Post on 02-May-2015
Insegnamento
CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE
TeCoRe
Docente
Prof. Daniele Fabbri
Laboratori di Scienze Ambientali via S.Alberto, 163
dani.fabbri@unibo.it Tel. 0544 - 937344
Materiale didatticoRubinson and Rubinson, Chimica Analitica Strumentale, 2002.Fifield and Kealey, Chimica Analitica, teoria e pratica, 1999. Lucidi: disponibili on-line o presso portineria sede.
PROGRAMMA
PARTE PRIMA.
Fasi di un procedimento analitico Valutazione del metodo analitico.
Campionamento e preparazione del campione
Analisi quantitativa
PARTE SECONDA Spettrometria atomica: FAAS GFAAS, HGAAS,ICP-AES, ICP-MS.
LABORATORI strumenti di indagine bibliografica - uso banche dati
Analisi metalli assorbimento atomico. Calibrazione esterna.Analisi acidi grassi gas cromatografia. Calibrazione interna.
Elaborazione dati (EXCELL)
ESAME
Orale.
Discussione esercitazione in biblioteca (articolo scientifico ottenuto da una ricerca bibliografica).
Discussione esercitazioni di laboratorio (relazioni).
Domande sul programma.
lot
campione: porzione di materiale selezionato per rappresentare un corpo più esteso di materiale.
sub-sample: porzione del campione ottenuto per suddivisione o selezione.
campione del laboratorio: materiale inviato al laboratorio per le analisi
campione test: campione preparato partendo dal campione di laboratorio
test portion: il materiale pesato e sottoposto all’analisi.
soluzione di misura
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
TRATTAMENTODEL CAMPIONE
CAMPIONEmateriale per il quale è richiesta un’informazione analitica
RAPPRESENTATIVO: la composizione è, nella sua globalità, identica a quella del materiale di partenza.
OMOGENEO: la composizione è la medesima in tutte le sue parti.
INTEGRO: non ci devono essere alterazioni durante il trasporto, la conservazione ….(adsorbimento, volatilizzazione, …)
altrimenti non si può mettere in relazione il risultato finale con il materiale originale, non importa quanto accurata sia l’analisi
Il campione deve essere:
Specificare l’identità dell’analita.nome comunenome commercialenome IUPACChemical Abstract Registry Number (CA RN)formula di strutturanome della miscela, presenza di isomeri, sottoprodotti…?
Cl
ClCl
Cl
ClDDTp,p’-DDTdiclorodifeniltricloroetano1,1,1-tricloro-2,2-bis(4-clorofenil)etano (IUPAC)1,1’-(2,2,2-tricloroetilidene)bis[4-clorobenzene] (CA)CA RN 50-29-3Trade Names: Agritan, Anofex, Arkotine, ….,Santobane, Zeidane, Zerdane…
esempio :
struttura molecolare
Vedi :esercitazione in biblioteca
ANALITA il componente da misurare attraverso l’analisi del campione
ANALITA MATRICE TRATTAMENTO
inorganico inorganica dissoluzione-digestione
inorganico organica distruzione sostanza organica
organico inorganica estrazione
organico organica estrazione selettiva
Analysts are seldom lucky enough to be able to inject samples with no pretreatment RE Majors, LC-GC 2003
MATRICE i componenti del campione chimicamente diversi dall’analita.
Il termine MATRICE è usato anche per Indicare le caratteristiche fisiche del campione (solido, liquido, gassoso, organico, inorganico, ecc). La natura della matrice e dell’analita definiscono la procedura di preparazione e trattamento del campione. Esempio:
Esempi:Interferenza da PAN nella determinazione NOx nell’atmosfera.[NOx] = [NO] + [NO2] ; PAN = perossiacetilnitrato Si effettua misura NO per chemiluminescenza, dopo che un convertitore ha trasformato NO2 in NO. Il convertitore trasforma anche il PAN in NO. Interferenza trascurabile nelle zone urbane ([NOx] >> [PAN]), significativa nelle zone rurali ([NOx]max).
