Novas Estratégias no Diagnóstico Microbiológico³stico-Molec… · Primers Tampão Água 94ºC...
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Novas Estratégias no
Diagnóstico MicrobiológicoProf. Dr. Rodrigo Cayô da SilvaSetor de Biologia Molecular, Microbiologia e Imunologia
Departamento de Ciências Biológicas - DCB
Instituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas - ICAQF
Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP, Campus Diadema
II CONGRESSO MINEIRO DE EPIDEMIOLOGIA,
PREVENÇÃO E CONTROLE DE INFECÇÕES
5° CONGRESSO MINEIRO DE INFECTOLOGIA
Belo Horizonte, 2019
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES
• Cultura– Cultura tradicional em meios de cultura (bactérias
cultiváveis)
• Testes imunológicos– Látex
• Sorologia– Bactérias não cultiváveis
• Proteômica
– Técnica de MALDI-TOF MS: identificação diretamente do espécime clínico
• Biologia Molecular
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES
• Cultura– Cultura tradicional em meios de cultura (bactérias
cultiváveis)
• Testes imunológicos– Látex
• Sorologia– Bactérias não cultiváveis
• Proteômica
– Técnica de MALDI-TOF MS: identificação diretamente do espécime clínico
• Biologia Molecular
Aplicações da Biologia Molecular
❖Diagnóstico das Infecções
❖Identificação Bacteriana
❖Estudo dos mecanismos de resistência
❖Avaliação epidemiológica
❖Estudo do Microbioma
SENSIBILIDADE ESPECIFICIDADE RAPIDEZ
Biologia Molecular: Metodologias
• Técnicas para detecção de fragmentos de DNA ou RNA específicos
❖ Amplificação do DNA ou RNA alvo
• PCR convencional e PCR em tempo Real
❖ Amplificação do DNA ou RNA alvo + sondas marcadas
• Luminex
• Micro Array
• Sequenciamento genético
❖ Sequenciamento de parte do genoma ou genoma completo
• Estudo da clonalidade
❖ PFGE e Diversilab
dATP
dCTP
dGTP
dTTP(nucleotideos)DNA polimerase termoestável
(Taq polimerase)
DNA molde
Oligonucleotídeos
iniciadores
(primers – foward e reverse)
Tampão
Mg2+
Replicação do DNA
❖ Processo de duplicação semiconservativo
❖ Cada molécula DNA serve como molde
❖ Síntese nova molécula mediada por DNA polimerase
❖ Regra de pareamento de bases
Taq polimerase
Primers
Tampão
Água
94ºCDENATURAÇÃO
72ºCEXTENSÃO
50-55ºCANELAMENTO
ETAPAS DA PCR
1. Adição de reagentes
2. Alternância de temperaturas
(Termociclador)
30-40 CICLOS
DNA
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
(nucleotídeos)
http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/produtos/equipamentos-de-diagnostico/products/molecular-diag/intro-pcr/
PCR convencional✓ DNA molde
✓ dNTPs
✓ MgCl2✓Taq DNA Polimerase
✓ Primers
TERMOCICLADOR
Evolução - Revolução
DIAGNÓSTICO MOLECULAR POR PCR EM TEMPO REAL:
❖ Amplificação e detecção ocorrem na mesma etapa
❖ Sistema de fluorescência indica resultados positivos
❖ Detecta um ou mais alvos (multiplex)
❖ Mais rápido que o convencional
❖ Reduz chances de contaminação, tubo fechado
❖ Análise qualitativa e quantitativa
❖ Sensível e específico
Sondas
• Probe de Hidrólise (TaqMan)
• Hairpin (molecular beacon probe)
• Probes adjacentes
• Scorpion primers
Intercalantes Fluorescentes
• SYBR Green 1
• SYTO9
• EvaGreen
PCR em Tempo Real
Quasar 670Fam Cal Fluor Orange TAMRA ROX
Sistema Taq Man
Aumento da intensidade de fluorescencia
Sistema Taq Man
PCR em Tempo RealPlateau
Fase Exponencial
Baseline
Threshold
A molécula emite maior intensidade de fluorescência quando ligado à dsDNA;
portanto aumentando a emissão de acordo com a formação dos produtos de PCR.
