Post on 02-May-2015
Sommario
La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni
sulla fitness Misurazione della barriera genetica
In vitro, in silico, in vivo Il ranking delle barriere dei singoli farmaci
Fattori che alterano la barriera genetica Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con
epitopi La barriera del singolo farmaco e la barriera
della combinazione
Sommario
La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza Numero e tipo di mutazioni, impatto delle
mutazioni sulla fitness Misurazione della barriera genetica
In vitro, in silico, in vivo Il ranking delle barriere dei singoli farmaci
Fattori che alterano la barriera genetica Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con
epitopi La barriera del singolo farmaco e la barriera
della combinazione
Selezione dei mutanti resistenti
VARIBILITA' NATURALE
ESITO DELLA PRESSIONE SELETTIVA
Barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza
La barriera genetica esprime l’entità di variazione richiesta perché il virus acquisisca resistenza Numero di mutazioni necessarie Tipo di mutazioni Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di
replicazione del virus (fitness)
Devono essere selezionate una o
più mutazioni perché il virus non
sia bloccato dal farmaco (fenotipo
resistente)
Barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza
La barriera genetica esprime l’entità di variazione richiesta perché il virus acquisisca resistenza Numero di mutazioni necessarie Tipo di mutazioni Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di
replicazione del virus (fitness)
Devono essere selezionate una o
più mutazioni perché il virus non
sia bloccato dal farmaco (fenotipo
resistente)
Barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza
Bassa barriera genetica
Barriera genetica
intermedia
Elevata barriera genetica
Virus resistente, terapia non più
efficace
Virus sensibile, terapia efficace
Barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza
La barriera genetica esprime l’entità di variazione richiesta perché il virus acquisisca resistenza Numero di mutazioni necessarie Tipo di mutazioni Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di
replicazione del virus (fitness)
Devono essere selezionate una o
più mutazioni perché il virus non
sia bloccato dal farmaco (fenotipo
resistente)
Il bias di selezione fra transizioni e trasversioni
A
G
C
T,U
Purine
Pirimidine
trasversione
transizione
Le transizioni sono evolutivamente favorite rispetto alle trasversioni
Virus Rapporto transizione : trasversione
HIV 1.5:1
HCV 50:1
Il bias di ipermutazione G → A Il sistema cellulare APOBEC3 induce
mutazioni G → A in HIV come meccanismo di difesa (genetic meltdown) HIV ostacola questo meccanismo bloccando
APOBEC3 mediante la propria proteina “accessoria” Vif
Le transizioni G → A sono quindi favorite
Ipermutazione G → A
Ipermutazione G → AE138K: GAG → AAG M184I: ATG → ATA
Mutazioni di resistenza a Rilpivirina nei trial ECHO & THRIVE
Kulkarni, IHDRW 2011
M184I diminuisce la suscettibilità a Rilpivirina più di M184V
Kulkarni, JAIDS 2012
Barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza
La barriera genetica esprime l’entità di variazione richiesta perché il virus acquisisca resistenza Numero di mutazioni necessarie Tipo di mutazioni Impatto che quelle mutazioni esercitano sulla capacità di
replicazione del virus (fitness)
Devono essere selezionate una o
più mutazioni perché il virus non
sia bloccato dal farmaco (fenotipo
resistente)
Fitness dei mutanti virali
La fitness di una variante è definita dalla sua capacità di contribuire alla successiva generazione
La fitness è sempre funzione delle condizioni in cui la variante virale si moltiplica (es. variabili correlate ai farmaci e alla risposta immunitaria)
Le diverse varianti competono fra di loro con esiti dipendenti dalle condizioni esterne
Misurazione della fitness in vitro
La fitness di un mutante può essere misurata in vari tipi di sistemi virus-cellula in vitro
Non c’è un gold standard di metodo riconosciuto
http://bis.urmc.rochester.edu:8080/HIVViralFitness/
Pressione farmacologica
Sospensione / cambio terapia
Virus wild type
La cinetica di decadimento dei mutanti off-therapy come indice della fitness in vivo
Fast disappearance
Prolonged persistence
T20-resistance (HR1)
Most major PI mutations
65R 74V 184V
TAMs Most minor PI mutations
NNRTI mutations
RT 215 “revertants”
R5 → X4 Tropism switch
IN mutations
La cinetica di decadimento dei mutanti off-therapy come indice della fitness in vivo
Sommario
La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni
sulla fitness Misurazione della barriera genetica
In vitro, in silico, in vivo Il ranking delle barriere dei singoli farmaci
Fattori che alterano la barriera genetica Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con
epitopi La barriera del singolo farmaco e la barriera
della combinazione
Misurazione dell'attività antivirale in vitro(IC = Inhibitory Concentration)
IC50, dose di farmaco che inibisce del 50% la produzione di virus Valore meno corrispondente alla reale inibizione ma misurazione più accurata (usato spesso)
IC90, dose di farmaco che inibisce del 90% la produzione di virus Valore più corrispondente alla reale inibizione ma misurazione poco accurata (usato raramente)
La terapia ha selezionato una variante virale farmacoresistente
TMC114: an increased genetic barrier to the development of resistance in vitro
De Meyer S, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2005;49: 2314-21.De Meyer S, et al. XV IHDRW, 2006, Poster 19.
