Post on 10-Apr-2015
METABOLISMO DE CUMARINA
POR Aspergillus niger ATCC11394
Lic.Aguirre-Pranzoni, Celeste
Algunos datos de metabolismo de
cumarina en otros organismos….
Mamíferos:Ratas y humanos
Monooxigenasa
Citocromo
P450
Alcohol
deshidrogenasa
Jeffrey D. Vassallo, Sarah M. Hicks,George P. Daston, and Lois D. Lehman-McKeeman Metabolic Detoxification Determines
Species Differences in Coumarin-Induced Hepatotoxicity TOXICOLOGICAL SCIENCES 80, 249–257 (2004)
Hongos filamentosos:Phanerochaete chrysosporium
Monooxigenasa
Citocromo
P450
Fumiko Matsuzaki, Hiroyuki Wariishi- Functional diversity of cytochrome P450s of the white-rot fungus
Phanerochaete chrysosporium Biochemical and Biophysical Research Communications 324 (2004) 387–393
Bacterias:Arthrobacter
Levy Carl and Frost Phillip The metabolism of coumarin by a microorganism. J. Biol. Chem. 241, 4, (1966), 997-1003 and papers cited therein.1962 el inicial ataque de COU es en el enlace 3-4 para dar DHC (Melillotus)
Bacterias:Pseudomona putida
XenA: familia de las OYE
Katrin Häser, Hans Henning Wenk, and Wilfried Schwab, Biocatalytic Production of Dihydrocoumarin from Coumarin by Saccharomyces cerevisiae J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 6236-6240.
Levaduras:
H+
S. cereviciae
Diferentes vías de metabolismo de cumarina
Aspergillus niger
Posee un eficiente metabolismo de xenobioticos: multiples Cit-P450
En 1967, Dyson reportaron: Ac. Melilotico como metabolito principal y
trazas de hidroxicumarinas.
Nuestro Objetivo:
Estudiar el metabolismo de A. niger a través biotransformaciones a
célula entera:
Analizar la cinética de bioreacción cada 24hs por medio
de GC-MS y RMN.
24 h
200 rpm
28 ºC
Cultivo I
Cultivo II
Medio de cultivo
Buffer fosfato
Sustrato
CULTIVO EN BATCH
SCREENING DE BIOCATALIZADORES FÚNGICOS
Hongos levaduriformes
Rhodotorula sp.OO
1
3
45
6
7
82
No biotransformó
O O O O
345
6
7
8S. cereviciae
SCREENING DE BIOCATALIZADORES FÚNGICOS
0% 20% 40% 60% 80% 100%
A.nigerIM7
A.niger (ATCC11394)
A.flavus
A.fumigatus
A.ochraceus
A.terreus
SUSTRATO BIOTRANSFORMADO
Hongos filamentosos del género Aspergillus
Análisis por GC-FID Biocatalizadores seleccionadospara estudios cinéticos
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 144 h
pro
du
cto
s d
e b
iotr
an
sfo
rma
ció
n
sustrato metabolito A
ESTUDIO CINÉTICO DE CEPAS SELECCIONADAS
Aspergillus ochraceus
Análisis por GC-FID
CULTIVO EN DESARROLLO
O O O O
345
6
7
8
A. ochraceus
CULTIVO EN REPOSO
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 144 hPro
du
cto
s d
e b
iotr
an
sfo
rma
ció
n
sustrato metabolito A metabolito B
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h
pro
du
cto
s d
e b
iotr
ansf
orm
ació
n
sustrato metabolito A metabolito B
ESTUDIO CINÉTICO DE CEPAS SELECCIONADAS
Aspergillus flavus
Análisis por GC-FID
CULTIVO EN DESARROLLO
CULTIVO EN REPOSO O OO O A. flavus
OH
1H RMN
Biotransformación de cumarina
A.niger Tiempo 0
1H RMN
Biotransformación de cumarinaA.niger Tiempo 24 horas
ESTUDIO CINÉTICO DE CEPAS SELECCIONADAS
Aspergillus niger ATCC11394
Análisis por CG-EM
D:\Xcalibur\data\MKS\MKS-Spt-2m8-10 30/09/2008 04:31:14 p.m.