Interferenza dei cloruri nella determinazione ICP-MS dell’arsenico. Il cloruro produce nel plasma lo ione 40Ar35Cl+ isobaro con 75As+ .
INTERFERENZA effetto indesiderato di un componente sulla accuratezza della misura di un altro componente.
CONTAMINAZIONEintroduzione non intenzionale dell’analita o di altre specie nel campione possibile causa di errore nella determinazione.Spesso è irriproducibile ed erratica.Esempio: lavaggio della vetreria inadeguato per l’analisi di metalli in tracce.
GLI ERRORI
La storia contaminata.Concentrazioni di piombo nell’acqua di mare pubblicate dal 1938 al 1980.tratta da M.Stoeppler Ed. Sampling and Sample Prep., Springer 1997
1930 1950 1970
10000
1000
100
10
1
198019601940
ng / l
anno
Errori casuali :
originati da processi incontrollabili e indeterminati, riducibili (ma non eliminabili) con un lavoro attento, presentano variazioni positive e negative, misurati dalla deviazione standard s.
Minore il contributo degli errori casuali, più precisa la procedura.
Errori sistematici (determinati): originati da cause determinate con lo stesso andamento (positivo o negativo), in principio eliminabili. Misurati dal bias.
Errori grossolani.Errori di calcolo, lettura, ….
RISULTATO il valore finale riportato per una quantità misurata o calcolata dopo avere effettuato la procedura di misurazione comprese le opportune valutazioni.
numero + unità di misura + incertezza
ESEMPIO:
valore medio Xm ± deviazione standard s , n (numero di misure)
stima del valore ± stima della “precisione”, n
Cifre significative:
Le cifre note con certezza più la prima cifra incerta (qualunque sia la posizione della virgola).lL’errore di una misura è rappresentato dall’errore sull’ultima cifra.Gli zeri a destra delle cifre significative sono significativi (se dopo la virgola), a sinistra no (indicano l’ordine di grandezza).
0.0410 tre cifre significative650 tre o due cifre significative, meglio usare la notazione scientifica: 6.50·102 oppure 6.5·102
definizione dell’informazione
desiderata
scelta del metodo
strategia di campionamento campionamento
omogeneizzazioneconservazione …
pretrattamento:eliminazione interferentiforma idonea per l’analisi
determinazione-bianco- calibrazione- campione- RM, CRM
convertire i dati in risultati numerici
interpretazione dei risultati
subsamplingcampione per il laboratorioaliquote per le analisi
ricerca bibliografica
LA PROCEDURA ANALITICA
fotodegradazione
ossidazione
rilascio di contaminanti
volatilizzazione
attività microbica
adsorbimento
reazioni chimiche
CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE
Trasformare analita/matrice nella forma più adatta alla tecnica d’analisi
Rimuovere interferenti
Ottenere concentrazione ottimale
Evitare contaminazione.Minimizzare perdite
Durante il trattamento del campione si possono avere perdite di analita. La capacità della procedura analitica di misurare la quantità reale di analita presente inizialmente nel campione è espressa dal recupero (recovery):
R, recupero % = Cmisurata/Cattesa·100 = Qmisurata/Qattesa·100
La concentrazione C (o quantità Q) di analita attesa può essere ottenuta dal valore certificato di un CRM, oppure stabilita preparando un campione fortificato.Il valore ideale è R = 100%Se R < 100% possibili cause: perdite durante le fasi di trattamento (filtrazione, ecc.)Se R > 100% possibili cause: contaminazione.
TRATTAMENTO DEL CAMPIONE
METALLIMatrice : acqua Filtrazione.preconcentrazione: complessare il metallo con un legante organico per estrarlo in un solvente organico.Matrice: solida digestione: trattamento con acidi forti concentrati a caldo; bomba per digestione se si formano prodotti volatili; digestione assistita da microonde (T< 200°C)Acidi utilizzati:HNO3, H2SO4, HClO4: ossidanti, precauzioni se organici elevato.HCl: complessante, in miscela con altri acidi.HF: disgregazione totale silicati; per analisi concentrazione totale.
