FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKYBINĖS SUDĖTIES ...

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

GEDIMINAS ZVICEVIČIUS

FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKYBINĖS SUDĖTIES

ĮVAIRAVIMAS OBUOLIŲ ŽIEVELĖSE IR MINKŠTIMUOSE

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

Prof., habil. dr. Valdimaras Janulis

KAUNAS, 2015

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis

FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKYBINĖS SUDĖTIES ĮVAIRAVIMAS

OBUOLIŲ ŽIEVELĖSE IR MINKŠTIMUOSE

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof., habil. dr. Valdimaras Janulis

Recenzentas: Darbą atliko

Doc. dr. Andrejus Ževžikovas Magistrantas

Gediminas Zvicevičius

KAUNAS, 2015

3

TURINYS

SANTRAUKA ......................................................................................................................................... 5

SUMMARY ............................................................................................................................................. 6

1. SANTRUMPOS ................................................................................................................................... 7

2. ĮVADAS ............................................................................................................................................... 8

3. LITERATŪROS APŽVALGA .......................................................................................................... 10

3.1. Malus Mill. genties apibūdinimas ir morfologiniai požymiai ..................................................... 10

3.2. Obelų vaisių ir lapų cheminės sudėties tyrimai ........................................................................... 10

3.3. Obuoliuose esančių fenolinių junginių ekstrakcijos metodai ...................................................... 12

3.4. Fenolinių junginių kiekio augalinėje žaliavoje nustatymo metodai ............................................ 16

3.4.1. Spektrofotometrinis fenolinių junginių nustatymo metodas ................................................ 16

3.4.2. Chromatografiniai fenolinių junginių nustatymo metodai ................................................... 17

3.4.3. Elektrocheminiai fenolinių junginių nustatymo metodai ..................................................... 19

4. TYRIMO METODIKA ...................................................................................................................... 21

4.1. Tyrimo objektas ........................................................................................................................... 21

4.2. Naudoti reagentai ........................................................................................................................ 21

4.3. Naudota aparatūra ....................................................................................................................... 21

4.4. Tyrimo metodai ........................................................................................................................... 22

5. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ................................................................................................ 27

5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktuose

spektrofotometriniu metodu ............................................................................................................... 27

5.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktuose


5.3. Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktuose


5.4. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymas obuolių minkštimuose ir

žievelėse efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ................................................................. 33

5.5. Obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas


5.5.1. Obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS

metodu ............................................................................................................................................ 37

5.5.2. Obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH

metodu ............................................................................................................................................ 39

4

5.5.3 Obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas FRAP

metodu ............................................................................................................................................ 40

5.6. Flavonoidų, fenolinių junginių ir proantocianidinų kiekių ir antioksidacinio aktyvumo

koreliacinių ryšių vertinimas .............................................................................................................. 42

5.7. Kiekybinis pektinų įvertinimas gravimetriniu metodu ................................................................ 43

6. IŠVADOS ........................................................................................................................................... 45

7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ................................................................................................. 46

8. LITERATŪROS SĄRAŠAS.............................................................................................................. 47

9. PRIEDAI ............................................................................................................................................ 55

5

SANTRAUKA

G. Zvicevičiaus magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas Prof., habil. dr.Valdimaras Janulis;

Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.

Raktiniai žodžiai: Malus, obuoliai, fenoliniai junginiai, flavonoidai, proantocianidinai,

pektinai, efektyvioji skysčių chromatografija, spektrofotometrija, antioksidacinis aktyvumas.

Tyrimo objektas ir metodai: Obuolių žievelių ir minkštimų ėminių ekstraktai. Bendro

fenolinių junginių kiekio, flavonoidų ir proantocianidinų kiekio nustatymas atliktas

spektrofotometriniu metodu. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties analizė atlikta

efektyviosos skysčių chromatografijos metodu. Antioksidacinis aktyvumas nustatytas

spektrofotometriniu metodu, naudojant ABTS, DPPH, FRAP reagentus. Pektinų kiekybinė sudėtis

nustatyta gravimetriniu metodu.

Darbo tikslas: Ištirti Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų veislių obuolių

žievelių ir minkštimų fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimus bei įvertinti jų

ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai: Nustatyti obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“,

„Rajka“ ir „Lodel“ obuolių žievelių ir minkštimų bendro fenolinių junginių kiekybinės sudėties

įvairavimą. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyti obelų veislių „Aldas“ ir „Lodel“

obuolių žievelių ir minkštimų fenolinių junginių kiekybinę bei kokybinę sudėtį. Nustatyti obuolių

žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą. Įvertinti fenolinių junginių, flavonoidų,

proantocianidinų kiekybinės sudėties ir ekstraktų antioksidacinio aktyvumo koreliacinius ryšius.

Nustatyti pektinų kiekį obelų obuolių žievelių ir minkštimų ėminiuose.

Išvados: Veislės „Aldas" obuolių žievelėse nustatyti didžiausi fenolinių junginių (3,37±0,03

proc.), flavonoidų (0,24±0,003 proc.) ir proantocianidinų (0,29±0,006 proc.) kiekiai. Veislės „Lodel"

obuolių minkštimuose nustatyti didžiausi fenolinių junginių (2,60±0,05 proc.), flavonoidų (0,03±0,001

proc.) ir proantocianidinų (0,21±0,007 proc.) kiekiai. „Aldas" ir „Lodel" veislių obuolių minkštimuose

ir žievelėse efektyviosios skysčių chromatografijos metodu didžiausiais kiekiais nustatyti tie patys

junginiai (chlorogeno rūgštis, procianidinas B2, (-)-epikatechinas). Didžiausias antioksidacinis

aktyvumas nustatytas veislės „Aldas" (119,86±3,23 µmol TE/g) obuolių žievelėse. Iš minkštimų

didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo „Auksis" (77,43±3,56 µmol TE/g) minkštimai.

Stipriausias koreliacinis ryšys nustatytas tarp fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo

nustatyto DPPH metodu (0,953). Didžiausias pektinų kiekis nustatytas „Rajka" veislės obuolių

žievelėse (13,3±0,5 proc.) ir minkštimuose (16,2±0,6 proc.).

6

SUMMARY

Key words: Malus, apple, phenolics, flavonoids, proanthocyanidins, pectin, high

performance liquid chromatography, spectrophotometry, antioxidant activity.

Object and methods: Apple peel and pulp extracts. Quantitative analysis of

the total content of phenolic compounds, flavonoids and proanthocyanidins was assesed by

spectrophotometry. Qualitative and quantitative determination of phenolic compounds was performed

using high performance liquid chromatography. The antioxidant activity was assesed by ABTS, DPPH

and FRAP spectrophotometric methods. Pectin content was determined by a gravimetric method.

Aim: to determine the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds of

apple peels and pulp of apple cultivars grown in Lithuanian climatic conditions and to assess the

antioxidant activity of their extracts.

Objective: to determine of the phenolic compounds quantitative composition variation of

apple peels and pulp of apple cultivars 'Ligol', 'Connel Red', 'Aldas', 'Auksis', 'Rajka' and 'Lodel'. To

determine the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds of apple peels and pulp

of apple cultivars 'Aldas' and 'Lodel' using high performance liquid chromatography. To assess the

antioxidant activity of apple peel and pulp extracts. To evaluate the correlation between the total

phenolic, flavonoid and proanthocyanidin content in apple peels and pulp and the antioxidant activity

of their extracts. To determine the pectin content in apple peels and pulp.

Conclusions: among apple peels the highest amount of phenolic compounds (3,37±0,03%),

flavonoids (0,24±0,003%) and proanthocyanidins (0,29±0,006%) were determined in the peels of

cultivar 'Aldas'. Among apple pulp the highest amount of phenolic compounds (2,60±0,05%),

flavonoids (0,03±0,001%) and proanthocyanidins (0,21±0,007%) were determined in the peels of

cultivar 'Lodel'. 11 phenolic compounds were identified and quantified in apple peels and pulp of

cultivars 'Aldas' and 'Lodel'. Chlorogenic acid, procianydin B2 and (-)-epicatechin were the main

phenolic compounds found in both apple cultivars. The highest antioxidant activity in apple peels was

determined in cultivar 'Aldas' (119,86±3,23 µmol TE/g) and the highest antioxidant activity in apple

pulp was determined in cultivar 'Auksis' (77,43±3,56 µmol TE/g). The strongest correlation (0,953)

was determined to be between the total amount of phenolic compounds and the antioxidant activity,

determined by the DPPH method. The highest pectin amount was determined in cultivar 'Rajka' peels

(13,3±0,5%) and pulp (16,2±0,6%).

7

1. SANTRUMPOS

ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis);

DMCA – 4-dimetilaminocinamaldehidas;

DMD-MS – diodų matricos detektorius su masių spektrometru;

DMD-MS/MS – diodų matricos detektorius su tandeminine masių spektrometrija;

DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas;

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija;

FRAP – geležies redukcijos antioksidacinė galia (angl.Ferric reducing antioxidant power);

GAE – galo rūgšties ekvivalentas (angl. Gallic acid equivalent);

KE-ED – kapiliarinė elektroforezė su elektrochemine detekcija;

MS – masių spektrometras;

MS/MS – tandeminė masių spektrometrija;

TAE – tanino rūgšties ekvivalentas (angl. Tannic acid equivalent);

TE – trolokso ekvivalentas;

TPTZ – 2,4,6-tripiridil-s-triazinas;

UV – ultravioletinė spinduliuotė.

8

2. ĮVADAS

Vaistinių augalinių žaliavų, maisto produktų ir maisto papildų tyrimai yra ypač aktualūs.

Siekiant vaistines augalines žaliavas panaudoti ligų profilaktikai, būtina nustatyti profilaktinėmis ar

gydančiomis sąvybėmis pasižyminčius biologiškai aktyvius junginius bei nustatyti šių junginių

cheminės sudėties įvairavimą skirtingose augalo rūšyse ir organuose. Lėtinių ligų profilaktikai gali būti

naudojami ne tik vaistiniai augalai, bet ir biologiškai aktyvias medžiagas kaupiančios daržovės ar

vaisiai, kurie dažnai kaupia didelius kiekius fenolinių junginių, pasižyminčių antioksidaciniu

aktyvumu.

Obuoliai yra vieni svarbiausių vidutinio klimato juostoje auginamų vaisių [52, 77, 98]. 2012

m. duomenimis, visame pasaulyje yra išauginama 76.38 milijonų tonų obuolių per metus. Obuoliai yra

vieni dažniausiai Lietuvoje vartojamų vaisių. 2012 m. Lietuvoje buvo išauginta 72.5 tūkstančių tonų

obuolių [100]. Obuoliai vartojami švieži, naudojami sulčių, sidro, vyno gamyboje. Obelų vaisiai yra

angliavandenių, mineralinių medžiagų, maistinių skaidulų bei fenolinių junginių šaltinis. Obuoliai

kaupia kvercetino glikozidus, epikatechiną, chlorogeno rūgštį, procianidinus ir dihidrochalkonus. Šie

junginiai pasižymi stipriu antioksidaciniu aktyvumu in vitro [49].

Pastaraisiais metais epidemiologinių ir biocheminių tyrimų metu nustatytas reikšmingas ryšys

tarp reguliaraus vaisių ir daržovių vartojimo bei jų įtakos širdies ligų, vėžio ir kitų degeneracinių ligų

profilaktikai [35, 82, 89]. Atlikta daug mokslinių tyrimų, kurių rezultatai rodo teigiamą fenolinų

junginių poveikį žmogaus organizmui. Įrodytas priešvėžinis poveikis [72, 80], antivirusinis veikimas

prieš Herpes simplex padermes [32], antialerginis [22, 41, 87], trigliceridų ir mažo tanko lipoproteinų

kiekį mažinantis, lipidų oksidaciją slopinantis poveikis [57, 86]. Obuoliuose esantys fenoliniai

junginiai gali apsaugoti virškinamojo trakto ląsteles nuo neigiamo nesteroidinių vaistų nuo uždegimo

poveikio [16], mažina astmos ir diabeto riziką [13]. Ankstesnių, kitų mokslininkų atliktų tyrimų

rezultatai parodė, kad obuoliai pasižymi stipriomis antioksidacinėmis sąvybėmis, kurios siejamos su

fenolinių junginių kiekiu [55, 88].

Fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis obuoliuose kinta priklausomai nuo

auginimo technologijos, klimatinių sąlygų ypatymų, laikymo sąlygų ir obelų veislės. Moksliniais

tyrimais įrodyta, kad skirtingose obuolio dalyse fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis

skiriasi [24, 44, 77]. Biologiškai aktyvių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimas obuolių

žievelėse bei minkštimuose turi įtakos fenolinių junginių kiekiui obuolių produktuose. Obuoliai yra

fenolinius junginius kaupianti augalinė žaliava, panaudojama kasdienėje mityboje, maisto produktų bei

maisto papildų gamyboje. Fenolinių junginių kiekis skirtingų veislių obuoliuose ir obuolio dalyse gali

9

skirtis, todėl verta nustatyti fenolinių junginių kiekio įvairavimų dėsningumus skirtingų Lietuvoje

auginamų obelų veislių obuolių žievelėse ir minkštimuose.

Darbo tikslas:

Ištirti Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų veislių obuolių žievelių ir minkštimų

fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimus bei įvertinti jų ekstraktų antioksidacinį

aktyvumą.

Uždaviniai:

1. Nustatyti obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių

žievelių ir minkštimų bendro fenolinių junginių kiekybinės sudėties įvairavimą.

2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyti obelų veislių „Aldas“ ir „Lodel“

obuolių žievelių ir minkštimų fenolinių junginių kiekybinę bei kokybinę sudėtį.

3. Nustatyti obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių

žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.

4. Įvertinti fenolinių junginių, flavonoidų, proantocianidinų kiekybinės sudėties ir ekstraktų

antioksidacinio aktyvumo koreliacinius ryšius.

5. Nustatyti pektinų kiekį obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir

„Lodel“ obuolių žievelių ir minkštimų ėminiuose.

10

3. LITERATŪROS APŽVALGA

3.1. Malus Mill. genties apibūdinimas ir morfologiniai požymiai

Obels (Malus Mill.) gentis priklauso erškėtinių (Rosaceae) šeimai. Malus Mill. gentis

plačiai paplitusi pasaulyje, ypač vidutinio klimato juostoje [52]. Gentį sudaro 55 rūšys, iš kurių

Europoje labiausiai paplitusi naminė obelis (Malus domestica Borkh.) ir miškinė obelis (Malus

sylvestris Mill.) [38,65].

M. domestica Borkh. geba prisitaikyti prie įvairių klimato sąlygų, tačiau geriausiai auga

vėsesnio klimato juostoje (35-50° šiaurės platumos), vandeniui pralaidžioje dirvoje, kurios pH 6-7.

Obelis auga šiauriau nei daugelis kitų vaismedžių dėl vėlyvo žydėjimo bei didelio atsparumo šalčiui.

Vaisiai sunoksta praėjus 120 – 150 dienų nuo žydėjimo pabaigos. Yra rūšių, kurios sunokina vaisius

po 70 ar po 180 dienų [61].

Obelys yra vasaržaliai, daugiamečiai medžiai, užaugantys iki 3 – 12 m. aukščio. Lapai

tamsiai žalios spalvos, ovalūs, dantytu kraštu, smailia viršūne. 5-12 cm ilgio, 3-6 cm pločio [61].

Obelų žiedai turi 5 taurėlapius ir 5 vainiklapius, kurių spalva gali kisti nuo baltos iki ryškiai rausvos

[37], skersmuo 2,5-3,5 cm [61]. 20 kuokelių su geltonomis dulkinėmis yra išsidėstę trimis ratais

(10+5+5). Mezginė apatinė su 3-5 lizdais. Liemenėliai penki, tarpusavyje suaugę [37]. Sėklų skaičius

yra 5 – 15 [61], nors tam tikros atmainos gali išauginti iki 30 sėklų [37].