Time (days)
Incr
ease
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n
0
50
100
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0 100 300 500 700 900 1100
TMC114 (R41T, K70E)
RTV (G16E, M46I, V82F, I84V)SQV (G48V, A71V, G73S, I84V, L90M)NFV (L10F, D30N, R41K, K45I, M46I, V77I,
I84V, N88D)
APV (L10F, V32I, L33F, M46I, I47V, I50V)LPV (L10F, L23I, M46I, I50V, I54V, L63P, V82A)TPV (L33V, M46L, V82T)ATV (L10F, V32I, M46I, I62V, A71V, I84V, N88S)
Viru
s b
rea
kth
rou
gh
(%
)
Days post-infection0 4 8 11 15 18 21 24 27 31
0
20
40
60
80
100
NVP (1µM)
EFV (1µM)
Control
TMC125 (1µM)
TMC125 (0.2µM)
TMC125 suppresses the in vitro selection of resistant HIV-1 from wild-type, suggesting an increased genetic barrier to the development of HIV drug resistance
Vingerhoets, et al. J Virol 2005;79:12773-82
Selezione di resistenza in vitro a NVP, EFV, ETV a partire da wild type
Azijn, AAC 2010
Selezione di resistenza in vitro a RPV
Starting from wild type HIV (IIIB)
La barriera genetica verso la resistenza in vitro è più elevata per dolutegravir ripetto a raltegravir
Seki, CROI 2010
Barriera genetica dei singoli antiretrovirali
DRV/rtv TPV/rtv
Altri PI/rtv
NRTI non XTC / ETV RPV? / DTG?
RTG EVG?
XTC / NVP EFV / T20
Slow dissociation of DRV as a major contribution to tight binding to HIV protease
Binding affinity of DRV to HIV-1 protease >100-fold higher compared with PIs due to much slower dissociation
Decrease in binding affinity of all PIs on MDR protease mainly caused by increased dissociation rate
In contrast to other PIs, decreases in DRV binding affinity of up to 1000-fold do not compromise antiviral activity
Multiple simultaneous mutations required to make the virus resistant to DRV (i. e. increased genetic barrier)
Dierynck, JV 2007
Model HIV evolution under therapy from longitudinal and cross-sectional sequence
data
For any defined genotype, neighbor mutants can be computed in silico and the
contribution of the expected mutants to resistance can be calculated
Functions weight for probability and expected time for mutants to occur
Probability to remain susceptible to a drug (below a defined phenotypic threshold)
GENETIC BARRIER Altmann et al, AVT 2007
EuResist – Evolutionary engine
Il sistema predittivo bioinformatico della risposta al trattamento EuResist (www.euresist.org) si basa su tre diverse engine, una delle quali calcola la barriera genetica della variante virale
Sommario
La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni
sulla fitness Misurazione della barriera genetica
In vitro, in silico, in vivo Il ranking delle barriere dei singoli farmaci
Fattori che alterano la barriera genetica Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni
con epitopi La barriera del singolo farmaco e la barriera
della combinazione
The Calculated Genetic Barrier for Antiretroviral DrugResistance Substitutions Is Largely Similar for DifferentHIV-1 Subtypes (van de Vijver et al., JAIDS 2006)Mutation Subtypes with
increased barrier*Subtypes with decreased barrier*
PR I82A C G
PR I82T C G
RT V106M C
RT V108I G
RT V118I G
RT Q151M D F
RT L210W C F G AG
RT P225H A
Based on analysis of 68 A, 1299 B, 209 C, 24 D, 26 F, 86 G, 20 J, 51 AE, 71 AG sequences from drug-naïve individuals
*With respect to subtype B. Example:subB 86% Q151M: CAG ATG (2 transversions)
12% Q151M: CAA ATG (1 transition, 2 transversions)subF 13% Q151M: CAG ATG (2 transversions)
83% Q151M: CAA ATG (1 transition, 2 transversions)
Mutations contributing to resistance to high genetic barrier PIs in different subtypes
The prevalence of TPV-RAMs* in HIV-1 subtype A/E and subtype B. *K20M, E35G, K43T, I47V, I54A/M/V, Q58E, T74P, V82L/T, N83D and I84V were not found (Sungkanuparph, JCV 2007).