SYBR GREEN
Instrumentos: PCR em Tempo Real
• As reações da PCR ficam emrotação contínua durante a corrida(400 RPM).
• Força G mantém os reagentes nabase do tubo (remove bolhas e condensação).
• Detecção uniforme da florescencia (Normalizador de fluorescência).
• Não necessita de calibração optica• Cinco canais de fluorescência +
HRM• Simples manuseio do equipamento
e do software
Amostras em rotação contínua durante a corrida
• 400 RPM
Aquisição de dados em alta velocidade
• todas as amostras lidas em uma rotação (0.15 sec)
Força G mantém os reagentes na base do tubo
• remove bolhas e condensação
• não forma pellet
Movimentação contínua: sem variação
• uniformidade térmica e óptica
400 RPM
Ventilação movimenta o ar
na câmara
Câmara selada para reter
o ar
Mecanismo de Aquecimento
Note: orifícios no
rotor permitem a
circulação do ar
Resistência ligada
Ar frio
Ventilação direciona o ar
para dentro da câmara
Ventilação em volta da
câmara
Abertura de ventilação se abre
para saída do ar quente
Mecanismo de Resfriamento
Resistência
desligada
Note: orifícios
permitema
circulação do ar
Câmara de reação
PMT Detector
LEDs
Lens
Filtros de detecção
Spindle/Motor Assembly
Mecanismo de DetecçãoDetecção
QIAGEN Rotor-Gene Q
(Corbett Rotor-Gene 6000)
❖ Reação feita em tubos
❖ Econômica
❖ Simples manuseio do
equipamento e
software
❖ Bom para laboratórios
com quantidade e
variedade
Alvos: Genes de
Resistência
Cepheid: Smartcycler
❖ Reação feita em tubos especiais
❖ Cada espaço funciona
independentemente como
diferentes equipamentos
❖ Bom para laboratórios com
variedade de exames
❖ Reduz contaminação
Prep Amostra +Extração DNA
2 horas
Prep PCR
0.5 hours
PCR
1.5 hours
Tempo Total
4 horas
Extração Prep PCR Amplificação
“Teste Tradicional”
Prep teste
2 min
PCR
30-60 min
Tempo Total
≈1 hour
Realizado na mesma área/sala
Teste “Amostra – Resultados”
1. Extração e Purificação de Ácidos Nucleicos
2. Amplificação
3. Detecção e Análise
3 INSTRUMENTOS
ou ou ou
Evolução - Revolução
GeneXpert
GX-1
GX-16
GeneXpert Infinity-48
GeneXpert®
ModuleGX-2 GX-4
Fácil
Manuseio
Rápidas
Respostas
Acurácia
Resultados
Melhor Aproveitamento dos Benefícios da Biologia Molecular
Cartucho
❖ Diagnóstico
• Doenças Infecciosas
• Oncologia
• Genética
❖ Testes feitos no mesmo cartucho
• Extração
• Amplificação
• Detecção
❖ Mesma base de cartucho para todos os
testes realizados no Sistema GeneXpert®
Vortex + dispensar a amostra no
cartucho
2
Inserir o cartucho no aparelho e
começar a corrida
3
Inserir o swab no reagente de
eluição
1
Trabalho Manual Total <1 Minuto
GeneXpert
Valor Clínico: Tempo de liberação dos resultados
é crucial
TIME TO RESULT
Cepheid vs. PCR e Cultura
Cepheid
PCR
PCRCultura
VA
LOR
CLÍ
NIC
O
0 12 hrs 1 dia 2 dias
Articles that look at time to result as crucial to maximizing diagnostic value:
1. Lance R. Peterson, M.D., Donna M. Hacek, M.T. (A.S.C.P.), Ari Robicsek, M.D., Case Study: An MRSA Intervention at
