Post on 02-Mar-2020
1
Fluoreszcencia spektroszkópia
2014. február 04-06.
PTE ÁOK Biofizikai Intézet
Huber Tamás
Biofizika szeminárium
A fény: elektromágneses hullám
2
Elekt
romágn
ese
s sp
ektr
um
Lumineszcencia: gerjesztett állapotú rendszer fény kibocsátása.
Molekulákból vagy ionokból: molekuláris lumineszcencia
Alapjelenségeit a Jablonski-féle séma szerint értelmezzük.
3
A lumineszcencia típusai
1. Kemilumineszcencia
• olyan fényemisszió, amelyhez szükséges gerjesztő
energia adott kémiai reakció során felszabaduló
energiából adódik
pl.: foszfor (P) oxidáció útján való világítása
• alkalmas anyagcsere folyamatok vizsgálatára
• kis intenzitású
• fiziológiás viszonyoktól függő
Kemilumineszcencia - Fotolumineszcencia
4
Biolumineszcencia: a kemilumineszcencia egyik típusa, amikor a gerjesztő energiát biztosító kémiai reakció élő organizmusban játszódik le. pl.: szentjánosbogár, mélytengeri halak, medúzák, polipok, baktériumok, planktonok
1. A luciferáz katalizálja a luciferin oxidációját.
2. Inaktív oxyluciferin és fény (h ) keletkezik.
3. A további luciferin a táplálékból vagy belső szintézisből pótlódik.
2. Fotolumineszcencia • olyan fényemisszió, amelyhez szükséges gerjesztő energia adott hullámhosszú (frekvenciájú, energiájú) fény besugárzásából adódik • alkalmas molekuláris rendszerek vizsgálatára, mert jelentős információt hordoz a molekula tulajdonságairól, kölcsönhatásairól, környezetével való kapcsolatáról
Lumineszkáló molekulák szerkezete: konjugált kettős kötéseket tartalmazó gyűrűkkel rendelkeznek • két típusa: fluoreszcencia, foszforeszcencia
5
Jablonski-féle termséma
http://www.olympusmicro.com/primer/java/jablonski/jabintro/
Kasha-szabály bizonyítéka: Bizonyíték: bármilyen hullámhosszú foton elnyelésével kerül a molekula gerjesztett állapotba, az emissziós spektrum alakja nem változik.
Alap és gerjesztett állapot természetétől függően:
Fluoreszcencia: a molekula
szingulett gerjesztett állapotból relaxálódik a szingulett alapállapotba
Foszforeszcencia: a molekula triplett gerjesztett állapotból relaxálódik a szingulett alapállapotba
Megkülönböztetésük: - spektrumuk alakja, - gerjesztett állapot időtartama szerint.
6
Az S1-S0 átmenet A rendszer többféle úton adhatja le az energiát fény formájában: a. Fluoreszcencia Az elektron a termikus relaxáció után egy lépésben tér vissza az
alapállapotba Lecsengése: 10-9 - 10-6 s nagyságrendű b. Foszforeszcencia S1 állapotú molekula sugárzás nélküli átmenettel T1 triplett
állapotba kerül ebből sugárzási energia kibocsátásával kerül S0 alapállapotba
(tiltott spin átmenet miatt kisebb valószínűséggel) Lecsengése: 10-6-10 s c. Késleltetett fluoreszcencia T1 állapotból termikus gerjesztéssel S1 állapotba, majd onnan S0-
ba („magas hőmérsékletű foszforeszcencia”)
A lumineszkáló anyagot jellemzi:
Abszorpciós spektruma, valamint fluoreszcencia, foszforeszcencia gerjesztési és emissziós spektruma
Sugárzás kvantumhatásfoka
Gerjesztett állapot élettartama
Emisszió polarizációfoka (anizotrópiája)
7
A fluoreszcencia mérésének alapelvei
Legfontosabb probléma: a gerjesztő fény és az általa okozott lumineszcencia fény elkülönítése.
• A gerjesztési és észlelési irányok célszerű megválasztása
• Három elrendezési lehetőség
1. Az észlelés iránya merőleges a gerjesztés irányára.
2. Az gerjesztés és az észlelés
iránya „párhuzamos”. A minta elülső oldaláról kilépő
fluoreszcenciát érzékeljük.
3. A minta gerjesztésével szemközti oldalon, azaz lineárisan detektálunk.
!! Fényszűrők, monokromátorok!!