Obuoliai priklausomai nuo veislės yra labai įvairios, dažniausiai rutuliškos formos [1] ir

labai įvairaus dydžio (nuo 5 cm iki 9 cm ir daugiau) [61], įvairių spalvų ir skonio, su išliekančiais

taurėlapiais viršuje. Sėklos pailgai kiaušiniškos, iš šonų suplotos, dažniausiai vienu lygiu ar įgaubtu

šonu, kitu – išgaubtu, pilkai rudos spalvos, matiniu, truputi blizgančiu paviršiumi, 6-7 mm ilgio, 3,5-

4,5 mm pločio, 1,8-2,1 mm storio [1].

3.2. Obelų vaisių ir lapų cheminės sudėties tyrimai

Yra atlikta daug obuolių cheminės sudėties tyrimų. Daugumoje tyrimų nustatomas

bendras fenolinių junginių kiekis obuoliuose. Dažnai nustatoma fenolinių junginių grupių arba atskirų

junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis. Dalies tyrimų objektas yra obuolių žievelės ir minkštimai.

Rečiau tiriamos obuolių sėklos ir obelų lapai.

11

Skirtingų obelų veislių obuoliuose nustatoma skirtinga fenolinių junginių kokybinė ir

kiekybinė sudėtis. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties pokyčiams obuoliuose

didžiausią įtaką daro augalo genotipas, vaisiaus subrendimo lygis ir mažiau klimatiniai aplinkos

veiksniai [61]. Obuoliuose kaupiami fenoliniai junginiai skirstomi į du pagrindinius pogrupius:

flavonoidus ir fenolines rūgštis. Svarbiausi obuoliuose nustatyti flavonoidai yra kvercetino glikozidai

(avikuliarinas, hiperozidas, izokvercitrinas, kvercitrinas, rutinas, kvercetino-3-O-ksilozidas,

kvercetino-3-O-arabinozidas), flavan-3-oliai - (+)-katechinas ir (−)-epikatechinas bei jų oligomerai -

procianidinai B1, B2 ir C1, polimeriniai procianidinai, dihidrochalkonai – floridzinas ir floretinas [3,

46,78]. Obuoliuose nustatytos fenolinės rūgštys: chlorogeno rūgštis bei p-kumarokvinino rūgštis [3,

54].

Literatūroje nurodoma, kad obuoliuose fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis

gali įvairuoti. Bendras fenolinių junginių kiekis gali įvairuoti nuo 662 µg/g iki 4291 µg/g [3, 92].

Kvercetino glikozidų nustatyta 41,0 µg/g - 87,0 µg/g [54], (+)-katechino 50,1 µg/g – 148,2 µg/g, (−)-

epikatechino 236,5 µg/g – 684,0 µg/g, procianidino B1 39,6 µg/g – 108,1 µg/g, procianidino B2 320,9

µg/g – 931,2 µg/g, floridzino 63,8 µg/g - 142,4 µg/g, chlorogeno rūgšties 341,3 µg/g – 2228,4 µg/g [3,

46].

Obuolių žievelėse vyraujantys fenoliniai junginiai yra procianidinai, (+)-katechinas, (−)-

epikatechinas, chlorogeninė rūgštis, floridzinas, floretino-29-ksilozidas, kvercetino glikozidai,

cianidin-3-O-galaktozidas [23, 26, 78]. Minkštimuose nustatyti mažesni, nei žievelėse (+)-katechino,

(−)-epikatechino, procianidinų kiekiai. Obuolių minkštimuose chlorogeno rūgštis nustatoma didesniais

kiekiais, nei žievelėse [8, 46, 78]. Fenolinių junginių kiekybinė sudėtis yra didesnė obuolių žievelėse,

tačiau žievelės sudaro iki 10 proc. obuolių masės. Svarbesni yra obuolių minkštimai, nes jie sudaro

didžiąją dalį obuolių masės [90].

Obuoliuose nustatyta pektinų - polisacharidų, sudarytų iš galakturono rūgšties

fragmentų. Dėl gelifikuojančių savybių pektinai naudojami maisto, farmacijos ir kosmetikos

pramonėje. Viena iš pramonėje naudojamų pektinų žaliavų yra obuoliai. Pektinų kiekiai obuoliuose,

priklausomai nuo veislės ir ekstrakcijos sąlygų kinta nuo 3.4 proc. iki 15 proc. absoliučiai sausos

žaliavos masės [27, 50].

Obelų lapuose nustatyti fenoliniai junginiai yra floridzinas, 3-hidroksifloridzinas, hiperozidas,

izokvercitrinas, kvercetino-3-O-ksilozidas, kvercetino-3-O-galaktozidas, avikuliarinas, apigeninas,

mirecetinas, rutinas, kvercitrinas, kemferolis, izoramnetinas, (+)-katechinas, (-)-epikatechinas,

chlorogeno rūgštis, kavos rūgštis [4, 63, 66]. Iš obelų lapų išskirti ir identifikuoti triterpenai (ursolo ir

oleaninė rūgštys), karotenoidai (α- tokoferolis) ir eteriniai aliejai (eukaliptolis, fitolis ir α-farnesenas)

[51]. Literatūros duomenimis, obelų lapuose fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis gali

12

įvairuoti. Bendras fenolinių junginių kiekis gali įvairuoti nuo 58,28 mg/g iki 163,35 mg/g [4, 45].

Floridzino nustatyta 54,1 mg/g - 140,0 mg/g [4, 63], chlorogeno rūgšties 0,11 mg/g - 1,38 mg/g, kavos

rūgšties 0,14 mg/g - 0,30 mg/g, (+)-katechino 0,05 mg/g - 0,82 mg/g, (-)-epikatechino 0,38 mg/g - 1,67

mg/g, rutino 0,03 mg/g - 8,85 mg/g, kvercitrino 0,61 mg/g - 9,01 mg/g [4, 45].

3.3. Obuoliuose esančių fenolinių junginių ekstrakcijos metodai

Tiriant augalinių žaliavų, maisto produktų, maisto papildų fenolinių junginių kokybinę ir

kiekybinę sudėtį, vienas svarbiausių analizės etapų yra fenolinių junginių ekstrakcija. Mėginių

ekstrakcijos procedūros dažnai yra laikomos silpnuoju analitinio metodo etapu. Klasikiniai mėginių

paruošimo metodai pasižymi ilga vykdymo trukme, dideliu sunaudojamu tirpiklių kiekiu bei yra bent

trečdalio tyrimo klaidų priežastis [43, 78].

Tiriama įvairių obuolių produktų fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis –

sulčių, sidro, išspaudų, minkštimų, žievelių bei pilnų vaisių. Mėginio ekstrakcijos metodas priklauso

nuo tiriamo objekto. Fenolinių junginių ekstrakcijai iš skystų obuolių produktų (sulčių, sidro)

plačiausiai naudojama skysčių-skysčių ekstrakcija. Tai nebrangus metodas, tačiau jam būdingas ilgas

vykdymo laikas. Tiriant skystus obuolių produktus, dažnai naudojamas kietafazės ekstrakcijos metodas

[76]. Analizuojant išspaudas, minkštimus, žieveles bei pilnus vaisius, dažniausiai naudojama kieto

mėginio ekstrakcija skysčiais ir dažnai vykdomas tolimesnis ekstrakto valymas, siekiant pašalinti

angliavandenius, chlorofilą, karotenoidus, lipidus [73, 76, 77]. Įprastus metodus keičia modernūs

ekstrakcijos metodai, tokie kaip superkritinių skysčių ekstrakcija, ekstrakcija suslėgtais skysčiais,

ekstrakcija mikrobangų pagalba, ekstrakcija ultragarso pagalba. Šie ekstrakcijos metodai reikšmingai

sumažina sunaudojamų tirpiklių kiekį, pagreitina ekstrakcijos procesą ir pagerina išeigą [76].

Fenolinių junginių ekstrakcija maceracijos metodu. Fenilkarboksi rūgščių ir kitų fenolių

(benzoinės rūgšties, benzoinės rūgšties aldehidų, cinamono rūgšties ir katechinų) ekstrakcijai iš kietų

ar puskiečių mėginių gali būti naudojama maceracija organiniais tirpikliais. Metodas reikalauja

brangių, pavojingų sveikatai ir ekologinei sistemai organinių tirpiklių. Fenolinių junginių ekstrakcijai

maceracijos būdu naudojami metanolis, etanolis, propanolis, acetonas, etilacetatas, jų tarpusavio

mišiniai ir mišiniai su vandeniu. Ekstrakcija maceracijos būdu yra ilgai trunkantis procesas. Dėl ilgos

ekstrakcijos trukmės yra tikėtinas junginių suirimas ir mažesnė fenolinių junginių ekstrakcijos išeiga.

Junginių suirimui įtakos turi šviesa ir aplinkos temperatūra. Fenolinių junginių ekstrakcijos trukmė

priklauso nuo ekstrahuojamų junginių tirpumo, jų koncentracijos ekstrahuojamame objekte, pasirinkto

13

organinio tirpiklio ir jo tūrio santykio su mėginio mase. Dėl išvardintų priežasčių maceracijos metodas

dažnai keičiamas atrankesniais, pigesniais, greitesniais ir ekologiškesniais augalinių žaliavų

ekstrakcijos metodais [76].

Fenolinių junginių ekstrakcija ultragarso pagalba. Obuolių išspaudų, obuolių ir jų

minkštimų bei žievelių ekstrakcijai dažnai naudojama ekstrakcija ultragarso pagalba [3, 69, 77].

Ultragarso savybė padidinti organinių junginių ekstrakcijos iš kietų objektų efektyvumą siejama su

kavitacijos fenomenu, kuris inicijuojamas ultragarso bangai sklindant tirpikliu. Kavitacijos metu

tirpiklyje esantys dujų burbulai dėl jų viduje staiga padidėjusio slėgio ir temperatūros sprogsta.

Kavitacinio burbulo sprogimas šalia kieto paviršiaus (pvz. ląstelės sienelės) sukelia staigų tirpiklio

judėjimą link ląstelės sienelių, taip didėjant tirpiklio skvarbumui į ląstelę bei kontaktinio paviršiaus

tarp kietos ir skystos fazės plotui. Kuriant ekstrakcijos ultragarso pagalba metodikas, optimizuojamas

ekstrahento poliškumas ir jo kiekis, mėginio masė, ekstrakcijos temperatūra ir laikas bei ultragarso

šaltinio parametrai (dažnis ir intensyvumas). Svarbiausi iš šių parametrų yra ekstrakcijos tirpiklis bei jo

santykis su vandeniu, ekstrakcijos temperatūra ir laikas [43].

Obuolių mėginių ekstrakcijai naudojant ultragarsą naudojami skirtingi tirpikliai: etanolio

ir vandens (70:30 v/v) mišinys [3], metanolio-vandens-acto rūgšties (30:69:1, v/v/v) mišinys [69].

Alonso-Salces ir kt. atlikto tyrimo metu fenolinių junginių ekstrakcija iš obuolių išspaudų vykdyta

dviem etapais. Pirmojo etapo metu vykdyta ekstrakcija ultragarso vonelėje tirpikliu naudojant

etilacetatą. Nufiltravus netirpų likutį ir iš filtrato išgarinus etilacetatą, tirpus etilacetate sausas likutis

ultragarso vonelėje ekstrahuotas dichlormetanu. Netirpus dichlormetane likutis frakcionuojamas

chromatografinėje kolonėlėje užpildytoje Sephadex LH-20 [77].

Ekstrakcija ultragarso pagalba yra vienas pigiausių, paprasčiausių, greičiausiai atliekamų

ir ekologiškiausių ekstrakcijos metodų. Dėl gero atkartojamumo, mažo sunaudojamo tirpiklių kiekio ir

žemos ekstrakcijos temperatūros ekstrakcija ultragarso pagalba pritaikoma daugybės skirtingų

biologiškai aktyvių junginių ekstrakcijai iš augalinių žaliavų [19, 99]. Metodas pritaikomas maisto,

chemijos pramonėje [47].

Fenolinių junginių ekstrakcija mikrobangų pagalba. Fenolinių junginių ekstrakcija iš

obuolių naudojant mikrobangas pasižymi pranašumu prieš tradicinius ekstrakcijos metodus, kadangi

reikšmingai sutrumpinamas ekstrakcijos laikas, sumažinamas sunaudojamų tirpiklių kiekis kartu

didėjant fenolinių junginių ekstrakcijos išeigai [17].

Ekstrakcija mikrobangų pagalba yra paremta polinių cheminių junginių gebėjimu absorbuoti

mikrobangų energiją. Mikrobangomis gali būti veikiami tik tie mėginiai, kurie savo sudėtyje turi

dipolinių medžiagų arba mikrobangų absorbentų, kurie mikrobangų poveikyje greitai didina mėginio

vidaus temperatūrą. Ekstrakcijos mikrobangų pagalba efektyvumas priklauso nuo tirpiklio bei

14

ekstrahuojamų medžiagų savybių ir ypač nuo jų dielektrinės konstantos [43]. Poliniai tirpikliai

mikrobangų aplinkoje greičiau įkaista, efektyviau ardo biologines struktūras bei pasižymi didesne

išeiga [20]. Mikrobangos gali būti naudojamos selektyviam, greitam ir lokalizuotam mėginyje esančio

vandens temperatūros padidinimui. Toks lokalus mėginio ląstelių vidaus temperatūros padidėjimas

sukelia greitą ekstrahuojamų medžiagų perėjimą į ekstrahentą [43]. Ekstrakcijos mikrobangomis

procesui įtaką daro keletas parametrų. Vystant ekstrakcijos mikrobangų pagalba metodus, įprastai

optimizuojama tirpiklio rūšis, tirpiklio tūris, mikrobangų galingumas, ekstrakcijos trukmė bei

ekstrahuojamo mėginio charakteristikos [20].

Literatūroje aprašyti fenolinių junginių ekstrakcijos iš obuolių produktų metodai naudojant

mikrobangas. Bai ir kt. [10], Rezaei ir kt. [74] bei Chandrasekar ir kt. [17] atliko tyrimus, kurių metu

atlikta fenolinių junginių ekstrakcija iš obuolių išspaudų. Tyrimų metu siekta optimizuoti fenolinių

junginių ekstrakcijos mikrobangų pagalba metodikas. Fenolinių junginių ekstrakcijos išeiga bei

metodikų parametrai buvo lyginami su kitais ekstrakcijos metodais. Tyrimų metu ekstrakcijai

naudotas 60-65 proc. (v/v) koncentracijų etanolis. Tyrimuose nustatyti panašūs optimalūs tirpiklio ir

mėginio santykiai (20:1 ir 22.9:1 (v/v)), o Chandrasekar ir kt. nustatė kitokį optimalų etanolio ir

sausos mėginio masės santykį (10.3:1 (v/m)). Optimalus ekstrakcijos laikas bei mikrobangų

galingumas varijavo: 650.4 W ir 53.7 s., 90 W ir 20 min., 735 W ir 149 s. Atitinkamai ženkliai skyrėsi

fenolinių junginių išeiga: 0.63±0.0035 mg GAE/g, 235±12 mg TAE/g, 15.8 mg GAE/g). Bai ir kt. bei

Rezaei ir kt. atliktų tyrimų metu ekstrakcija mikrobangų pagalba buvo lyginama su įprastiniais

ekstrakcijos metodais (maceracija, ekstrakcija Soksleto aparate, ekstrakcija ultragarso pagalba bei

ekstrakcija su grįžtamuoju kondensatoriumi).

Tyrimų autoriai nustatė, kad ekstrakcija mikrobangų pagalba yra pranašesnė už minėtus

metodus dėl didesnės fenolinių junginių išeigos, trumpesnės ekstrakcijos trukmės bei mažesnių

tirpiklių sąnaudų [10, 17, 74].

