Vitaminer(A, D, E ogK)...Vitamin A, D og E: • Væskekromatografi med UV eller MS deteksjon. •...
Transcript of Vitaminer(A, D, E ogK)...Vitamin A, D og E: • Væskekromatografi med UV eller MS deteksjon. •...
5/25/2018
1
Vitaminer (A, D, E og K)Trude Athammer Sandvik
Metodeutvikler Fürst Medisinsk Laboratorium
Kurs i Kromatografi og massespektrometriScandic Nidelven 23.mai 2018
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. Fürst Medisinsk LaboratoriumLaboratoriet ble grunnlagt i Oslo i 1950 av dr. Valentin Fürst og Astri Fürst
• Privateid og norsk
• Mer enn 400 ansatte
• Det største medisinske laboratoriet i Norden
• Betjener over 6000 leger over hele landet
• Analyserer daglig prøver fra 10.000 – 12.000 pasienter
• Akkreditert
5/25/2018
2
Hvor er vi ?Vårt hovedlaboratorium ligger på Furuset i Oslo
PRØVETAKINGSSTASJONER
Furuset
Majorstuen
Oslo sentrum
Sandefjord
Bergen
HJEMMEPRØVER
INSTITUSJONER/ SYKEHJEM
MEDISINSK BIOKJEMI KLINISK FARMAKOLOGI MEDISINSK MIKROBIOLOGI PATOLOGI
Våre fagområder
Fürst kan tilby over 250 analyser innen fagområdene medisinsk biokjemi, klinisk farmakologi, medisinsk mikrobiologi og patologi.
Oversikt over analysene finnes i “elektronisk blåbok” på furst.no
5/25/2018
3
Kromatografigruppa‐ del av Spesialanalyser‐ seksjonsleder
Bente N. Berge‐ fagbioingeniører
Bente HexebergIngrid Honne FrøysaElin Hagen (instrumenter)
‐ Ca. 12 bioingeniører
Daglig rutinedrift
Metodeutviklere‐ nye metoder‐ vedlikehold og
forbedring av metoder
‐ problemløsning‐ instrumentansvar‐ investeringer
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. Kromatografi og massespektrometriStartet med Metylmalonsyre på GC-MS som første analyse i 2003.
Instrumenter pr. mai 2018:
• 8 x LC-MS/MS
• 2 x SFC-MS/MS
• 1 x ICP-MS
Automasjon:
• 3 x Hamilton STAR
• 1 x Hamilton Vantage
5/25/2018
4
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. Våre kromatografi- og MS- analyser • Rusmiddel/misbruk bekreftelse
• Alkoholmarkører (PEth og EtG/EtS)
• Metylmalonsyre
• Vitamin D (25-OH-vit D2 og 25-OH-vit D3)
• Vitamin A (retinol)
• Vitamin E (tocopherol)
• Vitamin K (phylloquinone)
• Spor- og tungmetaller
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. Vitaminer• Essensielle næringsstoffer som trengs i
små mengder for forskjellige biokjemiske funksjoner i kroppen
• Kan ikke syntetiseres i kroppen og må derfor inntas via mat. Et unntak er vitamin D som kan lages i huden ved eksponering av sol.
• Vannløselige vitaminer: vitamin C og B
• Fettløselige vitaminer: vitamin A, D, E og K
5/25/2018
5
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen.
Viktig for:• Syn• Vekst• Reproduksjon
Kilder:• Lever og kjøtt• Egg• Meieriprodukter• β-karoten i grønne, gule og
oransje grønnsaker
Vitamin A
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen.
Viktig som:• Antioksidant
Kilder:• Vegetabilske oljer• Nøtter• Korn• Salat
Vitamin E
5/25/2018
6
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen.
Viktig for:• Regulering av kalsium og fosfat-
metabolismen• Kan redusere risiko for hjerte-kar-
sykdom, enkelte kreft-typer, diabetes, kognitiv svikt, depresjon, allergi, MS etc.
Kilder:• Sol• Tran• Fet fisk• Vitamin D-beriket mat og kost-tilskudd
Vitamin D
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen.
5/25/2018
7
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen.
Viktig for:• Koagulasjon• Forebygging av osteoporose• Forebygge forkalkning av blodårer
Kilder:• Grønne blad-grønnsaker• Små mengder i vegetabilske oljer, frukt, frokostblandinger, kjøtt
og meieriprodukter• Vitamin K2 i fermentert mat av mikrobiologisk opphav som
f.eks. «natto», ost og surkål.
