Post on 16-Oct-2021
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
GEDIMINAS ZVICEVIČIUS
FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKYBINĖS SUDĖTIES
ĮVAIRAVIMAS OBUOLIŲ ŽIEVELĖSE IR MINKŠTIMUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Prof., habil. dr. Valdimaras Janulis
KAUNAS, 2015
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis
FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKYBINĖS SUDĖTIES ĮVAIRAVIMAS
OBUOLIŲ ŽIEVELĖSE IR MINKŠTIMUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof., habil. dr. Valdimaras Janulis
Recenzentas: Darbą atliko
Doc. dr. Andrejus Ževžikovas Magistrantas
Gediminas Zvicevičius
KAUNAS, 2015
3
TURINYS
SANTRAUKA ......................................................................................................................................... 5
SUMMARY ............................................................................................................................................. 6
1. SANTRUMPOS ................................................................................................................................... 7
2. ĮVADAS ............................................................................................................................................... 8
3. LITERATŪROS APŽVALGA .......................................................................................................... 10
3.1. Malus Mill. genties apibūdinimas ir morfologiniai požymiai ..................................................... 10
3.2. Obelų vaisių ir lapų cheminės sudėties tyrimai ........................................................................... 10
3.3. Obuoliuose esančių fenolinių junginių ekstrakcijos metodai ...................................................... 12
3.4. Fenolinių junginių kiekio augalinėje žaliavoje nustatymo metodai ............................................ 16
3.4.1. Spektrofotometrinis fenolinių junginių nustatymo metodas ................................................ 16
3.4.2. Chromatografiniai fenolinių junginių nustatymo metodai ................................................... 17
3.4.3. Elektrocheminiai fenolinių junginių nustatymo metodai ..................................................... 19
4. TYRIMO METODIKA ...................................................................................................................... 21
4.1. Tyrimo objektas ........................................................................................................................... 21
4.2. Naudoti reagentai ........................................................................................................................ 21
4.3. Naudota aparatūra ....................................................................................................................... 21
4.4. Tyrimo metodai ........................................................................................................................... 22
5. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ................................................................................................ 27
5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktuose
spektrofotometriniu metodu ............................................................................................................... 27
5.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktuose
spektrofotometriniu metodu ............................................................................................................... 29
5.3. Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktuose
spektrofotometriniu metodu ............................................................................................................... 31
5.4. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymas obuolių minkštimuose ir
žievelėse efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ................................................................. 33
5.5. Obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas
spektrofotometriniu metodu ............................................................................................................... 37
5.5.1. Obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS
metodu ............................................................................................................................................ 37
5.5.2. Obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH
metodu ............................................................................................................................................ 39
4
5.5.3 Obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas FRAP
metodu ............................................................................................................................................ 40
5.6. Flavonoidų, fenolinių junginių ir proantocianidinų kiekių ir antioksidacinio aktyvumo
koreliacinių ryšių vertinimas .............................................................................................................. 42
5.7. Kiekybinis pektinų įvertinimas gravimetriniu metodu ................................................................ 43
6. IŠVADOS ........................................................................................................................................... 45
7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ................................................................................................. 46
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS.............................................................................................................. 47
9. PRIEDAI ............................................................................................................................................ 55
5
SANTRAUKA
G. Zvicevičiaus magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas Prof., habil. dr.Valdimaras Janulis;
Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.
Raktiniai žodžiai: Malus, obuoliai, fenoliniai junginiai, flavonoidai, proantocianidinai,
pektinai, efektyvioji skysčių chromatografija, spektrofotometrija, antioksidacinis aktyvumas.
Tyrimo objektas ir metodai: Obuolių žievelių ir minkštimų ėminių ekstraktai. Bendro
fenolinių junginių kiekio, flavonoidų ir proantocianidinų kiekio nustatymas atliktas
spektrofotometriniu metodu. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties analizė atlikta
efektyviosos skysčių chromatografijos metodu. Antioksidacinis aktyvumas nustatytas
spektrofotometriniu metodu, naudojant ABTS, DPPH, FRAP reagentus. Pektinų kiekybinė sudėtis
nustatyta gravimetriniu metodu.
Darbo tikslas: Ištirti Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų veislių obuolių
žievelių ir minkštimų fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimus bei įvertinti jų
ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai: Nustatyti obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“,
„Rajka“ ir „Lodel“ obuolių žievelių ir minkštimų bendro fenolinių junginių kiekybinės sudėties
įvairavimą. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyti obelų veislių „Aldas“ ir „Lodel“
obuolių žievelių ir minkštimų fenolinių junginių kiekybinę bei kokybinę sudėtį. Nustatyti obuolių
žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą. Įvertinti fenolinių junginių, flavonoidų,
proantocianidinų kiekybinės sudėties ir ekstraktų antioksidacinio aktyvumo koreliacinius ryšius.
Nustatyti pektinų kiekį obelų obuolių žievelių ir minkštimų ėminiuose.
Išvados: Veislės „Aldas" obuolių žievelėse nustatyti didžiausi fenolinių junginių (3,37±0,03
proc.), flavonoidų (0,24±0,003 proc.) ir proantocianidinų (0,29±0,006 proc.) kiekiai. Veislės „Lodel"
obuolių minkštimuose nustatyti didžiausi fenolinių junginių (2,60±0,05 proc.), flavonoidų (0,03±0,001
proc.) ir proantocianidinų (0,21±0,007 proc.) kiekiai. „Aldas" ir „Lodel" veislių obuolių minkštimuose
ir žievelėse efektyviosios skysčių chromatografijos metodu didžiausiais kiekiais nustatyti tie patys
junginiai (chlorogeno rūgštis, procianidinas B2, (-)-epikatechinas). Didžiausias antioksidacinis
aktyvumas nustatytas veislės „Aldas" (119,86±3,23 µmol TE/g) obuolių žievelėse. Iš minkštimų
didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo „Auksis" (77,43±3,56 µmol TE/g) minkštimai.
Stipriausias koreliacinis ryšys nustatytas tarp fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo
nustatyto DPPH metodu (0,953). Didžiausias pektinų kiekis nustatytas „Rajka" veislės obuolių
žievelėse (13,3±0,5 proc.) ir minkštimuose (16,2±0,6 proc.).
6
SUMMARY
Key words: Malus, apple, phenolics, flavonoids, proanthocyanidins, pectin, high
performance liquid chromatography, spectrophotometry, antioxidant activity.
Object and methods: Apple peel and pulp extracts. Quantitative analysis of
the total content of phenolic compounds, flavonoids and proanthocyanidins was assesed by
spectrophotometry. Qualitative and quantitative determination of phenolic compounds was performed
using high performance liquid chromatography. The antioxidant activity was assesed by ABTS, DPPH
and FRAP spectrophotometric methods. Pectin content was determined by a gravimetric method.
Aim: to determine the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds of
apple peels and pulp of apple cultivars grown in Lithuanian climatic conditions and to assess the
antioxidant activity of their extracts.
Objective: to determine of the phenolic compounds quantitative composition variation of
apple peels and pulp of apple cultivars 'Ligol', 'Connel Red', 'Aldas', 'Auksis', 'Rajka' and 'Lodel'. To
determine the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds of apple peels and pulp
of apple cultivars 'Aldas' and 'Lodel' using high performance liquid chromatography. To assess the
antioxidant activity of apple peel and pulp extracts. To evaluate the correlation between the total
phenolic, flavonoid and proanthocyanidin content in apple peels and pulp and the antioxidant activity
of their extracts. To determine the pectin content in apple peels and pulp.
Conclusions: among apple peels the highest amount of phenolic compounds (3,37±0,03%),
flavonoids (0,24±0,003%) and proanthocyanidins (0,29±0,006%) were determined in the peels of
cultivar 'Aldas'. Among apple pulp the highest amount of phenolic compounds (2,60±0,05%),
flavonoids (0,03±0,001%) and proanthocyanidins (0,21±0,007%) were determined in the peels of
cultivar 'Lodel'. 11 phenolic compounds were identified and quantified in apple peels and pulp of
cultivars 'Aldas' and 'Lodel'. Chlorogenic acid, procianydin B2 and (-)-epicatechin were the main
phenolic compounds found in both apple cultivars. The highest antioxidant activity in apple peels was
determined in cultivar 'Aldas' (119,86±3,23 µmol TE/g) and the highest antioxidant activity in apple
pulp was determined in cultivar 'Auksis' (77,43±3,56 µmol TE/g). The strongest correlation (0,953)
was determined to be between the total amount of phenolic compounds and the antioxidant activity,
determined by the DPPH method. The highest pectin amount was determined in cultivar 'Rajka' peels
(13,3±0,5%) and pulp (16,2±0,6%).
7
1. SANTRUMPOS
ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis);
DMCA – 4-dimetilaminocinamaldehidas;
DMD-MS – diodų matricos detektorius su masių spektrometru;
DMD-MS/MS – diodų matricos detektorius su tandeminine masių spektrometrija;
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas;
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija;
FRAP – geležies redukcijos antioksidacinė galia (angl.Ferric reducing antioxidant power);
GAE – galo rūgšties ekvivalentas (angl. Gallic acid equivalent);
KE-ED – kapiliarinė elektroforezė su elektrochemine detekcija;
MS – masių spektrometras;
MS/MS – tandeminė masių spektrometrija;
TAE – tanino rūgšties ekvivalentas (angl. Tannic acid equivalent);
TE – trolokso ekvivalentas;
TPTZ – 2,4,6-tripiridil-s-triazinas;
UV – ultravioletinė spinduliuotė.
8
2. ĮVADAS
Vaistinių augalinių žaliavų, maisto produktų ir maisto papildų tyrimai yra ypač aktualūs.
Siekiant vaistines augalines žaliavas panaudoti ligų profilaktikai, būtina nustatyti profilaktinėmis ar
gydančiomis sąvybėmis pasižyminčius biologiškai aktyvius junginius bei nustatyti šių junginių
cheminės sudėties įvairavimą skirtingose augalo rūšyse ir organuose. Lėtinių ligų profilaktikai gali būti
naudojami ne tik vaistiniai augalai, bet ir biologiškai aktyvias medžiagas kaupiančios daržovės ar
vaisiai, kurie dažnai kaupia didelius kiekius fenolinių junginių, pasižyminčių antioksidaciniu
aktyvumu.
Obuoliai yra vieni svarbiausių vidutinio klimato juostoje auginamų vaisių [52, 77, 98]. 2012
m. duomenimis, visame pasaulyje yra išauginama 76.38 milijonų tonų obuolių per metus. Obuoliai yra
vieni dažniausiai Lietuvoje vartojamų vaisių. 2012 m. Lietuvoje buvo išauginta 72.5 tūkstančių tonų
obuolių [100]. Obuoliai vartojami švieži, naudojami sulčių, sidro, vyno gamyboje. Obelų vaisiai yra
angliavandenių, mineralinių medžiagų, maistinių skaidulų bei fenolinių junginių šaltinis. Obuoliai
kaupia kvercetino glikozidus, epikatechiną, chlorogeno rūgštį, procianidinus ir dihidrochalkonus. Šie
junginiai pasižymi stipriu antioksidaciniu aktyvumu in vitro [49].
Pastaraisiais metais epidemiologinių ir biocheminių tyrimų metu nustatytas reikšmingas ryšys
tarp reguliaraus vaisių ir daržovių vartojimo bei jų įtakos širdies ligų, vėžio ir kitų degeneracinių ligų
profilaktikai [35, 82, 89]. Atlikta daug mokslinių tyrimų, kurių rezultatai rodo teigiamą fenolinų
junginių poveikį žmogaus organizmui. Įrodytas priešvėžinis poveikis [72, 80], antivirusinis veikimas
prieš Herpes simplex padermes [32], antialerginis [22, 41, 87], trigliceridų ir mažo tanko lipoproteinų
kiekį mažinantis, lipidų oksidaciją slopinantis poveikis [57, 86]. Obuoliuose esantys fenoliniai
junginiai gali apsaugoti virškinamojo trakto ląsteles nuo neigiamo nesteroidinių vaistų nuo uždegimo
poveikio [16], mažina astmos ir diabeto riziką [13]. Ankstesnių, kitų mokslininkų atliktų tyrimų
rezultatai parodė, kad obuoliai pasižymi stipriomis antioksidacinėmis sąvybėmis, kurios siejamos su
fenolinių junginių kiekiu [55, 88].
Fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis obuoliuose kinta priklausomai nuo
auginimo technologijos, klimatinių sąlygų ypatymų, laikymo sąlygų ir obelų veislės. Moksliniais
tyrimais įrodyta, kad skirtingose obuolio dalyse fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis
skiriasi [24, 44, 77]. Biologiškai aktyvių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimas obuolių
žievelėse bei minkštimuose turi įtakos fenolinių junginių kiekiui obuolių produktuose. Obuoliai yra
fenolinius junginius kaupianti augalinė žaliava, panaudojama kasdienėje mityboje, maisto produktų bei
maisto papildų gamyboje. Fenolinių junginių kiekis skirtingų veislių obuoliuose ir obuolio dalyse gali
9
skirtis, todėl verta nustatyti fenolinių junginių kiekio įvairavimų dėsningumus skirtingų Lietuvoje
auginamų obelų veislių obuolių žievelėse ir minkštimuose.
Darbo tikslas:
Ištirti Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų veislių obuolių žievelių ir minkštimų
fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimus bei įvertinti jų ekstraktų antioksidacinį
aktyvumą.
Uždaviniai:
1. Nustatyti obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių
žievelių ir minkštimų bendro fenolinių junginių kiekybinės sudėties įvairavimą.
2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyti obelų veislių „Aldas“ ir „Lodel“
obuolių žievelių ir minkštimų fenolinių junginių kiekybinę bei kokybinę sudėtį.
3. Nustatyti obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių
žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.
4. Įvertinti fenolinių junginių, flavonoidų, proantocianidinų kiekybinės sudėties ir ekstraktų
antioksidacinio aktyvumo koreliacinius ryšius.
5. Nustatyti pektinų kiekį obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir
„Lodel“ obuolių žievelių ir minkštimų ėminiuose.
10
3. LITERATŪROS APŽVALGA
3.1. Malus Mill. genties apibūdinimas ir morfologiniai požymiai
Obels (Malus Mill.) gentis priklauso erškėtinių (Rosaceae) šeimai. Malus Mill. gentis
plačiai paplitusi pasaulyje, ypač vidutinio klimato juostoje [52]. Gentį sudaro 55 rūšys, iš kurių
Europoje labiausiai paplitusi naminė obelis (Malus domestica Borkh.) ir miškinė obelis (Malus
sylvestris Mill.) [38,65].
M. domestica Borkh. geba prisitaikyti prie įvairių klimato sąlygų, tačiau geriausiai auga
vėsesnio klimato juostoje (35-50° šiaurės platumos), vandeniui pralaidžioje dirvoje, kurios pH 6-7.
Obelis auga šiauriau nei daugelis kitų vaismedžių dėl vėlyvo žydėjimo bei didelio atsparumo šalčiui.
Vaisiai sunoksta praėjus 120 – 150 dienų nuo žydėjimo pabaigos. Yra rūšių, kurios sunokina vaisius
po 70 ar po 180 dienų [61].
Obelys yra vasaržaliai, daugiamečiai medžiai, užaugantys iki 3 – 12 m. aukščio. Lapai
tamsiai žalios spalvos, ovalūs, dantytu kraštu, smailia viršūne. 5-12 cm ilgio, 3-6 cm pločio [61].
Obelų žiedai turi 5 taurėlapius ir 5 vainiklapius, kurių spalva gali kisti nuo baltos iki ryškiai rausvos
[37], skersmuo 2,5-3,5 cm [61]. 20 kuokelių su geltonomis dulkinėmis yra išsidėstę trimis ratais
(10+5+5). Mezginė apatinė su 3-5 lizdais. Liemenėliai penki, tarpusavyje suaugę [37]. Sėklų skaičius
yra 5 – 15 [61], nors tam tikros atmainos gali išauginti iki 30 sėklų [37].
Obuoliai priklausomai nuo veislės yra labai įvairios, dažniausiai rutuliškos formos [1] ir
labai įvairaus dydžio (nuo 5 cm iki 9 cm ir daugiau) [61], įvairių spalvų ir skonio, su išliekančiais
taurėlapiais viršuje. Sėklos pailgai kiaušiniškos, iš šonų suplotos, dažniausiai vienu lygiu ar įgaubtu
šonu, kitu – išgaubtu, pilkai rudos spalvos, matiniu, truputi blizgančiu paviršiumi, 6-7 mm ilgio, 3,5-
4,5 mm pločio, 1,8-2,1 mm storio [1].