Vingerhoets, et al. J Virol 2005;79:12773–82
Selezione di resistenza in vitro a ETV a partire da Y181C o da K103N
Wild type
Y181C
K103N
Control TMC125 (0.2µM)
TMC125 40nM TMC125 (1µM)
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33
Days post-infection
100
80
60
40
20
0
Viru
s b
rea
kth
rou
gh
(%
)
Vingerhoets, et al. J Virol 2005;79:12773-82
Selezione di resistenza in vitro a ETV a partire da Y181C + K103N
Azijn, AAC 2010
Selezione di resistenza in vitro a RPV
Reference data on wild type virus
I fallimenti di terapia abbassano la barriera genetica
1st failure
2nd failure
3rd failure
Nth failure
I fallimenti di terapia abbassano la barriera genetica
Le mutazioni selezionate dai precedenti regimi terapeutici abbassano la barriera Resistenza
acquisita Resistenza
trasmessa
Risposta virologica a 24 settimane di regime terapeutico contenente Darunavir
nei trial DUET e POWER (pazienti pretrattati con altri PI)
I fallimenti di terapia abbassano la barriera genetica
Le mutazioni selezionate dai precedenti regimi terapeutici abbassano la barriera Resistenza
acquisita Resistenza
trasmessa
Escape dalla pressione immunologica
Kent, Trends Microbiol 2005
Impatto delle mutazioni di resistenza sul riconoscimento immunologico
Epitopi B/T possono includere siti di mutazioni di resistenza A seconda dell’aplotipo HLA
del paziente, queste mutazioni possono essere favorite oppure ostacolate dalla pressione selettiva immunologica
Possibili alterazioni della barriera di un farmaco a livello di individuo Ancora un’area di indagine
KMIGGIGGF (KF9) è un epitopo CTL HLA-B*1501-ristretto che comprende diverse mutazioni di resistenza
ai PI (M46I/L, I47A/V, G48V, I50V)
Mueller, JAIDS 2011
Impatto delle mutazioni di resistenza sul riconoscimento immunologico
Epitopi B/T possono includere siti di mutazioni di resistenza A seconda dell’aplotipo HLA
del paziente, queste mutazioni possono essere favorite oppure ostacolate dalla pressione selettiva immunologica
Possibili alterazioni della barriera di un farmaco a livello di individuo Ancora un’area di indagine
Gatanaga, AIDS 2010
Sommario
La barriera genetica nei confronti della farmacoresistenza Numero e tipo di mutazioni, impatto delle mutazioni
sulla fitness Misurazione della barriera genetica
In vitro, in silico, in vivo Il ranking delle barriere dei singoli farmaci
Fattori che alterano la barriera genetica Polimorfismi, fallimenti di terapia, interazioni con
epitopi La barriera del singolo farmaco e la
barriera della combinazione
La terapia combinata rallenta la selezione della resistenza
Resistance to AZT develops quickly
AZT AZT
3TC
IDV
Resistance to whole regimen develops slowly
Monotherapy vs. combination therapy and risk of resistance
Initial resistance (3TC)
Combination therapy (e.g. AZT+3TC+IDV)
AZT
Third step (AZT+3TC+IDV)
Second step (AZT+3TC)
3TC
IDV
AZT
3TC
IDV
AZT
3TC
IDV
Combination therapy and risk of resistance
Initial resistance (3TC)
“Combination” therapy (e.g. AZT+3TC+IDV)
Third step (AZT+3TC+IDV)
Second step (AZT+3TC)
AZT
3TC
IDV
AZT
3TC
IDV
AZT
3TC
IDV
Local ‘dissociation’ of combination therapy: stepwise accumulation of resistance
Combination therapy and risk of resistance