Fenolinių junginių ekstrakcija suslėgtais skysčiais. Ekstrakcija suslėgtais skysčiais dar

vadinama pagreitinta ekstrakcija tirpikliais, ultra aukšto slėgio ekstrakcija. Ekstrakcijos metu

naudojami įprasti organiniai tirpikliai, aukštas slėgis ir (arba) aukšta temperatūra. Ekologiški,

ekstrakcijai naudojantys vandenį, ekstrakcijos suslėgtais skysčiais metodai – ekstrakcija suslėgtu

karštu vandeniu ir ekstrakcija superkarštu vandeniu. Tai vienas iš modernių kietų mėginių ekstrakcijos

metodų. Įprastai, naudojant ekstrakciją suslėgtais skysčiais, kietas mėginys talpinamas į nerūdijančio

plieno ekstrakcijos kamerą ir ekstrahuojamas tinkamu tirpikliu, esant aukštai temperatūrai (40–200 ºC)

ir slėgiui (500-3000 psi). Ekstrakcija vykdoma trumpai (5–15 min). Ekstrahavimo pabaigoje mėginio

ekstraktas suslėgtų dujų pagalba išstumiamas į surinkimo indą [76].

15

Alonso-Salces ir kt. atliko fenolinių junginių kiekybinės ir kokybinės sudėties įvertinimą

obuolių minkštimuose ir žievelėse. Fenolinių junginių ekstrakcijai naudota ekstrakcija suslėgtais

skysčiais. Prieš ekstrakciją, siekiant sumažinti tirpiklių sąnaudas, liofilizuoti obuolių minkštimų ir

žievelių mėginiai buvo sumaišyti su dispersine medžiaga diatomitu. Ekstrakcijos tirpikliu naudotas

grynas metanolis, kadangi preliminarių tyrimų metu nustatyta, kad bet koks vandens kiekis

ekstrakcijos sistemoje mažina tyrimo tikslumą, santykinei paklaidai didėjant iki 10-20 proc. Parinkta

40 ºC ekstrakcijos temperatūra, statinės ekstrakcijos trukmė - 5 min., slėgis 1000 psi [78]. H.

Wijngaard atlikto tyrimo metu tirtas obuolių išspaudų antioksidacinis aktyvumas. Fenolinių junginių

išskyrimui naudota pagreitinta ekstrakcija tirpikliais naudojant 60 proc. (v/v) etanolį, 102 °C

temperatūrą.

Autorių duomenimis, lyginant su tradicine kietų mėginių ekstrakcija skysčiais, naudojant

ekstrakciją suslėgtais skysčiais, nustatytas 2,4 karto didesnis antioksidacinis ekstraktų aktyvumas [95].

Ekstrakcijos suslėgtais skysčiais metodo pranašumai yra mažas sunaudojamas tirpiklio kiekis, trumpa

ekstrakcijos trukmė, galimybė naudoti tirpiklius esant aukštesnei nei jų virimo temperatūrai [76, 79].

Kietafazė ekstrakcija. Kietafazė ekstrakcija yra mėginio paruošimo metodas, naudojamas

analičių ekstrakcijai iš skystos terpės, jų išskirstymui ir koncentravimui. Kietafazė ekstrakcija paremta

junginių pasiskirstymu tarp kietos sorbento fazės ir skystos mėginio fazės. Kietafazės ekstrakcijos

principas yra panašus į skysčių chromatografijos. Ekstrakcijos procesas susideda iš keturių etapų:

kolonėlės kondicionavimo, mėginio pakrovimo, plovimo, analičių eliuavimo. Ekstrakcijos proceso

vystymo metu, atsižvelgiant į analičių ir mėginio terpės savybes, būtina pasirinkti tinkamus sorbentus,

plovimo tirpalą ir eiliuavimo tirpalą, kuris turi būti suderinamas su tolesnei analizei naudojama

analitine sistema [43].

Yra optimizuotas mažos molekulinės masės fenolinių junginių ekstrakcijos iš obuolių

sidro mėginių metodas, naudojant Extra-Sep C18 kolonėlę. Fenoliniai junginiai ekstrahuojami ir

frakcionuojami į neutralius ir rūgštinius junginius. Tolimesnis skirstymas ir kokybinės bei kiekybinės

sudėties nustatymas vykdomas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu [67, 85]. Lyginant su

skysčių-skysčių ekstrakcija naudojant etilacetatą, kietafazės ekstrakcijos metodas pasižymi didesne

išeiga [67].

Lyginant su skysčių-skysčių ekstrakcija, kietafazė skystų mėginių ekstrakcija pasižymi

šiais privalumais: didesnė išeiga, efektyvesnis junginių koncentravimas, naudojami mažesni organinių

tirpiklių kiekiai, nėra putojimo ar emulsijų formavimo problemos, trumpesnė proceso vykdymo

trukmė, paprastesnis atlikimas, procesą lengviau automatizuoti. Metodo trūkumai: prastas

atkartojamumas, reikalingos brangios medžiagos [43].

16

3.4. Fenolinių junginių kiekio augalinėje žaliavoje nustatymo metodai

Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties augalinėje žaliavoje nustatymas yra

svarbus siekiant nustatyti augalinės žaliavos cheminę sudėtį bei įvertinti žaliavos kokybę. Fenolinių

junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymui yra sukurta įvairių metodų. Plačiausiai

naudojami metodai yra ultravioletinio ir regimojo spektrų sugerties spektrofotometrija, plonasluoksnė

chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija. Rečiau naudojama kapiliarinė elektroforezė,

dujų chromatografija, ciklinė voltamperometrija [2, 7].

3.4.1. Spektrofotometrinis fenolinių junginių nustatymo metodas

Spektrofotometrinis fenolinių junginių nustatymo metodas naudojant aliuminio (III)

chloridą. Metodo principas yra aliuminio (III) chlorido ir flavonų bei flavonolių komplekso

sudarymas. Aliuminio (III) chloridas geba sudaryti rūgščioje aplinkoje stabilius kompleksus,

jungdamasis su C-4 keto grupe bei su C-3 arba C-5 hidroksi grupėmis esančiomis flavonų bei

flavonolių struktūroje [18].

Aliuminio ir flavonoidų komplekso formavimas ir jų kiekio nustatymas spektrofotometru

yra dažniausiai naudojamas metodas bendram flavonoidų kiekiui nustatyti [64]. Metodas pirmą kartą

pasiūlytas 1960 m. Christ and Müller. Šiuo metu naudojamos įvairios metodo modifikacijos.

Modifikacijas galima suskirstyti į dvi pagrindines rūšis. Pirmuoju atveju naudojamas 2-10

proc. (m/v) koncentracijos AlCl3 tirpalas. Reakcija vykdoma acto rūgšties arba natrio acetato

aplinkoje. Šviesos absorbcija matuojama po 2-60 min. esant 404–430 nm šviesos bangos ilgiui.

Rezultatai išreiškiami skirtingų flavonolių (kvercetino, rutino, kvercitrino, galangino) arba katechino

ekvivalentais. Antruoju atveju kompleksacijos reakcija vykdoma bazinėje terpėje, pridėjus NaNO2.

Šios metodo modifikacijos esmė – aromatinio žiedo, turinčio katecholio grupę su laisvomis trimis ar

keturiomis pozicijomis nitrinimas. Matuojama 510 nm ilgio šviesos absorbcija. Rezultatai išreiškiami

katechino ekvivalentais [64].

Pirmasis metodas yra jautrus tik flavonoliams ir flavonui liuteolinui. Antrasis metodas,

atliekamas bazinėje terpėje, yra jautrus rutinui, liuteolinui, katechinams bei fenolinėms rūgštims.

Tiriant tuos pačius augalinės kilmės mėginius skirtingomis metodo modifikacijomis, gaunami skirtingi

rezultatai [64].

17

Spektrofotometrinis fenolinių junginių nustatymo metodas naudojant 2,4-

Dinitrofenilhidraziną. Šio metodo principas yra 2,4-dinitrofenilhidrazino gebėjimas jungtis su

ketonais ir aldehidas, sudarant 2,4-dinitrofenilhidrazonus. Reakcija vykdoma metanolio aplinkoje.

Matuojama 495 nm bangos ilgio šviesos absorbcija [18]. Reagentas naudojamas nustatyti flavonoliams

(rutinui, kvercitrinui, morinui) ir flavonams (diosminui, daflonui) [56], dihidroflavonams. Standartu

naudojamas pinocembrinas [39].

Spektrofotometrinis fenolinių junginių nustatymo metodas naudojant Folin-Ciocalteu

reagentą. Reagentą sudaro 100 ml natrio volframato dihidrato, 25 ml natrio molibdato dihidrato, 50

ml 85 proc. fosforo rūgšties tirpalo ir 100 ml 36 proc. vandenilio chlorido rūgšties tirpalo [84].

Metodas paremtas nespecifine fenolinių junginių oksidacija dviem stipriais neorganiniais oksidatoriais

(fosfomolibdato ir fosfovolframato rūgštimis) bazinėje terpėje. Reakcija vykdoma 30 min [28, 40, 64]

arba mišinys 5 min. pašildomas vandens vonioje esant 50°C [84]. Matuojama 760-765 nm bangos ilgio

šviesos absorbcija [28, 40, 84]. Naudojant šį metodą, priklausomai nuo fenolinių junginių struktūros

gaunami skirtingi rezultatai,. Folin-Ciocalteu reagentas kartu su fenoliniais junginiais gali oksiduoti ir

keletą ne fenolinių organinių junginių bei tam tikras neorganines medžiagas, taip pervertinant fenolinių

junginių kiekį mėginyje [64]. Nepaisant galimo fenolinių junginių kiekio pervertinimo, Folin-

Ciocalteu metodas labai plačiai taikomas fenolinių junginių kiekybinės sudėties įvertinimui augalinės

kilmės mėginiuose [28, 40, 64, 84]. Tai greitas, sudėtingos ir brangios įrangos nereikalaujantis

metodas.

Spektrofotometrinis fenolinių junginių nustatymo metodas naudojant Berlyno mėlynąjį.

Metodas pagrįstas fenolinių junginių reakcija su K4Fe(CN)6 ir FeCl3 rūgštiniu tirpalu. 700 nm bangos

ilgio šviesos absorbcija matuojama po 7 min [28, 30].

Taip pat aprašyta metodo modifikacija, kuomet vietoje FeCl3 kaip pirmasis reagentas

naudojamas FeNH4(SO)4 rūgštinis tirpalas. Taip išvengiama FeCl3 tirpumo problemos. Matuojama 720

nm bangos ilgio šviesos absorbcija vienos minutės intervalais [31].

3.4.2. Chromatografiniai fenolinių junginių nustatymo metodai

Iš visų augalinių žaliavų mėginių tyrimo metodų chromatografinė analizė užima vieną

svarbiausių vietų augalinių žaliavų analizės pasaulyje. Chromatografiniai analizės metodai yra randami

visose farmakopėjose. Dėl reikšmingų privalumų, tokių kaip didelis specifiškumas ir galimybė metodą

panaudoti kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymui, chromatografiniai analizės metodai dažnai

18

sudaro esminę vaistinių augalinių žaliavų mėginių analizės metodikų dalį. Fitocheminėje analizėje

dažniausiai naudojami šie chromatografiniai metodai: vienos ir dviejų krypčių popieriaus

chromatografija, vienos ir dviejų krypčių plonasluoksnė chromatografija, kolonėlinė skysčių

chromatografija, jonų mainų chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, dujų

chromatografija.

Visos chromatografijos rūšys yra paremtos tuo, kad esant tokioms pačioms sąlygoms,

kiekvienas mišinyje esantis junginys su aplinka sąveikauja skirtingai. Chromatografija yra mišinio

sudedamųjų dalių išskirstymo metodas. Judančiojoje fazėje (eliuente) esantys tiriamojo mėginio

junginiai, judėdami per nejuntančiąją (stacionarią) fazę, dėl kiekvieno junginio savitos sąveikos su

nejudančiąja faze, yra sulaikomi ant nejudančiosios fazės. Sulaikymo trukmė yra skirtinga ir specifiška

kiekvienam junginiui [15].

Efektyvioji skysčių chromatografija. Efektyvioji skysčių chromatografija yra pirmo

pasirinkimo metodas kokybinėje ir kiekybinėje fenolinių junginių analizėje. Dėl fenolinių junginių

struktūros panašumo bei didelio skirtingų junginių kiekio ESC yra vienas tinkamiausių metodų

fenolinių junginių analizei. Lyginant su įprasta kolonėline chromatografija, efektyvioji skysčių

chromatografija turi daug privalumų. Metodas pasižymi greita vykdymo trukme – mėginio analizė gali

būti įvykdoma greičiau nei per 1 valandą. ESC yra jautrus metodas, pasižymintis aukšta rezoliucija.

Galima kokybinė ir kiekybinė mėginio analizė, mėginiai nėra suardomi, reikalingas labai mažas

mėginio kiekis. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu galima analizuoti daugybę skirtingų

junginių: nukleotidus, nukleozidus, vaistus ir jų metabolitus, steroidus, alkaloidus, vitaminus, amino

rūgštis, lipidus, baltymus, antioksidantus ir daugybę kitų junginių grupių. Iš esmės bet kuris tirpus

junginys gali būti analizuojamas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu [15].

Fenolinių medžiagų išskirstymui naudojama skirtingų parametrų efektyvioji skysčių

chromatografija. Naudojamos C18 50-300 mm ilgio kolonėlės su nuo 1,8 iki 5 µm dydžio dalelėmis.

Mažiausi kolonėlių ilgiai naudojami kartu su tandemine masių spektrometrija [25, 69], kadangi tokiu

atveju nėra būtinas pilnas junginių atskyrimas ir taip gerokai sutrumpinama tyrimo trukmė [69].

Fenolinių junginių chromatografiniam išskirstymui naudojamas gradientinis eliuavimas dviejų tirpiklių

sudarytomis iš skruzdžių rūgšties – metanolio [69], amonio acetato, parūgštinto skruzdžių rūgštimi –

metanolio [25], 10 proc. (v/v) acto rūgšties vandeninio tirpalo – metanolio [77], 2 proc. (v/v) acto

rūgšties vandeninio tirpalo – 0,5 proc. (v/v) acto rūgšties vandeninio tirpalo mišinyje su acetonitrilu

(50:50, v/v) [81], 2 proc. (v/v) acto rūgšties vandeninio tirpalo – 100 proc. (v/v) acetonitrilo. [3]

Eliuavimo greitis skirtingose metodikose naudojamas nuo 0,2 ml/min. iki 1 ml/min., kolonėlės

temperatūra dažniausiai palaikoma 25°C [3, 77, 81]. Naudojant ultravioletinės spinduliuotės (UV)

detekciją, absorbcijos spektrai paprastai registruojami esant 280 nm, 320 nm, 370 nm ir 530 nm

19

bangos ilgiams. Dihidrochalkonų ir flavan-3-olių kiekiai registruojami 280 nm chromatogramoje,

fenolinių rūgščių 320 nm, flavonolių 370 nm, antocianinų kiekiai 530 nm chromatogramose [3, 77,

81].

Fenolinių junginių išskirstymui naudojant efektyviąją skysčių chromatografiją,

dažniausiai naudojami detektoriai yra diodų matricos detektorius [3], masės spektrometras (MS), diodų

matricos detektorius su masių spektrometru (DMD-MS), tandeminė masių spektrometrija (MS/MS)

[69], diodų matricos detektorius su tandemine masių spektrometrija (DMD-MS/MS) [25, 45, 69, 77,

81].

Kitaip nei detekcijai naudojant spektrofotometrinį metodą, masių spektrometro

naudojimas kartu su ESC padeda išvengti nepilno analičių atsiskyrimo sukeliamų problemų. Ši

problema ypač efektyviai sprendžiama naudojant tandeminę masių spektrometriją. ESC - MS/MS yra

naudinga siekiant patvirtinti tiriamuose ekstraktuose nustatomų junginių struktūrą [25]. Rabaneda ir kt.

2004 m. atlikto tyrimo metu ESC–MS/MS buvo pritaikyta fenolinių junginių obuolių išspaudose

kokybiniam įvertinimui. Tyrimo metu naudotas elektrosrauto jonizatorius ir trigubo kvadrupolio masių

spektrometras. Dalis junginių buvo identifikuota pilno skenavimo ESC-MS metu, o likusi dalis

junginių, kurių pirminiu skenavimu nepavyko identifikuoti, buvo nustatyti pasitelkiant MS/MS erdvėje

skenavimo režimus (prekursoriaus skenavimą, neutralaus atskilimo skenavimą, pasirinktos reakcijos

stebėjimą). Šis tyrimas įrodė galimybę pasitelkti ESC su tandemine masių spektrometrija sudėtingų

biologiškai aktyvių junginių mišinių, tokių kaip obuoliai ir jų produktai kokybinės sudėties nustatymui.

