METABOLISMO DE CUMARINA

POR Aspergillus niger ATCC11394

Lic.Aguirre-Pranzoni, Celeste

Algunos datos de metabolismo de

cumarina en otros organismos….

Mamíferos:Ratas y humanos

Monooxigenasa

Citocromo

P450

Alcohol

deshidrogenasa

Jeffrey D. Vassallo, Sarah M. Hicks,George P. Daston, and Lois D. Lehman-McKeeman Metabolic Detoxification Determines

Species Differences in Coumarin-Induced Hepatotoxicity TOXICOLOGICAL SCIENCES 80, 249–257 (2004)

Hongos filamentosos:Phanerochaete chrysosporium

Monooxigenasa

Citocromo

P450

Fumiko Matsuzaki, Hiroyuki Wariishi- Functional diversity of cytochrome P450s of the white-rot fungus

Phanerochaete chrysosporium Biochemical and Biophysical Research Communications 324 (2004) 387–393

Bacterias:Arthrobacter

Levy Carl and Frost Phillip The metabolism of coumarin by a microorganism. J. Biol. Chem. 241, 4, (1966), 997-1003 and papers cited therein.1962 el inicial ataque de COU es en el enlace 3-4 para dar DHC (Melillotus)

Bacterias:Pseudomona putida

XenA: familia de las OYE

Katrin Häser, Hans Henning Wenk, and Wilfried Schwab, Biocatalytic Production of Dihydrocoumarin from Coumarin by Saccharomyces cerevisiae J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 6236-6240.

Levaduras:

H+

S. cereviciae

Diferentes vías de metabolismo de cumarina

Aspergillus niger

Posee un eficiente metabolismo de xenobioticos: multiples Cit-P450

En 1967, Dyson reportaron: Ac. Melilotico como metabolito principal y

trazas de hidroxicumarinas.

Nuestro Objetivo:

Estudiar el metabolismo de A. niger a través biotransformaciones a

célula entera:

Analizar la cinética de bioreacción cada 24hs por medio

de GC-MS y RMN.

24 h

200 rpm

28 ºC

Cultivo I

Cultivo II

Medio de cultivo

Buffer fosfato

Sustrato

CULTIVO EN BATCH

SCREENING DE BIOCATALIZADORES FÚNGICOS

Hongos levaduriformes

Rhodotorula sp.OO

1

3

45

6

7

82

No biotransformó

O O O O

345

6

7

8S. cereviciae

SCREENING DE BIOCATALIZADORES FÚNGICOS

0% 20% 40% 60% 80% 100%

A.nigerIM7

A.niger (ATCC11394)

A.flavus

A.fumigatus

A.ochraceus

A.terreus

SUSTRATO BIOTRANSFORMADO

Hongos filamentosos del género Aspergillus

Análisis por GC-FID Biocatalizadores seleccionadospara estudios cinéticos

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 144 h

pro

du

cto

s d

e b

iotr

an

sfo

rma

ció

n

sustrato metabolito A

ESTUDIO CINÉTICO DE CEPAS SELECCIONADAS

Aspergillus ochraceus

Análisis por GC-FID

CULTIVO EN DESARROLLO

O O O O

345

6

7

8

A. ochraceus

CULTIVO EN REPOSO

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 144 hPro

du

cto

s d

e b

iotr

an

sfo

rma

ció

n

sustrato metabolito A metabolito B

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h

pro

du

cto

s d

e b

iotr

ansf

orm

ació

n

sustrato metabolito A metabolito B

ESTUDIO CINÉTICO DE CEPAS SELECCIONADAS

Aspergillus flavus

Análisis por GC-FID

CULTIVO EN DESARROLLO

CULTIVO EN REPOSO O OO O A. flavus

OH

1H RMN

Biotransformación de cumarina

A.niger Tiempo 0

1H RMN

Biotransformación de cumarinaA.niger Tiempo 24 horas

ESTUDIO CINÉTICO DE CEPAS SELECCIONADAS

Aspergillus niger ATCC11394

Análisis por CG-EM

D:\Xcalibur\data\MKS\MKS-Spt-2m8-10 30/09/2008 04:31:14 p.m.