Vitamin K
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. Analytter og måleområde
Analyse Analytt Referanseområde i serum (Fürst)
Vitamin A Retinol > 0,7 µmol/L
Vitamin E Tocopherol 2‐42 µmol/L
Vitamin D25‐OH‐D225‐OH‐D3
50‐150 nmol/L
Vitamin K1 Phylloquinone0.1‐2.2 ng/mL(0.2‐5 nmol/L)
5/25/2018
8
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen.
Vitamin A (retinol)
Vitamin E (tocopherol)
Vitamin D2 (25‐hydroxy vitamin D2)
Vitamin K1 (phylloquinone)
Vitamin D3 (25‐hydroxy vitamin D3)
SFCSupercritical Fluid Chromatography
Kilde: waters.com
Kromatografiteknikker
5/25/2018
9
• Væske-væske ekstraksjon (LLE) • Fast-fase ekstraksjon (SPE)
Kilde: waters.com
Prøveopparbeidelse
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. Analysemetoder for bestemmelse av fettløselige vitaminer i serum:Vitamin A, D og E:• Væskekromatografi med UV eller MS deteksjon.• Prøveopparbeidelse med proteinfelling, væske-væske ekstraksjon og fast-fase
ekstraksjon• Immunoassay er tilgjengelig for 25-OH-vitamin D
Vitamin K:• Væskekromatografi med fluorescence detektor• LC-MS/MS• Omfattende prøveopparbeidelse med store volum løsemidler
5/25/2018
10
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen.
Forutsetninger ved metodeutvikling• Mange prøver -> «High throughput»• Arbeide i 96-brønnsplater (DWP)• Semi-automatisering – all pipettering ved hjelp av robot• «Keep it simple» (metoder og programmering)• Så generelle metoder som mulig (mange brukere)• HMS – bruke så «snille» kjemikalier som mulig
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. Våre vitamin-metoder
Vitamin A, D og E:• Serum• Proteinfelling/IS med metanol• Væske-væske ekstraksjon med heptan• LC-MS/MS
Vitamin K:• Serum• Proteinfelling/IS med metanol/etanol • Fast-fase ekstraksjon (SPE) med Oasis
HLB og heptan• SFC-MS/MS
5/25/2018
11
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. Rutineanalyse• Mange prøver.
• Prøveflyt fra pre-analyse til ferdig resultat.
• Semi-automatisert prøveopparbeidelse med pipetteringsrobot og annet «småutstyr».
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. RutineanalyseOverføring av barkoder til kromatografi-instrumenter og oppstart av instrument
5/25/2018
12
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. RutineanalyseAnalyse på kromatografi-instrumenter over natt.
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. RutineanalyseResultatbehandling: Prosessering og vurdering av kromatogram for allestandarder, kontroller og prøver.
5/25/2018
13
A
Kromatogram 1
A
A
B
B
B
C
C
C
D
D
D
E
E
E
Kromatogram 2
Kromatogram 3
Vurdering av:- Integrering- Retensjonstid- Internstandard- Ratio
Qual/Quant
A: m/z overgang
B: Signalintensitet
C: Retensjonstid
D: Areal
E: Høyde
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. Vitamin D (proteinfelling/ væske-væske ekstraksjon)
5/25/2018
14
Vitamin DPrøveopparbeidelse
Vitamin DPrøveopparbeidelse
1. Fellingsreagens med IS
2. Tilsetning av prøve
3. Utfelling av proteiner
4. Ekstraksjonsmiddel
5. Kraftig blanding med påfølgende sentrifugering
7. Inndampning
6. Overføring
Kilde: Thomas Bjellaas
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen.
1
2 3
4 5
Vitamin D (proteinfelling/ væske-væske ekstraksjon)
5/25/2018
15
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen. Vitamin K (proteinfelling/ fast-fase ekstraksjon)
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen.
1 2
3
4 5
Vitamin K (proteinfelling/ fast-fase ekstraksjon)
5/25/2018
16
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen.
• Oppdage «det unormale» – krever erfaring fra «normaltilstand».
• «Dag til dag» variasjoner i instrumenter og kromatografien.
• Feil kan oppstå i alle trinn, viktig å vite hva som skjedde «i går» eller «i forrige uke» for å kunne vurdere og feilsøke.
• Utfordringer øker med økende antall instrumenter – må vite at alle er like gode selv om de er ulike. Økende behov for vedlikehold!
Noen utfordringer ved rutineanalyse:
Finner ikke bildedelen med relasjons-ID rId2 i filen.
Takk for meg!- og takk til kromatografigjengen på Fürst