Šio tyrimo metu obuolių išspaudose identifikuota 60 fenolinių junginių, iš kurių 22, tuometinėmis

autorių žiniomis, prieš tai nebuvo nustatyti obuoliuose ar jų išspaudose [69]. Flores ir kt. 2014 m.

atlikto tyrimo metu fenolinių junginių identifikavimui bei kiekybiniam įvertinimui obuolių žievelėse,

minkštimuose ir pilnuose obuoliuose, panaudota panaši aparatūra (ultra efektyvioji skysčių

chromatografija su elektrostrauto jonizatoriumi bei trigubo kvadrupolio masių spektrometru). Tyrimo

metu kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti 22 junginiai ar jų grupės obuolių minkštimuose ir 26 junginiai

žievelėse [25].

3.4.3. Elektrocheminiai fenolinių junginių nustatymo metodai

Kapiliarinė elektroforezė. Kapiliarinė elektroforezė yra analitinis metodas, pasižymintis

efektyviu atskyrimu ir trumpa trukme. Tačiau lyginant su ESC, kapiliarinė elektroforezė yra mažiau

jautrus metodas, yra sistemos perpildymo mėginiais problema, prastesnis kiekybinių rezultatų

20

atkartojamumas. Taip pat, lyginant su ESC, ilgiau trunka metodo vystymas [7]. Junginių išskirstymui

dažniausiai naudojami elektroforetiniai metodai yra micelinė elektrokinetinė chromatografija (MEKC),

kapiliarinė elektrochromatografija (CEC) ir kapiliarinė zonų elektroforezė (CZE). Detekcijai

dažniausiai naudojama spektrofotometrija, elektrocheminė detekcija arba masių spektrometrija [44].

Youyuan Peng ir kt. atliktas tyrimas, kurio metu panaudojant kapiliarinę elektroforezę su

elektrochemine detekcija (KE-ED), buvo kiekybiškai įvertinti floridzinas, (-)-epikatechinas,

chlorogeno rūgštis ir miricitinas, esantys obuolių sultyse bei sidre. Naudojant šiame tyrime aprašytą

optimizuotą KE-ED metodiką, analitės buvo atskirtos per 20 min. naudojant 75 cm ilgio kapiliarą, 18

kV įtampą ir 50 mmol/l boratinį buferį (pH 8.7). detekcija buvo vykdoma naudojant 300 µm

skersmens anglies disko elektrodą. Analičių identifikavimo ribos varijavo nuo 1 × 10−7 iki

5 × 10−7 g/ml. Tyrimo rezultatai pademonstravo, kad KE-ED yra sėkmingai pritaikoma obuoliuose

nustatomų junginių kokybinei bei kiekybinei analizei ir pasižymi aukšta rezoliucija bei jautrumu,

patenkinamu pakartojamumu, mažomis tyrimo išlaidomis ir minimaliu reikalingu mėginio tūriu [62].

***

Literatūroje nurodoma, kad obuoliuose didžiausiais kiekiais nustatomi fenoliniai

junginiai yra chlorogeno rūgštis, (-)-epikatechinas, floridzinas. Fenolinių junginių išskyrimui iš

obuolių dažnai naudojama ekstrakcija ultragarso pagalba. Yra atlikta tyrimų, įrodančių metodo

tinkamumą ir pranašumą prieš kitus metodus, vykdant fenolinių junginių ekstrakciją iš obuolių. Dėl šių

priežasčių tyrime naudotas kitų mokslininkų optimizuotas fenolinių junginių ekstrakcijos iš obuolių

ultragarso pagalba metodas.

Fenolinių junginių kiekybinės sudėties įvertinimui obuolių mėginiuose labai dažnai

taikomas Folin-Ciocalteu metodas. Nepaisant galimai pervertinamo fenolinių junginių kiekio, tai

populiarus, paprastas ir greitai atliekamas metodas. Folin-Ciocalteu metodas leidžia palyginti fenolinių

junginių kiekius skirtingose obuolių veislėse.

Kokybinėje ir kiekybinėje fenolinių junginių analizėje pirmo pasirinkimo metodas yra

efektyvioji skysčių chromatografija. Literatūroje aprašyta daug obuolių fenolinių junginių tyrimų,

naudojant ESC metodą. Dėl šių priežasčių fenolinių junginių kokybinei ir kiekybinei analizei

obuoliuose naudotas kitų mokslininkų optimizuotas ESC metodas.

21

4. TYRIMO METODIKA

4.1. Tyrimo objektas

Tirti obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių

minkštimų ir žievelių ėminiai. Obelys auginamos Lietuvoje, Kauno r., Babtuose Lietuvos agrarinių ir

miškų mokslo centro filiale Sodininkystės ir daržininkystės institute. Tyrimui paruošti 2012 m. sezono

vaisių ėminiai.

4.2. Naudoti reagentai

Tirpikliai, standartai ir reagentai yra analitinio švarumo. Acto rūgštis, ABTS, DMCA, (-)-

epikatechino standartas, Trolox®-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksilinė rūgštis, galo

rūgšties monohidrato standartas, Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas, aliuminio chlorido heksahidratas

Sigma-Aldrich (Steinheim, Vokietija), etanolis (96,3 proc. v/v) (AB Stumbras, Lietuva), rutino

standartas (Extrasynthese, Genay, Prancūzija), natrio karbonatas, DPPH ir TPTZ (Carl Roth,

Karlsruhe, Vokietija), heksametiltetraminas, azoto rūgštis (Lachema, Neratovice, Čekija), geležies (III)

chlorido heksahidratas (Vaseline-Fabrik Rhenania, Bonn, Vokietija).

4.3. Naudota aparatūra

Obuolių minkštimai ir žievelės liofilizuoti liofilizatoriumi ZIRBUS sublimator 3x4x5/20

(Vokietija), liofilizuotas minkštimas ir žievelės sumalti, naudojant elektrinį malūną Retsch 200

(Vokietija).

Žaliavos ekstrakcija atlikta ultragarso vonelėje Bandelin Sanorex Digital 10P (Vokietija).

Spektrofotometrinė etanolinių ekstraktų analizė atlikta naudojant spektrofotometrą „Beckman DU-70“

(JAV).

Efektyvioji skysčių chromatografija atlikta naudojant Waters 2695 Alliance

chromatografinę sistemą („Waters“, Milfordas, JAV), diodų matricos detektorių Waters 2998 PDA.

Skirstymui naudota kolonėlė YMC-Pack ODS-A (250 × 4,6 mm, C18, dalelių dydis 5 µm) su

prieškolone YMC-Triart (10 × 3,0, C18, dalelių dydis 5 µm) (YMC Europe GmbH, Dinslakenas,

Vokietija). Chromatografinio skirstymo valdymas, chromatogramų registravimas, duomenų kaupimas

22

ir apdorojimas atliktas naudojantis „Empower®

2 chromatography Data Software” („Waters“,

Milfordas, JAV) programine įranga.

4.4. Tyrimo metodai

Obuolių minkštimų ir žievelių ekstraktų paruošimas. Pasveriama 2,5 g (tiksli masė)

obuolių liofilizato, užpilama 30 ml 70 proc. (v/v) etanolio ir ekstrahuojama ultragarso vonelėje 20 min.

40°C temperatūroje sandariuose stikliniuose buteliukuose. Ultragarso stipris – 480 W, dažnis – 35000

Hz. Gautas ekstraktas filtruojamas per popieriaus filtrą. Ant filtro esantis obuolių liofilizatas

praplaunamas 20 ml 70 proc. (v/v) etanolio į 50 ml matavimo kolbą, kurioje yra praskiedžiamas 70

proc. (v/v) etanoliu iki 50 ml. Prieš atliekant ESC analizę ekstraktai filtruojami per 0,22 µm porų

dydžio membraninius filtrus [3].

Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu. Bendras

fenolinių junginių kiekis nustatomas spektrofotometru, naudojant Folin-Ciocalteu reagentą.

Tirpalo A paruošimas: 1 ml tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 4 ml 96 proc. (v/v)

etanolio.

Tirpalo B paruošimas: 0,25 ml tirpalo A sumaišoma su 5 ml 10 proc. Folin-Ciocalteu

reagento ir 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalais. Lyginamasis mėginys gaminamas vietoje tirpalo A

naudojant 0,25 ml išgryninto vandens.

Gautas tirpalas paliekamas 60 min. tamsoje. Po to spektrofotometru išmatuojama 765 nm

bangos ilgio šviesos absorbcija. Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties

ekvivalentu (mg/ml) pagal kalibracijos lygtį [83].

Galo rūgšties koncentracijų intervalas 0 - 2,5 mg/ml.

y = 0,4679 x - 0,1291 R² = 0,9979

Procentinis fenolinių junginių kiekis absoliučiai sausoje žaliavoje apskaičiuojamas iš

formulės:

1000

1001

m

VXX ,

čia: X1 - bendras fenolinių junginių kiekis mg/ml;

V - tiriamos žaliavos ekstrakto gamybai naudoto ekstrahento tūris ml;

m - absoliučiai sausos žaliavos masė g.

Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu. Bendras flavonoidų

kiekis nustatomas spektrofotometru taikant reakciją su aliuminio chloridu. 1,5 ml ekstrakto sumaišoma

23

su 2 ml 96 proc. (v/v) etanolio, įpilama 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties, 1,2 ml išgryninto vandens, 0,3 ml

10 proc. aliuminio chlorido tirpalo. Po 30 min. tirpalas sumaišomas su 0,4 ml 5 proc.

heksametilentetramino tirpalo. Lyginamasis mėginys: 1,5 ml ekstrakto sumaišoma su 2 ml 96 proc.

(v/v) etanolio, įpilama 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties ir 1,9 ml išgryninto vandens. 407 nm bangos ilgio

šviesos absorbcija matuojama po sumaišymo su heksametilentetramino tirpalu. Bendras flavonoidų

kiekis išreiškiamas rutino ekvivalentu (mg/ml) pagal kalibracijos lygtį [6].

Rutino koncentracijų intervalas 0-0,175 mg/ml.

y = 5,9610x + 0,0117 R² = 0,9984

Procentinis flavonoidų kiekis absoliučiai sausoje žaliavoje apskaičiuojamas iš formulės:

1000

1001

m

VXX ,

čia: X1 - bendras flavonoidų kiekis mg/ml;

V - tiriamos žaliavos ekstrakto gamybai naudoto ekstrahento tūris ml;


Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu. Bendras

proantocianidinų kiekis nustatytas spektrofotometru taikant reakciją su DMCA (4-

dimetilaminocinamaldehidas) etanoliniu vandenilio chlorido rūgšties tirpalu (9:1 v/v). Tiriamasis

tirpalas: 20 μl tiriamojo etanolinio ekstrakto sumaišoma su 3 ml 0,1 proc. DMCA tirpalo. Lyginamasis

tirpalas: 3 ml 0,1 proc. DMCA tirpalo sumaišoma su 20 μl išgryninto vandens. Po 5 min. matuojama

tirpalo šviesos absorbcija esant 640 nm bangos ilgio šviesai [33]. Bendras proantocianidinų kiekis

išreiškiamas (-)-epikatechino ekvivalentu (mg/ml) pagal (-)-epikatechino kalibracijos lygtį.

y = 2,4979x + 0,0053 R² = 0,9990

(-)-epikatechino koncentracijų intervalas 0 – 0,4 mg/ml

Procentinis proantocianidinų kiekis absoliučiai sausoje žaliavoje apskaičiuojamas iš

formulės:

1000

1001

m

VXX ,

čia: X1 - bendras proantocianidinų kiekis mg/ml;

V - žaliavos ekstrakto gamybai naudoto ekstrahento tūris ml;


Spektrofotometrinis FRAP metodas. FRAP reagentas ruošiamas prieš pat darbą iš 300 mM

(pH=3,6) natrio acetato buferinio tirpalo, 10 mM TPTZ tirpalo 40 mM vandenilio chlorido rūgštyje, 20

mM geležies chlorido heksahidrato tirpalo. Jie maišomi santykiu 10:1:1. Tiriamasis tirpalas: 10 μl

tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 3 ml FRAP reagento tirpalo. Lyginamasis tirpalas: 3 ml FRAP

24

reagento tirpalo sumaišoma su 10 μl išgryninto vandens. Po 60 min. matuojama 593 nm bangos ilgio

šviesos absorbcija [11]. Antioksidantinis aktyvumas išreiškiamas μmol TE/g pagal trolokso

kalibracijos kreivę.

y = 0,6154x + 0,0012 R² = 0,9966

Trolokso koncentracijų intervalas 0 – 2 mg/ml

Absoliučiai sausos žaliavos antioksidacinis aktyvumas μmol TE/g apskaičiuojamas iš

formulės:

29.250

10001

m

VXX ,

čia: X1 - antioksidacinis aktyvumas mg TE/ml;



Spektrofotometrinis ABTS metodas. Motininio ABTS radikalo tirpalo gamyba: 2 mM

ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfoninė rūgštis) ištirpinama išgrynintame vandenyje (50

ml) ir pridedama 0,7 mM kalio persulfato. Gautas tirpalas laikomas 16-17 val. tamsoje, kambario

temperatūroje, kol kalio persulfatas suoksiduoja ABTS. Reakcijos metu susidaro stabilus ABTS•+

katijonas. Motininis ABTS•+ tirpalas, apsaugotas nuo šviesos poveikio, kambario temperatūroje yra

stabilus daugiau nei 2 paras. Darbinio ABTS•+ tirpalo gamyba: ABTS•+ motininis tirpalas

skiedžiamas išgrynintu vandeniu, kol matuojant 734 nm bangos ilgio šviesos absorbciją nustatomi

0,8±0,03 absorbcijos vienetai. Tiriamojo tirpalo gamyba: 10 μl tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 3 ml

darbinio ABTS•+ tirpalo. Kaip lyginamasis tirpalas naudojamas išgrynintas vanduo. Po 60 min.

spektrofotometru matuojamas tiriamojo tirpalo šviesos absorbcijos sumažėjimas esant 734 nm bangos

ilgiui. Antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas mg TE/ml pagal trolokso kalibracinę lygtį [71].

y = -0,3246x + 0,7497 R² = 0,9972



formulės:

29.250

10001

m

VXX ,




Spektrofotometrinis DPPH metodas. Darbinio DPPH tirpalo gamyba: 60 µM DPPH

tirpalas skiedžiamas 96,3 proc. (v/v) etanoliu, kol matuojant 515 nm bangos ilgio šviesos absorbciją

25

pasiekiami 0,8±0,03 absorbcijos vienetai. 10 µl tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 3 ml darbinio DPPH

tirpalo. Kaip tuščias mėginys naudojamas 96,3 proc. (v/v) etanolis. Po 30 min. matuojamas tiriamojo

tirpalo šviesos absorbcijos sumažėjimas esant 515 nm bangos ilgiui. Antioksidacinis aktyvumas

išreiškiamas mg TE/ml pagal trolokso kalibracinę lygtį [96].

y = -0,227x + 0,782 R² = 0,999



formulės:

29.250

10001

m

VXX ,




Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Fenolinių junginių identifikavimui bei

kiekybiniam įvertinimui naudota dviejų eliuentų sistema sudaryta iš 2 proc. (v/v) acto rūgšties tirpalo

vandenyje (eliuentas A) ir 100 proc. (v/v) acetonitrilo (eliuentas B). Gradiento kitimas: 0–30 min 3–15

proc. B, 30–45 min 15–25 proc. B, 45–50 min 25–50 proc. B, 50–55 min 50–95 proc. B. Judrios fazės

tėkmės greitis – 1 ml/min, injekcijos tūris – 10 l. Kolonėlė termostatuota 25°C temperatūroje. Chro-

matografinės smailės identifikuotos lyginant analičių ir etaloninių junginių sulaikymo laikus ir UV

absorbcijos spektrines charakteristikas ( = 200–600 nm). Identifikuotų junginių tapatybė patvirtinta

priedo metodu į tiriamąjį ekstraktą pridėjus etaloninio junginio, monitoruojant chromatografinių

smailių formos ir spektrinių charakteristikų pokyčius. Kiekinis obuolių minkštimų bei žievelių ėminių

ekstraktuose identifikuotų junginių nustatymas atliktas išorinio standarto metodu naudojantis

kiekvienai analitei sudarytais penkių lygmenų etaloninių junginių kalibravimo grafikais bei remiantis

analitės chromatografinės smailės ploto priklausomybe nuo analitės koncentracijos analizuojamame

ekstrakte. Visų obelų vaisių ir lapų ėminių ekstraktuose kiekybiškai įvertintų fenolinių junginių

koncentracijos buvo kalibravimo grafikų ribose. Dihidrochalkonų ir flavan-3-olių kiekiai

tiriamuosiuose ekstraktuose apskaičiuoti bangos ilgiui esant 280 nm, fenolinių rūgščių – 320 nm,

flavonolių – 360 nm [3].

