Post on 01-May-2019
06.06.2016
1
Kromatografiskseparasjon ogdeteksjon av legemidler
Elisabeth Leere Øiestad
Avdeling for rusmiddeltoksikologisk forskning Folkehelseinstituttet
Kromatografi
• Kromatografi = ”fargeskriving” (Tsvet 1903)
– chroma ‐ farge
– grafi – skrive
– Separerte klorofyll og karotenoider
• Samlenavn på separasjonsmetoder
06.06.2016
2
Hvorfor separere stoffer?
• Prøvene er komplekse blandinger
– interessert i å analysere noen få stoffer i blandingen
• Kvalitetskontroll
– råvarer• forurensninger
– preparater• produktkontroll, holdbarhetskontroll (spaltningsprodukter)
• Sporanalyse
– stoffer i biologisk materiale• fullblod, plasma, urin, spytt, vev, matvarer etc.
Fordeler med kromatografiske analyser
06.06.2016
3
Kan gi svært følsomme og spesifikke analyser
• LOQ = 0,1 nM (0,08 ng/mL)
Oiestad, E.L., et al., Determination of Digoxin and Digitoxin in Whole Blood. Journal of Analytical Toxicology, 2009. 33(7): p. 372‐378.
Enklere å legge til stoffer
06.06.2016
4
Hvordan separere stoffer?
• La stoffblandingen vandre en viss lengde.
– hvis stoffene vandrer med forskjellig hastighet vil de kunne separeres
• hvis forskjell i vandringshastighet er stor nok
• hvis veien stoffene vandrer er lang nokstart
mål
“Løypa” stoffene vandrer gjennom kalles en kolonne
Separasjonsprinsipper
• I kromatografi tvinges stoffene gjennom løypa (kolonnen) med en væske eller gass som presses gjennom med konstant hastighet
– væsken eller gassen kalles mobil fase
• Kolonnen / stasjonærfasen holder stoffene tilbake ‐ retensjon
– stoffene kan separeres hvis retensjonen er forskjellig
06.06.2016
5
Kromatografisk separasjon
1. Stoffene beveger seg med forskjellig hastighet2. Stoffene spres i lengderetningen når de vandrer
Retensjon
K =
Cs
Cm
Fordelingskoeffisientenbestemmer hvor mye avstoffet som vil oppholde segi stasjonær fase (BESTEMMERRETENSJONEN)
06.06.2016
6
a. Stoffet oppholder seg bare i mobil fase og retarderes ikkeav stasjonær fase
b. Stoffet oppholder seg i svært stor grad i stasjonær fase ogvandrer svært langsomt ‐ kraftig retensjon
K =
Cs
Cm
Båndspredning
• Får alltid båndspredning fordi molekyler av samme type har forskjellig (gjennomsnitts) hastighet
• Skyldes fysiske prosesser
06.06.2016
7
KromatogramResultatet av en kromatografisk separasjon
1. Retensjonstiden tR karakteriserer retensjonen ‐interaksjonen med stasjonær fase (brukes til identifikasjon)
2. Bredden av toppene tW (ved grunnlinjen) karakterisererbåndspredningen
3. t0 er tiden et ikke retardert stoff bruker gjennom kolonnen
Oppløsningsevne: effekt av selektivitet, effektivitet og retensjon
Rs= 1/4 (
‐1)
N(
k
1 + k
)
06.06.2016
8
Analytten
• Lipofilisitet = fettløselighet
• Hydrofilisitet = vannløselighet
• Polare funksjonelle grupper ‐ lokalisert eller spredt ut over molekylet?