ORGANICI
estrazione. (biota dopo saponificazione; sedimenti); a riflusso; soxhlet; estrazione accelerata con solvente (ASE T>, P>, t<, V<); con fluidi supercritici (SFE; es.CO2).
cromatografia su colonna; per eliminare interferenti.
Esempi di trattamento del campione
criteri per la scelta del metodo analitico FIGURE DI MERITO
precisione
accuratezza (bias)
sensibilità
limite di rivelabilità
selettività
intervallo dinamico
costi/investimenti
durata dell’analisithroughput
sicurezza, tossicità reagentigreenness
abilità richiesta all’operatore
portability
ruggdness
dimensione del campione
VALIDAZIONE è il processo che permette di dimostrare se i risultati ottenuti con il metodo sono affidabili, riproducibili e se il metodo è adatto per l’applicazione richiesta.
Può essere effettuata tramite:
Confronto con un metodo differente sullo stesso campione (le fonti di errori dovrebbero essere differenti).
Confronto con altri laboratori (partecipazione a studi inter-laboratorio).
Uso di materiali di riferimento (certificati).
Quando validare un metodo Viene sviluppato un nuovo metodo per risolvere un particolare problema.
Si intende migliorare un metodo esistente per estenderlo ad un nuovo problema.
Il controllo di qualita’ mostra che le prestazioni del metodo stanno cambiando.
Si intende valutare la prestazione del laboratorio anche per un metodo esistente, utilizzato da un altro laboratorio, analista, …
Reference material (RM): a material or substance, one or more of whose property values are sufficiently homogeneous and well-established to be used for the calibration of an apparatus, for the assessment of a measurement method or for assessing values to materials.
Certified reference material (CRM): a reference material, accompained by a certificate, one or more of whose property values are certified by a procedure. This procedure enables the material’s traceability to be established in terms of the SI unit (to be understood as: a mole of a substance…). Each certified value is accompanied by an uncertainty at a stated level of confidence. ISO guide 1991
materiali di riferimento - materiali di riferimento certificati (CRM)
Alcuni enti che producono (C)RMASTM American Society for Testing and MaterialsBCR Bureau Communitaire de ReferenceIAEA International Atomic Energy AgencyNIST National Institute of Standard and TechnologyNRC National Research Council of Canada
Come scegliere i crmIl materiale di riferimento dovrebbe avere una composizione simile a quella del campione (matrix matching)Contenere l’analita ad una concentrazione simile a quella del campione.
Serie: i risultati …Xi… di analisi ripetute usando un solo metodo analitico su un materiale omogeneo n : il numero totale dei valori misurati della serie. Il numero di repliche n va sempre riportato.
PRECISIONEconcordanza fra misure ripetute
Media (aritmetica) : Xm = Xi / n = (X1 + X2 + X3 + X4) / n
indici della precisione (imprecisione) della misura Stima della deviazione standard: s = [(Xi - Xm)2/ (n -1)]1/2
Deviazione standard relativa: sr = s / Xmerrore standard della media: s/n1/2
numero minimo consigliato per una stima utile: n = 6
X1
X2
X3
X4
analisi strumentale
valori misurati
soluzione di misura
campione test
prelievoporzioni test trattamento
soluzione di misura misura calcoli
valore misurato
X1
X2
X3
X4
campione test
prelievoporzione test trattamento
soluzione di misura
misura calcolivalore misurato
X1
X2
X3
X4
Esempi di analisi replicate
Precisione del metodo
Y1 = 10.09
Y2 = 10.11
Y3 = 10.09
Y4 = 10.10
Y5 = 10.12
Risultato:Ym = 10.10 ± 0.013 n = 5
Calcoli:Ym = 10.102s = 0.0130rsd% = 0.13 %
0.5344 g
0.4984 g
0.5003 g
0.5034 g
20 mL
20 mL
20 mL
20 mL
digestionediluizione2 mL a 10 mL misura
conc. rame nella soluzione
0.383 mg/L
0.377 mg/L
0.394 mg/L
0.380 mg/L
Risultato:75.4 ug /g ± 2.9 ug/g (RSD = 3.8 %) n = 4oppure 75 ug /g ± 3 ug/g n = 4
Ripetibilità : s è riferito allo stesso metodo sullo stesso materiale nelle stesse condizioni (operatore, apparato, laboratorio) dopo brevi intervalli di tempo.