3.2. Obelų vaisių ir lapų cheminės sudėties tyrimai
Yra atlikta daug obuolių cheminės sudėties tyrimų. Daugumoje tyrimų nustatomas
bendras fenolinių junginių kiekis obuoliuose. Dažnai nustatoma fenolinių junginių grupių arba atskirų
junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis. Dalies tyrimų objektas yra obuolių žievelės ir minkštimai.
Rečiau tiriamos obuolių sėklos ir obelų lapai.
11
Skirtingų obelų veislių obuoliuose nustatoma skirtinga fenolinių junginių kokybinė ir
kiekybinė sudėtis. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties pokyčiams obuoliuose
didžiausią įtaką daro augalo genotipas, vaisiaus subrendimo lygis ir mažiau klimatiniai aplinkos
veiksniai [61]. Obuoliuose kaupiami fenoliniai junginiai skirstomi į du pagrindinius pogrupius:
flavonoidus ir fenolines rūgštis. Svarbiausi obuoliuose nustatyti flavonoidai yra kvercetino glikozidai
(avikuliarinas, hiperozidas, izokvercitrinas, kvercitrinas, rutinas, kvercetino-3-O-ksilozidas,
kvercetino-3-O-arabinozidas), flavan-3-oliai - (+)-katechinas ir (−)-epikatechinas bei jų oligomerai -
procianidinai B1, B2 ir C1, polimeriniai procianidinai, dihidrochalkonai – floridzinas ir floretinas [3,
46,78]. Obuoliuose nustatytos fenolinės rūgštys: chlorogeno rūgštis bei p-kumarokvinino rūgštis [3,
54].
Literatūroje nurodoma, kad obuoliuose fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis
gali įvairuoti. Bendras fenolinių junginių kiekis gali įvairuoti nuo 662 µg/g iki 4291 µg/g [3, 92].
Kvercetino glikozidų nustatyta 41,0 µg/g - 87,0 µg/g [54], (+)-katechino 50,1 µg/g – 148,2 µg/g, (−)-
epikatechino 236,5 µg/g – 684,0 µg/g, procianidino B1 39,6 µg/g – 108,1 µg/g, procianidino B2 320,9
µg/g – 931,2 µg/g, floridzino 63,8 µg/g - 142,4 µg/g, chlorogeno rūgšties 341,3 µg/g – 2228,4 µg/g [3,
46].
Obuolių žievelėse vyraujantys fenoliniai junginiai yra procianidinai, (+)-katechinas, (−)-
epikatechinas, chlorogeninė rūgštis, floridzinas, floretino-29-ksilozidas, kvercetino glikozidai,
cianidin-3-O-galaktozidas [23, 26, 78]. Minkštimuose nustatyti mažesni, nei žievelėse (+)-katechino,
(−)-epikatechino, procianidinų kiekiai. Obuolių minkštimuose chlorogeno rūgštis nustatoma didesniais
kiekiais, nei žievelėse [8, 46, 78]. Fenolinių junginių kiekybinė sudėtis yra didesnė obuolių žievelėse,
tačiau žievelės sudaro iki 10 proc. obuolių masės. Svarbesni yra obuolių minkštimai, nes jie sudaro
didžiąją dalį obuolių masės [90].
Obuoliuose nustatyta pektinų - polisacharidų, sudarytų iš galakturono rūgšties
fragmentų. Dėl gelifikuojančių savybių pektinai naudojami maisto, farmacijos ir kosmetikos
pramonėje. Viena iš pramonėje naudojamų pektinų žaliavų yra obuoliai. Pektinų kiekiai obuoliuose,
priklausomai nuo veislės ir ekstrakcijos sąlygų kinta nuo 3.4 proc. iki 15 proc. absoliučiai sausos
žaliavos masės [27, 50].
Obelų lapuose nustatyti fenoliniai junginiai yra floridzinas, 3-hidroksifloridzinas, hiperozidas,
izokvercitrinas, kvercetino-3-O-ksilozidas, kvercetino-3-O-galaktozidas, avikuliarinas, apigeninas,
mirecetinas, rutinas, kvercitrinas, kemferolis, izoramnetinas, (+)-katechinas, (-)-epikatechinas,
chlorogeno rūgštis, kavos rūgštis [4, 63, 66]. Iš obelų lapų išskirti ir identifikuoti triterpenai (ursolo ir
oleaninė rūgštys), karotenoidai (α- tokoferolis) ir eteriniai aliejai (eukaliptolis, fitolis ir α-farnesenas)
[51]. Literatūros duomenimis, obelų lapuose fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis gali
12
įvairuoti. Bendras fenolinių junginių kiekis gali įvairuoti nuo 58,28 mg/g iki 163,35 mg/g [4, 45].
Floridzino nustatyta 54,1 mg/g - 140,0 mg/g [4, 63], chlorogeno rūgšties 0,11 mg/g - 1,38 mg/g, kavos
rūgšties 0,14 mg/g - 0,30 mg/g, (+)-katechino 0,05 mg/g - 0,82 mg/g, (-)-epikatechino 0,38 mg/g - 1,67
mg/g, rutino 0,03 mg/g - 8,85 mg/g, kvercitrino 0,61 mg/g - 9,01 mg/g [4, 45].
3.3. Obuoliuose esančių fenolinių junginių ekstrakcijos metodai
Tiriant augalinių žaliavų, maisto produktų, maisto papildų fenolinių junginių kokybinę ir
kiekybinę sudėtį, vienas svarbiausių analizės etapų yra fenolinių junginių ekstrakcija. Mėginių
ekstrakcijos procedūros dažnai yra laikomos silpnuoju analitinio metodo etapu. Klasikiniai mėginių
paruošimo metodai pasižymi ilga vykdymo trukme, dideliu sunaudojamu tirpiklių kiekiu bei yra bent
trečdalio tyrimo klaidų priežastis [43, 78].
Tiriama įvairių obuolių produktų fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis –
sulčių, sidro, išspaudų, minkštimų, žievelių bei pilnų vaisių. Mėginio ekstrakcijos metodas priklauso
nuo tiriamo objekto. Fenolinių junginių ekstrakcijai iš skystų obuolių produktų (sulčių, sidro)
plačiausiai naudojama skysčių-skysčių ekstrakcija. Tai nebrangus metodas, tačiau jam būdingas ilgas
vykdymo laikas. Tiriant skystus obuolių produktus, dažnai naudojamas kietafazės ekstrakcijos metodas
[76]. Analizuojant išspaudas, minkštimus, žieveles bei pilnus vaisius, dažniausiai naudojama kieto
mėginio ekstrakcija skysčiais ir dažnai vykdomas tolimesnis ekstrakto valymas, siekiant pašalinti
angliavandenius, chlorofilą, karotenoidus, lipidus [73, 76, 77]. Įprastus metodus keičia modernūs
ekstrakcijos metodai, tokie kaip superkritinių skysčių ekstrakcija, ekstrakcija suslėgtais skysčiais,
ekstrakcija mikrobangų pagalba, ekstrakcija ultragarso pagalba. Šie ekstrakcijos metodai reikšmingai
sumažina sunaudojamų tirpiklių kiekį, pagreitina ekstrakcijos procesą ir pagerina išeigą [76].
Fenolinių junginių ekstrakcija maceracijos metodu. Fenilkarboksi rūgščių ir kitų fenolių
(benzoinės rūgšties, benzoinės rūgšties aldehidų, cinamono rūgšties ir katechinų) ekstrakcijai iš kietų
ar puskiečių mėginių gali būti naudojama maceracija organiniais tirpikliais. Metodas reikalauja
brangių, pavojingų sveikatai ir ekologinei sistemai organinių tirpiklių. Fenolinių junginių ekstrakcijai
maceracijos būdu naudojami metanolis, etanolis, propanolis, acetonas, etilacetatas, jų tarpusavio
mišiniai ir mišiniai su vandeniu. Ekstrakcija maceracijos būdu yra ilgai trunkantis procesas. Dėl ilgos
ekstrakcijos trukmės yra tikėtinas junginių suirimas ir mažesnė fenolinių junginių ekstrakcijos išeiga.
Junginių suirimui įtakos turi šviesa ir aplinkos temperatūra. Fenolinių junginių ekstrakcijos trukmė
priklauso nuo ekstrahuojamų junginių tirpumo, jų koncentracijos ekstrahuojamame objekte, pasirinkto
13
organinio tirpiklio ir jo tūrio santykio su mėginio mase. Dėl išvardintų priežasčių maceracijos metodas
dažnai keičiamas atrankesniais, pigesniais, greitesniais ir ekologiškesniais augalinių žaliavų
ekstrakcijos metodais [76].
Fenolinių junginių ekstrakcija ultragarso pagalba. Obuolių išspaudų, obuolių ir jų
minkštimų bei žievelių ekstrakcijai dažnai naudojama ekstrakcija ultragarso pagalba [3, 69, 77].
Ultragarso savybė padidinti organinių junginių ekstrakcijos iš kietų objektų efektyvumą siejama su
kavitacijos fenomenu, kuris inicijuojamas ultragarso bangai sklindant tirpikliu. Kavitacijos metu
tirpiklyje esantys dujų burbulai dėl jų viduje staiga padidėjusio slėgio ir temperatūros sprogsta.
Kavitacinio burbulo sprogimas šalia kieto paviršiaus (pvz. ląstelės sienelės) sukelia staigų tirpiklio
judėjimą link ląstelės sienelių, taip didėjant tirpiklio skvarbumui į ląstelę bei kontaktinio paviršiaus
tarp kietos ir skystos fazės plotui. Kuriant ekstrakcijos ultragarso pagalba metodikas, optimizuojamas
ekstrahento poliškumas ir jo kiekis, mėginio masė, ekstrakcijos temperatūra ir laikas bei ultragarso
šaltinio parametrai (dažnis ir intensyvumas). Svarbiausi iš šių parametrų yra ekstrakcijos tirpiklis bei jo
santykis su vandeniu, ekstrakcijos temperatūra ir laikas [43].
Obuolių mėginių ekstrakcijai naudojant ultragarsą naudojami skirtingi tirpikliai: etanolio
ir vandens (70:30 v/v) mišinys [3], metanolio-vandens-acto rūgšties (30:69:1, v/v/v) mišinys [69].
Alonso-Salces ir kt. atlikto tyrimo metu fenolinių junginių ekstrakcija iš obuolių išspaudų vykdyta
dviem etapais. Pirmojo etapo metu vykdyta ekstrakcija ultragarso vonelėje tirpikliu naudojant
etilacetatą. Nufiltravus netirpų likutį ir iš filtrato išgarinus etilacetatą, tirpus etilacetate sausas likutis
ultragarso vonelėje ekstrahuotas dichlormetanu. Netirpus dichlormetane likutis frakcionuojamas
chromatografinėje kolonėlėje užpildytoje Sephadex LH-20 [77].
Ekstrakcija ultragarso pagalba yra vienas pigiausių, paprasčiausių, greičiausiai atliekamų
ir ekologiškiausių ekstrakcijos metodų. Dėl gero atkartojamumo, mažo sunaudojamo tirpiklių kiekio ir
žemos ekstrakcijos temperatūros ekstrakcija ultragarso pagalba pritaikoma daugybės skirtingų
biologiškai aktyvių junginių ekstrakcijai iš augalinių žaliavų [19, 99]. Metodas pritaikomas maisto,
chemijos pramonėje [47].
Fenolinių junginių ekstrakcija mikrobangų pagalba. Fenolinių junginių ekstrakcija iš
obuolių naudojant mikrobangas pasižymi pranašumu prieš tradicinius ekstrakcijos metodus, kadangi
reikšmingai sutrumpinamas ekstrakcijos laikas, sumažinamas sunaudojamų tirpiklių kiekis kartu
didėjant fenolinių junginių ekstrakcijos išeigai [17].
Ekstrakcija mikrobangų pagalba yra paremta polinių cheminių junginių gebėjimu absorbuoti
mikrobangų energiją. Mikrobangomis gali būti veikiami tik tie mėginiai, kurie savo sudėtyje turi
dipolinių medžiagų arba mikrobangų absorbentų, kurie mikrobangų poveikyje greitai didina mėginio
vidaus temperatūrą. Ekstrakcijos mikrobangų pagalba efektyvumas priklauso nuo tirpiklio bei
14
ekstrahuojamų medžiagų savybių ir ypač nuo jų dielektrinės konstantos [43]. Poliniai tirpikliai
mikrobangų aplinkoje greičiau įkaista, efektyviau ardo biologines struktūras bei pasižymi didesne
išeiga [20]. Mikrobangos gali būti naudojamos selektyviam, greitam ir lokalizuotam mėginyje esančio
vandens temperatūros padidinimui. Toks lokalus mėginio ląstelių vidaus temperatūros padidėjimas
sukelia greitą ekstrahuojamų medžiagų perėjimą į ekstrahentą [43]. Ekstrakcijos mikrobangomis
procesui įtaką daro keletas parametrų. Vystant ekstrakcijos mikrobangų pagalba metodus, įprastai
optimizuojama tirpiklio rūšis, tirpiklio tūris, mikrobangų galingumas, ekstrakcijos trukmė bei
ekstrahuojamo mėginio charakteristikos [20].
Literatūroje aprašyti fenolinių junginių ekstrakcijos iš obuolių produktų metodai naudojant
mikrobangas. Bai ir kt. [10], Rezaei ir kt. [74] bei Chandrasekar ir kt. [17] atliko tyrimus, kurių metu
atlikta fenolinių junginių ekstrakcija iš obuolių išspaudų. Tyrimų metu siekta optimizuoti fenolinių
junginių ekstrakcijos mikrobangų pagalba metodikas. Fenolinių junginių ekstrakcijos išeiga bei
metodikų parametrai buvo lyginami su kitais ekstrakcijos metodais. Tyrimų metu ekstrakcijai
naudotas 60-65 proc. (v/v) koncentracijų etanolis. Tyrimuose nustatyti panašūs optimalūs tirpiklio ir
mėginio santykiai (20:1 ir 22.9:1 (v/v)), o Chandrasekar ir kt. nustatė kitokį optimalų etanolio ir
sausos mėginio masės santykį (10.3:1 (v/m)). Optimalus ekstrakcijos laikas bei mikrobangų
galingumas varijavo: 650.4 W ir 53.7 s., 90 W ir 20 min., 735 W ir 149 s. Atitinkamai ženkliai skyrėsi
fenolinių junginių išeiga: 0.63±0.0035 mg GAE/g, 235±12 mg TAE/g, 15.8 mg GAE/g). Bai ir kt. bei
Rezaei ir kt. atliktų tyrimų metu ekstrakcija mikrobangų pagalba buvo lyginama su įprastiniais
ekstrakcijos metodais (maceracija, ekstrakcija Soksleto aparate, ekstrakcija ultragarso pagalba bei
ekstrakcija su grįžtamuoju kondensatoriumi).
Tyrimų autoriai nustatė, kad ekstrakcija mikrobangų pagalba yra pranašesnė už minėtus
metodus dėl didesnės fenolinių junginių išeigos, trumpesnės ekstrakcijos trukmės bei mažesnių
tirpiklių sąnaudų [10, 17, 74].
Fenolinių junginių ekstrakcija suslėgtais skysčiais. Ekstrakcija suslėgtais skysčiais dar
vadinama pagreitinta ekstrakcija tirpikliais, ultra aukšto slėgio ekstrakcija. Ekstrakcijos metu
naudojami įprasti organiniai tirpikliai, aukštas slėgis ir (arba) aukšta temperatūra. Ekologiški,
ekstrakcijai naudojantys vandenį, ekstrakcijos suslėgtais skysčiais metodai – ekstrakcija suslėgtu
karštu vandeniu ir ekstrakcija superkarštu vandeniu. Tai vienas iš modernių kietų mėginių ekstrakcijos
metodų. Įprastai, naudojant ekstrakciją suslėgtais skysčiais, kietas mėginys talpinamas į nerūdijančio
plieno ekstrakcijos kamerą ir ekstrahuojamas tinkamu tirpikliu, esant aukštai temperatūrai (40–200 ºC)
ir slėgiui (500-3000 psi). Ekstrakcija vykdoma trumpai (5–15 min). Ekstrahavimo pabaigoje mėginio
ekstraktas suslėgtų dujų pagalba išstumiamas į surinkimo indą [76].
