Abszorpciós fotometria

Fluoreszcencia spektroszkópia.

Huber Tamás

PTE ÁOK Biofizikai Intézet2010. október 19.

A fény

A fény

x

B

hullámhosszE

x

elektromos térerısség-

vektor

Az elektromos és a mágneses térerısség vektorai

merılegesek egymásra, valamint a haladási irányra! Transzverzális

hullám

A fény kettıs természete:

Hullám(terjedéskor)

• Elhajlás (diffrakció)• Interferencia• Polarizáció

Részecske(kölcsönhatáskor)

• Fotoeffektus• Compton-effektus

Sir Isaac Newton (1642–1727)

� vonalas (atomok (magas hımérséklető, ritka gázok))széles hullámhossz tartományokat nulla intenzitás jellemeza spektrumvonalak pozíciói a fényt kibocsátó kémiai elemre jellemzıek (kémiai összetevık, koncentráció)

�sávos (molekulák)sok, egymáshoz közeli vonalmegjelenésük a molekula forgásával, illetve a molekulát alkotóatomok vibrációival (rezgéseivel) kapcsolatos

� folytonos (hevített anyagok)a folytonos spektrumban minden hullámhossz képviselve van, és a szomszédos hullámhosszak intenzitásai folytonosan kapcsolódnak egymáshoz, vagyis a spektrumban nincsenek ugrásszerőintenzitásváltozások

A spektrumok megjelenési formái

Emissziós (kibocsátási) illetve abszorpciós (elnyelési) színképek

Magas

hımérsékleten izzó

szilárd és

folyékony anyagok

Izzó gázok

emissziós

spektruma

Izzó gázok

abszorpciós

spektruma

http://astro-canada.ca/_en/a3300.html

Joseph von Fraunhofer

(1787–1826)

Sötét vonalak a Nap spektrumában, amelyeket a

szoláris kromoszférában lévı elemeknek

a Nap forró belsejérıl kibocsátott látható sugárzás

bizonyos hullámhosszain történı abszorpciója okoz.

Néhány elem vonalas (emissziós) spektruma

Ar

He

Ne

A spektrum• Egy hullám, például elektromágneses hullám felhasadása

alkotó frekvenciáira.

• Egy intenzitás-jellegő mennyiség ábrázolva egy energia-

jellegő mennyiség függvényében.

λ (nm)

absz

orp

cióintenzitás, beütésszám (pl. radioaktivitás

mérése), fotonszám, transzmittancia,

abszorbancia (extinkció, OD)

energia és azzal arányos

mennyiségek (pl. frekvencia,

hullámhossz, hullámszám)

Fény és anyag kölcsönhatása

• Kvantált energiafelvétel (foton)• Atomi rendszerrel (anyaggal) kölcsönható

elektromágneses sugárzás:• visszaverıdhet (reflexió) • elnyelıdhet (abszorpció) • áthaladhat (transzmisszió)

a biológiai hatás létrejöttének feltétele!

A fényabszorpció

A beesı fénynyaláb elektromos tere az útjába esıkis részecskék töltéseit rezgésre kényszerítiapró oszcillátorok vagy „rádióadók”

elektromágneses hullámokat bocsátanak kiHa ez a rezonanciafrekvencia: a rezgési amplitúdó

megnı, „belsı súrlódás” lép felaz oszcillátor energiája lecsökkenaz anyag részlegesen elnyeli a sugárzást

Gerjesztı fény

f rezonancia

Atomi/molekuláris

rendszer

Fényintenzitás-változás

I0 I

Transzmisszió

mintafényforrás detektor

T = I / I0

Általában százalékban (%) adjuk meg.

I0 I

I = I0.10-ε(λ) x c

εεεε(λλλλ): az extinkciós koefficiens (anyagi minıségtıl függ),

c: a minta koncentrációja, x: az optikai úthossz

Lambert-Beer

törvény

Abszorpció Az abszorpció …

Megjegyzés: a transzmittancia nem additív: ha az egyik komponens

átenged 30%-ot, a másik 60%-ot, akkor a kettı együtt NEM 90%-

ot fog átengedni!

E ≈ OD ≈ A = lg (I0/I) = ε(λ) . c . x

Miért ε(λ) és nemcsak ε?

λλλλ (nm)

absz

orpc

ió

Mert az abszorpció λ függı, így az ε is az kell hogy legyen!