Pektinų kiekio nustatymas gravimetriniu metodu. 2 g obuolių liofilizato (tikslus svėrinys)

talpinama į 250 ml kolbą, užpilama 80 ml 100 mM azoto rūgšties tirpalu. 10 min. palaikoma virimo

temperatūra. Kolbos turinys filtruojamas pro dvigubą marlės sluoksnį. Filtratas atvėsinamas iki 40 °C.

Į filtratą pilama 60 ml atšaldyto iki 5°C etanolio 96 proc. (v/v). Gauta masė laikoma šaldytuve (5°C) 1

26

val. Masė filtruojama pro dvigubą marlės sluoksnį. Gauta pektinų masė džiovinama iki pastovios

masės ir sveriama [45, 49, 60, 93].

Procentinis pektinų kiekis absoliučiai sausoje žaliavoje apskaičiuojamas iš formulės:

m

XX

1001

čia: X1 - pektinų masė g.;


Duomenų analizė. Duomenų analizė ir vertinimas atliktas „MS Excel 2007“ (Microsoft,

JAV) kompiuterine programa ir „SPSS 20“ („IBM“, JAV) statistiniu paketu. Duomenys įvertinti

apskaičiavus tyrimų rezultatų matematinį vidurkį, standartinį nuokrypį ir standartinę klaidą. Siekiant

nustatyti duomenų koreliacinius ryšius, apskaičiuoti Pirsono koreliacijos koeficientai.

27

5. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas obuolių žievelių ir minkštimų

ekstraktuose spektrofotometriniu metodu

Vertinant obuolių kokybę svarbu ištirti jų cheminę sudėtį, nustatyti fenolinių junginių

kiekybinės sudėties įvairavimą. Šis parametras leidžia įvertinti obuolių kokybę. Fenolinių junginių

kiekybinės sudėties analizė svarbi obuolius vartojant ne tik mitybai, bet ir gaminant obuolių produktus

bei maisto papildus.

Atlikti Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“,

„Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių fenolinių junginių kiekybinės sudėties tyrimai. Obuolių

minkštimų ir žievelių ėminių fenolinių junginių kiekybinės sudėties tyrimui pasirinktas populiarus,

sudėtingos aparatūros nereikalaujantis spektrofotometrinis metodas naudojant Folin-Ciocalteu

reagentą.

Fenolinių junginių kiekis tirtuose Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obuolių

minkštimuose įvairuoja 1,92 - 2,60 proc. ribose. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas

„Lodel" (2,60±0,05 proc.) veislės obuolių minkštimuose. Šiek tiek mažesni kiekiai - „Auksis"

(2,44±0,04 proc.) ir „Aldas" (2,41±0,04 proc.) veislių obuolių minkštimuose. Mažiausias fenolinių

junginių kiekis nustatytas „Rajka" veislės obuolių minkštime (1,92±0,05 proc.). Labai panašūs

fenolinių junginių kiekiai nustatyti veislių „Ligol" (2,06±0,07 proc.) ir „Connel Red" (2,05±0,08 proc.)

bei „Aldas" (2,41±0,04 proc.) ir „Auksis" (2,44±0,04 proc.) minkštimuose (1 pav.).

1 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas obuolių minkštimuose (n=3)

28

Lyginant tyrimų rezultatus su kitų mokslininkų tyrimų rezultatais, galima teigti, kad JAV

populiarių obelų veislių obuolių minkštimuose nustatytas mažesnis fenolinių junginių kiekis,

įvairuojantis nuo 0,072 iki 0,168 proc. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas veislių „Red

Delicious", „Northern Spy" ir „Fortune" obuolių minkštimuose. Mažiausias - „Jonagold" ir „Empire"

minkštimuose [48].

Fenolinių junginių kiekis tirtose Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obuolių žievelėse

varijuoja 2,68 - 3,37 proc. ribose. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas veislės „Aldas"

(3,37±0,03 proc.) obuolių žievelėse. Šiek tiek mažesni kiekiai nustatyti „Auksis" (3,31±0,05 proc.) ir

„Lodel" (3,20±0,10 proc.) veislių obuolių žievelėse. Mažiausias fenolinių jugninių kiekis nustatytas

„Ligol" (2,68±0,02 proc.) žievelėse (2 pav.).

Kitų mokslininkų atlikto tyrimo metu, kurio objektas buvo JAV populiarių obelų veislių

obuolių žievelės ir minkštimai, obuolių žievelėse nustatytas mažesnis fenolinių junginių kiekis, kuris

įvairavo nuo 0,31 iki 0,59 proc. Didžiausi fenolinių junginių kiekiai nustatyti veislių „Idared" ir „Rome

Beauty" žievelėse. Mažiausi - „Cortland" ir „Golden Delicious" žievelėse [97].

2 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas obuolių žievelėse (n=3)

29

5.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas obuolių žievelių ir minkštimų


Flavonoidai yra viena didžiausių ir dažniausiai augaluose aptinkamų junginių grupių.

Vertinant augalinės žaliavos kokybę, svarbu nustatyti bendrą flavonoidų kiekį. Bendras flavonoidų

kiekis obuolių minkštimų ir žievelių ėminiuose nustatytas plačiai naudojamu, nesudėtingu metodu,

pagrįstu flavonoidų reakcija su aliuminio chloridu. Aliuminio ir flavonoidų komplekso formavimas ir

jų kiekio nustatymas spektrofotometru yra dažniausiai naudojamas metodas bendram flavonoidų

kiekiui nustatyti [64]. Metodas pirmą kartą pasiūlytas 1960 m. Christ and Müller. Mūsų tyrimo metu

naudotas modifikuotas metodas.

Nustatytas bendras flavonoidų kiekis Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų

veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių minkštimuose.

Flavonoidų kiekis tirtuose obuolių minkštimuose varijuoja 0,012 - 0,030 proc. ribose. Didžiausias

flavonoidų kiekis nustatytas „Lodel" (0,030±0,001 proc.) obuolių minkštimuose. Šiek tiek mažesnis

kiekis nustatytas „Connel Red" (0,027±0,001 proc.) veislės obuolių minkštimuose. Mažiausias kiekis -

„Ligol" (0,012±0,001 proc.) minkštimuose. Panašūs flavonoidų kiekiai nustatyti „Aldas“ (0,019±0,001

proc.), „Auksis“ (0,019±0,001 proc.) ir „Rajka“ (0,018±0,001 proc.) obuolių minkštimuose (3 pav.).

Tyrimų rezultatus lyginant su kitų mokslininkų tyrimų rezultatais, galima teigti, kad JAV

populiarių obelų veislių obuolių minkštimuose flavonoidų kiekis yra didesnis ir varijuoja 0,036 - 0,047

proc. ribose. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas „Cortland" ir „Rome Beauty" veislių

minkštimuose. Mažiausias - „Idared" veislės obuolių minkštimuose [97].

3 pav. Bendro flavonoidų kiekio įvairavimas obuolių minkštimuose (n=3)

30

Nustatytas bendras flavonoidų kiekis Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų

veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių žievelėse. Flavonoidų

kiekis tirtose obuolių žievelėse varijuoja 0,085 - 0,239 proc. ribose. Didžiausias flavonoidų kiekis

nustatytas „Aldas" (0,239±0,003 proc.) obuolių žievelėse. Mažesnis flavonoidų kiekis nustatytas

„Connel Red" (0,184±0,003 proc.) obuolių žievelėse. Veislės „Auksis" obuolių žievelėse nustatytas

mažiausias flavonoidų kiekis (0,085±0,003 proc.). Veislės „Auksis" žievelėse nustatytas 2,8 karto

mažesnis flavonoidų kiekis, nei veislės „Aldas" žievelėse. Veislių „Ligol“ (0,141±0,003 proc.),

„Rajka" (0,164±0,003 proc.) ir „Lodel“ (0,143±0,004 proc.) žievelėse nustatyti panašūs flavonoidų

kiekiai (4 pav.).

Tyrimo rezultatus lyginant su kitų mokslininkų atlikto tyrimo rezultatais, JAV populiarių

obelų veislių obuolių žievelėse nustatytas didesnis flavonoidų kiekis, kuris įvairuoja 0,167 - 0,306 proc

ribose. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas „Idared" ir „Rome Beauty" žievelėse. Mažiausias -

„Cortland" ir „Golden Delicious" obuolių žievelėse [97].

Minėto tyrimo metu bendro flavonoidų kiekio nustatymui obuolių žievelėse ir minkštimuose,

naudota reakcijos su aliuminio chloridu modifikacija, kurioje tiriamasis ekstraktas maišomas su 5 proc.

NaNO2 tirpalu, 10 proc AlCl3 ir 1 M NaOH tirpalais [97]. Tiriant tuos pačius augalinės žaliavos

mėginius skirtingomis metodo modifikacijomis, gaunami skirtingi rezultatai, todėl sudėtinga lyginti

skirtingų tyrimų rezultatus [64].

4 pav. Bendro flavonoidų kiekio įvairavimas obuolių žievelėse (n=3)

31

5.3. Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas obuolių žievelių ir minkštimų


Proantocianidinai yra gamtoje plačiai paplitusi fenolinių junginių grupė, sudaranti didžiausią

dalį su maistu ir gėrimais suvartojamų flavonoidų [94]. Proantocianidinų nustatymas atliktas

spektrofotometriniu metodu, naudojant DMCA reagentą. Tai populiarus, sudėtingos aparatūros

nereikalaujantis, paprastas ir labai greitas proantocianidinų nustatymo metodas. Lyginant su kitais

proantocianidinų nustatymui naudojamais metodais, DMCA metodas pasižymi geresniu

atkartojamumu, selektyvumu, greitesniu atlikimu [33, 94].

Nustatytas bendras proantocianidinų kiekis Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų

veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių minkštimuose.

Proantocianidinų kiekis tirtuose obuolių minkštimuose varijuoja 0,123 - 0,209 proc. ribose.

Didžiausias proantocianidinų kiekis nustatytas „Lodel" veislės minkštimuose (0,209±0,007 proc.).

Mažiausias jų kiekis nustatytas „Connel Red" veislės obuolių minkštimuose (0,122±0,006 proc.).

„Ligol“ (0,134±0,006 proc.) ir „Rajka“ (0,138±0,004 proc.) bei veislių „Aldas“ (0,151±0,007 proc.) ir

„Auksis“ (0,153±0,005 proc.) minkštimuose nustatyti beveik vienodi proantocianidinų kiekiai (5 pav.).

Nustatytas bendras proantocianidinų kiekis Lietuvos klimatinėmis sąlygomis auginamų obelų

veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių žievelėse.

Proantocianidinų kiekis tirtose obuolių žievelių ėminių ekstraktuose varijuoja 0,170 - 0,292 proc.

ribose. Didžiausias proantocianidinų kiekis nustatytas veislės „Aldas" (0,292±0,006 proc.) obuolių

5 pav. Bendro proantocianidinų kiekio įvairavimas obuolių minkštimuose (n=3)

32

žievelėse. Panašūs, mažesni proantocianidinų kiekiai nustatyti „Auksis" (0,257±0,010 proc.) ir

„Connel Red" (0,236±0,013 proc.) veislių obuolių žievelėse. Mažiausi proantocianidinų kiekiai

nustatyti „Rajka" (0,170±0,006 proc.) ir „Ligol" (0,176±0,005 proc.) veislių obuolių žievelėse (6 pav.).

Tyrimo rezultatus lyginant su Suomijos ir JAV mokslininkų atliktų tyrimų rezultatais, galima

teigti, kad šių tyrimų metu obuoliuose nustatytas mažesnis proantocianidinų kiekis, varijuojantis nuo

0,070 iki 0,162 proc. [34, 29]. Jarkko K. ir kt. atlikto tyrimo duomenimis obuolių žievelėse

proantocianidinų nustatyta nuo 0,182 iki 0,227 proc. [34].

Kitų mokslininkų nustatyti mažesni proantocianidinų kiekiai gali būti susiję su skirtingomis

obelų auginimo technologijomis, klimatinėmis sąlygomis bei veislių skirtumais. Taip pat nustatyti

mažesni proantocianidinų kiekiai gali būti susiję su kiekybinio tyrimo metodikų skirtumais. Mūsų

atliktame tyrime naudotas DMCA reagentas, kuris yra jautrus ne tik (+)-katechino ir (-)-epikatechino

oligomerams bei polimerams, bet ir monomerams [58]. Tyrimui naudojant didesniu specifiškumu

pasižyminčius metodus, tokius kaip efektyvioji skysčių chromatografija, žaliavoje nustatomas

proantocianidinų kiekis gali būti mažesnis.

6 pav. Bendro proantocianidinų kiekio įvairavimas obuolių žievelėse (n=3)

33

5.4. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymas obuolių

minkštimuose ir žievelėse efektyviosios skysčių chromatografijos metodu

Kokybinė ir kiekybinė fenolinių junginių analizė atlikta efektyviosios skysčių

chromatografijos metodu. ESC pasižymi labai geru atkartojamumu, aukšta skiriamąja geba. Tai

tikslus, daugelio junginių grupių atskyrimui pritaikomas metodas, pastaruoju metu dažnai naudojamas

augalinių žaliavų ekstraktų kokybinei ir kiekybinei analizei.

ESC metodu tirti veislių „Aldas" ir „Lodel" obuolių minkštimai ir žievelės. Tyrimui

pasirinktos šios obuolių veislės, kadangi veislės „Aldas" žievelėse nustatyti didžiausi fenolinių

junginių, flavonoidų bei proantocianidinų kiekiai bei didžiausias antioksidacinis aktyvumas, o veislė

„Lodel" išsiskyrė didžiausiais minkštimuose nustatytais fenolinių junginių, flavonoidų ir

proantocianidinų kiekiais, dideliu minkštimų antioksidaciniu aktyvumu. Anksčiau nebuvo atlikta

veislės „Lodel" fenolinių junginių kokybinio ir kiekybinio tyrimo.

(a)

7 pav. Veislių Aldas (a) ir Lodel (b) žievelių ėminių etanolinių ekstraktų

chromatograma (λ=280 nm).1-procianidinas B1, 2-(+)-katechinas, 3-chlorogeno rūgštis,

4-procianidinas B2, 5-(–)-epikatechinas, 6-rutinas, 7-hiperozidas, 8-izokvercitrinas, 9-

avikuliarinas, 10-kvercitrinas, 11-floridzinas.

(b)

34

Tirtuose obuolių ekstraktuose identifikuota 11 skirtingų fenolinių junginių: chlorogeno

rūgštis, (+)-katechinas, (-)-epikatechinas, procianidinas B1, procianidinas B2, floridzinas, hiperozidas,

izokvercitrinas, avikuliarinas, kvercitrinas, rutinas (7 pav.), (8 pav.).