Riproducibilità : s è riferito allo stesso metodo sullo stesso materiale in condizioni diverse (operatore, apparato, laboratorio) e/o dopo lunghi intervalli di tempo.
tempo
Currie and Svehla, Pure and Appl.Chem. 66(1994)595.
Valore vero : valore ideale che si potrebbe ottenere se tutte le cause di errore fossero eliminate e l’intera popolazione fosse campionata.
Valore ‘ritenuto vero’ T (accepted reference value; conventional true value) valore attribuito ad una quantità e accettato con un incertezza appropriata per un determinato scopo.).
CRMT è il valore certificato
materiale FORTIFICATO (spiked)T è il valore stabilito dall’aggiunta
dell’analita
ACCURATEZZA (accuracy):
concordanza tra il risultato ed il valore ‘vero’ T
L’accuratezza è un concetto qualitativo. Una misura è accurata quando è precisa e libera da bias.
ESATTEZZA (trueness): vicinanza di accordo tra il valore medio Xm ottenuto da una serie grande di misure e .
ACCURATEZZA
ESATTEZZA
diminuita daerrori sistematici
PRECISIONE
diminuita daerrori casuali
Currie and Svehla, Pure and Appl.Chem. 66(1994)595.
Errore del risultato : Ei = Xi - TErrore relativo: Er = E / TErrore relativo percentuale Er(%) = E/T•100
BIAS E = Xm - T
Ei = (Xi - Xm) + (Xm -T) = Ecasuale + Esistematico(bias)
In questo caso l’accuratezza indica una combinazione di errori casuali e sistematici.
valore misuratomedia laboratorio
valore vero
bias totale
mediainter-laboratorio
bias del lab
bias del metodo
Bias del metodo: tipico del metodo, l’errore si presenta in qualsiasi laboratorio; corrisponde al bias di un test inter-laboratorio.
Bias del laboratorio: comprende il bias del metodo e il bias inerente al dato laboratorio.
CALIBRAZIONE insieme di operazioni che stabiliscono, sotto condizioni specificate, le relazioni tra i valori delle quantità indicate da un sistema di misura e i valori corrispondenti realizzati da uno standard.
STANDARD di CALIBRAZIONEmateriale con valori noti della quantità Qst da misurare.Esempio: composto puro in un solvente.
STRUMENTO DI MISURA
segnale Yst
Qst
CAMPIONE STRUMENTO DI MISURA
segnale Yc
Qc
RELAZIONE Q - Y
CONFRONTO. Calibration is comparison
Nota bene:
non confondere CALIBRAZIONE (= relazione tra segnale e misurando) e TARATURA (= accertamento funzionalità di uno strumento).
preparazione (ottenimento) degli
standard
analisi degli standard
produrre il modello di calibrazione
analisi dei campioni
applicare il modello di calibrazione ai dati dei
campioni
ricalibrare regolarmente
PROTOCOLLO DI CALIBRAZIONE
Il modello di calibrazione viene utilizzato per ricavare il valore di C del campione utilizzando la funzione inversa: MODELLO ANALITICO.