Cele-To-C2-SL3
RT: 0,00 - 24,85
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Relat
ive Ab
unda
nce
13,46
9,54 13,718,97 13,067,933,18 4,48 5,59 6,28 14,9911,36 16,49 18,90 19,60 21,5917,96 22,58 24,59
NL:
4,07E5
TIC MS
MKS-Spt-
2m8-10
O OM+ 146
0 h
MKS-Spt-2m8-11_080930173104 30/09/2008 05:31:04 p.m.
Cele-T1-C2-SL3
RT: 0,00 - 28,67
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Relati
ve Abu
ndance
14,83
20,93
3,17 4,83 5,44 7,93 8,995,95 9,09 10,12 21,0415,0611,51 14,03 16,29 17,25 22,3218,66 24,82 27,5225,99
NL:
6,19E3
TIC MS
MKS-Spt-
2m8-
11_080930
173104
O OM+ 146
O O
M+ 148
24 h
D:\Xcalibur\data\MKS\MKS-Spt-2m8-12 01/10/2008 08:39:15 a.m.
Cele-T2-C2-SL3
RT: 0,00 - 26,85
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Relat
ive Ab
unda
nce
14,18
17,21
15,53
15,629,59
3,23 20,737,953,39 5,05 8,99 18,705,76 10,16 13,2810,89 19,37 22,32 25,1722,88 26,31
NL:
3,12E4
TIC MS
MKS-Spt-
2m8-12
OH OH
M+ 152
O O
M+ 148
D:\Xcalibur\data\MKS\MKS-Spt-2m8-13 01/10/2008 09:36:03 a.m.
Cele-T4-C2-SL3
RT: 0,00 - 28,67
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
Time (min)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Relat
ive Ab
unda
nce
14,13
15,65
17,20
18,00
9,57
3,219,01 18,12 20,744,13 7,97
4,49 6,94 13,7912,9310,55 19,45 21,00 22,31 28,3726,6424,50
NL:
1,72E4
TIC MS
MKS-Spt-
2m8-13
48 h
72 hO O
M+ 148 OH OH
M+ 152
Enotao reductasa
Alcohol deshidrogenasa Monooxigenasa Cit-P450
Aspergillus niger : growing cells
Aspergillus niger
A B
[O2] [O2]
B
[O2]
A
[O2]
No biotransformó
No biotransformó
No biotransformó
No biotransformó
M+176
M+178
M+164M+194
24hs
A. niger : growing cells
A.niger : Resting cells
Ensayo de Inhibición de Enzimas
¿ La enzima Enoato Reductasa es de
tipo OYE?
1- sustrato especifico (0,7mM) + inhibidor ( 2- 8 mM)
2- cumarina (0,7mM) + Inhibidor (2-8mM)
3- bcos. Correspondiente
4- inhibidor +catalizador
A. niger: Resting cells
A.niger : Resting cells
24hs
+ Inhibidor 8mM
72hs
Inhibidor 8mM + biocatalizador Productos de biotransformación (?)…. 48hs
¿ Las enzimas que hidroxilan COU son monooxigenasas Cit.P450 o
Peroxidasas extracelulares ?
Ensayo de Inhibición de Enzimas
1- filtrado de un cultivo de 3 o 4 días
2- Incubación del sustrato con el filtrado
3- Toma de muestra a las 24 y 48 hs
Resultado : No hubo biotransformación del sustrato
¿ Las enzimas que hidroxilan COU son monooxigenasas Cit.P450 o
Peroxidasas extracelulares ?
Ensayo de Inhibición de Enzimas
Ensayo de Inhibición de cit-P450:-piperonil butoxido
1- sustrato (0,7)+ inhibidor ( 1-2 y 2,5 mM)
2- inhibidor + biocatalizador
A. niger: Resting cells
Resultados:
1- A las 24 hs de incubación se observo DHC
2- A las 48hs y 6 días DHC continuo siendo el único metabolito
Ensayo de Inhibición de cit-P450:-piperonil butoxido + Inhibidor 2,5mM
24hs
72hs
6 días
Conclusión :
Enoato reductasa
Enoato reductasaCit-p450
Cit-p450
ADH