Kitų mokslininkų atlikto tyrimo metu obuoliuose nustatyta daugiau fenolinių junginių:

apigeninas, liuteolinas, izoramnetinas ir jo glikozidai, kemferolio glikozidai, miricetinas,

epigalokatechinas, floretinas. Šių junginių nustatyti labai maži kiekiai, naudojant ultra efektyviosios

skysčių chromatografijos su tandemine masių spektrometrija metodą [25].

„Aldas" žievelėse ir minkštimuose iš visų kiekybiškai įvertintų junginių, didžiausias kiekis

nustatytas chlorogeno rūgšties (atitinkamai 2019,31±4,28 μg/g ir 2731,74±4,35 μg/g). Veislės „Lodel"

obuolių žievelėse chlorogeno rūgšties nustatyta 2,8 karto mažiau (709,94±0,98 μg/g), nei „Aldas"

žievelėse. „Lodel" minkštimuose chlorogeno rūgšties nustatyta 1630,88±5,97 μg/g (1 lentelė).

Chlorogeno rūgštis yra vienas iš didžiausiais kiekiais nustatomų junginių obuoliuose, ypač dideliais

(a)

8 pav. Veislės „Aldas" (a) ir „Lodel" (b) minkštimų ėminių etanolinių ekstraktų

chromatograma (λ=280 nm).1-procianidinas B1, 2-(+)-katechinas, 3-chlorogeno

rūgštis, 4-procianidinas B2, 5-(–)-epikatechinas, 6-rutinas, 7-hiperozidas, 8-

izokvercitrinas, 9-avikuliarinas, 10-kvercitrinas, 11-floridzinas.

(b)

35

kiekiais nustatomas minkštime. Tokias tendencijas patvirtina kitų mokslininkų tyrimų duomenys [3,

21, 77, 78].

Didžiausias kvercetino glikozidų kiekis (1690,20 μg/g) nustatytas „Aldas" žievelėse. Veislės

„Lodel" žievelėse nustatytas mažesnis kvercetino glikozidų kiekis (1025,78 μg/g). Abiejose veislėse

didžiausiais kiekiais kaupiamas kvercetino glikozidas yra hiperozidas: „Aldas" žievelėse nustatyta

642,41±2,30 μg/g, „Lodel" žievelėse - 395,38±0,50 μg/g hiperozido. „Aldas" žievelėse aptikti didesni

kiekiai avikuliarino ir kvercitrino (atitinkamai 556,01±15,99 μg/g ir 377,10±0,11μg/g). „Lodel"

žievelėse nustatyti mažesni avikuliarino ir kvercitrino kiekiai (316,24±7,32 μg/g ir 263,94±14,42

μg/g). Abiejų veislių žievelėse nustatyti maži rutino ir izokvercitrino kiekiai (1 lentelė). „Aldas" ir

„Lodel" minkštimuose nustatyti labai maži kvercetino glikozidų kiekiai. Kvercetino glikozidai obuolių

žievelėse kaupiami daug didesniais kiekiais nei minkštime. Tokios tendencijos stebimos ir kitų

mokslininkų tyrimų rezultatuose [77, 78].

Monomeriniai flavan-3-oliai obelų veislės „Aldas" obuoliuose yra kaupiami didesniais

kiekiais žievelėse (920,61 μg/g) nei minkštimuose (574,50 μg/g). Veislės „Lodel" obuoliuose didesnis

flavan-3-olių kiekis nustatytas minkštimuose (1058,53 μg/g) nei žievelėse (662,19 μg/g). Abiejų

veislių žievelėse ir minkštimuose didžiausią dalį flavan-3-olių sudaro (-)-epikatechinas, o (+)-

Junginys, μg/g Žievelės Minkštimai

„Aldas" „Lodel" „Aldas" „Lodel"

Hiperozidas 642,41±2,30 395,38±0,50 19,27±0,44 15,89±0,12

Izokvercitrinas 86,93±1,32 26,50±0,16 9,54±0,10 1,46±0,07

Rutinas 27,76±1,35 23,72±0,64 - -

Avikuliarinas 556,01±15,99 316,24±7,32 25,93±0,67 21,48±0,09

Kvercitrinas 377,10±0,11 263,94±14,42 29,07±0,53 23,01±0,49

(+)-Katechinas 111,17±1,51 74,55±5,01 89,34±1,73 49,29±2,63

(-)-Epikatechinas 809,44±1,70 587,64±2,89 485,16±0,95 1009,24±1,99

Procianidinas B1 110,23±0,09 85,73±2,06 115,37±4,11 71,25±1,02

Procianidinas B2 948,02±11,49 736,62±9,30 839,14±3,39 1344,16±5,32

Floridzinas 236,62±2,74 235,91±0,67 131,92±1,07 386,18±1,57

Chlorogeno rūgštis 2019,31±4,28 709,94±0,98 2731,74±4,35 1630,88±5,97

Bendras junginių

kiekis 5924,99 3456,17 4487,60 4564,36

1 lentelė. Fenolinių junginių kiekiai obelų veislių „Aldas" ir „Lodel" obuolių minkštimuose ir

žievelėse (n=3)

36

katechinas obuoliuose sudaro mažą flavan-3-olių dalį (1 lentelė). Didesni (-)-epikatechino kiekiai

nustatyti ir kitų mokslininkų tyrimuose [77, 78].

Obelų veislės „Aldas" obuolių žievelėse procianidino B2 ir procianidino B1 nustatyta

atitinkamai 948,02±11,49 μg/g ir 110,23±0,09 μg/g. Minkštimuose - 839,14±3,39 μg/g ir 115,37±4,11

μg/g. Veislės „Lodel" žievelėse procianidino B2 nustatyta mažiau nei minkštimuose. Žievelėse

nustatyta 736,62±9,30 μg/g, o minkštimuose - 1344,16±5,32 μg/g procianidino B2. Procianidino B1

„Lodel" žievelėse nustatyta 71,25±1,02 μg/g, minkštimuose - 85,73±2,06 μg/g (1 lentelė). „Aldas" ir

„Lodel" minkštimuose ir žievelėse nustatytas panašus bendras proantocianidinų kiekis. Abiejų obelų

veislių obuolių žievelių ir minkštimų ėminiuose procianidino B2 nustatyta daugiau nei procianidino B1.

Tai patvirtina kitų mokslininkų atlikti fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties obuoliuose

tyrimai, kuriuose nustatomi maži procianidino B1 kiekiai arba junginys nėra identifikuojamas [3, 77,

78].

Didžiausias floridzino kiekis nustatytas obelų veislės „Lodel" obuolių minkštimuose

(386,18±1,57 μg/g). Veislės „Aldas" minkštimuose nustatytas 2,9 karto mažesnis floridzino kiekis

(131,92±1,07 μg/g). „Lodel" ir „Aldas" žievelėse nustatyti beveik vienodi floridzino kiekiai

(atitinkamai 235,91±0,67 μg/g ir 236,62±2,74 μg/g) (1 lentelė). Tyrimų rezultatus lyginant su kitų

mokslininkų tyrimų rezultatais, veislės „Lodel" minkštimuose kaupiami dideli floridzino kiekiai. Kitų

mokslininkų tyrimų duomenimis didesni floridzino kiekiai įprastai nustatomi obuolio žievelėje [21, 77,

78].

Gausiausi fenoliniai junginiai veislės Aldas žievelėse yra chlorogeno rūgštis (2019,31±4,28

μg/g), procianidinas B2 (948,02±11,49 μg/g) bei (-)-epikatechinas (809,44±1,70 μg/g). Bendras

fenolinių junginių kiekis „Aldas" žievelėse yra 5924,99 μg/g. „Lodel" žievelėse didžiausi kiekiai

nustatyti chlorogeno rūgšties (709,94±0,98 μg/g), procianidino B2 (736,62±9,30 μg/g), (-)-

epikatechino (587,64±2,89 μg/g). Bendras fenolinių junginių kiekis „Lodel" žievelėse yra 3456,17

μg/g (1 lentelė). Procentinis skirtumas tarp veislių „Aldas" ir „Lodel" žievelėse nustatyto bendro

fenolinių junginių kiekio yra 52,63 proc..

„Aldas" ir „Lodel" veislių obuolių minkštimuose didžiausiais kiekiais nustatyti tie patys

junginiai kaip ir žievelėse. Obelų veislės „Aldas" obuolių minkštimuose didžiausiais kiekiais nustatyta

chlorogeno rūgštis (2731,74±4,35 μg/g), procianidinas B2 (839,14±3,39 μg/g) ir (-)-epikatechinas

(485,16±0,95 μg/g). „Lodel" obuolių minkštimuose taip pat vyravo chlorogeno rūgštis (1630,88±5,97

μg/g), procianidinas B2 (1344,16±5,32 μg/g) bei (-)-epikatechinas (1009,24±1,99 μg/g).

Bendras fenolinių junginių kiekis „Aldas" ir „Lodel" minkštimuose yra atitinkamai 4487,60

μg/g ir 4564,36 μg/g. Procentinis skirtumas tarp veislių „Aldas" ir „Lodel" minkštimuose nustatyto

bendro fenolinių junginių kiekio yra 1,70 proc..

37

Obuolių veislės „Aldas" obuolių žievelės ir minkštimai kaupia didelius chlorogeno

rūgšties kiekius. Chlorogeno rūgštis sudaro didžiąją dalį visų veislės „Aldas" minkštimuose nustatytų

fenolinių junginių. Didelis bendras fenolinių junginių kiekis ir didelis chlorogeno rūgšties kiekis

„Aldas" veislės žievelėse yra patvirtinamas ankstesnių tyrimų duomenimis [3].

5.5. Obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas

spektrofotometriniu metodu

Antioksidaciniu aktyvumu pasižyminčių vaistinių augalinių žaliavų paieška yra aktuali.

Augalinėse žaliavose nustatomi fenoliniai junginiai yra reikalingi, siekiant palaikyti oksidacinės-

redukcinės sistemos homeostazę [14]. Organizme susidarantys laisvieji radikalai didina vėžio, širdies,

kraujagyslių ir kitų organų lėtinių ligų riziką bei skatina senėjimo procesą [12]. Norint apsaugoti

organizmą nuo laisvųjų radikalų, yra svarbu su maistu gauti pakankamai antioksidaciniu aktyvumu

pasižyminčių medžiagų. Obuoliai ir jų produktai pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis

[14]. Svarbu nustatyti Lietuvoje auginamų obelų veislių obuolių žievelių ir minkštimų antioksidacinį

aktyvumą.

Siekiant nustatyti obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“

minkštimų ir žievelių antioksidacinį aktyvumą, atlikti antioksidacinio aktyvumo tyrimai naudojant

redukcinį FRAP metodą bei ABTS ir DPPH radikalų surišimo metodus.

5.5.1. Obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo

nustatymas ABTS metodu

ABTS radikalo surišimo spektrofotometrinis metodas yra nesudėtingas, greitai atliekamas,

pasižymi geru atkartojamumu. Metodas plačiai pritaikomas įvairių objektų analizei. Metodą galima

naudoti hidrofilinių ir lipofilinių junginių analizei [9].

Nustatytas antioksidacinis aktyvumas obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“,

„Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių minkštimuose. Didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas

veislės „Auksis" (77,43±3,56 µmol TE/g) obuolių minkštimo ekstrakte. Panašus, bet mažesnis

antioksidacinis aktyvumas nustatytas „Lodel" (75,31±3,80 µmol TE/g) ir „Aldas" (73,76±2,79 µmol

38

TE/g) veislių obuolių minkštimų ekstraktuose. Mažesnis antioksidacinis aktyvumas nustatytas veislių

„Ligol“ (64,82±3,82 µmol TE/g) ir „Connel Red“ (69,17±3,24 µmol TE/g) minkštimuose. Mažiausiu

antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo „Rajka" veislės obuolių minkštimai (56,20±1,42 µmol TE/g) (9

pav.).


„Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių žievelėse. Didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas

veislės „Aldas" (119,86±3,23 µmol TE/g) obuolių žievelių ekstrakte. Labai panašus, mažesnis

antioksidacinis aktyvumas nustatytas „Auksis" (118,29±2,46 µmol TE/g) ir „Connel Red"

(117,29±1,35 µmol TE/g) veislių obuolių žievelių ekstraktuose. Mažesnis antioksidacinis aktyvumas

nustatytas veislių „Ligol“ (91,73±2,53 µmol TE/g) ir „Lodel“ (87,76±4,25 µmol TE/g) obuolių

žievelėse. Mažiausias - „Rajka" (80,41±3,26 µmol TE/g) veislės obuolių žievelėse (10 pav.).

9 pav. ABTS spektrofotometriniu metodu nustatytas obuolių minkštimų antioksidacinis

aktyvumas (n=3)

10 pav. ABTS spektrofotometriniu metodu nustatytas obuolių žievelių antioksidacinis

aktyvumas (n=3)

39

Kiti mokslininkai, obuolių antioksidaciniam aktyvumui nustatyti naudoję spektrofotometrinį

ABTS metodą, nustatė daug mažesnį antioksidacinį aktyvumą: obuolių žievelėse 19 - 45 µmol TE/g

[42], obuoliuose su žievelėmis 17 - 25 µmol TE/g [21]. Vynuogių išspaudose ABTS metodu nustatytas

193,36 - 485,42 µmol TE/g antioksidacinis aktyvumas [75].

5.5.2. Obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo

nustatymas DPPH metodu

DPPH radikalo surišimo spektrofotometrinis metodas yra plačiai naudojamas išgrynintų

fenolinių junginių bei augalinės žaliavos ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymui. Tai yra

nesudėtingas metodas. Lyginant su kitais, DPPH metodas pasižymi ilgesne vykdymo trukme, DPPH

radikalas nėra tirpus vandenyje, o mėginyje esant antocianinų antioksidacinis aktyvumas gali būti

pervertinamas. Nepaisant trūkumų, metodas yra populiarus ir pasižymi geru atkartojamumu.


„Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių minkštimuose naudojant DPPH spektrofotometrinį metodą.

Didžiausias antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas veislės „Aldas" (59,56±1,87 µmol TE/g)

minkštimuose. Labai panašus antioksidacinis aktyvumas nustatytas „Auksis" (59,53±3,27 µmol TE/g)

ir „Lodel" (58,62±2,88 µmol TE/g) obuolių minkštimuose. Mažesniu antioksidaciniu aktyvumu

pasižymėjo veislių „Connel Red“ (43,81±2,61 µmol TE/g) ir, „Ligol“ (41,56±2,64 µmol TE/g) obuolių

minkštimai. Mažiausiu - veislės „Rajka" (40,43±2,42 µmol TE/g) minkštimai (11 pav.).

11 pav. DPPH spektrofotometriniu metodu nustatytas obuolių minkštimų

antioksidacinis aktyvumas (n=3)

40


„Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių minkštimuose. Didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo

veislės „Aldas" (98,49±3,09 µmol TE/g) žievelės, o mažiausiu - veislių „Ligol" (62,87± 2,72 µmol

TE/g) ir „Rajka" (65,16±2,10 µmol TE/g) žievelės (12 pav.).

Tyrimo rezultatus lyginant su kitų mokslininkų atliktų tyrimų rezultatais, naudojant DPPH

metodą, kitų tyrimų metu nustatytas daug mažesnis antioksidacinis aktyvumas obuolių minkštime

(3,46 – 8,91 μmol TE/g) ir žievelėse (10,0 – 38,77 μmol TE/g) [91]. Vynuogių išspaudose nustatytas

didesnis antioksidacinis aktyvumas (188,02 - 505,52 µmol TE/g) [75].

DPPH metodu nustatytas antioksidacinis aktyvumas turėtų būti interpretuojamas atsargiai,

kadangi metodu nustatomi tik organiniuose tirpikliuose tirpūs antioksidantai, DPPH radikalas yra

jautrus šviesai, deguoniui, pH pokyčiams, rezultatai skiriasi naudojant skirtingus tirpiklius [59]. Dėl

DPPH radikalo erdvinės struktūros, mažos molekulės lengviau suriša DPPH radikalą [68].