15
Alonso-Salces ir kt. atliko fenolinių junginių kiekybinės ir kokybinės sudėties įvertinimą
obuolių minkštimuose ir žievelėse. Fenolinių junginių ekstrakcijai naudota ekstrakcija suslėgtais
skysčiais. Prieš ekstrakciją, siekiant sumažinti tirpiklių sąnaudas, liofilizuoti obuolių minkštimų ir
žievelių mėginiai buvo sumaišyti su dispersine medžiaga diatomitu. Ekstrakcijos tirpikliu naudotas
grynas metanolis, kadangi preliminarių tyrimų metu nustatyta, kad bet koks vandens kiekis
ekstrakcijos sistemoje mažina tyrimo tikslumą, santykinei paklaidai didėjant iki 10-20 proc. Parinkta
40 ºC ekstrakcijos temperatūra, statinės ekstrakcijos trukmė - 5 min., slėgis 1000 psi [78]. H.
Wijngaard atlikto tyrimo metu tirtas obuolių išspaudų antioksidacinis aktyvumas. Fenolinių junginių
išskyrimui naudota pagreitinta ekstrakcija tirpikliais naudojant 60 proc. (v/v) etanolį, 102 °C
temperatūrą.
Autorių duomenimis, lyginant su tradicine kietų mėginių ekstrakcija skysčiais, naudojant
ekstrakciją suslėgtais skysčiais, nustatytas 2,4 karto didesnis antioksidacinis ekstraktų aktyvumas [95].
Ekstrakcijos suslėgtais skysčiais metodo pranašumai yra mažas sunaudojamas tirpiklio kiekis, trumpa
ekstrakcijos trukmė, galimybė naudoti tirpiklius esant aukštesnei nei jų virimo temperatūrai [76, 79].
Kietafazė ekstrakcija. Kietafazė ekstrakcija yra mėginio paruošimo metodas, naudojamas
analičių ekstrakcijai iš skystos terpės, jų išskirstymui ir koncentravimui. Kietafazė ekstrakcija paremta
junginių pasiskirstymu tarp kietos sorbento fazės ir skystos mėginio fazės. Kietafazės ekstrakcijos
principas yra panašus į skysčių chromatografijos. Ekstrakcijos procesas susideda iš keturių etapų:
kolonėlės kondicionavimo, mėginio pakrovimo, plovimo, analičių eliuavimo. Ekstrakcijos proceso
vystymo metu, atsižvelgiant į analičių ir mėginio terpės savybes, būtina pasirinkti tinkamus sorbentus,
plovimo tirpalą ir eiliuavimo tirpalą, kuris turi būti suderinamas su tolesnei analizei naudojama
analitine sistema [43].
Yra optimizuotas mažos molekulinės masės fenolinių junginių ekstrakcijos iš obuolių
sidro mėginių metodas, naudojant Extra-Sep C18 kolonėlę. Fenoliniai junginiai ekstrahuojami ir
frakcionuojami į neutralius ir rūgštinius junginius. Tolimesnis skirstymas ir kokybinės bei kiekybinės
sudėties nustatymas vykdomas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu [67, 85]. Lyginant su
skysčių-skysčių ekstrakcija naudojant etilacetatą, kietafazės ekstrakcijos metodas pasižymi didesne
išeiga [67].
Lyginant su skysčių-skysčių ekstrakcija, kietafazė skystų mėginių ekstrakcija pasižymi
šiais privalumais: didesnė išeiga, efektyvesnis junginių koncentravimas, naudojami mažesni organinių
tirpiklių kiekiai, nėra putojimo ar emulsijų formavimo problemos, trumpesnė proceso vykdymo
trukmė, paprastesnis atlikimas, procesą lengviau automatizuoti. Metodo trūkumai: prastas
atkartojamumas, reikalingos brangios medžiagos [43].
16
3.4. Fenolinių junginių kiekio augalinėje žaliavoje nustatymo metodai
Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties augalinėje žaliavoje nustatymas yra
svarbus siekiant nustatyti augalinės žaliavos cheminę sudėtį bei įvertinti žaliavos kokybę. Fenolinių
junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymui yra sukurta įvairių metodų. Plačiausiai
naudojami metodai yra ultravioletinio ir regimojo spektrų sugerties spektrofotometrija, plonasluoksnė
chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija. Rečiau naudojama kapiliarinė elektroforezė,
dujų chromatografija, ciklinė voltamperometrija [2, 7].
3.4.1. Spektrofotometrinis fenolinių junginių nustatymo metodas
Spektrofotometrinis fenolinių junginių nustatymo metodas naudojant aliuminio (III)
chloridą. Metodo principas yra aliuminio (III) chlorido ir flavonų bei flavonolių komplekso
sudarymas. Aliuminio (III) chloridas geba sudaryti rūgščioje aplinkoje stabilius kompleksus,
jungdamasis su C-4 keto grupe bei su C-3 arba C-5 hidroksi grupėmis esančiomis flavonų bei
flavonolių struktūroje [18].
Aliuminio ir flavonoidų komplekso formavimas ir jų kiekio nustatymas spektrofotometru
yra dažniausiai naudojamas metodas bendram flavonoidų kiekiui nustatyti [64]. Metodas pirmą kartą
pasiūlytas 1960 m. Christ and Müller. Šiuo metu naudojamos įvairios metodo modifikacijos.
Modifikacijas galima suskirstyti į dvi pagrindines rūšis. Pirmuoju atveju naudojamas 2-10
proc. (m/v) koncentracijos AlCl3 tirpalas. Reakcija vykdoma acto rūgšties arba natrio acetato
aplinkoje. Šviesos absorbcija matuojama po 2-60 min. esant 404–430 nm šviesos bangos ilgiui.
Rezultatai išreiškiami skirtingų flavonolių (kvercetino, rutino, kvercitrino, galangino) arba katechino
ekvivalentais. Antruoju atveju kompleksacijos reakcija vykdoma bazinėje terpėje, pridėjus NaNO2.
Šios metodo modifikacijos esmė – aromatinio žiedo, turinčio katecholio grupę su laisvomis trimis ar
keturiomis pozicijomis nitrinimas. Matuojama 510 nm ilgio šviesos absorbcija. Rezultatai išreiškiami
katechino ekvivalentais [64].
Pirmasis metodas yra jautrus tik flavonoliams ir flavonui liuteolinui. Antrasis metodas,
atliekamas bazinėje terpėje, yra jautrus rutinui, liuteolinui, katechinams bei fenolinėms rūgštims.
Tiriant tuos pačius augalinės kilmės mėginius skirtingomis metodo modifikacijomis, gaunami skirtingi
rezultatai [64].
17
Spektrofotometrinis fenolinių junginių nustatymo metodas naudojant 2,4-
Dinitrofenilhidraziną. Šio metodo principas yra 2,4-dinitrofenilhidrazino gebėjimas jungtis su
ketonais ir aldehidas, sudarant 2,4-dinitrofenilhidrazonus. Reakcija vykdoma metanolio aplinkoje.
Matuojama 495 nm bangos ilgio šviesos absorbcija [18]. Reagentas naudojamas nustatyti flavonoliams
(rutinui, kvercitrinui, morinui) ir flavonams (diosminui, daflonui) [56], dihidroflavonams. Standartu
naudojamas pinocembrinas [39].
Spektrofotometrinis fenolinių junginių nustatymo metodas naudojant Folin-Ciocalteu
reagentą. Reagentą sudaro 100 ml natrio volframato dihidrato, 25 ml natrio molibdato dihidrato, 50
ml 85 proc. fosforo rūgšties tirpalo ir 100 ml 36 proc. vandenilio chlorido rūgšties tirpalo [84].
Metodas paremtas nespecifine fenolinių junginių oksidacija dviem stipriais neorganiniais oksidatoriais
(fosfomolibdato ir fosfovolframato rūgštimis) bazinėje terpėje. Reakcija vykdoma 30 min [28, 40, 64]
arba mišinys 5 min. pašildomas vandens vonioje esant 50°C [84]. Matuojama 760-765 nm bangos ilgio
šviesos absorbcija [28, 40, 84]. Naudojant šį metodą, priklausomai nuo fenolinių junginių struktūros
gaunami skirtingi rezultatai,. Folin-Ciocalteu reagentas kartu su fenoliniais junginiais gali oksiduoti ir
keletą ne fenolinių organinių junginių bei tam tikras neorganines medžiagas, taip pervertinant fenolinių
junginių kiekį mėginyje [64]. Nepaisant galimo fenolinių junginių kiekio pervertinimo, Folin-
Ciocalteu metodas labai plačiai taikomas fenolinių junginių kiekybinės sudėties įvertinimui augalinės
kilmės mėginiuose [28, 40, 64, 84]. Tai greitas, sudėtingos ir brangios įrangos nereikalaujantis
metodas.
Spektrofotometrinis fenolinių junginių nustatymo metodas naudojant Berlyno mėlynąjį.
Metodas pagrįstas fenolinių junginių reakcija su K4Fe(CN)6 ir FeCl3 rūgštiniu tirpalu. 700 nm bangos
ilgio šviesos absorbcija matuojama po 7 min [28, 30].
Taip pat aprašyta metodo modifikacija, kuomet vietoje FeCl3 kaip pirmasis reagentas
naudojamas FeNH4(SO)4 rūgštinis tirpalas. Taip išvengiama FeCl3 tirpumo problemos. Matuojama 720
nm bangos ilgio šviesos absorbcija vienos minutės intervalais [31].
3.4.2. Chromatografiniai fenolinių junginių nustatymo metodai
Iš visų augalinių žaliavų mėginių tyrimo metodų chromatografinė analizė užima vieną
svarbiausių vietų augalinių žaliavų analizės pasaulyje. Chromatografiniai analizės metodai yra randami
visose farmakopėjose. Dėl reikšmingų privalumų, tokių kaip didelis specifiškumas ir galimybė metodą
panaudoti kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymui, chromatografiniai analizės metodai dažnai
18
sudaro esminę vaistinių augalinių žaliavų mėginių analizės metodikų dalį. Fitocheminėje analizėje
dažniausiai naudojami šie chromatografiniai metodai: vienos ir dviejų krypčių popieriaus
chromatografija, vienos ir dviejų krypčių plonasluoksnė chromatografija, kolonėlinė skysčių
chromatografija, jonų mainų chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, dujų
chromatografija.
Visos chromatografijos rūšys yra paremtos tuo, kad esant tokioms pačioms sąlygoms,
kiekvienas mišinyje esantis junginys su aplinka sąveikauja skirtingai. Chromatografija yra mišinio
sudedamųjų dalių išskirstymo metodas. Judančiojoje fazėje (eliuente) esantys tiriamojo mėginio
junginiai, judėdami per nejuntančiąją (stacionarią) fazę, dėl kiekvieno junginio savitos sąveikos su
nejudančiąja faze, yra sulaikomi ant nejudančiosios fazės. Sulaikymo trukmė yra skirtinga ir specifiška
kiekvienam junginiui [15].
Efektyvioji skysčių chromatografija. Efektyvioji skysčių chromatografija yra pirmo
pasirinkimo metodas kokybinėje ir kiekybinėje fenolinių junginių analizėje. Dėl fenolinių junginių
struktūros panašumo bei didelio skirtingų junginių kiekio ESC yra vienas tinkamiausių metodų
fenolinių junginių analizei. Lyginant su įprasta kolonėline chromatografija, efektyvioji skysčių
chromatografija turi daug privalumų. Metodas pasižymi greita vykdymo trukme – mėginio analizė gali
būti įvykdoma greičiau nei per 1 valandą. ESC yra jautrus metodas, pasižymintis aukšta rezoliucija.
Galima kokybinė ir kiekybinė mėginio analizė, mėginiai nėra suardomi, reikalingas labai mažas
mėginio kiekis. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu galima analizuoti daugybę skirtingų
junginių: nukleotidus, nukleozidus, vaistus ir jų metabolitus, steroidus, alkaloidus, vitaminus, amino
rūgštis, lipidus, baltymus, antioksidantus ir daugybę kitų junginių grupių. Iš esmės bet kuris tirpus
junginys gali būti analizuojamas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu [15].
Fenolinių medžiagų išskirstymui naudojama skirtingų parametrų efektyvioji skysčių
chromatografija. Naudojamos C18 50-300 mm ilgio kolonėlės su nuo 1,8 iki 5 µm dydžio dalelėmis.
Mažiausi kolonėlių ilgiai naudojami kartu su tandemine masių spektrometrija [25, 69], kadangi tokiu
atveju nėra būtinas pilnas junginių atskyrimas ir taip gerokai sutrumpinama tyrimo trukmė [69].
Fenolinių junginių chromatografiniam išskirstymui naudojamas gradientinis eliuavimas dviejų tirpiklių
sudarytomis iš skruzdžių rūgšties – metanolio [69], amonio acetato, parūgštinto skruzdžių rūgštimi –
metanolio [25], 10 proc. (v/v) acto rūgšties vandeninio tirpalo – metanolio [77], 2 proc. (v/v) acto
rūgšties vandeninio tirpalo – 0,5 proc. (v/v) acto rūgšties vandeninio tirpalo mišinyje su acetonitrilu
(50:50, v/v) [81], 2 proc. (v/v) acto rūgšties vandeninio tirpalo – 100 proc. (v/v) acetonitrilo. [3]
Eliuavimo greitis skirtingose metodikose naudojamas nuo 0,2 ml/min. iki 1 ml/min., kolonėlės
temperatūra dažniausiai palaikoma 25°C [3, 77, 81]. Naudojant ultravioletinės spinduliuotės (UV)
detekciją, absorbcijos spektrai paprastai registruojami esant 280 nm, 320 nm, 370 nm ir 530 nm
19
bangos ilgiams. Dihidrochalkonų ir flavan-3-olių kiekiai registruojami 280 nm chromatogramoje,
fenolinių rūgščių 320 nm, flavonolių 370 nm, antocianinų kiekiai 530 nm chromatogramose [3, 77,
81].
Fenolinių junginių išskirstymui naudojant efektyviąją skysčių chromatografiją,
dažniausiai naudojami detektoriai yra diodų matricos detektorius [3], masės spektrometras (MS), diodų
matricos detektorius su masių spektrometru (DMD-MS), tandeminė masių spektrometrija (MS/MS)
[69], diodų matricos detektorius su tandemine masių spektrometrija (DMD-MS/MS) [25, 45, 69, 77,
81].
Kitaip nei detekcijai naudojant spektrofotometrinį metodą, masių spektrometro
naudojimas kartu su ESC padeda išvengti nepilno analičių atsiskyrimo sukeliamų problemų. Ši
problema ypač efektyviai sprendžiama naudojant tandeminę masių spektrometriją. ESC - MS/MS yra
naudinga siekiant patvirtinti tiriamuose ekstraktuose nustatomų junginių struktūrą [25]. Rabaneda ir kt.
2004 m. atlikto tyrimo metu ESC–MS/MS buvo pritaikyta fenolinių junginių obuolių išspaudose
kokybiniam įvertinimui. Tyrimo metu naudotas elektrosrauto jonizatorius ir trigubo kvadrupolio masių
spektrometras. Dalis junginių buvo identifikuota pilno skenavimo ESC-MS metu, o likusi dalis
junginių, kurių pirminiu skenavimu nepavyko identifikuoti, buvo nustatyti pasitelkiant MS/MS erdvėje
skenavimo režimus (prekursoriaus skenavimą, neutralaus atskilimo skenavimą, pasirinktos reakcijos
stebėjimą). Šis tyrimas įrodė galimybę pasitelkti ESC su tandemine masių spektrometrija sudėtingų
biologiškai aktyvių junginių mišinių, tokių kaip obuoliai ir jų produktai kokybinės sudėties nustatymui.
Šio tyrimo metu obuolių išspaudose identifikuota 60 fenolinių junginių, iš kurių 22, tuometinėmis
autorių žiniomis, prieš tai nebuvo nustatyti obuoliuose ar jų išspaudose [69]. Flores ir kt. 2014 m.
atlikto tyrimo metu fenolinių junginių identifikavimui bei kiekybiniam įvertinimui obuolių žievelėse,
minkštimuose ir pilnuose obuoliuose, panaudota panaši aparatūra (ultra efektyvioji skysčių
chromatografija su elektrostrauto jonizatoriumi bei trigubo kvadrupolio masių spektrometru). Tyrimo
metu kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti 22 junginiai ar jų grupės obuolių minkštimuose ir 26 junginiai
žievelėse [25].