Cele-To-C2-SL3

RT: 0,00 - 24,85

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Relat

ive Ab

unda

nce

13,46

9,54 13,718,97 13,067,933,18 4,48 5,59 6,28 14,9911,36 16,49 18,90 19,60 21,5917,96 22,58 24,59

NL:

4,07E5

TIC MS

MKS-Spt-

2m8-10

O OM+ 146

0 h

MKS-Spt-2m8-11_080930173104 30/09/2008 05:31:04 p.m.

Cele-T1-C2-SL3

RT: 0,00 - 28,67

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Relati

ve Abu

ndance

14,83

20,93

3,17 4,83 5,44 7,93 8,995,95 9,09 10,12 21,0415,0611,51 14,03 16,29 17,25 22,3218,66 24,82 27,5225,99

NL:

6,19E3

TIC MS

MKS-Spt-

2m8-

11_080930

173104

O OM+ 146

O O

M+ 148

24 h

D:\Xcalibur\data\MKS\MKS-Spt-2m8-12 01/10/2008 08:39:15 a.m.

Cele-T2-C2-SL3

RT: 0,00 - 26,85

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Relat

ive Ab

unda

nce

14,18

17,21

15,53

15,629,59

3,23 20,737,953,39 5,05 8,99 18,705,76 10,16 13,2810,89 19,37 22,32 25,1722,88 26,31

NL:

3,12E4

TIC MS

MKS-Spt-

2m8-12

OH OH

M+ 152

O O

M+ 148

D:\Xcalibur\data\MKS\MKS-Spt-2m8-13 01/10/2008 09:36:03 a.m.

Cele-T4-C2-SL3

RT: 0,00 - 28,67

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Relat

ive Ab

unda

nce

14,13

15,65

17,20

18,00

9,57

3,219,01 18,12 20,744,13 7,97

4,49 6,94 13,7912,9310,55 19,45 21,00 22,31 28,3726,6424,50

NL:

1,72E4

TIC MS

MKS-Spt-

2m8-13

48 h

72 hO O

M+ 148 OH OH

M+ 152

Enotao reductasa

Alcohol deshidrogenasa Monooxigenasa Cit-P450

Aspergillus niger : growing cells

Aspergillus niger

A B

[O2] [O2]

B

[O2]

A

[O2]

No biotransformó

No biotransformó

No biotransformó

No biotransformó

M+176

M+178

M+164M+194

24hs

A. niger : growing cells

A.niger : Resting cells

Ensayo de Inhibición de Enzimas

¿ La enzima Enoato Reductasa es de

tipo OYE?

1- sustrato especifico (0,7mM) + inhibidor ( 2- 8 mM)

2- cumarina (0,7mM) + Inhibidor (2-8mM)

3- bcos. Correspondiente

4- inhibidor +catalizador

A. niger: Resting cells

A.niger : Resting cells

24hs

+ Inhibidor 8mM

72hs

Inhibidor 8mM + biocatalizador Productos de biotransformación (?)…. 48hs

¿ Las enzimas que hidroxilan COU son monooxigenasas Cit.P450 o

Peroxidasas extracelulares ?

Ensayo de Inhibición de Enzimas

1- filtrado de un cultivo de 3 o 4 días

2- Incubación del sustrato con el filtrado

3- Toma de muestra a las 24 y 48 hs

Resultado : No hubo biotransformación del sustrato

¿ Las enzimas que hidroxilan COU son monooxigenasas Cit.P450 o

Peroxidasas extracelulares ?

Ensayo de Inhibición de Enzimas

Ensayo de Inhibición de cit-P450:-piperonil butoxido

1- sustrato (0,7)+ inhibidor ( 1-2 y 2,5 mM)

2- inhibidor + biocatalizador

A. niger: Resting cells

Resultados:

1- A las 24 hs de incubación se observo DHC

2- A las 48hs y 6 días DHC continuo siendo el único metabolito

Ensayo de Inhibición de cit-P450:-piperonil butoxido + Inhibidor 2,5mM

24hs

72hs

6 días

Conclusión :

Enoato reductasa

Enoato reductasaCit-p450

Cit-p450

ADH