• Størrelsen på upolar del av molekylet
• Sure og basiske grupper – pKa‐verdier
Analytten
• Flyktighet, størrelse, stabilitet
• Egenskaper av betydning for deteksjon
• UV‐absorbans
• Fluorescens
• Oksiderbarhet
• Bestemte grunnstoffer (nitrogen, fosfor, halogener)
• Konsentrasjon
06.06.2016
9
Eksempel: Ladningen av morfin ved forskjellige pH‐verdier
Morfin: pKa1= 8.0 pKa2 =9.9
pH ~ 6
99% av molekylene er ladet på aminet
100% er uladet på oksygenene
H+
OH O
NCH3
OH
Ladet
pH = 8
50% av molekylene er ladet på aminet
50% er uladet på aminet
~99% er uladet på oksygenene
OH O
N
CH3
OH
H+
OH O
N
CH3
OH
Ladet
‐O O
N
CH3
OH
Ladet
OH O
N
CH3
OH
pH = 10
99% av molekylene er uladet på aminet
~50% er ladet på det ene oksygenet
~50% er uladet på oksygenene
Figur lånt av Thomas Berg, FHI
Matriks
• Vanlige komponenter som må vurderes– Proteiner– Fett– Salter– Endogene forbindelser– Andre stoffer/metabolitter
• Hvordan foreligger analytten– Grad av proteinbinding– Konjugert
• Er det forbindelser som kan interferere eller ødelegge for analysen?
06.06.2016
10
Prinsipper NB! Prinsipp er ikke det samme som teknikk (metode)
• Prinsipper (type stasjonærfase i kolonnen)– Adsorpsjon
– Fordeling/faste kjemisk bundne stasjonærfaser
– Ionebytte
– Eksklusjon (gel)
• Stasjonærfasen i kolonnen holder stoffene tilbake ‐retensjon
– Stoffene tvinges i gjennom kolonnen med en væske eller gass som presses gjennom med konstant hastighet (gassen/væsken kalles mobilfasen)
Teknikker
• Gasskromatografi (GC)– Mobilfasen er en gass
• Væskekromatografi (UHPLC/HPLC el LC)– Mobilfasen er en væske
– Kolonne• preparativ eller analytisk
– Tynnsjikt (TLC)
• Superkritisk fluid kromatografi– Mobilfasen er et superkritisk fluid (vanligvis superkritisk CO2)
06.06.2016
11
Kromatografi
• Separasjon av en blanding av stoffer (a,b,c) fås hvis stoffene har forskjellig interaksjon med stasjonærfasen (og evt. mobilfasen)
Stasjonærfase
Prøve (a,b,c)
Mobilfase
• Detektorer
– Flammeionisasjonsdetektor
– Nitrogen‐fosfor detektor
–MS
Vanligvis helium
Gasskromatografi
06.06.2016
12
• Detektorer
– UV
– Fluorescence
– Elektrokjemisk
– MS
Væskekromatografi (LC)
• Forskjell i kolonnelengde betyr at man kan få bedre separasjon på en GC‐kolonne enn en LC‐kolonne
– GC 10 – 30 m
– LC 2 – 30 cm
• I HPLC kan vi i større grad variere mobilfasen og stasjonærfasen – flere muligheter
• Forskjellige krav til flyktighet, løselighet osv.
– GC – må ofte derivatisere
– Større og mer polare molekyler ‐> LC
GC vs LC
06.06.2016
13
Separasjonsprinsipper i LC
• Omvendt fase
– Stasjonærfasen er upolar og mobilfasen er polarevæsker slik som metanol, acetonitril eller vann.
– Vanlige stasjonærfaser: C18, C8
– Mer upolare forbindelser har større retensjon i systemet.
– Aller mest brukte system innen LC per i dag!
06.06.2016
14
I omvendt fase kromatografi retarderes stoffene ved hydrofob interaksjon
SiOSi
OSi
O SiH3C
H3CCH3
O
O Si
Si
H3COHCH3C
COOH
Hydrofob interaksjon – van der Waalske krefter
Interaksjon mellom hydrokarbonkjedene på C18 og den hydrofobe delen av naproxen
Isokratisk eluering vs. gradient eluering
• Isokratisk eluering: mobilfasens sammensetning endrer seg ikke under analysen.