3.4.3. Elektrocheminiai fenolinių junginių nustatymo metodai
Kapiliarinė elektroforezė. Kapiliarinė elektroforezė yra analitinis metodas, pasižymintis
efektyviu atskyrimu ir trumpa trukme. Tačiau lyginant su ESC, kapiliarinė elektroforezė yra mažiau
jautrus metodas, yra sistemos perpildymo mėginiais problema, prastesnis kiekybinių rezultatų
20
atkartojamumas. Taip pat, lyginant su ESC, ilgiau trunka metodo vystymas [7]. Junginių išskirstymui
dažniausiai naudojami elektroforetiniai metodai yra micelinė elektrokinetinė chromatografija (MEKC),
kapiliarinė elektrochromatografija (CEC) ir kapiliarinė zonų elektroforezė (CZE). Detekcijai
dažniausiai naudojama spektrofotometrija, elektrocheminė detekcija arba masių spektrometrija [44].
Youyuan Peng ir kt. atliktas tyrimas, kurio metu panaudojant kapiliarinę elektroforezę su
elektrochemine detekcija (KE-ED), buvo kiekybiškai įvertinti floridzinas, (-)-epikatechinas,
chlorogeno rūgštis ir miricitinas, esantys obuolių sultyse bei sidre. Naudojant šiame tyrime aprašytą
optimizuotą KE-ED metodiką, analitės buvo atskirtos per 20 min. naudojant 75 cm ilgio kapiliarą, 18
kV įtampą ir 50 mmol/l boratinį buferį (pH 8.7). detekcija buvo vykdoma naudojant 300 µm
skersmens anglies disko elektrodą. Analičių identifikavimo ribos varijavo nuo 1 × 10−7 iki
5 × 10−7 g/ml. Tyrimo rezultatai pademonstravo, kad KE-ED yra sėkmingai pritaikoma obuoliuose
nustatomų junginių kokybinei bei kiekybinei analizei ir pasižymi aukšta rezoliucija bei jautrumu,
patenkinamu pakartojamumu, mažomis tyrimo išlaidomis ir minimaliu reikalingu mėginio tūriu [62].
***
Literatūroje nurodoma, kad obuoliuose didžiausiais kiekiais nustatomi fenoliniai
junginiai yra chlorogeno rūgštis, (-)-epikatechinas, floridzinas. Fenolinių junginių išskyrimui iš
obuolių dažnai naudojama ekstrakcija ultragarso pagalba. Yra atlikta tyrimų, įrodančių metodo
tinkamumą ir pranašumą prieš kitus metodus, vykdant fenolinių junginių ekstrakciją iš obuolių. Dėl šių
priežasčių tyrime naudotas kitų mokslininkų optimizuotas fenolinių junginių ekstrakcijos iš obuolių
ultragarso pagalba metodas.
Fenolinių junginių kiekybinės sudėties įvertinimui obuolių mėginiuose labai dažnai
taikomas Folin-Ciocalteu metodas. Nepaisant galimai pervertinamo fenolinių junginių kiekio, tai
populiarus, paprastas ir greitai atliekamas metodas. Folin-Ciocalteu metodas leidžia palyginti fenolinių
junginių kiekius skirtingose obuolių veislėse.
Kokybinėje ir kiekybinėje fenolinių junginių analizėje pirmo pasirinkimo metodas yra
efektyvioji skysčių chromatografija. Literatūroje aprašyta daug obuolių fenolinių junginių tyrimų,
naudojant ESC metodą. Dėl šių priežasčių fenolinių junginių kokybinei ir kiekybinei analizei
obuoliuose naudotas kitų mokslininkų optimizuotas ESC metodas.
21
4. TYRIMO METODIKA
4.1. Tyrimo objektas
Tirti obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių
minkštimų ir žievelių ėminiai. Obelys auginamos Lietuvoje, Kauno r., Babtuose Lietuvos agrarinių ir
miškų mokslo centro filiale Sodininkystės ir daržininkystės institute. Tyrimui paruošti 2012 m. sezono
vaisių ėminiai.
4.2. Naudoti reagentai
Tirpikliai, standartai ir reagentai yra analitinio švarumo. Acto rūgštis, ABTS, DMCA, (-)-
epikatechino standartas, Trolox®-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksilinė rūgštis, galo
rūgšties monohidrato standartas, Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas, aliuminio chlorido heksahidratas
Sigma-Aldrich (Steinheim, Vokietija), etanolis (96,3 proc. v/v) (AB Stumbras, Lietuva), rutino
standartas (Extrasynthese, Genay, Prancūzija), natrio karbonatas, DPPH ir TPTZ (Carl Roth,
Karlsruhe, Vokietija), heksametiltetraminas, azoto rūgštis (Lachema, Neratovice, Čekija), geležies (III)
chlorido heksahidratas (Vaseline-Fabrik Rhenania, Bonn, Vokietija).
4.3. Naudota aparatūra
Obuolių minkštimai ir žievelės liofilizuoti liofilizatoriumi ZIRBUS sublimator 3x4x5/20
(Vokietija), liofilizuotas minkštimas ir žievelės sumalti, naudojant elektrinį malūną Retsch 200
(Vokietija).
Žaliavos ekstrakcija atlikta ultragarso vonelėje Bandelin Sanorex Digital 10P (Vokietija).
Spektrofotometrinė etanolinių ekstraktų analizė atlikta naudojant spektrofotometrą „Beckman DU-70“
(JAV).
Efektyvioji skysčių chromatografija atlikta naudojant Waters 2695 Alliance
chromatografinę sistemą („Waters“, Milfordas, JAV), diodų matricos detektorių Waters 2998 PDA.
Skirstymui naudota kolonėlė YMC-Pack ODS-A (250 × 4,6 mm, C18, dalelių dydis 5 µm) su
prieškolone YMC-Triart (10 × 3,0, C18, dalelių dydis 5 µm) (YMC Europe GmbH, Dinslakenas,
Vokietija). Chromatografinio skirstymo valdymas, chromatogramų registravimas, duomenų kaupimas
22
ir apdorojimas atliktas naudojantis „Empower®
2 chromatography Data Software” („Waters“,
Milfordas, JAV) programine įranga.
4.4. Tyrimo metodai
Obuolių minkštimų ir žievelių ekstraktų paruošimas. Pasveriama 2,5 g (tiksli masė)
obuolių liofilizato, užpilama 30 ml 70 proc. (v/v) etanolio ir ekstrahuojama ultragarso vonelėje 20 min.
40°C temperatūroje sandariuose stikliniuose buteliukuose. Ultragarso stipris – 480 W, dažnis – 35000
Hz. Gautas ekstraktas filtruojamas per popieriaus filtrą. Ant filtro esantis obuolių liofilizatas
praplaunamas 20 ml 70 proc. (v/v) etanolio į 50 ml matavimo kolbą, kurioje yra praskiedžiamas 70
proc. (v/v) etanoliu iki 50 ml. Prieš atliekant ESC analizę ekstraktai filtruojami per 0,22 µm porų
dydžio membraninius filtrus [3].
Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu. Bendras
fenolinių junginių kiekis nustatomas spektrofotometru, naudojant Folin-Ciocalteu reagentą.
Tirpalo A paruošimas: 1 ml tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 4 ml 96 proc. (v/v)
etanolio.
Tirpalo B paruošimas: 0,25 ml tirpalo A sumaišoma su 5 ml 10 proc. Folin-Ciocalteu
reagento ir 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalais. Lyginamasis mėginys gaminamas vietoje tirpalo A
naudojant 0,25 ml išgryninto vandens.
Gautas tirpalas paliekamas 60 min. tamsoje. Po to spektrofotometru išmatuojama 765 nm
bangos ilgio šviesos absorbcija. Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties
ekvivalentu (mg/ml) pagal kalibracijos lygtį [83].
Galo rūgšties koncentracijų intervalas 0 - 2,5 mg/ml.
y = 0,4679 x - 0,1291 R² = 0,9979
Procentinis fenolinių junginių kiekis absoliučiai sausoje žaliavoje apskaičiuojamas iš
formulės:
1000
1001
m
VXX ,
čia: X1 - bendras fenolinių junginių kiekis mg/ml;
V - tiriamos žaliavos ekstrakto gamybai naudoto ekstrahento tūris ml;
m - absoliučiai sausos žaliavos masė g.
Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu. Bendras flavonoidų
kiekis nustatomas spektrofotometru taikant reakciją su aliuminio chloridu. 1,5 ml ekstrakto sumaišoma
23
su 2 ml 96 proc. (v/v) etanolio, įpilama 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties, 1,2 ml išgryninto vandens, 0,3 ml
10 proc. aliuminio chlorido tirpalo. Po 30 min. tirpalas sumaišomas su 0,4 ml 5 proc.
heksametilentetramino tirpalo. Lyginamasis mėginys: 1,5 ml ekstrakto sumaišoma su 2 ml 96 proc.
(v/v) etanolio, įpilama 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties ir 1,9 ml išgryninto vandens. 407 nm bangos ilgio
šviesos absorbcija matuojama po sumaišymo su heksametilentetramino tirpalu. Bendras flavonoidų
kiekis išreiškiamas rutino ekvivalentu (mg/ml) pagal kalibracijos lygtį [6].
Rutino koncentracijų intervalas 0-0,175 mg/ml.
y = 5,9610x + 0,0117 R² = 0,9984
Procentinis flavonoidų kiekis absoliučiai sausoje žaliavoje apskaičiuojamas iš formulės:
1000
1001
m
VXX ,
čia: X1 - bendras flavonoidų kiekis mg/ml;
V - tiriamos žaliavos ekstrakto gamybai naudoto ekstrahento tūris ml;
m - absoliučiai sausos žaliavos masė g.
Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu. Bendras
proantocianidinų kiekis nustatytas spektrofotometru taikant reakciją su DMCA (4-
dimetilaminocinamaldehidas) etanoliniu vandenilio chlorido rūgšties tirpalu (9:1 v/v). Tiriamasis
tirpalas: 20 μl tiriamojo etanolinio ekstrakto sumaišoma su 3 ml 0,1 proc. DMCA tirpalo. Lyginamasis
tirpalas: 3 ml 0,1 proc. DMCA tirpalo sumaišoma su 20 μl išgryninto vandens. Po 5 min. matuojama
tirpalo šviesos absorbcija esant 640 nm bangos ilgio šviesai [33]. Bendras proantocianidinų kiekis
išreiškiamas (-)-epikatechino ekvivalentu (mg/ml) pagal (-)-epikatechino kalibracijos lygtį.
y = 2,4979x + 0,0053 R² = 0,9990
(-)-epikatechino koncentracijų intervalas 0 – 0,4 mg/ml
Procentinis proantocianidinų kiekis absoliučiai sausoje žaliavoje apskaičiuojamas iš
formulės:
1000
1001
m
VXX ,
čia: X1 - bendras proantocianidinų kiekis mg/ml;
V - žaliavos ekstrakto gamybai naudoto ekstrahento tūris ml;
m - absoliučiai sausos žaliavos masė g.
Spektrofotometrinis FRAP metodas. FRAP reagentas ruošiamas prieš pat darbą iš 300 mM
(pH=3,6) natrio acetato buferinio tirpalo, 10 mM TPTZ tirpalo 40 mM vandenilio chlorido rūgštyje, 20
mM geležies chlorido heksahidrato tirpalo. Jie maišomi santykiu 10:1:1. Tiriamasis tirpalas: 10 μl
tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 3 ml FRAP reagento tirpalo. Lyginamasis tirpalas: 3 ml FRAP
24
reagento tirpalo sumaišoma su 10 μl išgryninto vandens. Po 60 min. matuojama 593 nm bangos ilgio
šviesos absorbcija [11]. Antioksidantinis aktyvumas išreiškiamas μmol TE/g pagal trolokso
kalibracijos kreivę.
y = 0,6154x + 0,0012 R² = 0,9966
Trolokso koncentracijų intervalas 0 – 2 mg/ml
Absoliučiai sausos žaliavos antioksidacinis aktyvumas μmol TE/g apskaičiuojamas iš
formulės:
29.250
10001
m
VXX ,
čia: X1 - antioksidacinis aktyvumas mg TE/ml;
V - žaliavos ekstrakto gamybai naudoto ekstrahento tūris ml;
m - absoliučiai sausos žaliavos masė g.
Spektrofotometrinis ABTS metodas. Motininio ABTS radikalo tirpalo gamyba: 2 mM
ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfoninė rūgštis) ištirpinama išgrynintame vandenyje (50
ml) ir pridedama 0,7 mM kalio persulfato. Gautas tirpalas laikomas 16-17 val. tamsoje, kambario
temperatūroje, kol kalio persulfatas suoksiduoja ABTS. Reakcijos metu susidaro stabilus ABTS•+
katijonas. Motininis ABTS•+ tirpalas, apsaugotas nuo šviesos poveikio, kambario temperatūroje yra
stabilus daugiau nei 2 paras. Darbinio ABTS•+ tirpalo gamyba: ABTS•+ motininis tirpalas
skiedžiamas išgrynintu vandeniu, kol matuojant 734 nm bangos ilgio šviesos absorbciją nustatomi
0,8±0,03 absorbcijos vienetai. Tiriamojo tirpalo gamyba: 10 μl tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 3 ml
darbinio ABTS•+ tirpalo. Kaip lyginamasis tirpalas naudojamas išgrynintas vanduo. Po 60 min.
spektrofotometru matuojamas tiriamojo tirpalo šviesos absorbcijos sumažėjimas esant 734 nm bangos
ilgiui. Antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas mg TE/ml pagal trolokso kalibracinę lygtį [71].
y = -0,3246x + 0,7497 R² = 0,9972
Trolokso koncentracijų intervalas 0 – 2 mg/ml
Absoliučiai sausos žaliavos antioksidacinis aktyvumas μmol TE/g apskaičiuojamas iš
formulės:
29.250
10001
m
VXX ,
čia: X1 - antioksidacinis aktyvumas mg TE/ml;
V - žaliavos ekstrakto gamybai naudoto ekstrahento tūris ml;
m - absoliučiai sausos žaliavos masė g.
Spektrofotometrinis DPPH metodas. Darbinio DPPH tirpalo gamyba: 60 µM DPPH
tirpalas skiedžiamas 96,3 proc. (v/v) etanoliu, kol matuojant 515 nm bangos ilgio šviesos absorbciją
25
pasiekiami 0,8±0,03 absorbcijos vienetai. 10 µl tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 3 ml darbinio DPPH
tirpalo. Kaip tuščias mėginys naudojamas 96,3 proc. (v/v) etanolis. Po 30 min. matuojamas tiriamojo
tirpalo šviesos absorbcijos sumažėjimas esant 515 nm bangos ilgiui. Antioksidacinis aktyvumas
išreiškiamas mg TE/ml pagal trolokso kalibracinę lygtį [96].
y = -0,227x + 0,782 R² = 0,999
Trolokso koncentracijų intervalas 0 – 2 mg/ml
Absoliučiai sausos žaliavos antioksidacinis aktyvumas μmol TE/g apskaičiuojamas iš
formulės:
29.250
10001
m
VXX ,
čia: X1 - antioksidacinis aktyvumas mg TE/ml;
V - žaliavos ekstrakto gamybai naudoto ekstrahento tūris ml;
m - absoliučiai sausos žaliavos masė g.