X = Y - b / a
Y = aX + b
diluizioni seriali
misura
stocksolution
1000 mg Cu / L 1 mL qb a 100 mL 1 mL qb a 200 mL
50.0 ugCu / L solvente
0 uL + 1000 uL
100 uL + 900 uL
250 uL + 750 uL
500 uL + 500 uL
750 uL + 250 uL
1000 uL + 0 uL
soluzioni di calibrazione
bianco
5.00 ug/L
12.5 ug/L
25.0 ug/L
37.5 ug/L
50.0 ug/L
segnaleY
0.002
0.092
0.202
0.378
0.615
0.788
0
0.25
0.5
0.75
1
0 10 20 30 40 50
ug / L
Y
Y = 0.0158*C + 0.0045R2 = 0.9981
modello di calibrazione
PROTOCOLLO DI CALIBRAZIONE
campione test
prelievoporzione test trattamento
soluzione di misura
misura
segnale
0.513
Y = 0.0158*C + 0.0045
0
0.25
0.5
0.75
1
0 10 20 30 40 50
ug / L
Y
0.513
32.2 ug/L
C = (Y - 0.0045) / 0.0158
modello di calibrazione modello analitico
ANALISI CAMPIONE
la curva di calibrazione
INTERVALLO DINAMICO (dynamic range) del metodo: valori estremi di concentrazione C fra cui si registra una variazione netta del segnale Y al variare di C.
INTERVALLO DINAMICO LINEARE: valori di estremi di concentrazione (LOQ-LOL) in cui il segnale Y varia linearmente con la C.
Y
LOD concentrazione C
Yb
LOQ LOL
intervallo dinamico lineare
A valori bassi di concentrazione il segnale è troppo debole;
A valori alti di concentrazione si hanno deviazioni dalla proporzionalità (a in genere diminuisce all’aumentare di C).
REGRESSIONE LINEARE : l’operazione per ottenere la relazione lineare Yr = b + a•Cr che meglio interpola i dati sperimentali
La retta ottimale è quella che minimiza la somma dei quadrati dei residui :
(Yst - Yr)2 valore minimo
Ym = Yst / NCm = Cst / NXm, Ym centroide
Yst, XstX
YYr = a•Xr + b
PENDENZA (sensibilità)a = (Xst - Xm)•(Yst - Ym)/(Xst-Xm)2
INTERCETTAb = Xm - a•Xm
Yst, Xst ottenuti dall’analisi di N soluzioni di calibrazione.
Con lo sviluppo dei computer l’interpolazione dei punti diventa più semplice.
Difficile trovare equazioni su basi teoriche teoriche, perché la non-linearità è dovuta a molteplici cause. Relazioni empiriche:
Modello di calibrazione polinomiale :
Y = b + a•C + a’•C2 + a’’•C3 + …
problemi: necessita più standard, maggiori difficoltà nella valutazione dell’incertezza,
single-point calibration :
La calibrazione più semplice è quella in cui si usa un solo standard): Yst, Xst.
Si assume Y = 0 per X = 0; risposta lineare da X = 0 a X = Xst (estrapolazione oltre i valori Yst, Xst sconsigliata).
il modello di calibrazione
Modello di calibrazione lineare :
Y = a•C + b = S•C + Yb
I chimici hanno favorito metodi con relazioni lineari, causa difficoltà ad interpolare curve. Ci sono metodi analitici non-lineari (saggi immunologici).
.S = dY / dXpendenza della retta di calibrazione Y = a C + b
SENSIBILITÀ costante di propozionalità tra il segnale ed il misurando
è una misura dell’abilità di un metodo di distiguere piccole differenze di concentrazioni dell’analita.
Y metodo più sensibile
C
metodo meno sensibile
linee analitiche del Si nell’intervallo 250-253 nm
curve di calibrazione lineari per ogni linea analitica.
Analisi del Si tramite AAS
La sensibilità dipende dalla scelta della di misura
25
0.6
9
25
1.4
32
51
.61
25
1.9
2
25
2.4
1 25
2.8
5
lunghezza d’onda, nm
inte
nsi
tà r
ela
tiva
concentrazione Si, mg/Lass
orb
an
za
esempio
251.61
251.92
standard esterno analita nella soluzione di calbrazione misurato separatamente dal campione. Il campione contenente quantità ignote di analita e le soluzioni di calibrazione contenenti quantità note di analita standard sono separate.Soluzioni di calibrazione preparate per diluizioni seriali da una soluzione madre concentrata.