• Gradienteluering: mobilfasens sammensetning endrer seg under analysen.– Brukes når stoffene har stor forskjell i hydrofobisitet
– Topper som eluerer sent blir smalere
– Sparer tid!
06.06.2016
15
Gradienteluering
• Ulike muligheter for programmering av gradienten
10
20
30
40
50
60
70
80
90
2 4 6 8 10 12Time (min)
% organic m
odifier
convex
concave
linear
10
20
30
40
50
60
70
80
90
2 4 6 8 10 12Time (min)
% organic m
odifier
block
combined
Van Deemter
• Høyere optimal flowhastighet for små partikler enn store.
• Høyere flow gir smalere og høyere topper.
Figur fra Waters
06.06.2016
16
5 μm partikel 1.7 μm partikler
60 μm menneskehår
Retensjonen påvirkes av:
• Mobilfasens sammensetning– Økende innhold av organisk modifikator (ACN, MeOH) gir mindre retensjon
• pH– Syrer blir minst retardert ved høy pH
– Baser blir minst retardert ved lav pH
• Tilsetning av salter– Salter kan minske løseligheten i mobil fase
– Ionepardannere øker stoffets lipofile karakter
– Tilsetningsstoffer som adsorberes til kolonnen (eks. aminer) gir mindre retensjon samt bedre symmetri og mindre båndspredning ved analyse av baser
06.06.2016
17
Retensjonen påvirkes av:
• Stasjonær fase
– Omvendt fase materialer med lange hydrokarbonkjeder som C18 gir større retensjon enn materialer med kortere hydrokarbonkjeder
– Materialer med polare overflatergrupper gir mindre retensjon
– Forskjellige typer C18 materialer kan gi forskjellig retensjon
• Temperatur
– Økende temperatur gir mindre retensjon
– Ofte ca. 35 grader HPLC, 65 grader UPLC
06.06.2016
18
UHPSFC – basiske betingelser
UHPLC – basiske betingelser
UHPLC – sure betingelser
UHPSFC – sure betingelser
06.06.2016
19
Detektorer• En detektor skal gi en respons dvs. et elektrisk signal for de stoffer en ønsker å identifisere/kvantifisere
• Responsen skal være proporsjonal med
–konsentrasjon av stoff i mobilfasen
–mengde (massen) av stoff i mobilfasen
slik at det kan utføres kvantitative analyser basert på måling av topphøyder/arealer
06.06.2016
20
Flammeionisasjonsdetektor (FID)
• Generell detektor som registrer de aller fleste stoffer som inneholder karbon
• Stabil og reproduserbar
• Stort lineært område
• Lett å bruke
Signal probe
Signal probe
Flame tip
Hydrogen
Air
Collector
ColumnFigur fra Perkin Elmer
UV detektoren
• Vanlig LC‐detektor
• Svært mange legemidler absorberer UV lys
• UV detektoren er derfor den mest anvendte detektor i farmasøytisk analyse
• Filterfotometer
• Spektrofotometer
– f. eks. diodearraydetektoren gir stoffenes UV spektra
lys Foto‐detektor
Mobil fase
06.06.2016
21
Massespektrometer som detektor
• Mye benyttet som detektor til GC og LC
• Generell og spesifikk detektor
• «Gullstandard» innen dopinganalyse og rettstoksikologisk analyse
Massespektrometre
• Nødvendige egenskaper:
‐ Analytt må kunne komme i gassfasen
‐ Analytt må kunne ioniseres
• Til sammenligning:
– UV: analytt må absorbere lys (kromofor)
– fluorescens: analytt må fluorescere
– elektrokjemisk: analytt må ha red/ox egenskaper
06.06.2016
22
Prinsipp for MS
• Danner og analyserer ioner
– stoffet ioniseres og spaltes (fragmenterer)
• Måler masse over ladning, m/z
• Analyserer i vakuum (gassfase)
• Destruktiv teknikk
Gode MS‐betingelser = godt vakuum Hva med mobilfasen??