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Fenolinių junginių identifikavimui bei
kiekybiniam įvertinimui naudota dviejų eliuentų sistema sudaryta iš 2 proc. (v/v) acto rūgšties tirpalo
vandenyje (eliuentas A) ir 100 proc. (v/v) acetonitrilo (eliuentas B). Gradiento kitimas: 0–30 min 3–15
proc. B, 30–45 min 15–25 proc. B, 45–50 min 25–50 proc. B, 50–55 min 50–95 proc. B. Judrios fazės
tėkmės greitis – 1 ml/min, injekcijos tūris – 10 l. Kolonėlė termostatuota 25°C temperatūroje. Chro-
matografinės smailės identifikuotos lyginant analičių ir etaloninių junginių sulaikymo laikus ir UV
absorbcijos spektrines charakteristikas ( = 200–600 nm). Identifikuotų junginių tapatybė patvirtinta
priedo metodu į tiriamąjį ekstraktą pridėjus etaloninio junginio, monitoruojant chromatografinių
smailių formos ir spektrinių charakteristikų pokyčius. Kiekinis obuolių minkštimų bei žievelių ėminių
ekstraktuose identifikuotų junginių nustatymas atliktas išorinio standarto metodu naudojantis
kiekvienai analitei sudarytais penkių lygmenų etaloninių junginių kalibravimo grafikais bei remiantis
analitės chromatografinės smailės ploto priklausomybe nuo analitės koncentracijos analizuojamame
ekstrakte. Visų obelų vaisių ir lapų ėminių ekstraktuose kiekybiškai įvertintų fenolinių junginių
koncentracijos buvo kalibravimo grafikų ribose. Dihidrochalkonų ir flavan-3-olių kiekiai
tiriamuosiuose ekstraktuose apskaičiuoti bangos ilgiui esant 280 nm, fenolinių rūgščių – 320 nm,
flavonolių – 360 nm [3].
Pektinų kiekio nustatymas gravimetriniu metodu. 2 g obuolių liofilizato (tikslus svėrinys)
talpinama į 250 ml kolbą, užpilama 80 ml 100 mM azoto rūgšties tirpalu. 10 min. palaikoma virimo
temperatūra. Kolbos turinys filtruojamas pro dvigubą marlės sluoksnį. Filtratas atvėsinamas iki 40 °C.
Į filtratą pilama 60 ml atšaldyto iki 5°C etanolio 96 proc. (v/v). Gauta masė laikoma šaldytuve (5°C) 1
26
val. Masė filtruojama pro dvigubą marlės sluoksnį. Gauta pektinų masė džiovinama iki pastovios
masės ir sveriama [45, 49, 60, 93].
Procentinis pektinų kiekis absoliučiai sausoje žaliavoje apskaičiuojamas iš formulės:
m
XX
1001
čia: X1 - pektinų masė g.;
m - absoliučiai sausos žaliavos masė g.
Duomenų analizė. Duomenų analizė ir vertinimas atliktas „MS Excel 2007“ (Microsoft,
JAV) kompiuterine programa ir „SPSS 20“ („IBM“, JAV) statistiniu paketu. Duomenys įvertinti
apskaičiavus tyrimų rezultatų matematinį vidurkį, standartinį nuokrypį ir standartinę klaidą. Siekiant
nustatyti duomenų koreliacinius ryšius, apskaičiuoti Pirsono koreliacijos koeficientai.
27
5. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas obuolių žievelių ir minkštimų
ekstraktuose spektrofotometriniu metodu
Vertinant obuolių kokybę svarbu ištirti jų cheminę sudėtį, nustatyti fenolinių junginių
kiekybinės sudėties įvairavimą. Šis parametras leidžia įvertinti obuolių kokybę. Fenolinių junginių
kiekybinės sudėties analizė svarbi obuolius vartojant ne tik mitybai, bet ir gaminant obuolių produktus
bei maisto papildus.
Atlikti Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“,
„Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių fenolinių junginių kiekybinės sudėties tyrimai. Obuolių
minkštimų ir žievelių ėminių fenolinių junginių kiekybinės sudėties tyrimui pasirinktas populiarus,
sudėtingos aparatūros nereikalaujantis spektrofotometrinis metodas naudojant Folin-Ciocalteu
reagentą.
Fenolinių junginių kiekis tirtuose Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obuolių
minkštimuose įvairuoja 1,92 - 2,60 proc. ribose. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas
„Lodel" (2,60±0,05 proc.) veislės obuolių minkštimuose. Šiek tiek mažesni kiekiai - „Auksis"
(2,44±0,04 proc.) ir „Aldas" (2,41±0,04 proc.) veislių obuolių minkštimuose. Mažiausias fenolinių
junginių kiekis nustatytas „Rajka" veislės obuolių minkštime (1,92±0,05 proc.). Labai panašūs
fenolinių junginių kiekiai nustatyti veislių „Ligol" (2,06±0,07 proc.) ir „Connel Red" (2,05±0,08 proc.)
bei „Aldas" (2,41±0,04 proc.) ir „Auksis" (2,44±0,04 proc.) minkštimuose (1 pav.).
1 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas obuolių minkštimuose (n=3)
28
Lyginant tyrimų rezultatus su kitų mokslininkų tyrimų rezultatais, galima teigti, kad JAV
populiarių obelų veislių obuolių minkštimuose nustatytas mažesnis fenolinių junginių kiekis,
įvairuojantis nuo 0,072 iki 0,168 proc. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas veislių „Red
Delicious", „Northern Spy" ir „Fortune" obuolių minkštimuose. Mažiausias - „Jonagold" ir „Empire"
minkštimuose [48].
Fenolinių junginių kiekis tirtose Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obuolių žievelėse
varijuoja 2,68 - 3,37 proc. ribose. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas veislės „Aldas"
(3,37±0,03 proc.) obuolių žievelėse. Šiek tiek mažesni kiekiai nustatyti „Auksis" (3,31±0,05 proc.) ir
„Lodel" (3,20±0,10 proc.) veislių obuolių žievelėse. Mažiausias fenolinių jugninių kiekis nustatytas
„Ligol" (2,68±0,02 proc.) žievelėse (2 pav.).
Kitų mokslininkų atlikto tyrimo metu, kurio objektas buvo JAV populiarių obelų veislių
obuolių žievelės ir minkštimai, obuolių žievelėse nustatytas mažesnis fenolinių junginių kiekis, kuris
įvairavo nuo 0,31 iki 0,59 proc. Didžiausi fenolinių junginių kiekiai nustatyti veislių „Idared" ir „Rome
Beauty" žievelėse. Mažiausi - „Cortland" ir „Golden Delicious" žievelėse [97].
2 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas obuolių žievelėse (n=3)
29
5.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas obuolių žievelių ir minkštimų
ekstraktuose spektrofotometriniu metodu
Flavonoidai yra viena didžiausių ir dažniausiai augaluose aptinkamų junginių grupių.
Vertinant augalinės žaliavos kokybę, svarbu nustatyti bendrą flavonoidų kiekį. Bendras flavonoidų
kiekis obuolių minkštimų ir žievelių ėminiuose nustatytas plačiai naudojamu, nesudėtingu metodu,
pagrįstu flavonoidų reakcija su aliuminio chloridu. Aliuminio ir flavonoidų komplekso formavimas ir
jų kiekio nustatymas spektrofotometru yra dažniausiai naudojamas metodas bendram flavonoidų
kiekiui nustatyti [64]. Metodas pirmą kartą pasiūlytas 1960 m. Christ and Müller. Mūsų tyrimo metu
naudotas modifikuotas metodas.
Nustatytas bendras flavonoidų kiekis Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų
veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių minkštimuose.
Flavonoidų kiekis tirtuose obuolių minkštimuose varijuoja 0,012 - 0,030 proc. ribose. Didžiausias
flavonoidų kiekis nustatytas „Lodel" (0,030±0,001 proc.) obuolių minkštimuose. Šiek tiek mažesnis
kiekis nustatytas „Connel Red" (0,027±0,001 proc.) veislės obuolių minkštimuose. Mažiausias kiekis -
„Ligol" (0,012±0,001 proc.) minkštimuose. Panašūs flavonoidų kiekiai nustatyti „Aldas“ (0,019±0,001
proc.), „Auksis“ (0,019±0,001 proc.) ir „Rajka“ (0,018±0,001 proc.) obuolių minkštimuose (3 pav.).
Tyrimų rezultatus lyginant su kitų mokslininkų tyrimų rezultatais, galima teigti, kad JAV
populiarių obelų veislių obuolių minkštimuose flavonoidų kiekis yra didesnis ir varijuoja 0,036 - 0,047
proc. ribose. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas „Cortland" ir „Rome Beauty" veislių
minkštimuose. Mažiausias - „Idared" veislės obuolių minkštimuose [97].
3 pav. Bendro flavonoidų kiekio įvairavimas obuolių minkštimuose (n=3)
30
Nustatytas bendras flavonoidų kiekis Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų
veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių žievelėse. Flavonoidų
kiekis tirtose obuolių žievelėse varijuoja 0,085 - 0,239 proc. ribose. Didžiausias flavonoidų kiekis
nustatytas „Aldas" (0,239±0,003 proc.) obuolių žievelėse. Mažesnis flavonoidų kiekis nustatytas
„Connel Red" (0,184±0,003 proc.) obuolių žievelėse. Veislės „Auksis" obuolių žievelėse nustatytas
mažiausias flavonoidų kiekis (0,085±0,003 proc.). Veislės „Auksis" žievelėse nustatytas 2,8 karto
mažesnis flavonoidų kiekis, nei veislės „Aldas" žievelėse. Veislių „Ligol“ (0,141±0,003 proc.),
„Rajka" (0,164±0,003 proc.) ir „Lodel“ (0,143±0,004 proc.) žievelėse nustatyti panašūs flavonoidų
kiekiai (4 pav.).
Tyrimo rezultatus lyginant su kitų mokslininkų atlikto tyrimo rezultatais, JAV populiarių
obelų veislių obuolių žievelėse nustatytas didesnis flavonoidų kiekis, kuris įvairuoja 0,167 - 0,306 proc
ribose. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas „Idared" ir „Rome Beauty" žievelėse. Mažiausias -
„Cortland" ir „Golden Delicious" obuolių žievelėse [97].
Minėto tyrimo metu bendro flavonoidų kiekio nustatymui obuolių žievelėse ir minkštimuose,
naudota reakcijos su aliuminio chloridu modifikacija, kurioje tiriamasis ekstraktas maišomas su 5 proc.
NaNO2 tirpalu, 10 proc AlCl3 ir 1 M NaOH tirpalais [97]. Tiriant tuos pačius augalinės žaliavos
mėginius skirtingomis metodo modifikacijomis, gaunami skirtingi rezultatai, todėl sudėtinga lyginti
skirtingų tyrimų rezultatus [64].
4 pav. Bendro flavonoidų kiekio įvairavimas obuolių žievelėse (n=3)
31
5.3. Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas obuolių žievelių ir minkštimų
ekstraktuose spektrofotometriniu metodu
Proantocianidinai yra gamtoje plačiai paplitusi fenolinių junginių grupė, sudaranti didžiausią
dalį su maistu ir gėrimais suvartojamų flavonoidų [94]. Proantocianidinų nustatymas atliktas
spektrofotometriniu metodu, naudojant DMCA reagentą. Tai populiarus, sudėtingos aparatūros
nereikalaujantis, paprastas ir labai greitas proantocianidinų nustatymo metodas. Lyginant su kitais
proantocianidinų nustatymui naudojamais metodais, DMCA metodas pasižymi geresniu
atkartojamumu, selektyvumu, greitesniu atlikimu [33, 94].
Nustatytas bendras proantocianidinų kiekis Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų
veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių minkštimuose.
Proantocianidinų kiekis tirtuose obuolių minkštimuose varijuoja 0,123 - 0,209 proc. ribose.
Didžiausias proantocianidinų kiekis nustatytas „Lodel" veislės minkštimuose (0,209±0,007 proc.).
Mažiausias jų kiekis nustatytas „Connel Red" veislės obuolių minkštimuose (0,122±0,006 proc.).
„Ligol“ (0,134±0,006 proc.) ir „Rajka“ (0,138±0,004 proc.) bei veislių „Aldas“ (0,151±0,007 proc.) ir
„Auksis“ (0,153±0,005 proc.) minkštimuose nustatyti beveik vienodi proantocianidinų kiekiai (5 pav.).
Nustatytas bendras proantocianidinų kiekis Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų
veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių žievelėse.
Proantocianidinų kiekis tirtose obuolių žievelių ėminių ekstraktuose varijuoja 0,170 - 0,292 proc.
ribose. Didžiausias proantocianidinų kiekis nustatytas veislės „Aldas" (0,292±0,006 proc.) obuolių
5 pav. Bendro proantocianidinų kiekio įvairavimas obuolių minkštimuose (n=3)
32
žievelėse. Panašūs, mažesni proantocianidinų kiekiai nustatyti „Auksis" (0,257±0,010 proc.) ir
„Connel Red" (0,236±0,013 proc.) veislių obuolių žievelėse. Mažiausi proantocianidinų kiekiai
nustatyti „Rajka" (0,170±0,006 proc.) ir „Ligol" (0,176±0,005 proc.) veislių obuolių žievelėse (6 pav.).
Tyrimo rezultatus lyginant su Suomijos ir JAV mokslininkų atliktų tyrimų rezultatais, galima
teigti, kad šių tyrimų metu obuoliuose nustatytas mažesnis proantocianidinų kiekis, varijuojantis nuo
0,070 iki 0,162 proc. [34, 29]. Jarkko K. ir kt. atlikto tyrimo duomenimis obuolių žievelėse
proantocianidinų nustatyta nuo 0,182 iki 0,227 proc. [34].
Kitų mokslininkų nustatyti mažesni proantocianidinų kiekiai gali būti susiję su skirtingomis
obelų auginimo technologijomis, klimatinėmis sąlygomis bei veislių skirtumais. Taip pat nustatyti
mažesni proantocianidinų kiekiai gali būti susiję su kiekybinio tyrimo metodikų skirtumais. Mūsų
atliktame tyrime naudotas DMCA reagentas, kuris yra jautrus ne tik (+)-katechino ir (-)-epikatechino
oligomerams bei polimerams, bet ir monomerams [58]. Tyrimui naudojant didesniu specifiškumu
pasižyminčius metodus, tokius kaip efektyvioji skysčių chromatografija, žaliavoje nustatomas
proantocianidinų kiekis gali būti mažesnis.
6 pav. Bendro proantocianidinų kiekio įvairavimas obuolių žievelėse (n=3)
33
5.4. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymas obuolių
minkštimuose ir žievelėse efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Kokybinė ir kiekybinė fenolinių junginių analizė atlikta efektyviosios skysčių
chromatografijos metodu. ESC pasižymi labai geru atkartojamumu, aukšta skiriamąja geba. Tai
tikslus, daugelio junginių grupių atskyrimui pritaikomas metodas, pastaruoju metu dažnai naudojamas
augalinių žaliavų ekstraktų kokybinei ir kiekybinei analizei.
ESC metodu tirti veislių „Aldas" ir „Lodel" obuolių minkštimai ir žievelės. Tyrimui
pasirinktos šios obuolių veislės, kadangi veislės „Aldas" žievelėse nustatyti didžiausi fenolinių
junginių, flavonoidų bei proantocianidinų kiekiai bei didžiausias antioksidacinis aktyvumas, o veislė
„Lodel" išsiskyrė didžiausiais minkštimuose nustatytais fenolinių junginių, flavonoidų ir
proantocianidinų kiekiais, dideliu minkštimų antioksidaciniu aktyvumu. Anksčiau nebuvo atlikta
veislės „Lodel" fenolinių junginių kokybinio ir kiekybinio tyrimo.
(a)
7 pav. Veislių Aldas (a) ir Lodel (b) žievelių ėminių etanolinių ekstraktų
chromatograma (λ=280 nm).1-procianidinas B1, 2-(+)-katechinas, 3-chlorogeno rūgštis,
4-procianidinas B2, 5-(–)-epikatechinas, 6-rutinas, 7-hiperozidas, 8-izokvercitrinas, 9-
avikuliarinas, 10-kvercitrinas, 11-floridzinas.
(b)
34
Tirtuose obuolių ekstraktuose identifikuota 11 skirtingų fenolinių junginių: chlorogeno
rūgštis, (+)-katechinas, (-)-epikatechinas, procianidinas B1, procianidinas B2, floridzinas, hiperozidas,
izokvercitrinas, avikuliarinas, kvercitrinas, rutinas (7 pav.), (8 pav.).
Kitų mokslininkų atlikto tyrimo metu obuoliuose nustatyta daugiau fenolinių junginių:
apigeninas, liuteolinas, izoramnetinas ir jo glikozidai, kemferolio glikozidai, miricetinas,
epigalokatechinas, floretinas. Šių junginių nustatyti labai maži kiekiai, naudojant ultra efektyviosios
skysčių chromatografijos su tandemine masių spektrometrija metodą [25].