Evanston Northwestern Healthcare, printed in The Joint Commission Journal on Quality and Patient Safety Volume 33
Number 12, December 2007
2. Lance R. Peterson, M.D., Rapid Diagnosis of Community-Acquired MRSA, printed in Clinical Updates in Infectious
Diseases, Volume Issue 3, October 2008
3. Eli N. Perencevich, MD, MS et al., SHEA Guideline: Raising Standards While Watching the Bottom Line: Making a
Business Case for Infection Control, Infection Control and Hospital Epidemiology, Volume 28, Number 10, October
2007
Saúde da
Mulher
GBS
Infecções
Relacionadas a
Assistência a Saúde
Doenças
Infecciosas
Críticas
Teste CLIA-
Waived
(Point of Care)
Oncologia &
Genética
MRSA/SA BC
SA Nasal Complete
vanAfor VRE
MRSA/SA SSTI
MRSA C. difficile
Flu HemosILFII & FV
Virologia
• 11 Testes Disponíveis nos EUA
• 12 Testes Disponíveis Fora dos EUA– Incluíndo MDR-Tuberculosis e BCR-ABL
EV
C. diff/Epi
MTB/RIF
CE-IVD
BCR-ABLMonitor
CE-IVD
GeneXpert
EV Flu
MTB/RIF
Infecções
Relacionadas a
Assistência a Saúde
Doenças
Infecciosas
Críticas
Teste CLIA-
Waived
(Point of Care)
Oncologia &
Genética
Virologia
Microbial ID
Candidemia
HIVQuant HCV Quant
MRSA/SA BC
SA Nasal Complete
vanAfor VRE
MRSA/SA SSTI
MRSA C. difficile
C. diff/Epi Norovirus
Gastro B Panel
BCR/ABLMonitor
V2
HemosILFII & FV
BCR/ABLMonitor V1
Breast CA RX Strat
Breast Cancer
MetastasisRisk
SA
CT/NG
Flu A/B Panel
MRSA/SA SSTI EBV Quant
BKV
HBV Quant
HCV Genotype
Group A Strep
VaginitisGroup A
Strep
MDROVAP
MRSA/SA
VAP Gram Negative
RSV
CMV Quant
VZV
CE-IVD
CE-IVD CE-IVD
CE-IVD CE-IVDCE-IVD
Vaginitis/Vaginosis
CE-IVD
CE-IVD
46 Testes Disponíveis
Bladder Cancer Monitor
CE-IVD
BladderSympt
GBS CT/NG
HPV
CE-IVD
CT
VaginitisVaginosis
CE-IVD
HSV TypingLesion
Saúde da
Mulher
CE-IVD
GeneXpert
Xpert® MRSA NxG
Xpert® SA Nasal Complete
Xpert® MRSA/SA BC
Xpert® MRSA/SA SSTI
Xpert® C. difficile
Xpert® C. difficile/Epi
Xpert® vanA
Xpert® Carba-R
Xpert® Norovirus
Xpert® Xpress Strep A
Xpert® Xpress Flu
Xpert® Xpress Flu/RSV
Xpert® MTB/RIF
Xpert® EV
Xpert® Ebola†
Xpert® CT/NG
Xpert® TV
Xpert® GBS
Xpert® GBS LB
Xpert® MRSA NxGmethicillin-resistant Staphylococcus
aureus (MRSA)Active MRSA surveillance testing in 45 minutes
Xpert® SA Nasal Complete methicillin-resistant Staphylococcus
aureus (MRSA)e Pre-surgical testing for S. aureus and MRSA in about an hour
Xpert® MRSA/SA BCmethicillin-resistant Staphylococcus
aureus (MRSA)
Detection of MRSA and S. aureus in positive blood cultures in
about an hour
Xpert® MRSA/SA SSTImethicillin-resistant Staphylococcus
aureus (MRSA)
Detection of MRSA & S. aureus skin and soft tissue infections in
about an hour
Xpert® C. difficile Clostridium difficile Detection of Clostridium difficile in just over 30 minutes*
Xpert® C. difficile/Epi Clostridium difficileDetection and differentiation of Clostridium difficile & the
epidemic 027 strain in 45 minutes
Xpert® vanAVancomycin-resistant Enterococcus
spp.