8
Hogyan mérünk fluoreszcenciát? (‘steady-state’ eset)
fényforrás
hullámhossz
választás minta
hullámhossz
választás
detektor
A gerjesztési spektrum
• Egy rögzített emissziós hullámhosszon detektálunk.
• Az intenzitást a gerjesztési hullámhossz függvényében mérjük.
• Függvényalakja az abszorpciós spektruméval megegyezik.
Stokes-féle eltolódás, tükörkép spektrumok
Sir George Gabriel Stokes, 1st Baronet
(1819–1903)
Gerjesztés
9
Az emissziós spektrum
Az első szingulett gerjesztett állapot legalsó vibrációs szintjéről az alapállapot valamely vibrációs szintjére való átmenetkor keletkezik.
Információt ad az alapállapot vibrációs szintrendszeréről.
Kémiai denaturáció hatása a gerjesztési és emissziós spektrumra
Gu
HC
l
10
• Az első triplett gerjesztett állapotból a szinglett állapotba való átalakuláskor.
• Szobahőmérsékleten csak kristályos anyagokon. (oldatban: kioltók pl. O2)
• A fluoreszcencia sávhoz képest a vörös felé eltolódott.
Foszforeszcencia emissziós spektrum Fluoreszcencia élettartam
Az az időtartam, amely alatt a gerjesztett állapotban található molekulák száma e-ad részére csökken.
= 1 / (kf + kössz) f : fluoreszcencia össz : f + vibr. + rot. (azaz f + non-radiatív)
11
Kvantumhatásfok
Q= Nemitt / Nabsz < 1
Q = kf / (kf + kössz)
- kifejezhető a sebességi állandók hányadosaként is:
fluoreszcencia során kibocsátott és elnyelt fotonok számának hányadosa.
Fluoreszcencia élettartam mérése
• „idő-függő” mérés /time domain measurement/
• rövid gerjesztő impulzusok (~ fs)
• Fotonok detektálása időablakokban
Principles of Fluorescence Spectroscopy_Joseph R. Lakowicz.
12
Időkorrelált egy-foton számlálás /TCSPC/
1
10
100
1000
0 20 40 60 80 1001
10
100
1000
Idő (ns)
Flu
ore
szce
ncia
in
ten
zitá
s (
cp
s)
PEVK11
IAEDANS
PEVK21
IAEDANS
Principles of Fluorescence Spectroscopy_Joseph R. Lakowicz.
Fluoreszcencia élettartam mérése
• „frekvencia-függő” mérés („frequency
domain measurement”)
Inte
nzitá
s
Eltelt idő Modulált gerjesztés (frekvencia ~20 / 80 MHz)
13
Fluoreszcencia élettartam mérése
• „frekvencia-függő” mérés („frequency
domain measurement”)
Inte
nzitá
s
Eltelt idő Emisszió – rövid élettartamé (pl. 1 ns)
Emisszió – hosszú élettartamé (pl. 10 ns)
Modulált gerjesztés (50 MHz)
Demoduláció (modulációs mélység)
Fáziskülönbség
Fluoreszcens festékek
Triptofán, tirozin, fenilalanin
Előnyük: Nem kell módosítani a fehérjét.
• natív vagy intrinsic fluorofórok:
14
Extrinsic (külső) fluorofórok
Direkt jelölés festékekkel: Danzil Rodamin IAEDANS IAF FITC Fluoreszcensen jelölt toxinokkal: Falloidin B-skorpiótoxin A-bungarotoxin
Makrofágok Aktin jelölve falloidin- Alexa 568-cal (Piros)
Magok: DAPI (Kék)
Streptococcus aureus
(Zöld)
15
A fehérjék fluoreszcens jelölése
- A jelölők minősége és elhelyezkedése tervezhető.
- A fluorofórokat specifikus kötőhelyekhez kapcsoljuk.
- Így a fehérje módosulhat, aktivitását tesztelni kell.