„Aldas" žievelėse ir minkštimuose iš visų kiekybiškai įvertintų junginių, didžiausias kiekis
nustatytas chlorogeno rūgšties (atitinkamai 2019,31±4,28 μg/g ir 2731,74±4,35 μg/g). Veislės „Lodel"
obuolių žievelėse chlorogeno rūgšties nustatyta 2,8 karto mažiau (709,94±0,98 μg/g), nei „Aldas"
žievelėse. „Lodel" minkštimuose chlorogeno rūgšties nustatyta 1630,88±5,97 μg/g (1 lentelė).
Chlorogeno rūgštis yra vienas iš didžiausiais kiekiais nustatomų junginių obuoliuose, ypač dideliais
(a)
8 pav. Veislės „Aldas" (a) ir „Lodel" (b) minkštimų ėminių etanolinių ekstraktų
chromatograma (λ=280 nm).1-procianidinas B1, 2-(+)-katechinas, 3-chlorogeno
rūgštis, 4-procianidinas B2, 5-(–)-epikatechinas, 6-rutinas, 7-hiperozidas, 8-
izokvercitrinas, 9-avikuliarinas, 10-kvercitrinas, 11-floridzinas.
(b)
35
kiekiais nustatomas minkštime. Tokias tendencijas patvirtina kitų mokslininkų tyrimų duomenys [3,
21, 77, 78].
Didžiausias kvercetino glikozidų kiekis (1690,20 μg/g) nustatytas „Aldas" žievelėse. Veislės
„Lodel" žievelėse nustatytas mažesnis kvercetino glikozidų kiekis (1025,78 μg/g). Abiejose veislėse
didžiausiais kiekiais kaupiamas kvercetino glikozidas yra hiperozidas: „Aldas" žievelėse nustatyta
642,41±2,30 μg/g, „Lodel" žievelėse - 395,38±0,50 μg/g hiperozido. „Aldas" žievelėse aptikti didesni
kiekiai avikuliarino ir kvercitrino (atitinkamai 556,01±15,99 μg/g ir 377,10±0,11μg/g). „Lodel"
žievelėse nustatyti mažesni avikuliarino ir kvercitrino kiekiai (316,24±7,32 μg/g ir 263,94±14,42
μg/g). Abiejų veislių žievelėse nustatyti maži rutino ir izokvercitrino kiekiai (1 lentelė). „Aldas" ir
„Lodel" minkštimuose nustatyti labai maži kvercetino glikozidų kiekiai. Kvercetino glikozidai obuolių
žievelėse kaupiami daug didesniais kiekiais nei minkštime. Tokios tendencijos stebimos ir kitų
mokslininkų tyrimų rezultatuose [77, 78].
Monomeriniai flavan-3-oliai obelų veislės „Aldas" obuoliuose yra kaupiami didesniais
kiekiais žievelėse (920,61 μg/g) nei minkštimuose (574,50 μg/g). Veislės „Lodel" obuoliuose didesnis
flavan-3-olių kiekis nustatytas minkštimuose (1058,53 μg/g) nei žievelėse (662,19 μg/g). Abiejų
veislių žievelėse ir minkštimuose didžiausią dalį flavan-3-olių sudaro (-)-epikatechinas, o (+)-
Junginys, μg/g Žievelės Minkštimai
„Aldas" „Lodel" „Aldas" „Lodel"
Hiperozidas 642,41±2,30 395,38±0,50 19,27±0,44 15,89±0,12
Izokvercitrinas 86,93±1,32 26,50±0,16 9,54±0,10 1,46±0,07
Rutinas 27,76±1,35 23,72±0,64 - -
Avikuliarinas 556,01±15,99 316,24±7,32 25,93±0,67 21,48±0,09
Kvercitrinas 377,10±0,11 263,94±14,42 29,07±0,53 23,01±0,49
(+)-Katechinas 111,17±1,51 74,55±5,01 89,34±1,73 49,29±2,63
(-)-Epikatechinas 809,44±1,70 587,64±2,89 485,16±0,95 1009,24±1,99
Procianidinas B1 110,23±0,09 85,73±2,06 115,37±4,11 71,25±1,02
Procianidinas B2 948,02±11,49 736,62±9,30 839,14±3,39 1344,16±5,32
Floridzinas 236,62±2,74 235,91±0,67 131,92±1,07 386,18±1,57
Chlorogeno rūgštis 2019,31±4,28 709,94±0,98 2731,74±4,35 1630,88±5,97
Bendras junginių
kiekis 5924,99 3456,17 4487,60 4564,36
1 lentelė. Fenolinių junginių kiekiai obelų veislių „Aldas" ir „Lodel" obuolių minkštimuose ir
žievelėse (n=3)
36
katechinas obuoliuose sudaro mažą flavan-3-olių dalį (1 lentelė). Didesni (-)-epikatechino kiekiai
nustatyti ir kitų mokslininkų tyrimuose [77, 78].
Obelų veislės „Aldas" obuolių žievelėse procianidino B2 ir procianidino B1 nustatyta
atitinkamai 948,02±11,49 μg/g ir 110,23±0,09 μg/g. Minkštimuose - 839,14±3,39 μg/g ir 115,37±4,11
μg/g. Veislės „Lodel" žievelėse procianidino B2 nustatyta mažiau nei minkštimuose. Žievelėse
nustatyta 736,62±9,30 μg/g, o minkštimuose - 1344,16±5,32 μg/g procianidino B2. Procianidino B1
„Lodel" žievelėse nustatyta 71,25±1,02 μg/g, minkštimuose - 85,73±2,06 μg/g (1 lentelė). „Aldas" ir
„Lodel" minkštimuose ir žievelėse nustatytas panašus bendras proantocianidinų kiekis. Abiejų obelų
veislių obuolių žievelių ir minkštimų ėminiuose procianidino B2 nustatyta daugiau nei procianidino B1.
Tai patvirtina kitų mokslininkų atlikti fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties obuoliuose
tyrimai, kuriuose nustatomi maži procianidino B1 kiekiai arba junginys nėra identifikuojamas [3, 77,
78].
Didžiausias floridzino kiekis nustatytas obelų veislės „Lodel" obuolių minkštimuose
(386,18±1,57 μg/g). Veislės „Aldas" minkštimuose nustatytas 2,9 karto mažesnis floridzino kiekis
(131,92±1,07 μg/g). „Lodel" ir „Aldas" žievelėse nustatyti beveik vienodi floridzino kiekiai
(atitinkamai 235,91±0,67 μg/g ir 236,62±2,74 μg/g) (1 lentelė). Tyrimų rezultatus lyginant su kitų
mokslininkų tyrimų rezultatais, veislės „Lodel" minkštimuose kaupiami dideli floridzino kiekiai. Kitų
mokslininkų tyrimų duomenimis didesni floridzino kiekiai įprastai nustatomi obuolio žievelėje [21, 77,
78].
Gausiausi fenoliniai junginiai veislės Aldas žievelėse yra chlorogeno rūgštis (2019,31±4,28
μg/g), procianidinas B2 (948,02±11,49 μg/g) bei (-)-epikatechinas (809,44±1,70 μg/g). Bendras
fenolinių junginių kiekis „Aldas" žievelėse yra 5924,99 μg/g. „Lodel" žievelėse didžiausi kiekiai
nustatyti chlorogeno rūgšties (709,94±0,98 μg/g), procianidino B2 (736,62±9,30 μg/g), (-)-
epikatechino (587,64±2,89 μg/g). Bendras fenolinių junginių kiekis „Lodel" žievelėse yra 3456,17
μg/g (1 lentelė). Procentinis skirtumas tarp veislių „Aldas" ir „Lodel" žievelėse nustatyto bendro
fenolinių junginių kiekio yra 52,63 proc..
„Aldas" ir „Lodel" veislių obuolių minkštimuose didžiausiais kiekiais nustatyti tie patys
junginiai kaip ir žievelėse. Obelų veislės „Aldas" obuolių minkštimuose didžiausiais kiekiais nustatyta
chlorogeno rūgštis (2731,74±4,35 μg/g), procianidinas B2 (839,14±3,39 μg/g) ir (-)-epikatechinas
(485,16±0,95 μg/g). „Lodel" obuolių minkštimuose taip pat vyravo chlorogeno rūgštis (1630,88±5,97
μg/g), procianidinas B2 (1344,16±5,32 μg/g) bei (-)-epikatechinas (1009,24±1,99 μg/g).
Bendras fenolinių junginių kiekis „Aldas" ir „Lodel" minkštimuose yra atitinkamai 4487,60
μg/g ir 4564,36 μg/g. Procentinis skirtumas tarp veislių „Aldas" ir „Lodel" minkštimuose nustatyto
bendro fenolinių junginių kiekio yra 1,70 proc..
37
Obuolių veislės „Aldas" obuolių žievelės ir minkštimai kaupia didelius chlorogeno
rūgšties kiekius. Chlorogeno rūgštis sudaro didžiąją dalį visų veislės „Aldas" minkštimuose nustatytų
fenolinių junginių. Didelis bendras fenolinių junginių kiekis ir didelis chlorogeno rūgšties kiekis
„Aldas" veislės žievelėse yra patvirtinamas ankstesnių tyrimų duomenimis [3].
5.5. Obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas
spektrofotometriniu metodu
Antioksidaciniu aktyvumu pasižyminčių vaistinių augalinių žaliavų paieška yra aktuali.
Augalinėse žaliavose nustatomi fenoliniai junginiai yra reikalingi, siekiant palaikyti oksidacinės-
redukcinės sistemos homeostazę [14]. Organizme susidarantys laisvieji radikalai didina vėžio, širdies,
kraujagyslių ir kitų organų lėtinių ligų riziką bei skatina senėjimo procesą [12]. Norint apsaugoti
organizmą nuo laisvųjų radikalų, yra svarbu su maistu gauti pakankamai antioksidaciniu aktyvumu
pasižyminčių medžiagų. Obuoliai ir jų produktai pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis
[14]. Svarbu nustatyti Lietuvoje auginamų obelų veislių obuolių žievelių ir minkštimų antioksidacinį
aktyvumą.
Siekiant nustatyti obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“
minkštimų ir žievelių antioksidacinį aktyvumą, atlikti antioksidacinio aktyvumo tyrimai naudojant
redukcinį FRAP metodą bei ABTS ir DPPH radikalų surišimo metodus.
5.5.1. Obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo
nustatymas ABTS metodu
ABTS radikalo surišimo spektrofotometrinis metodas yra nesudėtingas, greitai atliekamas,
pasižymi geru atkartojamumu. Metodas plačiai pritaikomas įvairių objektų analizei. Metodą galima
naudoti hidrofilinių ir lipofilinių junginių analizei [9].
Nustatytas antioksidacinis aktyvumas obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“,
„Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių minkštimuose. Didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas
veislės „Auksis" (77,43±3,56 µmol TE/g) obuolių minkštimo ekstrakte. Panašus, bet mažesnis
antioksidacinis aktyvumas nustatytas „Lodel" (75,31±3,80 µmol TE/g) ir „Aldas" (73,76±2,79 µmol
38
TE/g) veislių obuolių minkštimų ekstraktuose. Mažesnis antioksidacinis aktyvumas nustatytas veislių
„Ligol“ (64,82±3,82 µmol TE/g) ir „Connel Red“ (69,17±3,24 µmol TE/g) minkštimuose. Mažiausiu
antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo „Rajka" veislės obuolių minkštimai (56,20±1,42 µmol TE/g) (9
pav.).
Nustatytas antioksidacinis aktyvumas obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“,
„Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių žievelėse. Didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas
veislės „Aldas" (119,86±3,23 µmol TE/g) obuolių žievelių ekstrakte. Labai panašus, mažesnis
antioksidacinis aktyvumas nustatytas „Auksis" (118,29±2,46 µmol TE/g) ir „Connel Red"
(117,29±1,35 µmol TE/g) veislių obuolių žievelių ekstraktuose. Mažesnis antioksidacinis aktyvumas
nustatytas veislių „Ligol“ (91,73±2,53 µmol TE/g) ir „Lodel“ (87,76±4,25 µmol TE/g) obuolių
žievelėse. Mažiausias - „Rajka" (80,41±3,26 µmol TE/g) veislės obuolių žievelėse (10 pav.).
9 pav. ABTS spektrofotometriniu metodu nustatytas obuolių minkštimų antioksidacinis
aktyvumas (n=3)
10 pav. ABTS spektrofotometriniu metodu nustatytas obuolių žievelių antioksidacinis
aktyvumas (n=3)
39
Kiti mokslininkai, obuolių antioksidaciniam aktyvumui nustatyti naudoję spektrofotometrinį
ABTS metodą, nustatė daug mažesnį antioksidacinį aktyvumą: obuolių žievelėse 19 - 45 µmol TE/g
[42], obuoliuose su žievelėmis 17 - 25 µmol TE/g [21]. Vynuogių išspaudose ABTS metodu nustatytas
193,36 - 485,42 µmol TE/g antioksidacinis aktyvumas [75].
5.5.2. Obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo
nustatymas DPPH metodu
DPPH radikalo surišimo spektrofotometrinis metodas yra plačiai naudojamas išgrynintų
fenolinių junginių bei augalinės žaliavos ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymui. Tai yra
nesudėtingas metodas. Lyginant su kitais, DPPH metodas pasižymi ilgesne vykdymo trukme, DPPH
radikalas nėra tirpus vandenyje, o mėginyje esant antocianinų antioksidacinis aktyvumas gali būti
pervertinamas. Nepaisant trūkumų, metodas yra populiarus ir pasižymi geru atkartojamumu.
Nustatytas antioksidacinis aktyvumas obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“,
„Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių minkštimuose naudojant DPPH spektrofotometrinį metodą.
Didžiausias antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas veislės „Aldas" (59,56±1,87 µmol TE/g)
minkštimuose. Labai panašus antioksidacinis aktyvumas nustatytas „Auksis" (59,53±3,27 µmol TE/g)
ir „Lodel" (58,62±2,88 µmol TE/g) obuolių minkštimuose. Mažesniu antioksidaciniu aktyvumu
pasižymėjo veislių „Connel Red“ (43,81±2,61 µmol TE/g) ir, „Ligol“ (41,56±2,64 µmol TE/g) obuolių
minkštimai. Mažiausiu - veislės „Rajka" (40,43±2,42 µmol TE/g) minkštimai (11 pav.).
11 pav. DPPH spektrofotometriniu metodu nustatytas obuolių minkštimų
antioksidacinis aktyvumas (n=3)
40
Nustatytas antioksidacinis aktyvumas obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“,
„Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių minkštimuose. Didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo
veislės „Aldas" (98,49±3,09 µmol TE/g) žievelės, o mažiausiu - veislių „Ligol" (62,87± 2,72 µmol
TE/g) ir „Rajka" (65,16±2,10 µmol TE/g) žievelės (12 pav.).
Tyrimo rezultatus lyginant su kitų mokslininkų atliktų tyrimų rezultatais, naudojant DPPH
metodą, kitų tyrimų metu nustatytas daug mažesnis antioksidacinis aktyvumas obuolių minkštime
(3,46 – 8,91 μmol TE/g) ir žievelėse (10,0 – 38,77 μmol TE/g) [91]. Vynuogių išspaudose nustatytas
didesnis antioksidacinis aktyvumas (188,02 - 505,52 µmol TE/g) [75].
DPPH metodu nustatytas antioksidacinis aktyvumas turėtų būti interpretuojamas atsargiai,
kadangi metodu nustatomi tik organiniuose tirpikliuose tirpūs antioksidantai, DPPH radikalas yra
jautrus šviesai, deguoniui, pH pokyčiams, rezultatai skiriasi naudojant skirtingus tirpiklius [59]. Dėl
DPPH radikalo erdvinės struktūros, mažos molekulės lengviau suriša DPPH radikalą [68].
5.5.3 Obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo
nustatymas FRAP metodu
FRAP spektrofotometrinis metodas yra paprastas, pigus, pasižymi geru atkartojamumu. FRAP
spektrofotometriniu metodu nustatomas tik vandenyje tirpių, rūgštinėje terpėje stabilių junginių
antioksidacinis aktyvumas. FRAP metodu nustatytas mėginio antioksidacinis aktyvumas gali stipriai
12 pav. DPPH spektrofotometriniu metodu nustatytas obuolių žievelių antioksidacinis
aktyvumas (n=3)
41
skirtis priklausomai nuo tiriamų junginių struktūros ir laiko, praėjusio nuo reakcijos pradžios -
paprastos struktūros fenoliniai junginiai su FRAP reagentu reaguoja greitai, o reakcija su daug
fenolinių grupių turinčiais junginiais gali trukti kelias valandas.