Composizione soluzione di calibrazione simile alla soluzione del campione ? matrix matching Soluzioni del bianco. Es. solvente puro (es. H2O), azzeramento dello strumento.
Soluzione del bianco procedurale (dei reagenti): contiene tutte le sostanze usate nella preparazione del campione alla stessa concentrazione della soluzione di misura (il valore va sottratto da quello del campione). (es. soluzioni di HNO3/HCl)
Matrix blank solution: contiene anche i costituenti della matrice (es. sedimento).
CALIBRAZIONE ESTERNA
standard interno sostanza differente ma simile all’analita (surrogato: comportamento simile a quello dell’analita). può essere aggiunto al campione nella fase iniziale della procedura, in fasi successive o nella soluzione di misura.
Scopo: controllare un passaggio critico causa di elevata incertezza.Rapporto [analita]/[surrogato] meglio di [analita] solo
Fattore di risposta F = [analita]•Ys/[surrogato]•Ya
Esempi surrogato:Cd per Tl, Pd per Pt spettroscopia atomica 57Co (radioattivo) per 59Co analisi radiochimicacomposto organico marcato con 2H, 13C analisi MSappartenente alla stessa classe (CH3(CH2)17COOH per acidi grassi)
CALIBRAZIONE INTERNA
Preparazione delle soluzioni di calibrazione. Lo standard interno si trova alla stessa concentrazione in tutte le soluzioni (e lo sarà nella soluzione campione), mentre la concentrazione dell’analita varia.
soluzione di standard interno
soluzione di analitasolvente
area analita / area s.i.
concentrazione analita
standardizzazione interna
Qs.i. (area analita / area s.i.)
Quantità di analitaQ analita
RUMORE DI FONDO: variazione indesiderata del segnale, casuale e dipendente dal tempo (noise); segnale non dovuto all’analita, costante o lentamente variabile (deriva) (background).
BIANCO: campione che non contiene analita deliberatamente aggiunto, ma contiene tutti i (o alcuni dei) componenti della procedura analitica.
N noise misurato come differenza tra il valore più alto e quello più basso (da picco a picco) oppure come valore medio.
Y
tempoN
Rapporto segnale su rumore : S / Ntempo
S
analisi del bianco
analisi del campione S segnale (altezza del picco).Y
LOD - LIMITE DI RIVELAZIONE (limite di rivelabilità, limit of detection): la quantità di analita che produce il minimo segnale significativamente diverso da quello del bianco.
Ylod = Yb + 3sbYlod = Yb + 3sb
f
YlodYb
Sb
Y
Yb segnale del biancosb deviazione standard del bianco
Ylod segnale del campione al LOD
Ylod LOD
Y
tempoN
S
dal rapporto segnale/rumore S/N LOD quella concentrazione che produce un rapporto segnale su rumore S / N = 3
LOD = 3·sb / a
b + 3sb
b
Y
LOD
C
dalla retta di calibrazioneY = aC + b
dalla retta di calibrazione:Ylod = a LOD + bLOD = (Ylod - b) / aponendo b Yb
LOD = (Ylod - Yb ) / asostituendo Ylod con la definizione di LOD: Ylod = Yb + 3sb
LOD = 3sb) / a
determinare il LOD
Y
LOD LOD
C
metodo 1metodo 2
Yb
il LOD dipende dagli effetti del fondo e dalla sensibilità (a).LOD = 3s / a
LOQ = 10 s / a limite di quantificazione
Y = a C + b
Selettività :
indica quanto il metodo è libero da interferenze. Coefficiente di selettività dell’analita A rispetto l’interferente B : K = Sb / Sa.
Specificità:
capacità del metodo di distinguere tra l’analita e le altre sostanze.
Robustezza (robustness):
capacità del metodo di resistere alle variazioni delle condizioni sperimentali.