5.5.3 Obuolių žievelių ir minkštimų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo

nustatymas FRAP metodu

FRAP spektrofotometrinis metodas yra paprastas, pigus, pasižymi geru atkartojamumu. FRAP

spektrofotometriniu metodu nustatomas tik vandenyje tirpių, rūgštinėje terpėje stabilių junginių

antioksidacinis aktyvumas. FRAP metodu nustatytas mėginio antioksidacinis aktyvumas gali stipriai

12 pav. DPPH spektrofotometriniu metodu nustatytas obuolių žievelių antioksidacinis

aktyvumas (n=3)

41

skirtis priklausomai nuo tiriamų junginių struktūros ir laiko, praėjusio nuo reakcijos pradžios -

paprastos struktūros fenoliniai junginiai su FRAP reagentu reaguoja greitai, o reakcija su daug

fenolinių grupių turinčiais junginiais gali trukti kelias valandas.


„Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių minkštimuose naudojant FRAP spektrofotometrinį metodą.

Didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas veislės „Lodel" (76,79±2,39 µmol TE/g) obuolių

minkštimuose. Tarpusavyje panašus antioksidacinis aktyvumas nustatytas veislių „Ligol" (59,36±2,42

µmol TE/g), „Connel Red“ (57,10±3,13 µmol TE/g), „Aldas" (64,92±3,32 µmol TE/g) ir „Auksis"

(65,43±2,82 µmol TE/g) obuolių minkštimuose. Mažiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas

veislės „Rajka" minkštimuose (43,61±3,01 µmol TE/g) (13 pav.).


„Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių žievelėse. Didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas

„Auksis" (117,90±2,00 µmol TE/g) ir „Aldas" (117,17±2,60 µmol TE/g) veislių obuolių žievelėse.

Mažesnis, tarpusavyje panašus, antioksidacinis aktyvumas nustatytas veislių „Ligol“ (80,94±2,67

µmol TE/g) ir „Rajka“ (87,78±2,75 µmol TE/g) žievelėse. Mažiausiu antioksidaciniu aktyvumu

pasižymėjo „Lodel" veislės obuolių žievelės (65,95±3,41 µmol TE/g) (14 pav.).

13 pav. FRAP spektrofotometriniu metodu nustatytas obuolių minkštimų antioksidacinis

aktyvumas (n=3)

42

Kitų mokslininkų duomenimis, obuolių žievelių antioksidacinis aktyvumas, nustatytas FRAP

metodu varijuoja 49,9 - 131,0 µmol TE/g ribose. Didžiausias antioksidacinis aktyvuvas nustatytas

veislės „Dolgo" žievelėse, o mažiausias - „Antanovka" žievelėse [36].

5.6. Flavonoidų, fenolinių junginių ir proantocianidinų kiekių ir antioksidacinio

aktyvumo koreliacinių ryšių vertinimas

Norint nustatyti fenolinių junginių grupes, darančias didžiausią įtaką obuolių

antioksidaciniam aktyvumui, būtina įvertinti bendro fenolinių junginių, flavonoidų ir proantocianidinų

kiekio koreliacinius ryšius su ABTS, DPPH ir FRAP metodais nustatytu antioksidaciniu aktyvumu.

Antioksidacinis

aktyvumas, µmol TE/g

Fenolinių junginių

kiekis, proc.

Flavonoidų kiekis,

proc.

Proantocianidinų

kiekis, proc.

ABTS 0,898 0,788 0,908

FRAP 0,858 0,756 0,905

DPPH 0,953 0,880 0,909

14 pav. FRAP spektrofotometriniu metodu nustatytas obuolių žievelių antioksidacinis

aktyvumas (n=3)

2 lentelė. Fenolinių junginių, flavonoidų bei proantocianidinų kiekio (proc.) obuolių minkštimuose

ir žievelėse bei antioksidacinio aktyvumo (µmol TE/g) koreliacijos koeficientai

43

Koreliacinių ryšių vertinimui apskaičiuoti Pirsono koreliacijos koeficientai (p<0,01).

Nustatyti stiprūs koreliaciniai ryšiai tarp antioksidacinio aktyvumo tirto ABTS spektrofotometriniu

metodu ir tarp bendro fenolinių junginių kiekio (0,898) bei flavonoidų kiekio (0,788) ir labai stiprūs

koreliaciniai ryšiai su proantocianidinų kiekiu (0,908). Tarp antioksidacinio aktyvumo, nustatyto

FRAP spektrofotometriniu metodu ir fenolinių junginių (0,858), flavonoidų (0,756) kiekių taip pat

nustatyti stiprūs koreliaciniai ryšiai bei labai stiprūs koreliaciniai ryšiai su proantocianidinų (0,905)

kiekiu. Tarp DPPH metodu nustatyto antioksidacinio aktyvumo ir flavonoidų kiekio nustatyti stiprūs

koreliaciniai ryšiai (0,880) ir labai stiprūs koreliaciniai ryšiai su fenoliniais junginiais (0,953) bei

proantocianidinais (0,909). Stipriausi koreliaciniai ryšiai nustatyti tarp skirtingais metodais nustatyto

obuolių žievelių bei minkštimų antioksidacinio aktyvumo ir bendro proantocianidinų kiekio (2 lentelė).

Remiantis eksperimentinių tyrimų rezultatais ir nustatytais koreliaciniais ryšiais, galima teigti,

kad didžiausią įtaką obuolių antioksidaciniam aktyvumui daro bendras fenolinių junginių ir

proantocianidinų kiekis. Tai atitinka kitų mokslininkų atliktų tyrimų rezultatus [88, 55].

5.7. Kiekybinis pektinų įvertinimas gravimetriniu metodu

Pektinai yra polisacharidai, sudaryti iš galakturono rūgšties fragmentų. Dėl gelifikuojančių

savybių pektinai naudojami maisto, farmacijos ir kosmetikos pramonėje. Viena iš pramonėje

naudojamų pektinų žaliavų yra obuoliai. Siekiant įvertinti Lietuvoje auginamų obuolių žievelių ir

minkštimų, kaip pektinų žaliavos vertę, atliktas pektinų kiekio nustatymas gravimetriniu metodu obelų

veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių minkštimuose ir

žievelėse.

Daugiausia pektinų nustatyta „Rajka" (16,2±0,6 proc.) ir „Connel Red" (14,8±0,6 proc.)

veislės obuolių žievelėse. Tarp minkštimų mažiausias pektinų kiekis nustatytas „Aldas" (10,0±0,7

proc.) ir „Lodel" (10,2±0,4 proc.) veislių minkštimuose (15 pav.).

44

Didžiausias pektinų kiekis nustatytas „Rajka" (13,3±0,5 proc.) ir „Ligol (12,2±0,6 proc.)

veislės žievelėse, o mažiausias „Connel Red" (9,9±0,6 proc.). ir „Lodel" žievelėse (9,9±0,5 proc.) (16

pav.).

Rezultatai atitinka kitų autorių tyrimų duomenis. Tiriant obuolių išspaudas, nustatyta, kad

priklausomai nuo veislės ir ekstrakcijos sąlygų pektinų kiekiai varijuoja nuo 3,4 proc. iki 15 proc. [27,

50].

16 pav. Pektinų kiekis obuolių žievelėse (n=3)

15 pav. Pektinų kiekis obuolių minkštimuose (n=3)

45

6. IŠVADOS

1. Nustatytas bendro fenolinių junginių, flavonoidų ir proantocianidinų kiekio įvairavimas obelų

veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių žievelių ir

minkštimų ėminiuose. Veislės „Aldas" obuolių žievelėse nustatyti didžiausi fenolinių junginių

(3,37±0,03 proc.), flavonoidų (0,24±0,003 proc.) ir proantocianidinų (0,29±0,006 proc.) kiekiai.

Veislės „Lodel" obuolių minkštimuose nustatyti didžiausi fenolinių junginių (2,60±0,05 proc.),

flavonoidų (0,03±0,001 proc.) ir proantocianidinų (0,21±0,007 proc.) kiekiai.

2. Atlikta obelų veislių „Aldas“ ir „Lodel“ obuolių žievelių ir minkštimų kokybinės ir kiekybinės

sudėties analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu:

a) Obelų veislių „Aldas“ ir „Lodel" obuolių žievelių ėminiuose atitinkamai nustatyta 920,61 μg/g

ir 662,19 μg/g flavan-3-olių, 1058,25 μg/g ir 822,35 μg/g proantocianidinų, 1690,20 μg/g ir

1025,78 μg/g kvercetino glikozidų, 2019,31 μg/g ir 709,94 μg/g fenolinių rūgščių, 236,62 μg/g ir

235,91 μg/g dihidrochalkonų.

b) Obelų veislių „Aldas“ ir „Lodel" obuolių minkštimų ėminiuose atitinkamai nustatyta 574,50

μg/g ir 1058,53 μg/g flavan-3-olių, 954,51 μg/g ir 1415,41 μg/g proantocianidinų, 94,93 μg/g ir

73,35 μg/g kvercetino glikozidų, 2731,74 μg/g ir 1630,88 μg/g fenolinių rūgščių, 131,92 μg/g ir

386,18 μg/g dihidrochalkonų.

3. Atliktas obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir „Lodel“ obuolių

žievelių ir minkštimų ėminių ekstraktų antioksidacinio aktyvumo tyrimas. Didžiausias

antioksidacinis aktyvumas nustatytas obelų veislių „Auksis" (77,43±3,56 µmol TE/g), „Aldas"

(73,76±2,79 µmol TE/g) ir „Lodel" (75,31±3,80 µmol TE/g) obuolių minkštimų ėminių

ekstraktuose. Žievelių ėminių ekstraktuose didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas obelų

veislių „Aldas" (119,86±3,23 µmol TE/g), „Auksis" (118,28±2,46 µmol TE/g) ir „Connel Red"

(117,29±1,35 µmol TE/g) obuolių žievelių ėminių ekstraktuose.

4. Nustatyti stiprūs ir labai stiprūs koreliaciniai ryšiai (p<0,01) tarp bendro fenolinių junginių kiekio,

flavonoidų kiekio, proantocianidinų kiekio (proc.) ir skirtingais metodais nustatyto antioksidacinio

aktyvumo (µmol TE/g). Bendras fenolinių junginių kiekis ir antioksidacinis aktyvumas koreliuoja

0,858 - 0,953 ribose. Flavonoidų kiekis ir antioksidacinis aktyvumas koreliuoja 0,756 - 0,880

ribose. Proantocianidinų kiekis ir antioksidacinis aktyvumas koreliuoja 0,905 - 0,909 ribose.

5. Nustatytas pektinų kiekis obelų veislių „Ligol“, „Connel Red“, „Aldas“, „Auksis“, „Rajka“ ir

„Lodel“ obuolių žievelėse ir minkštimuose gravimetriniu metodu. Didžiausias pektinų kiekis

nustatytas „Rajka" veislės obuolių žievelėse (13,3±0,5 proc.) ir minkštimuose (16,2±0,6 proc.).

46

7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

1. Rekomenduojame obelų veislių „Aldas" ir „Lodel" obuolius naudoti maisto produktų bei maisto

papildų gamybai. Veislių „Aldas" ir „Lodel" obuoliuose nustatytas didžiausias bendras fenolinių

junginių, flavonoidų, proantocianidinų kiekis bei didelis antioksidacinis aktyvumas.

2. Obuolius vartojant maistui arba atliekant vaisių paruošimą obuolių produktų gamybai,

rekomenduojame naudoti visą obuolį. Obuolių žievelėse nustatytas didesnis bendras fenolinių

junginių, flavonoidų, proantocianidinų kiekis ir didesnis antioksidacinis aktyvumas nei

minkštimuose.

47

8. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Grigas A. Lietuvos augalų vaisiai ir sėklos. Vilnius: Mokslas; 1986 p. 190.

2. Jakštas V, Janulis V, Trumbeckaitė S. Cheminis fitopreparatų tyrimas. Kaunas: KMU leidykla;

2009. p. 71-9.

3. Liaudanskas M, Viškelis P, Jakštas V, Raudonis R, Kviklys D, Milašius A, Janulis V.

Application of an optimized HPLC method for the detection of various phenolic compounds in

apples from Lithuanian cultivars. J Chem. New York. 2014; 2014.

4. Liaudanskas M, Viškelis P, Raudonis R, Kviklys D, Uselis N, Janulis V. Phenolic Composition

and Antioxidant Activity of Malus domestica Leaves. ScientificWorldJournal. 2014;

2014:306217.

5. Sikorskaite S, Gelvonauskiene D, Stanys V, Baniulis D. Characterization of microsatellite loci

in apple (Malus × domestica Borkh.) cultivars. Žemdirbystė=Agriculture. 2012;

99(2):131‒138.

6. Urbonavičiūtė A., Jakštas V., Kornyšova O., Janulis V., Maruška A. Capillary electrophoretic

analysis of flavonoids in single-styled hawthorn (Crataegus monogyna Jacq.) ethanolic

extracts. J Chromatogr. A. 2006; 1112:339-44.

7. Andersen OM, Markham KR. Flavonoids: chemistry, biochemistry, and applications. USA:

CRC Press. 2005.

8. Awad MA, Jager AD, Westing LMV. Flavonoid and chlorogenic acid levels in apple fruit:

characterisation of variation. Sci Hort. 2000 Mar; 31(3-4):249–63.

9. Awika JM, Rooney LW, Wu X, Prior RL, Cisneros-Zevallos L. Screening Methods to Measure

Antioxidant Activity of Sorghum (Sorghum bicolor) and Sorghum Products. J Agric Food

Chem. 2003 Nov 5; 51(23):6657-62.

10. Bai XL, Yue TL, Yuan YH, Zhang HW. Optimization of microwave-assisted extraction of

polyphenols from apple pomace using response surface methodology and HPLC analysis. J Sep

Sci. 2010 Dec; 33(23-24):3751-8.

11. Benzie IFF, Strain JJ. The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as a Measure of

Antioxidant Power: The FRAP Assay. Anal Chem. 1996; 239:70-6.

12. Boyer J, Liu RH. Antioxidants of Apples. N Y Fruit Q. 2003; 11(4):11-15.

13. Boyer J, Liu RH. Apple phytochemicals and their health benefits. Nutr J. 2004 May 12; 3:5.

14. Bouayed J, Hoffmann L, Bohn T. Antioxidative Mechanisms of Whole-Apple Antioxidants

Employing Different Varieties from Luxembourg. J Med Food. 2011 Dec;14(12):1631-7.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423899001247



http://www.sciencedirect.com/science/journal/03044238

48

15. Brown P. High Pressure Liquid Chromatography – Biochemical and Biomedical Applications.

New York, London: Academic Press; 1973. p. 2-14.

16. Carrasco-Pozo C, Speisky H, Brunser O, Pastene E, Gotteland M. Apple peel polyphenols

protect against gastrointestinal mucosa alterations induced by indomethacin in rats. J Agric

Food Chem. 2011 Jun 22;59(12):6459-66.

17. Chandrasekar V, González MFS, Hirst P, Ballard TS. Optimizing Microwave-Assisted

Extraction of Phenolic Antioxidants from Red Delicious and Jonathan Apple Pomace. J Food

Process Eng. 2015.

18. Chang CC, Yang MH, Wen HM, Chern JC. Estimation of Total Flavonoid Content in Propolis

by Two Complementary Colorimetric Methods. J Food Drug Anal. 2002; 10(3):178-82.

19. Chen W, Wang WP, Zhang HS, Huang Q. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of

water-soluble polysaccharides from Boletus edulis mycelia using response surface

methodology. Carbohydr Polym. 2012; 87(1):614–9.

20. Destandau E, Michel T, Elfakir C.. Microwave-Assisted Extraction. Cambridge: RSC

Publishing; 2013.

21. Duda-Chodak A, Tarko T, Tuszyński T. Antioxidant activity of apples – an impact of maturity

stage and fruit part. Acta Sci Pol Technol Aliment. 2011 Oct-Dec; 10(4):443-54.

22. Enomoto T, Nagasako-Akazome Y, Kanda T, Ikeda M, Dake Y. Clinical effects of apply

polyphenols on persistent allergic rhinitis: A randomized double-blind placebo-controlled

parallel arm study. J Investig Allergol Clin Immunol. 2006; 16(5):283-9.