Nustatytas antioksidacinis aktyvumas obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“,
„Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių minkštimuose naudojant FRAP spektrofotometrinį metodą.
Didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas veislės „Lodel" (76,79±2,39 µmol TE/g) obuolių
minkštimuose. Tarpusavyje panašus antioksidacinis aktyvumas nustatytas veislių „Ligol" (59,36±2,42
µmol TE/g), „Connel Red“ (57,10±3,13 µmol TE/g), „Aldas" (64,92±3,32 µmol TE/g) ir „Auksis"
(65,43±2,82 µmol TE/g) obuolių minkštimuose. Mažiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas
veislės „Rajka" minkštimuose (43,61±3,01 µmol TE/g) (13 pav.).
Nustatytas antioksidacinis aktyvumas obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“,
„Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių žievelėse. Didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas
„Auksis" (117,90±2,00 µmol TE/g) ir „Aldas" (117,17±2,60 µmol TE/g) veislių obuolių žievelėse.
Mažesnis, tarpusavyje panašus, antioksidacinis aktyvumas nustatytas veislių „Ligol“ (80,94±2,67
µmol TE/g) ir „Rajka“ (87,78±2,75 µmol TE/g) žievelėse. Mažiausiu antioksidaciniu aktyvumu
pasižymėjo „Lodel" veislės obuolių žievelės (65,95±3,41 µmol TE/g) (14 pav.).
13 pav. FRAP spektrofotometriniu metodu nustatytas obuolių minkštimų antioksidacinis
aktyvumas (n=3)
42
Kitų mokslininkų duomenimis, obuolių žievelių antioksidacinis aktyvumas, nustatytas FRAP
metodu varijuoja 49,9 - 131,0 µmol TE/g ribose. Didžiausias antioksidacinis aktyvuvas nustatytas
veislės „Dolgo" žievelėse, o mažiausias - „Antanovka" žievelėse [36].
5.6. Flavonoidų, fenolinių junginių ir proantocianidinų kiekių ir antioksidacinio
aktyvumo koreliacinių ryšių vertinimas
Norint nustatyti fenolinių junginių grupes, darančias didžiausią įtaką obuolių
antioksidaciniam aktyvumui, būtina įvertinti bendro fenolinių junginių, flavonoidų ir proantocianidinų
kiekio koreliacinius ryšius su ABTS, DPPH ir FRAP metodais nustatytu antioksidaciniu aktyvumu.
Antioksidacinis
aktyvumas, µmol TE/g
Fenolinių junginių
kiekis, proc.
Flavonoidų kiekis,
proc.
Proantocianidinų
kiekis, proc.
ABTS 0,898 0,788 0,908
FRAP 0,858 0,756 0,905
DPPH 0,953 0,880 0,909
14 pav. FRAP spektrofotometriniu metodu nustatytas obuolių žievelių antioksidacinis
aktyvumas (n=3)
2 lentelė. Fenolinių junginių, flavonoidų bei proantocianidinų kiekio (proc.) obuolių minkštimuose
ir žievelėse bei antioksidacinio aktyvumo (µmol TE/g) koreliacijos koeficientai
43
Koreliacinių ryšių vertinimui apskaičiuoti Pirsono koreliacijos koeficientai (p<0,01).
Nustatyti stiprūs koreliaciniai ryšiai tarp antioksidacinio aktyvumo tirto ABTS spektrofotometriniu
metodu ir tarp bendro fenolinių junginių kiekio (0,898) bei flavonoidų kiekio (0,788) ir labai stiprūs
koreliaciniai ryšiai su proantocianidinų kiekiu (0,908). Tarp antioksidacinio aktyvumo, nustatyto
FRAP spektrofotometriniu metodu ir fenolinių junginių (0,858), flavonoidų (0,756) kiekių taip pat
nustatyti stiprūs koreliaciniai ryšiai bei labai stiprūs koreliaciniai ryšiai su proantocianidinų (0,905)
kiekiu. Tarp DPPH metodu nustatyto antioksidacinio aktyvumo ir flavonoidų kiekio nustatyti stiprūs
koreliaciniai ryšiai (0,880) ir labai stiprūs koreliaciniai ryšiai su fenoliniais junginiais (0,953) bei
proantocianidinais (0,909). Stipriausi koreliaciniai ryšiai nustatyti tarp skirtingais metodais nustatyto
obuolių žievelių bei minkštimų antioksidacinio aktyvumo ir bendro proantocianidinų kiekio (2 lentelė).
Remiantis eksperimentinių tyrimų rezultatais ir nustatytais koreliaciniais ryšiais, galima teigti,
kad didžiausią įtaką obuolių antioksidaciniam aktyvumui daro bendras fenolinių junginių ir
proantocianidinų kiekis. Tai atitinka kitų mokslininkų atliktų tyrimų rezultatus [88, 55].
5.7. Kiekybinis pektinų įvertinimas gravimetriniu metodu
Pektinai yra polisacharidai, sudaryti iš galakturono rūgšties fragmentų. Dėl gelifikuojančių
savybių pektinai naudojami maisto, farmacijos ir kosmetikos pramonėje. Viena iš pramonėje
naudojamų pektinų žaliavų yra obuoliai. Siekiant įvertinti Lietuvoje auginamų obuolių žievelių ir
minkštimų, kaip pektinų žaliavos vertę, atliktas pektinų kiekio nustatymas gravimetriniu metodu obelų
veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių minkštimuose ir
žievelėse.
Daugiausia pektinų nustatyta „Rajka" (16,2±0,6 proc.) ir „Connel Red" (14,8±0,6 proc.)
veislės obuolių žievelėse. Tarp minkštimų mažiausias pektinų kiekis nustatytas „Aldas" (10,0±0,7
proc.) ir „Lodel" (10,2±0,4 proc.) veislių minkštimuose (15 pav.).
44
Didžiausias pektinų kiekis nustatytas „Rajka" (13,3±0,5 proc.) ir „Ligol (12,2±0,6 proc.)
veislės žievelėse, o mažiausias „Connel Red" (9,9±0,6 proc.). ir „Lodel" žievelėse (9,9±0,5 proc.) (16
pav.).
Rezultatai atitinka kitų autorių tyrimų duomenis. Tiriant obuolių išspaudas, nustatyta, kad
priklausomai nuo veislės ir ekstrakcijos sąlygų pektinų kiekiai varijuoja nuo 3,4 proc. iki 15 proc. [27,
50].
16 pav. Pektinų kiekis obuolių žievelėse (n=3)
15 pav. Pektinų kiekis obuolių minkštimuose (n=3)
45
6. IŠVADOS
1. Nustatytas bendro fenolinių junginių, flavonoidų ir proantocianidinų kiekio įvairavimas obelų
veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių žievelių ir
minkštimų ėminiuose. Veislės „Aldas" obuolių žievelėse nustatyti didžiausi fenolinių junginių
(3,37±0,03 proc.), flavonoidų (0,24±0,003 proc.) ir proantocianidinų (0,29±0,006 proc.) kiekiai.
Veislės „Lodel" obuolių minkštimuose nustatyti didžiausi fenolinių junginių (2,60±0,05 proc.),
flavonoidų (0,03±0,001 proc.) ir proantocianidinų (0,21±0,007 proc.) kiekiai.
2. Atlikta obelų veislių „Aldas“ ir „Lodel“ obuolių žievelių ir minkštimų kokybinės ir kiekybinės
sudėties analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu:
a) Obelų veislių „Aldas“ ir „Lodel" obuolių žievelių ėminiuose atitinkamai nustatyta 920,61 μg/g
ir 662,19 μg/g flavan-3-olių, 1058,25 μg/g ir 822,35 μg/g proantocianidinų, 1690,20 μg/g ir
1025,78 μg/g kvercetino glikozidų, 2019,31 μg/g ir 709,94 μg/g fenolinių rūgščių, 236,62 μg/g ir
235,91 μg/g dihidrochalkonų.
b) Obelų veislių „Aldas“ ir „Lodel" obuolių minkštimų ėminiuose atitinkamai nustatyta 574,50
μg/g ir 1058,53 μg/g flavan-3-olių, 954,51 μg/g ir 1415,41 μg/g proantocianidinų, 94,93 μg/g ir
73,35 μg/g kvercetino glikozidų, 2731,74 μg/g ir 1630,88 μg/g fenolinių rūgščių, 131,92 μg/g ir
386,18 μg/g dihidrochalkonų.
3. Atliktas obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių
žievelių ir minkštimų ėminių ekstraktų antioksidacinio aktyvumo tyrimas. Didžiausias
antioksidacinis aktyvumas nustatytas obelų veislių „Auksis" (77,43±3,56 µmol TE/g), „Aldas"
(73,76±2,79 µmol TE/g) ir „Lodel" (75,31±3,80 µmol TE/g) obuolių minkštimų ėminių
ekstraktuose. Žievelių ėminių ekstraktuose didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas obelų
veislių „Aldas" (119,86±3,23 µmol TE/g), „Auksis" (118,28±2,46 µmol TE/g) ir „Connel Red"
(117,29±1,35 µmol TE/g) obuolių žievelių ėminių ekstraktuose.
4. Nustatyti stiprūs ir labai stiprūs koreliaciniai ryšiai (p<0,01) tarp bendro fenolinių junginių kiekio,
flavonoidų kiekio, proantocianidinų kiekio (proc.) ir skirtingais metodais nustatyto antioksidacinio
aktyvumo (µmol TE/g). Bendras fenolinių junginių kiekis ir antioksidacinis aktyvumas koreliuoja
0,858 - 0,953 ribose. Flavonoidų kiekis ir antioksidacinis aktyvumas koreliuoja 0,756 - 0,880
ribose. Proantocianidinų kiekis ir antioksidacinis aktyvumas koreliuoja 0,905 - 0,909 ribose.
5. Nustatytas pektinų kiekis obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir
„Lodel“ obuolių žievelėse ir minkštimuose gravimetriniu metodu. Didžiausias pektinų kiekis
nustatytas „Rajka" veislės obuolių žievelėse (13,3±0,5 proc.) ir minkštimuose (16,2±0,6 proc.).
46
7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
1. Rekomenduojame obelų veislių „Aldas" ir „Lodel" obuolius naudoti maisto produktų bei maisto
papildų gamybai. Veislių „Aldas" ir „Lodel" obuoliuose nustatytas didžiausias bendras fenolinių
junginių, flavonoidų, proantocianidinų kiekis bei didelis antioksidacinis aktyvumas.
2. Obuolius vartojant maistui arba atliekant vaisių paruošimą obuolių produktų gamybai,
rekomenduojame naudoti visą obuolį. Obuolių žievelėse nustatytas didesnis bendras fenolinių
junginių, flavonoidų, proantocianidinų kiekis ir didesnis antioksidacinis aktyvumas nei
minkštimuose.
47
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Grigas A. Lietuvos augalų vaisiai ir sėklos. Vilnius: Mokslas; 1986 p. 190.
2. Jakštas V, Janulis V, Trumbeckaitė S. Cheminis fitopreparatų tyrimas. Kaunas: KMU leidykla;
2009. p. 71-9.
3. Liaudanskas M, Viškelis P, Jakštas V, Raudonis R, Kviklys D, Milašius A, Janulis V.
Application of an optimized HPLC method for the detection of various phenolic compounds in
apples from Lithuanian cultivars. J Chem. New York. 2014; 2014.
4. Liaudanskas M, Viškelis P, Raudonis R, Kviklys D, Uselis N, Janulis V. Phenolic Composition
and Antioxidant Activity of Malus domestica Leaves. ScientificWorldJournal. 2014;
2014:306217.
5. Sikorskaite S, Gelvonauskiene D, Stanys V, Baniulis D. Characterization of microsatellite loci
in apple (Malus × domestica Borkh.) cultivars. Žemdirbystė=Agriculture. 2012;
99(2):131‒138.
6. Urbonavičiūtė A., Jakštas V., Kornyšova O., Janulis V., Maruška A. Capillary electrophoretic
analysis of flavonoids in single-styled hawthorn (Crataegus monogyna Jacq.) ethanolic
extracts. J Chromatogr. A. 2006; 1112:339-44.
7. Andersen OM, Markham KR. Flavonoids: chemistry, biochemistry, and applications. USA:
CRC Press. 2005.
8. Awad MA, Jager AD, Westing LMV. Flavonoid and chlorogenic acid levels in apple fruit:
characterisation of variation. Sci Hort. 2000 Mar; 31(3-4):249–63.
9. Awika JM, Rooney LW, Wu X, Prior RL, Cisneros-Zevallos L. Screening Methods to Measure
Antioxidant Activity of Sorghum (Sorghum bicolor) and Sorghum Products. J Agric Food
Chem. 2003 Nov 5; 51(23):6657-62.
10. Bai XL, Yue TL, Yuan YH, Zhang HW. Optimization of microwave-assisted extraction of
polyphenols from apple pomace using response surface methodology and HPLC analysis. J Sep
Sci. 2010 Dec; 33(23-24):3751-8.
11. Benzie IFF, Strain JJ. The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as a Measure of
Antioxidant Power: The FRAP Assay. Anal Chem. 1996; 239:70-6.
12. Boyer J, Liu RH. Antioxidants of Apples. N Y Fruit Q. 2003; 11(4):11-15.
13. Boyer J, Liu RH. Apple phytochemicals and their health benefits. Nutr J. 2004 May 12; 3:5.
14. Bouayed J, Hoffmann L, Bohn T. Antioxidative Mechanisms of Whole-Apple Antioxidants
Employing Different Varieties from Luxembourg. J Med Food. 2011 Dec;14(12):1631-7.
48
15. Brown P. High Pressure Liquid Chromatography – Biochemical and Biomedical Applications.
New York, London: Academic Press; 1973. p. 2-14.
16. Carrasco-Pozo C, Speisky H, Brunser O, Pastene E, Gotteland M. Apple peel polyphenols
protect against gastrointestinal mucosa alterations induced by indomethacin in rats. J Agric
Food Chem. 2011 Jun 22;59(12):6459-66.
17. Chandrasekar V, González MFS, Hirst P, Ballard TS. Optimizing Microwave-Assisted
Extraction of Phenolic Antioxidants from Red Delicious and Jonathan Apple Pomace. J Food
Process Eng. 2015.
18. Chang CC, Yang MH, Wen HM, Chern JC. Estimation of Total Flavonoid Content in Propolis
by Two Complementary Colorimetric Methods. J Food Drug Anal. 2002; 10(3):178-82.
19. Chen W, Wang WP, Zhang HS, Huang Q. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of
water-soluble polysaccharides from Boletus edulis mycelia using response surface
methodology. Carbohydr Polym. 2012; 87(1):614–9.
20. Destandau E, Michel T, Elfakir C.. Microwave-Assisted Extraction. Cambridge: RSC
Publishing; 2013.
21. Duda-Chodak A, Tarko T, Tuszyński T. Antioxidant activity of apples – an impact of maturity
stage and fruit part. Acta Sci Pol Technol Aliment. 2011 Oct-Dec; 10(4):443-54.
22. Enomoto T, Nagasako-Akazome Y, Kanda T, Ikeda M, Dake Y. Clinical effects of apply
polyphenols on persistent allergic rhinitis: A randomized double-blind placebo-controlled
parallel arm study. J Investig Allergol Clin Immunol. 2006; 16(5):283-9.
23. Escarpa A, González MC. High-performance liquid chromatography with diode-array detection
for the determination of phenolic compounds in peel and pulp from different apple varieties. J
Chromatogr A. 1998 Oct 9; 823(1–2):331–7.
24. Ferreres F, Gomes D, Valentão P, Gonçalves R, Pio, R, Alves, E et al. Improved loquat
(Eriobotrya japonica Lindl.) cultivars: variation of phenolics and antioxidative potential. Food
Chem. 2009; 114:1019-1027.
25. Flores MIA. González RR, Vidal JLM, Frenich AG. Evaluation of the Presence of Phenolic
Compounds in Different Varieties of Apple by Ultra-High-Performance Liquid
Chromatography Coupled to Tandem Mass Spectrometry. Food Anal Methods. 2015;
8(3):696–709.
26. Francini A, Sebastiani L. Phenolic Compounds in Apple (Malus x domestica Borkh.):
Compounds Characterization and Stability during Postharvest and after Processing.