Hogyan mérjük az abszorpciót?

fényforrás minta detektormonokromátor

Egy fotométer egyszerő sémája:

fotometria = abszorpciós spektroszkópia

mőanyag, üveg,

kvarc küvettákban

Folytonos fényő, pl.: halogén,

deutérium, xenon, stb. lámpa

Prizma vagy optikai

rács + rés

Egy- és két-utas fotométerek

Az emisszió és az abszorpció mérése

emisszió Tér bármely irányából!

abszorpció Csak lineáris

elrendezésben!

A fotométer linearitása;

“stray light effect”

Várható tendencia

koncentráció

absz

orpc

ió

Meredekség: ε

A probléma oka: nem tökéletesek a monokromátorok!

Optikai rács

Második, harmadik, stb. felharmónikusokmegjelenése!

A fotométer linearitása;

“stray light effect”

mintaI0 I

99% λkiválasztott

és

1% λfelharmónikus

89% λkiválasztott

és

1% λfelharmónikus

Kicsi abszorpció mellett

mintaI0 I

99% λkiválasztott

és

1% λfelharmónikus

1% λkiválasztott

és

1% λfelharmónikus

Nagy abszorpció mellett

Ezt is érzékeli a detektor!!!

Fényszórás

• Tömény (nagy koncentrációjú) mintáknál jelentkezhet a „stray light effect” mellett!

minta

Az abszorpciós fotometria alkalmazásai

• Különbözı oldatok (pl. fehérjeoldatok!!!) koncentrációjának meghatározása

• híg oldatok esetén használatos (az oldatban lévımolekulák nem befolyásolják egymás energiaszintjeit)

• Idıfüggı változások nyomon követése

• Elektroforetikus minták kiértékelése

A fehérjék abszorpciójának értelmezése

Idıfüggı mérések

Anyagi,

minıségbeli,

szerkezeti

változások

követése (pl.

kémiai reakciók

hatására)

0 1000 2000 3000 4000

-0,4

-0,2

0,0

0,2

Absz

orpc

ió

idõ (s)

Abszorpció egyéb alkalmazásaSDS-PAGE minták kiértékelése

Lumineszcencia alapjelensLumineszcencia alapjelenséégek, gek, paramparamééterekterek

Lumineszcencia: a fényt kibocsátó rendszer nem a magas hımérséklet miatt világít („hideg emisszió”).Molekulákból vagy ionokból: molekuláris lumineszcencia.

Alapjelenségeit a Jablonski-féle séma szerint értelmezzük.

Az energiaszintek Az energiaszintek felhasadnak:felhasadnak:VibrVibráácicióóssszintekre szintekre (atommagok rezg(atommagok rezgıımozgmozgáása)sa)Ezek tovEzek továább bb rotrotáácicióós s szintekre szintekre (atommagok (atommagok tengely ktengely köörrüüli li forgforgáássáábbóól)l)

Gerjesztés módjaiofotonabszorpció (fotolumineszcencia)okémiai reakció (kemilumineszcencia)obiokémiai reakció (biolumineszcencia)oradioaktív bomlás energiája (radiolumineszcencia)

Lumineszkáló molekulák szerkezete: konjugált kettıs kötéseket tartalmazógyőrőkkel rendelkeznek

1,51,5--IAEDANSIAEDANS

o Ha S0 alapállapotú molekulát E= h*n energiával gerjesztünk, 10-15

s alatt S1 gerjesztett állapotba kerül (igen ritkán: S2 állapotba)

o A foton-abszorpció során az elektron spin állapota nem változik meg

o A rendszer alapállapotra törekszik:A molekula olyan vibrációs szinten van, ami nem felel meg a környezettel való termikus egyensúlynak

• S2-S1 átalakulás: 10-12 s alatt• S1-S0 átalakulás: 10-8 s alatt

Termikus relaxáció:

A „forró” molekula és a környezete közti hıcsere

(Vibrációs relaxáció: a vibrációs energia hıvé alakul)

Fotoemisszió:

A gerjesztett molekula alapállapotba kerül egy foton kisugárzása révén

Kasha-szabály:

A fluoreszcencia-emisszió az elsı gerjesztett állapot legalacsonyabb vibrációs

szintjérıl történik

Bizonyíték: bármilyen hullámhosszú foton elnyelésével kerül a molekula

gerjesztett állapotba, az emissziós spektrum alakja nem változik

SS11--SS00 nem nem spintiltottspintiltott((internalinternal

conversionconversion=IC)=IC)