On-demand testing to assist with VRE surveillance in just over
30 minutes*
Xpert® Carba-R Gram-negative bacilli
Detection of the carbapenem-resistance genes encoding KPC,
NDM, VIM, OXA-48 and IMP in 48 minutes from isolates, rectal
swabs, or perirectal swabs
Xpert® Norovirus NoravirusRapid identification and differentiation of Norovirus GI and GII
in less than one hour*
Xpert® Xpress Strep A Rapid detection of Group A Streptococcus DNA in as soon as
18 minutesGroup A Streptococcus
Xpert® Xpress Flu Rapid detection of Flu A and Flu B in as soon as 20 minutesInfluenza A
Influenza B
Xpert® Xpress Flu/RSVRapid detection and differentiation of Flu A, Flu B, and RSV in
as soon as 20 minutes
Influenza A
Influenza B
Xpert® MTB/RIF Mycobacterium tuberculosisDetection of MTB and rifampin resistance mutations in
less than two hours
Xpert® EV Fast molecular diagnostic testing for enterovirus in 2.5 hours 1 Enterovirus
Xpert® Ebola† Detection of Ebola Zaire virus in 98 minutes Ebola Zaire Virus
Xpert® CT/NGDetection of Chlamydia trachomatis and Neisseria
gonorrhoeae infections in 90 minutes
Chlamydia trachomatis
Neisseria gonorrhoeae
Xpert® TVDetection of Trichomonas vaginalis in male and female
specimens in as soon as 40 minutes*
Trichomonas
vaginalis
Xpert® GBSIntrapartum screening for Group B streptococcus during
labor/delivery in 35 minutes* Group B Streptococcus
Xpert® GBS LBAntepartum screening from LIM broth for Group B
streptococcus in 35 minutes*Group B Streptococcus
• Cartucho detecta 5 famílias de genes que conferem resistência aos carbapenêmicos
‒ blaKPC
‒ blaNDM
‒ blaVIM
‒ blaOXA-48
‒ blaIMP-1 subgroup
• Amostra: Swab Retal
• TAT: 48 minutos
ALL KPCs ALL VIMS All NDMS OXA-48
OXA-162
OXA-163
OXA-204
IMP 1 IMP 6
IMP 25IMP 3
IMP 10 IMP 30
IMP-1
subgroup
BD MAX™:
Amostra Resultados
• Único Sistema “amostra – resultado” ABERTO
• Profissional pode padronizar e definir os protocolos (Standardize User-Defined Protocol: UDPs)
• Consegue extrair DNA e RNA na mesma corrida
• Multiplex com detecção de 5 cores diferentes
• Laboratório pode padronizar a análise de resultados:– Amplificação de curvas em tempo real– Interpretação da curva de PCR– Análise por curva de dissociação (melting curve)– Resultados quantitativos
BD MAX™:
Única etapa manual: pipetar a amostra
BD MAX™:
BD MAX™:
Reagentes: Sistema Aberto
Reagentes de Extração e PCR
Extração
BD MAX™:
Modo aberto
Preparação da Amostra
BD MAX™:
*
BD MAX™:
“Layout”
BD MAX™:
Cartucho onde o PCR acontece
Colocar reagentes, amostras e cartão do PCR no BD MAXTM
Criar a lista de trabalho com identificação do teste e amostras
Fechar a porta do aparelho para começar a corrida
BD MAX™:
Tecnologia Microarray:
• Permite identificar, em uma mesma matriz, milhares de alvos diferentes
• Vários painéis multiplex vem sendo desenvolvidos usando esta metodologia
K.pneumoniae de
infecção de ferida
E.coli de fezes
NDM-1
CTX-M1
SHV-12
CMY-4
Exemplo de Resultados:
Verigene(Nanosphere)
Gram-positivos
Gram-negativos
Leveduras
FilmArray® Respiratory Panel 20 patógenos respirtatórios
Bordetella pertussis
Chlamydophila pneumoniae
Mycoplasma pneumoniae
Adenovirus
Coronavirus 229E
Coronavirus HKU1
Coronavirus OC43
Coronavirus NL63
Human Metapneumovirus
Human Rhinovirus/Enterovirus
Influenza A Influenza
A/H1
Influenza A/H1-2009
Influenza A/H3
Influenza B
Parainfluenza 1
Parainfluenza 2
Parainfluenza 3
Parainfluenza 4
RSV
FilmArray® BCID Panel24 patógenos (sangue) e 03 genes de
resistência
Enterococcus
Listeria monocytogenes
Staphylococcus
Staphylococcus aureus
Streptococcus