Antioxidants. 2013; 2:181-93.
49
27. Garna H, Mabon N, Robert C, Cornet C, Legros H, Wathelet B et al. Effect of Extraction
Conditions on the Yield and Purity of Apple Pomace Pectin Precipitated but Not Washed by
Alcohol. J Food Sci. 2007 Jan; 72(1):C001-9.
28. González M, Guzmán B, Rudyk R, Romano E, Molina MAA. Spectrophotometric
Determination of Phenolic Compounds in Propolis. Lat Am J Pharm 2003; 22(3):243-8.
29. Gu L, Kelm MA, Hammerstone JF, Beecher G, Holden J, Haytowitz D. Concentrations of
Proanthocyanidins in Common Foods and Estimations of Normal Consumption. J Nutr. 2004
Mar;134(3):613-7.
30. Hagerman AE. Modified Prussian Blue Assay For Total Phenols. J Agric Foods Chem. 2002.
31. Hagerman AE. Prussian Blue Assay For Total Phenols. J Agric Foods Chem. 2002.
32. He RR, Wang M, Wang CZ, Chen BT, Lu CN, Yao XS. Protective effect of apple polyphenols
against stress-provoked influenza viral infection in restraint mice. J Agric Food Chem. 2011
Apr 27; 59(8):3730-7.
33. Heil M, Baumann B, Andary C, Linsenmair KE, McKey D. Extraction and quantification of
'condensed tannins' as a measure of plant anti-herbivore defence? Revisiting an old problem.
Naturwissenschaften. 2002; 89:519-24.
34. Hellström JK, Mattila PH. HPLC Determination of Extractable and Unextractable
Proanthocyanidins in Plant Materials. J Agric Food Chem. 2008 Sep 10; 56(17):7617-24.
35. Hyson DA. A Comprehensive Review of Apples and Apple Components and Their
Relationship to Human Health. Adv Nutr. 2011 Sep; 2:408-20.
36. Huber GM, Rupasinghe HP. Phenolic Profiles and Antioxidant Properties of Apple Skin
Extracts. J Food Sci. 2009 Nov-Dec; 74(9):C693-700.
37. Jackson JE. The Biology of Apples and Pears. Camrbidge university press. 2003.
38. Jain SM, Priyadarshan PM. Breeding Plantation Tree Crops: Temperate Species. New York:
Springer-Verlag. 2009 Mar 1; p. 36.
39. Jun, X. Shouqin Z. Antioxidant activity of ethanolic extracts of propolis by hydrostatic pressure
extraction. Int. J. Food Sci. Tech. 2007; 42(11):1350–6.
40. Kähkönen MP,. Hopia AI, Vuorela HJ, Rauha JP, Pihlaja K, Kujala TS et al. Antioxidant
Activity of Plant Extracts Containing Phenolic Compounds. J Agric Food Chem. 1999 Oct;
47(10):3954-62.
41. Kanda T, Akiyama H, Yanagida A, Tanabe M, Goda Y, Toyoda M et al. Inhibitory effects of
apple polyphenol on induced histamine release from RBL-2H3 cells and rat mast cells. Biosci
Biotechnol Biochem. 1998 Jul; 62(7):1284-9.
50
42. Karaman S, Tütem E, Başkan KS, Apak R. Comparison of antioxidant capacity and phenolic
composition of peel and flesh of some apple varieties. J Sci Food Agric. 2013 Mar 15;
93(4):867-75.
43. Kataoka H. New Trends in Sample Preparation for Analysis of Plant-Derived Medicines. Curr
Org Chem. 2010; 14:1698-713.
44. Khoddami A, Wilkes MA, Roberts TH. Techniques for Analysis of Plant Phenolic Compounds.
Molecules. 2013 Feb 19; 18(2):2328-75.
45. Kindt M, Orsini MC, Costantini B. Improved High-Performance Liquid Chromatography–
Diode Array Detection Method for the Determination of Phenolic Compounds in Leaves and
Peels From Different Apple Varieties. J Chromatogr Sci. 2007 Sep; 45(8):507-14.
46. Lee KW, Kim YJ, Kim DO, Lee HJ, Lee CY. Major phenolics in apple and their contribution
to the total antioxidant capacity. J Agric Food Chem. 2003 Oct 22; 51(22):6516-20.
47. Leonelli C. Mason TJ. Microwave and ultrasonic processing: now a realistic option for
industry. Chem Eng Process. Process Intensif. 2010; 49(9):885-900.
48. Liu RH, Eberhardt MV, Lee CY. Antioxidant and antiproliferative activites of selected New
York apple cultivars. N Y Fruit Q. 2001; 9:15-17.
49. Lu Y, Foo LY. Antioxidant and radical scavenging activities of polyphenols from apple
pomace. Food Chem. 2000; 68:81–85.
50. May CD. Industrial pectins: Sources, production and applications. Carbohydr Polym. 1990;
12(1): 79-99.
51. Mayanka W, Tavleen SM, Dharmesh K, Vijai KA, Bikram S. Chemical Composition and In
Vitro Cytotoxic Activity of Essential Oil of Leaves of Malus domestica Growing in Western
Himalaya (India) J Evid Based Complementary Altern Med. 2012; 2012.
52. Manzoor M, Anwar F, Saari N, Ashraf M. Variations of Antioxidant Characteristics and
Mineral Contents in Pulp and Peel of Different Apple (Malus domestica Borkh.) Cultivars from
Pakistan. Molecules. 2012 Jan 4; 17(1):390-407.
53. Maqsood A, Sabir SM, Qaisar M, Riaz M. Nutritional analysis and in-vitro antioxidant activity
of apple (Malus domestica). J Food Agric Environ. 2013; 11(3):168-72.
54. Markowski J, Płocharsk W. Determination of phenolic compounds in Apples and processed
apple products. J Fruit Ornam Plant Res. 2006; 14(2): 133-42.
55. Matthes A, Schmitz-Eiberger M. Polyphenol content and antioxidant capacity of apple fruit:
effect of cultivar and storage conditions. J Appl Bot Food Qual. 2009; 82(2):152-157.
51
56. Mir SA, Bhat AS, Ahangar AA. A simplified 2,4-dinitrophenylhydrazine assay for Flavonoids
and its comparison with a standard flavonoid assay. Int J PharmTech Res. 2014 Apr-Jun;
6(2):751-758.
57. Nagasako-Akazome Y, Kanda T, Ohtake Y, Shimasaki H, Kobayashi T. Apple polyphenols
influence cholesterol metabolism in healthy subjects with relatively high body mass index. J
Oleo Sci. 2007; 56(8):417-28.
58. Otles S. Methods of Analysis of Food Components and Additives. 2nd
ed. USA: CRC Press,
2011. p. 268.
59. Ozcelik B, Lee JH, Min DB. Effects of Light, Oxygen, and pH on The Absorbance of 2,2-
Diphenyl-1-Picrylhydrazyl. J. Food Sci. 2003; 68(2):487-490.
60. Patel RJ, Sarawade R. Analgesic activity of extracts of malus domestica (apple). WJPPS. 2015;
4(3):1240-8.
61. Patel V, Kaswala R, Chakraborty M, Kamath JV. Phytochemical and Pharmacological Profile
of Malus Domestica: An Overview. Int J Cur Biomed Phar Res. 2012; 2(2):334–8.
62. Peng Y, Liu F, Peng Y, Ye J. Determination of polyphenols in apple juice and cider by
capillary electrophoresis with electrochemical detection. Food Chem. 2005; 92(1):169–75.
63. Petkovšek MM, Stampar F, Veberic R. Increased phenolic content in apple leaves infected with
the apple scab pathogen. Journal of Plant Pathology. 2008; 90(1):49-55.
64. Pękal A, Pyrzynska K. Evaluation of Aluminium Complexation Reaction for Flavonoid
Content Assay. Food Anal Methods. 2014; 7:1776–82.
65. Phipps JB, Robertson KR, Smith PG, Rohrer JR. A checklist of the subfamily Maloideae
(Rocaceae). Can. J. Bot. 1990; 68(10):2209-69.
66. Picinelli A, Dapena E, Mangas JJ. Polyphenolic Pattern in Apple Tree Leaves in Relation to
Scab Resistance. A Preliminary Study. J Agric Food Chem. 1995; 43(8):2273–2278.
67. Picinelli A, Suarez B, Mangas JJ. Analysis of polyphenols in apple products. Z Lebensm
Unters Forsch A. 1997; 204:48-51.
68. Prior RL, Wu X, Schaich K. Standardized Methods for the Determination of Antioxidant
Capacity and Phenolics in Foods and Dietary Supplements. J Agric Food Chem. 2005 May 18;
53(10):4290-302.
69. Rabaneda FS, Ja´uregui O, Raventos RML, Viladomat F, Bastida J, Codina C. Qualitative
analysis of phenolic compounds in applepomace using liquid chromatography coupled to mass
spectrometry in tandem mode. Rapid Commun Mass Spectrom. 2004; 18(5):553-63.
70. Rasheed AM. Effect of Different Acids, Heating Time and Particle Size on Pectin Extraction
from Watermelon Rinds. Journal of Kerbala University, 2008; 6(4):236.
52
71. Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C. Antioxidant activity
applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic Biol Med.1999;
26:1231–7.
72. Reagan-Shaw S, Eggert D, Mukhtar H, Ahmad N. Antiproliferative effects of apple peel
extract against cancer cells, Nutr Cancer. 2010; 62(4):517-24.
73. Reis SF, Rai DK, Abu-Ghannam N. Water at room temperature as a solvent for the extraction
of apple pomace phenolic compounds. Food Chem. 2012 Dec 1;135(3):1991-8.
74. Rezaei S, Rezaei K, Haghighi M, Labbafi M. Solvent and Solvent to Sample Ratio as Main
Parameters in the Microwave-assisted Extraction of Polyphenolic Compounds from Apple
Pomace. Food Sci Biotechnol. 2013; 22(5):1269-74.
75. Rockenbach II , Rodrigues E, Gonzaga LV, Caliari V, Genovese MI, Gonçalves AEDSS et al.
Phenolic compounds content and antioxidant activity in pomace from selected red grapes (Vitis
vinifera L. and Vitis labrusca L.) widely produced in Brazil. Food Chem. 2011; 127(1):174-9.
76. Salas PG, Soto AM, Carretero AS, Gutiérrez AF. Phenolic-Compound-Extraction Systems for
Fruit and Vegetable Samples. Molecules. 2010 Dec 3; 15(12):8813-26.
77. Alonso-Salces RM, Barranco A, Corta E, Berrueta LA, Gallo B, Vicente F. A validated solid–
liquid extraction method for the HPLC determination of polyphenols in apple tissues
Comparison with pressurised liquid extraction. Talanta. 2005 Feb 15; 65(3):654-62.
78. Alonso-Salces RM, Korta E, Barranco A, Berrueta LA, Gallo B, Vicente F. Pressurized liquid
extraction for the determination of polyphenols in apple. J Chromatogr A. 2001 Nov 9; 933(1-
2):37-43.
79. Santos DT, Veggi PC, M. Meireles MAA. Optimization and economic evaluation of
pressurized liquid extraction of phenolic compounds from jabuticaba skins. J Food Eng. 2012
Feb; 108(3):444–52.
80. Schaefer S, Baum M, Eisenbrand G, Janzowski C. Modulation of oxidative cell damage by
reconstituted mixtures of phenolic apple juice extracts in human colon cell lines. Mol Nutr
Food Res. 2006 Apr; 50(4-5):413-7.
81. Schieber A, Keller P, Carle R. Determination of phenolic acids and flavonoids of apple and
pear by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A. 2001 Mar 2; 910(2):265-
73.
82. Singh RP, Sharad S, Kapur S. Free Radicals and Oxidative Stress in Neurodegenerative
Diseases: Relevance of Dietary Antioxidants. J Indian Acad Clin Med. 2004; 5(3):218-25.
83. Slinkard K., Singleton V. L. Total phenol analysis: Automation and comparison with manual
methods. Am J Enol Vitic. 1977; 28:49-55.
53
84. Stratil P, Kubáň V, Fojtová J. Comparison of the Phenolic Content and Total Antioxidant
Activity in Wines as Determined by Spectrophotometric Methods. Czech J Food Sci. 2008;
26(4):242–53.
85. Suarez B, Mangas JJ, Picinelli A. Solid-phase extraction and high-performance liquid
chromatographic determination of polyphenols in apple musts and ciders. J Chromatogr A.
1996; 727(2):203-9.
86. Thilakarathna SH, Rupasinghe HP, Needs PW. Apple peel bioactive rich extracts effectively
inhibit in vitro human LDL cholesterol oxidation. Food Chem. 2013 May 1; 138(1):463-70.
87. Tokura T, Nakano N, Ito T, Matsuda H, Nagasako-Akazome Y, Kanda T et al. Inhibitory effect
of polyphenol-enriched apple extracts on mast cell degranulation in vitro targeting the binding
between IgE and FcepsilonRI. Biosci Biotechnol Biochem. 2005 Oct; 69(10):1974-7.
88. Tsao R, Yang R, Xie S, Sockovie E, Khanizadeh S. Which polyphenolic compounds contribute
to the total antioxidant activities of apple? J Agric Food Chem. 2005 Jun 15; 53(12):4989-95.
89. Valverde MI, Periago MJ, Ros G. Nutritional importance of phenolic compounds in the diet.
Arch Latinoam Nutr. 2000 Mar; 50(1):5-18.
90. Veberic R, Trobec M, Herbinger K, Hofer M, Grill D, Stampar F. Phenolic compounds in some
apple (Malus domestica Borkh) cultivars of organic and integrated production. J Sci Food
Agric. 2005; 85(10):1687–94.
91. Vieiraa FGK, Borgesa GDSC, Copettia C, Pietrob PFD, Nunesc EDC, Fett R. Phenolic
compounds and antioxidant activity of the apple flesh and peel of eleven cultivars grown in
Brazil. Sci Hort. 2011; 128(3): 261–266.
92. Vrhovsek U, Rigo A, Tonon D, Mattivi F. Quantitation of polyphenols in
different apple varieties.. J Agric Food Chem. 2004 Oct; 52(21):6532–8.
93. Vriesmanna LC, Teófilo RF, Petkowicza CLO. Optimization of nitric acid-mediated extraction
of pectin from cacao pod husks (Theobroma cacao L.) using response surface methodology.
Carbohydr Polym. 2011 Apr; 84(4):1230–6.
94. Wallace TC, Giusti MM.. Evaluation of parameters that affect the 4-
dimethylaminocinnamaldehyde assay for flavanols and proanthocyanidins. J Food Sci. 2010
Sep; 75(7):C619-25.
95. Wijngaard H, Brunton N. The Optimization of Extraction of Antioxidants from Apple Pomace
by Pressurized Liquids. J. Agric Food Chem. 2009; 57(22):10625–31.
96. Williams WB, Cuvelier ME, Berset C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant
activity. LWT-Food Sci Technol. 1995; 28(1):25–30.
54
97. Wolfe K, Wu X, Liu RH. Antioxidant Activity of Apple Peels. J Agric Food Chem. 2003 Jan
29; 51(3):609-14.
98. Zhang XJ, Wang LX, Liu YL, Chen XX, Yang YZ, Zhao ZY. Differential gene expression
analysis of ‘Granny Smith’ apple (Malus domestica Borkh.) during fruit skin coloration. S Afr
J Bot. 2013 Sep; 88:125–31.
99. Zhao Y, Hou Y, Tang G, Cai E, Liu S, Yang H et al. Optimization of Ultrasonic Extraction of
Phenolic Compounds from Epimedium brevicornum Maxim Using Response Surface
Methodology and Evaluation of Its Antioxidant Activities In Vitro. J Anal Methods
Chem. 2014; 2014:864654.
100. FAOSTAT. Food and agriculture organization of the united nations statistics division. Prieiga
per internetą: http://faostat3.fao.org/browse/Q/QC/E Peržiūros data: 2014 01 16
55
9. PRIEDAI
Dalyvavimas mokslinėse konfenrencijose:
1. Gediminas Zvicevičius, Mindaugas Liaudanskas, Jonas Viškelis. Phenolic compound
quantification and antioxidant activity determination in ethanol extracts of apple pulp and
peels. The 5th
International Conference on Pharmaceutical Sciences and Pharmacy Practice.
November 22, 2014. Kaunas, Lithuania. Stendinis pranešimas.