SS11--TT11

áátalakultalakuláás: s: spintiltottspintiltottfolyamatfolyamat((spinvspinvááltltóóáátmenet, tmenet, intersystemintersystemcrossingcrossing=ISC)=ISC)

A rendszer többféle úton adhatja le az energiát fény formájában:

a. FluoreszcenciaAz elektron a termikus relaxáció után egy lépésben tér vissza azalapállapotbaLecsengése: nanoszekundumos (10-9) nagyságrendő

b. FoszforeszcenciaS1 állapotú molekula sugárzás nélküli átmenettel T1 triplettállapotba kerül ebbıl sugárzási energia kibocsátásával kerül S0 alapállapotba (tiltott spin átmenet miatt kisebb valószínőséggel)Lecsengése: 10-6-10 s

c. Késleltetett fluoreszcenciaT1 állapotból termikus gerjesztéssel S1 állapotba, majd onnan S0-ba(„magas hımérséklető foszforeszcencia”)

Az S1-S0 átmenet

A lumineszkA lumineszkáállóó anyagot jellemzi:anyagot jellemzi:

AbszorpciAbszorpcióóss--, fluoreszcencia, fluoreszcencia--, , foszforeszcenciafoszforeszcencia gerjesztgerjesztéési si éés s emissziemisszióós spektrumas spektruma

SugSugáárzrzáás kvantumhats kvantumhatáásfokasfoka

Gerjesztett Gerjesztett áállapot llapot éélettartamalettartama

EmissziEmisszióó polarizpolarizáácicióófoka (anizotrfoka (anizotróópipiáája)ja)

Az emissziós spektrum

A kisugárzott fény teljesítménysőrőségének hullámhossztól valófüggését kifejezı függvény:

∆∆∆∆JE / ∆λ (λ)∆λ (λ)∆λ (λ)∆λ (λ)

Azt a sugárzási intenzitást jelöli, mely egy adott hullámhossz ∆λ∆λ∆λ∆λkörnyezetében mérhetı.A ∆λ∆λ∆λ∆λ intervallumot a rés szélessége határozza meg.

Fluoreszcencia emissziós spektrum

Az elsı szingulett gerjesztett állapot legalsó vibrációs szintjérıl az alapállapot valamely vibrációs szintjére való átmenetkor keletkezik.

Információt ad az alapállapot vibrációs szintrendszerérıl.

Foszforeszcencia emissziós spektrum

Az elsı triplett gerjesztett állapotból a szingulett állapotba valóátalakuláskor keletkezik.

Szobahımérsékleten csak kristályos anyagokon (oldatban: kioltók pl. O2) figyelhetı meg.

A fluoreszcencia sávhoz képest a vörös felé eltoldódott.

Gerjesztési spektrumo Egy rögzített emissziós hullámhosszon detektálunk.o Az intenzitást a gerjesztési hullámhossz függvényében mérjük.o Függvényalakja az abszorpciós spektruméval egyezik meg, de

csak az adott hullámhosszon emittáló komponensre jellemzı.

Stokes-eltolódás A mérés alapelvei

Legfontosabb probléma: a gerjesztı fény és az általa okozott lumineszcencia fény elkülönítése

I. Fluoreszcencia mérésénél:A gerjesztési és észlelési irányok célszerő megválasztásaHárom elrendezés

1. Az észlelés iránya merıleges a gerjesztés irányára

2. Az gerjesztés és az észlelés iránya „párhuzamos”

A minta elülsı oldaláról kilépıfluoreszcenciát érzékeljük

3. A minta gerjesztéssel ellenkezıirányú, hátsó oldaláról detektálunk

!! Fényszőrık, monokromátorok!!

II. Foszforeszcencia mérésénélA gerjesztı fény a foszforeszcenciafénytıl idıben elkülönüljönAz intenzitás idıbeli változása is mérhetı legyenFoszforoszkóp alkalmazása:A mintát gerjesztés után optikai ernyıvel eltakarjuk Ekkor juthat a detektorhoz az emittált fény

Az az idı, amely a gerjesztés befejezése és a megfigyelés kezdete között eltelik: függ a forgási sebességtılfügg a nyílások számától

Gyakorlatilag elérhetı legrövidebb idı: 10-5 s nagyságrendőMindig alacsony hımérsékleten kell mérni

A forgó átlátszatlan henger résén a gerjesztı fény áthatol, de a foszforeszcencia a henger falán nem jut át

Negyedfordulat után a gerjesztıfény útja záródik el, a foszforeszcencia a detektorhoz jut a henger másik részén

Köszönöm a figyelmet!