Streptococcus agalactiae
Streptococcus pyogenes
Streptococcus pneumoniae Acinetobacter
baumannii Haemophilus influenzae
Neisseria meningitidis
Pseudomonas aeruginosa
Enterobacteriaceae
Enterobacter cloacae complex
Escherichia coli
Klebsiella oxytoca
Klebsiella pneumoniae
Proteus
Serratia marcescens
Candida albicans
Candida glabrata
Candida krusei
Candida parapsilosis
Candida tropicalis
mecA - methicillin resistance
vanA/B - vancomycin resistance
KPC - carbapenem resistance
FilmArray®
Meningitis/Encephalitis (ME)
Panel
14 patógenos (líquior)
Escherichia coli K1
Haemophilus influenzae
Listeria monocytogenes
Neisseria meningitidis
Streptococcus agalactiae
Streptococcus pneumoniae
Cytomegalovirus (CMV)
Enterovirus
Herpes simplex virus 1 (HSV-1)
Herpes simplex virus 2 (HSV-2)
Human herpes virus 6 (HHV-6)
Human parechovirus
Varicella zoster virus (VZV)
Cryptococcus
neoformans/gattii
FilmArray® GI Panel 22 patógenos (fezes)
Campylobacter (jejuni, coli & upsaliensis)
Clostridium difficile (Toxin A/B)
Plesiomonas shigelloides
Salmonella
Yersinia enterocolitica
Vibrio (parahaemolyticus, vulnificus, & cholerae)
Vibrio cholerae E. coli O157
Enteroaggregative E. coli (EAEC)
Enteropathogenic E. coli (EPEC)
Enterotoxigenic E. coli (ETEC) lt/st
Shiga-like toxin-producing E. coli (STEC) stx1/stx2 E. coli O157
Shigella/Enteroinvasive E. coli (EIEC)
Adenovirus F 40/41
Astrovirus
Norovirus GI/GII
Rotavirus A
Sapovirus (I,II, IV, and V)
Cryptosporidium
Cyclospora cayetanensis
Entamoeba histolytica
Giardia lamblia
BD MAX™:
Gentilmente cedido por Suzane Silbert
BD Max
Braço robótico 4 ponteiras
Gavetas cartuchos – dois termocicladores independentes
Duas racks – 12 testes cada
Tubos secundários de amostra
Cartucho microfluídico
BD MaxCartuchos microfluídicos
24 câmarasindividualmentecontroladas parareação de PCR
Orifícios onde as amostras são carregadas
Código de barras 2D com número de lote
✓Características específicas
Gentilmente cedido por Suzane Silbert
Gentilmente cedido por Suzane Silbert
BD MAX TM
Cartuchos microfluídicos
24 câmarasindividualmentecontroladas parareação de PCR
Orifícios onde as amostras são carregadas
Código de barras2D com númerode lote
Braço robótico 4 ponteiras
Gavetas cartuchos – dois termocicladores independentes
Duas racks – 12 testes cada
Tubos secundários de amostra
Cartucho microfluídico
Única Etapa Manual: pipetar a amostra
Gentilmente cedido por Suzane Silbert
Gentilmente cedido por Suzane Silbert
Gentilmente cedido por Suzane Silbert
1) Protocolo de Meningite bacteriana do CDC:Material que será extraído DNA: liquorExtração de DNAMaster Mix
442819 ExKTM DNA-2 Swab seco e Líquido cefalorraquidiano (CSF)
DNA MMK (sem SPC)
442848
PrimersProbes
1) Protocolo de Meningite bacteriana do CDC:Material que será extraído DNA: liquorExtração de DNAMaster Mix
442819 ExKTM DNA-2 Swab seco e Líquido cefalorraquidiano (CSF)
Master Mix Primers e Probes Próprios
Colocar as amostras no tubo deprocessamento que contém o tampão
Carregar os reagentes na rack do BDMAX
Colocar os tubos de processamento contendo as amostras na rack
Identificar as amostrasFechar a porta e iniciar a corrida
Colocar a rack carregada com as amostras e o cartucho no BDMAX
Resultados
PCR direto de amostra de sangue total!!!!!
SEPTIFAST
- Técnica de PCR em tempo Real
- Detecção e identificação de bactérias e fungos através de
alvos específicos
- Detecção de mecanismos de resistência
- Direto do sangue ou de amostras clínicas
http://www.roche.com/prod_diag_septifast.pdf
1.5 mL
SeptiFast
LightCycler® System
PCR EM TEMPO
REAL