• GC: mobilfasen er en gass, og er derfor kompatibel med MS’en.
• LC: mobilfasen er en væske ‐ kan ikke føres direkte inn i vakuum (0,1 mL/min væske ca. 100 mL/min gass!!)
06.06.2016
23
Kvadrupol masseanalysator
Detector
IonSource
+
_
_
DC and ACVoltages
resonant ion
non-resonant ion
+
Pre-filter
Quadrupole Mass Filter
Post-filter
Stable (resonant) ion
Rejected ions
2 . 5 0 3 . 0 0 3 . 5 0 4 . 0 0 4 . 5 0 5 . 0 0
2 . 5 0 3 . 0 0 3 . 5 0 4 . 0 0 4 . 5 0 5 . 0 0
2 . 5 0 3 . 0 0 3 . 5 0 4 . 0 0 4 . 5 0 5 . 0 0
2 . 5 0 3 . 0 0 3 . 5 0 4 . 0 0 4 . 5 0 5 . 0 0
2 . 5 0 3 . 0 0 3 . 5 0 4 . 0 0 4 . 5 0 5 . 0 0
2 . 5 0 3 . 0 0 3 . 5 0 4 . 0 0 4 . 5 0 5 . 0 0
3 . 7 0
3 . 7 84 . 0 5
3 . 6 5
3 . 7 2
3 . 7 8
3 . 7 8
4 . 0 1 4 . 0 8
4 . 0 1
3 . 7 63 . 6 7 4 . 1 2
3 . 9 3
3 . 7 63 . 6 94 . 0 3
4 . 1 7Oksazepam
Metadon
Klonazepam
Bromazepam
Flunitrazepam
Alprazolam
Kan se flere stoffer samtidig
- ett signal per stoff (hvis forskjellig masse)
06.06.2016
24
“Trippelkvadrupol”‐instrumenter
• I et «trippelkvadrupol» eller tandem massespektrometer er MS1 og MS2 masseanalysatorer som filtrerer ioner
• Kollisjonscellen er fylt med argon, og et potensiale settes på for å fragmentere ionene.
MS1MS1 KollisjonscelleKollisjonscelle MS2MS2
48
0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70Time0
100
%
MixIso_1G14_022 SIR of 1 Channel ES+ TIC
5.95e61.31
OH
O
O
O
OH
O
Fenbufen
Ketoprofen
Begge har MW på 254
Ionekromatogram av m/z=255
FenbufenKetoprofen
60 ng/mL Ketoprofen60 ng/mL Fenbufen
Fenbufen ??Ketoprofen
60 ng/mL Ketoprofen6 ng/mL Fenbufen
0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70Time0
100
%
MixIso_1G14_023 SIR of 1 Channel ES+ TIC
6.03e61.31
Sammenlikning av SIM og MRM
06.06.2016
25
49
0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70Time0
100
%
MixIso_1G14_023 SIR of 1 Channel ES+ TIC
6.03e61.31
60 ng/mL Ketoprofen6 ng/mL Fenbufen
SIM avm/z= 255
0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70Time0
100
%
0
100
%
MixIso_1G14_024 MRM of 2 Channels ES+ 255.25 > 209.2
1.43e61.31
MixIso_1G14_024 MRM of 2 Channels ES+ 255.25 > 237.2
8.06e41.42
Fenbufen
Ketoprofen
MRM avm/z= 255 > 209
MRM avm/z= 255 > 237
06.06.2016
26
Oppsummering
• Kromatografiske metoder
– Godt egnet for legemiddelanalyse
– Spesifikke og følsomme analyser
– Identifikasjon av stoff
– Kan legge til nye stoffer etterhvert
– Kan være kvantitativ
06.06.2016
27
Takk til
• Professor Leon Reubsaet, Farmasøytisk Institutt
• Åse Marit Leere Øiestad, Folkehelseinstituttet
Spørsmål ?