Jelölés specifikus antitestekkel (immunfluoreszcens, immunhisztokémiai
jelölés)
Az antitest nagy affinitással és specifitással kötődik az általa felismert molekula felszínéhez (epitóp)
Monoklonális és poliklonális antitestek
Direkt jelölés: az antitesthez fluoreszcens festék van kötve
Indirekt jelölés: az elődleges antitest jelöletlen, a másodlagos antitest van megjelölve
16
Foszforeszcencia mérése
• A gerjesztő fény a foszforeszcencia fénytől időben elkülönüljön
• Az intenzitás időbeli változása is mérhető legyen
• Mindig alacsony hőmérsékleten kell mérni
• Foszforoszkóp alkalmazása: A mintát gerjesztés után optikai ernyővel eltakarjuk , ekkor juthat a
detektorhoz az emittált fény.
Az az idő, amely a gerjesztés befejezése és a megfigyelés kezdete
között eltelik függ: • a forgási sebességtől
• a nyílások számától
Gyakorlatilag elérhető legrövidebb idő: 10-5 s nagyságrendű
A foszforoszkóp A forgó átlátszatlan henger résén
a gerjesztő fény áthatol, de a foszforeszcencia a henger falán nem jut át
Negyedfordulat után a gerjesztő
fény útja záródik el, a foszforeszcencia a detektorhoz jut a henger másik részén
17
A minta
• Általában oldat (fehérje, nukleinsav, pigment extraktum, sejtszuszpenzió)
• A küvetta anyaga ne fluoreszkáljon! • Üvegküvetta (látható tartomány) • Speciális üvegküvetta (λ > 300 nm) • Műanyag küvetta • Speciális kvarcküvetta (fluoreszcencia mérésre) • Küvetta tartó berendezések: • Temperálható (több féle módon) • Több (ált. 4) minta, forgatható
Gerjesztő fényforrások A mesterséges fényforrások által kibocsátott fény lehet:
• Folytonos-, (magas hőmérsékletre hevített anyag)
Halogéntöltésű izzószálas lámpák. Nagy nyomású gázokkal töltött lámpák.
• Vonalas-, (atomok) Intenzív, monokromatikus fény állítható elő. Alacsony nyomású higanygőzzel töltött
gázkisülési cső. • Stb.
18
Optikai szűrők
Abszorpciós filterek Általában üvegből készülnek. Szerves vagy szervetlen összetevőket
tartalmaznak, emiatt bizonyos hullámhosszúságú fénysugarakat átengednek, míg másokat nem.
Műanyag (olcsóbb, könnyebb)
Dikroikus tükrök
Szelektivitás bizonyos hullámhosszúságú fényre
Optikai szűrők
Ultraibolya (UV) filterek: Az ultraibolya-fényt nem engedik át, de hosszabb
hullámhosszúakat igen.
Neutrális szűrők: Transzmissziójuk széles színképtartományban a
hullámhosszúságtól független.
A gerjesztő fény intenzitásától függő fotokémiai, fotobiológiai folyamatok tanulmányozhatók.
Interferencia szűrők: Akkor használjuk, ha a folytonos színképű fényből viszonylag
keskeny sávot akarunk kiválasztani.
Vonalas színképű gerjesztő fényből meghatározott hullámhosszúságnál fellépő vonalat kell elkülönítenünk.
Áteresztőképességük a beeső fény beesési szögétől függ.
19
Optikai szűrők Longpass-filterek (Felüláteresztő szűrők) Magasabb hullámhosszú fénysugarakat enged át. Általában éles csúcs jellemzi őket. Fluoreszcens mikroszkópiában a dikroikus tükrök emissziós filterekként
használatosak. Shortpass filterek (Aluláteresztő szűrők) Optikai interferencia vagy színezett üveg filterek. Rövidebb hullámhosszú fénysugarakat enged át. Dikroikus tükrök excitációs filterek-ként használatosak. Bandpass filterek (Sáv szűrők) Előző kettő kombinációja. Általában alacsonyabb transzmittancia-érték mint az előzőeknél. A kiválasztott intervallumon kívül teljesen blokkol minden más
hullámhosszú fényt.
Optikai szűrők
20
A: Fényforrás
B: Rés
C: Kollimátor
D: Prizma vagy rács
E: Tükör
F: Excitációs rés
G: Minta
Monokromátorok A detektor
Fotoelektron-sokszorozó cső (Photomultiplier tube)
Nagyon szenzitív érzékelők az ultraibolyától a közeli infravörös tartományig.
A fluoreszcencia alkalmazásának előnyei:
- jó detektálhatóság: kis koncentrációban is jól mérhető
- a fluoreszcencia érzékeny a környezetre
21
Köszönöm a figyelmet!