluenza 3

Parainfluenza 4

RSV

FilmArray® BCID Panel24 patógenos (sangue) e 03 genes de

resistência

Enterococcus

Listeria monocytogenes

Staphylococcus

Staphylococcus aureus

Streptococcus

Streptococcus agalactiae

Streptococcus pyogenes

Streptococcus pneumoniae Acinetobacter

baumannii Haemophilus influenzae

Neisseria meningitidis

Pseudomonas aeruginosa

Enterobacteriaceae

Enterobacter cloacae complex

Escherichia coli

Klebsiella oxytoca

Klebsiella pneumoniae

Proteus

Serratia marcescens

Candida albicans

Candida glabrata

Candida krusei

Candida parapsilosis

Candida tropicalis

mecA - methicillin resistance

vanA/B - vancomycin resistance

KPC - carbapenem resistance

FilmArray®

Meningitis/Encephalitis (ME)

Panel

14 patógenos (líquior)

Escherichia coli K1

Haemophilus influenzae

Listeria monocytogenes

Neisseria meningitidis

Streptococcus agalactiae

Streptococcus pneumoniae

Cytomegalovirus (CMV)

Enterovirus

Herpes simplex virus 1 (HSV-1)

Herpes simplex virus 2 (HSV-2)

Human herpes virus 6 (HHV-6)

Human parechovirus

Varicella zoster virus (VZV)

Cryptococcus

neoformans/gattii

FilmArray® GI Panel 22 patógenos (fezes)

Campylobacter (jejuni, coli & upsaliensis)

Clostridium difficile (Toxin A/B)

Plesiomonas shigelloides

Salmonella

Yersinia enterocolitica

Vibrio (parahaemolyticus, vulnificus, & cholerae)

Vibrio cholerae E. coli O157

Enteroaggregative E. coli (EAEC)

Enteropathogenic E. coli (EPEC)

Enterotoxigenic E. coli (ETEC) lt/st

Shiga-like toxin-producing E. coli (STEC) stx1/stx2 E. coli O157

Shigella/Enteroinvasive E. coli (EIEC)

Adenovirus F 40/41

Astrovirus

Norovirus GI/GII

Rotavirus A

Sapovirus (I,II, IV, and V)

Cryptosporidium

Cyclospora cayetanensis

Entamoeba histolytica

Giardia lamblia

BD MAX™:

Gentilmente cedido por Suzane Silbert

BD Max

Braço robótico 4 ponteiras

Gavetas cartuchos – dois termocicladores independentes

Duas racks – 12 testes cada

Tubos secundários de amostra

Cartucho microfluídico

BD MaxCartuchos microfluídicos

24 câmarasindividualmentecontroladas parareação de PCR

Orifícios onde as amostras são carregadas

Código de barras 2D com número de lote

✓Características específicas

Gentilmente cedido por Suzane Silbert

Gentilmente cedido por Suzane Silbert

BD MAX TM

Cartuchos microfluídicos

24 câmarasindividualmentecontroladas parareação de PCR

Orifícios onde as amostras são carregadas

Código de barras2D com númerode lote

Braço robótico 4 ponteiras

Gavetas cartuchos – dois termocicladores independentes

Duas racks – 12 testes cada

Tubos secundários de amostra

Cartucho microfluídico

Única Etapa Manual: pipetar a amostra

Gentilmente cedido por Suzane Silbert

Gentilmente cedido por Suzane Silbert

Gentilmente cedido por Suzane Silbert

1) Protocolo de Meningite bacteriana do CDC:Material que será extraído DNA: liquorExtração de DNAMaster Mix

442819 ExKTM DNA-2 Swab seco e Líquido cefalorraquidiano (CSF)

DNA MMK (sem SPC)

442848

PrimersProbes

1) Protocolo de Meningite bacteriana do CDC:Material que será extraído DNA: liquorExtração de DNAMaster Mix

442819 ExKTM DNA-2 Swab seco e Líquido cefalorraquidiano (CSF)

Master Mix Primers e Probes Próprios

Colocar as amostras no tubo deprocessamento que contém o tampão

Carregar os reagentes na rack do BDMAX

Colocar os tubos de processamento contendo as amostras na rack

Identificar as amostrasFechar a porta e iniciar a corrida

Colocar a rack carregada com as amostras e o cartucho no BDMAX

Resultados

PCR direto de amostra de sangue total!!!!!

SEPTIFAST

- Técnica de PCR em tempo Real

- Detecção e identificação de bactérias e fungos através de

alvos específicos

- Detecção de mecanismos de resistência

- Direto do sangue ou de amostras clínicas

http://www.roche.com/prod_diag_septifast.pdf

1.5 mL

SeptiFast

LightCycler® System

PCR EM TEMPO

REAL