23. Escarpa A, González MC. High-performance liquid chromatography with diode-array detection

for the determination of phenolic compounds in peel and pulp from different apple varieties. J

Chromatogr A. 1998 Oct 9; 823(1–2):331–7.

24. Ferreres F, Gomes D, Valentão P, Gonçalves R, Pio, R, Alves, E et al. Improved loquat

(Eriobotrya japonica Lindl.) cultivars: variation of phenolics and antioxidative potential. Food

Chem. 2009; 114:1019-1027.

25. Flores MIA. González RR, Vidal JLM, Frenich AG. Evaluation of the Presence of Phenolic

Compounds in Different Varieties of Apple by Ultra-High-Performance Liquid

Chromatography Coupled to Tandem Mass Spectrometry. Food Anal Methods. 2015;

8(3):696–709.

26. Francini A, Sebastiani L. Phenolic Compounds in Apple (Malus x domestica Borkh.):

Compounds Characterization and Stability during Postharvest and after Processing.

Antioxidants. 2013; 2:181-93.

49

27. Garna H, Mabon N, Robert C, Cornet C, Legros H, Wathelet B et al. Effect of Extraction

Conditions on the Yield and Purity of Apple Pomace Pectin Precipitated but Not Washed by

Alcohol. J Food Sci. 2007 Jan; 72(1):C001-9.

28. González M, Guzmán B, Rudyk R, Romano E, Molina MAA. Spectrophotometric

Determination of Phenolic Compounds in Propolis. Lat Am J Pharm 2003; 22(3):243-8.

29. Gu L, Kelm MA, Hammerstone JF, Beecher G, Holden J, Haytowitz D. Concentrations of

Proanthocyanidins in Common Foods and Estimations of Normal Consumption. J Nutr. 2004

Mar;134(3):613-7.

30. Hagerman AE. Modified Prussian Blue Assay For Total Phenols. J Agric Foods Chem. 2002.

31. Hagerman AE. Prussian Blue Assay For Total Phenols. J Agric Foods Chem. 2002.

32. He RR, Wang M, Wang CZ, Chen BT, Lu CN, Yao XS. Protective effect of apple polyphenols

against stress-provoked influenza viral infection in restraint mice. J Agric Food Chem. 2011

Apr 27; 59(8):3730-7.

33. Heil M, Baumann B, Andary C, Linsenmair KE, McKey D. Extraction and quantification of

'condensed tannins' as a measure of plant anti-herbivore defence? Revisiting an old problem.

Naturwissenschaften. 2002; 89:519-24.

34. Hellström JK, Mattila PH. HPLC Determination of Extractable and Unextractable

Proanthocyanidins in Plant Materials. J Agric Food Chem. 2008 Sep 10; 56(17):7617-24.

35. Hyson DA. A Comprehensive Review of Apples and Apple Components and Their

Relationship to Human Health. Adv Nutr. 2011 Sep; 2:408-20.

36. Huber GM, Rupasinghe HP. Phenolic Profiles and Antioxidant Properties of Apple Skin

Extracts. J Food Sci. 2009 Nov-Dec; 74(9):C693-700.

37. Jackson JE. The Biology of Apples and Pears. Camrbidge university press. 2003.

38. Jain SM, Priyadarshan PM. Breeding Plantation Tree Crops: Temperate Species. New York:

Springer-Verlag. 2009 Mar 1; p. 36.

39. Jun, X. Shouqin Z. Antioxidant activity of ethanolic extracts of propolis by hydrostatic pressure

extraction. Int. J. Food Sci. Tech. 2007; 42(11):1350–6.

40. Kähkönen MP,. Hopia AI, Vuorela HJ, Rauha JP, Pihlaja K, Kujala TS et al. Antioxidant

Activity of Plant Extracts Containing Phenolic Compounds. J Agric Food Chem. 1999 Oct;

47(10):3954-62.

41. Kanda T, Akiyama H, Yanagida A, Tanabe M, Goda Y, Toyoda M et al. Inhibitory effects of

apple polyphenol on induced histamine release from RBL-2H3 cells and rat mast cells. Biosci

Biotechnol Biochem. 1998 Jul; 62(7):1284-9.

50

42. Karaman S, Tütem E, Başkan KS, Apak R. Comparison of antioxidant capacity and phenolic

composition of peel and flesh of some apple varieties. J Sci Food Agric. 2013 Mar 15;

93(4):867-75.

43. Kataoka H. New Trends in Sample Preparation for Analysis of Plant-Derived Medicines. Curr

Org Chem. 2010; 14:1698-713.

44. Khoddami A, Wilkes MA, Roberts TH. Techniques for Analysis of Plant Phenolic Compounds.

Molecules. 2013 Feb 19; 18(2):2328-75.

45. Kindt M, Orsini MC, Costantini B. Improved High-Performance Liquid Chromatography–

Diode Array Detection Method for the Determination of Phenolic Compounds in Leaves and

Peels From Different Apple Varieties. J Chromatogr Sci. 2007 Sep; 45(8):507-14.

46. Lee KW, Kim YJ, Kim DO, Lee HJ, Lee CY. Major phenolics in apple and their contribution

to the total antioxidant capacity. J Agric Food Chem. 2003 Oct 22; 51(22):6516-20.

47. Leonelli C. Mason TJ. Microwave and ultrasonic processing: now a realistic option for

industry. Chem Eng Process. Process Intensif. 2010; 49(9):885-900.

48. Liu RH, Eberhardt MV, Lee CY. Antioxidant and antiproliferative activites of selected New

York apple cultivars. N Y Fruit Q. 2001; 9:15-17.

49. Lu Y, Foo LY. Antioxidant and radical scavenging activities of polyphenols from apple

pomace. Food Chem. 2000; 68:81–85.

50. May CD. Industrial pectins: Sources, production and applications. Carbohydr Polym. 1990;

12(1): 79-99.

51. Mayanka W, Tavleen SM, Dharmesh K, Vijai KA, Bikram S. Chemical Composition and In

Vitro Cytotoxic Activity of Essential Oil of Leaves of Malus domestica Growing in Western

Himalaya (India) J Evid Based Complementary Altern Med. 2012; 2012.

52. Manzoor M, Anwar F, Saari N, Ashraf M. Variations of Antioxidant Characteristics and

Mineral Contents in Pulp and Peel of Different Apple (Malus domestica Borkh.) Cultivars from

Pakistan. Molecules. 2012 Jan 4; 17(1):390-407.

53. Maqsood A, Sabir SM, Qaisar M, Riaz M. Nutritional analysis and in-vitro antioxidant activity

of apple (Malus domestica). J Food Agric Environ. 2013; 11(3):168-72.

54. Markowski J, Płocharsk W. Determination of phenolic compounds in Apples and processed

apple products. J Fruit Ornam Plant Res. 2006; 14(2): 133-42.

55. Matthes A, Schmitz-Eiberger M. Polyphenol content and antioxidant capacity of apple fruit:

effect of cultivar and storage conditions. J Appl Bot Food Qual. 2009; 82(2):152-157.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lee%20KW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14558772

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kim%20YJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14558772

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kim%20DO%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14558772

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lee%20HJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14558772

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lee%20CY%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14558772

51

56. Mir SA, Bhat AS, Ahangar AA. A simplified 2,4-dinitrophenylhydrazine assay for Flavonoids

and its comparison with a standard flavonoid assay. Int J PharmTech Res. 2014 Apr-Jun;

6(2):751-758.

57. Nagasako-Akazome Y, Kanda T, Ohtake Y, Shimasaki H, Kobayashi T. Apple polyphenols

influence cholesterol metabolism in healthy subjects with relatively high body mass index. J

Oleo Sci. 2007; 56(8):417-28.

58. Otles S. Methods of Analysis of Food Components and Additives. 2nd

ed. USA: CRC Press,

2011. p. 268.

59. Ozcelik B, Lee JH, Min DB. Effects of Light, Oxygen, and pH on The Absorbance of 2,2-

Diphenyl-1-Picrylhydrazyl. J. Food Sci. 2003; 68(2):487-490.

60. Patel RJ, Sarawade R. Analgesic activity of extracts of malus domestica (apple). WJPPS. 2015;

4(3):1240-8.

61. Patel V, Kaswala R, Chakraborty M, Kamath JV. Phytochemical and Pharmacological Profile

of Malus Domestica: An Overview. Int J Cur Biomed Phar Res. 2012; 2(2):334–8.

62. Peng Y, Liu F, Peng Y, Ye J. Determination of polyphenols in apple juice and cider by

capillary electrophoresis with electrochemical detection. Food Chem. 2005; 92(1):169–75.

63. Petkovšek MM, Stampar F, Veberic R. Increased phenolic content in apple leaves infected with

the apple scab pathogen. Journal of Plant Pathology. 2008; 90(1):49-55.

64. Pękal A, Pyrzynska K. Evaluation of Aluminium Complexation Reaction for Flavonoid

Content Assay. Food Anal Methods. 2014; 7:1776–82.

65. Phipps JB, Robertson KR, Smith PG, Rohrer JR. A checklist of the subfamily Maloideae

(Rocaceae). Can. J. Bot. 1990; 68(10):2209-69.

66. Picinelli A, Dapena E, Mangas JJ. Polyphenolic Pattern in Apple Tree Leaves in Relation to

Scab Resistance. A Preliminary Study. J Agric Food Chem. 1995; 43(8):2273–2278.

67. Picinelli A, Suarez B, Mangas JJ. Analysis of polyphenols in apple products. Z Lebensm

Unters Forsch A. 1997; 204:48-51.

68. Prior RL, Wu X, Schaich K. Standardized Methods for the Determination of Antioxidant

Capacity and Phenolics in Foods and Dietary Supplements. J Agric Food Chem. 2005 May 18;

53(10):4290-302.

69. Rabaneda FS, Ja´uregui O, Raventos RML, Viladomat F, Bastida J, Codina C. Qualitative

analysis of phenolic compounds in applepomace using liquid chromatography coupled to mass

spectrometry in tandem mode. Rapid Commun Mass Spectrom. 2004; 18(5):553-63.

70. Rasheed AM. Effect of Different Acids, Heating Time and Particle Size on Pectin Extraction

from Watermelon Rinds. Journal of Kerbala University, 2008; 6(4):236.

52

71. Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C. Antioxidant activity

applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic Biol Med.1999;

26:1231–7.

72. Reagan-Shaw S, Eggert D, Mukhtar H, Ahmad N. Antiproliferative effects of apple peel

extract against cancer cells, Nutr Cancer. 2010; 62(4):517-24.

73. Reis SF, Rai DK, Abu-Ghannam N. Water at room temperature as a solvent for the extraction

of apple pomace phenolic compounds. Food Chem. 2012 Dec 1;135(3):1991-8.

74. Rezaei S, Rezaei K, Haghighi M, Labbafi M. Solvent and Solvent to Sample Ratio as Main

Parameters in the Microwave-assisted Extraction of Polyphenolic Compounds from Apple

Pomace. Food Sci Biotechnol. 2013; 22(5):1269-74.

75. Rockenbach II , Rodrigues E, Gonzaga LV, Caliari V, Genovese MI, Gonçalves AEDSS et al.

Phenolic compounds content and antioxidant activity in pomace from selected red grapes (Vitis

vinifera L. and Vitis labrusca L.) widely produced in Brazil. Food Chem. 2011; 127(1):174-9.

76. Salas PG, Soto AM, Carretero AS, Gutiérrez AF. Phenolic-Compound-Extraction Systems for

Fruit and Vegetable Samples. Molecules. 2010 Dec 3; 15(12):8813-26.

77. Alonso-Salces RM, Barranco A, Corta E, Berrueta LA, Gallo B, Vicente F. A validated solid–

liquid extraction method for the HPLC determination of polyphenols in apple tissues

Comparison with pressurised liquid extraction. Talanta. 2005 Feb 15; 65(3):654-62.

78. Alonso-Salces RM, Korta E, Barranco A, Berrueta LA, Gallo B, Vicente F. Pressurized liquid

extraction for the determination of polyphenols in apple. J Chromatogr A. 2001 Nov 9; 933(1-

2):37-43.

79. Santos DT, Veggi PC, M. Meireles MAA. Optimization and economic evaluation of

pressurized liquid extraction of phenolic compounds from jabuticaba skins. J Food Eng. 2012

Feb; 108(3):444–52.

80. Schaefer S, Baum M, Eisenbrand G, Janzowski C. Modulation of oxidative cell damage by

reconstituted mixtures of phenolic apple juice extracts in human colon cell lines. Mol Nutr

Food Res. 2006 Apr; 50(4-5):413-7.

81. Schieber A, Keller P, Carle R. Determination of phenolic acids and flavonoids of apple and

pear by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A. 2001 Mar 2; 910(2):265-

73.

82. Singh RP, Sharad S, Kapur S. Free Radicals and Oxidative Stress in Neurodegenerative

Diseases: Relevance of Dietary Antioxidants. J Indian Acad Clin Med. 2004; 5(3):218-25.

83. Slinkard K., Singleton V. L. Total phenol analysis: Automation and comparison with manual

methods. Am J Enol Vitic. 1977; 28:49-55.




53

84. Stratil P, Kubáň V, Fojtová J. Comparison of the Phenolic Content and Total Antioxidant

Activity in Wines as Determined by Spectrophotometric Methods. Czech J Food Sci. 2008;

26(4):242–53.

85. Suarez B, Mangas JJ, Picinelli A. Solid-phase extraction and high-performance liquid

chromatographic determination of polyphenols in apple musts and ciders. J Chromatogr A.

1996; 727(2):203-9.

86. Thilakarathna SH, Rupasinghe HP, Needs PW. Apple peel bioactive rich extracts effectively

inhibit in vitro human LDL cholesterol oxidation. Food Chem. 2013 May 1; 138(1):463-70.

87. Tokura T, Nakano N, Ito T, Matsuda H, Nagasako-Akazome Y, Kanda T et al. Inhibitory effect

of polyphenol-enriched apple extracts on mast cell degranulation in vitro targeting the binding

between IgE and FcepsilonRI. Biosci Biotechnol Biochem. 2005 Oct; 69(10):1974-7.

88. Tsao R, Yang R, Xie S, Sockovie E, Khanizadeh S. Which polyphenolic compounds contribute

to the total antioxidant activities of apple? J Agric Food Chem. 2005 Jun 15; 53(12):4989-95.

89. Valverde MI, Periago MJ, Ros G. Nutritional importance of phenolic compounds in the diet.

Arch Latinoam Nutr. 2000 Mar; 50(1):5-18.

90. Veberic R, Trobec M, Herbinger K, Hofer M, Grill D, Stampar F. Phenolic compounds in some

apple (Malus domestica Borkh) cultivars of organic and integrated production. J Sci Food

Agric. 2005; 85(10):1687–94.

91. Vieiraa FGK, Borgesa GDSC, Copettia C, Pietrob PFD, Nunesc EDC, Fett R. Phenolic

compounds and antioxidant activity of the apple flesh and peel of eleven cultivars grown in

Brazil. Sci Hort. 2011; 128(3): 261–266.

92. Vrhovsek U, Rigo A, Tonon D, Mattivi F. Quantitation of polyphenols in

different apple varieties.. J Agric Food Chem. 2004 Oct; 52(21):6532–8.

93. Vriesmanna LC, Teófilo RF, Petkowicza CLO. Optimization of nitric acid-mediated extraction

of pectin from cacao pod husks (Theobroma cacao L.) using response surface methodology.

Carbohydr Polym. 2011 Apr; 84(4):1230–6.

94. Wallace TC, Giusti MM.. Evaluation of parameters that affect the 4-

dimethylaminocinnamaldehyde assay for flavanols and proanthocyanidins. J Food Sci. 2010

Sep; 75(7):C619-25.

95. Wijngaard H, Brunton N. The Optimization of Extraction of Antioxidants from Apple Pomace

by Pressurized Liquids. J. Agric Food Chem. 2009; 57(22):10625–31.

96. Williams WB, Cuvelier ME, Berset C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant

activity. LWT-Food Sci Technol. 1995; 28(1):25–30.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tsao%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15941346

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yang%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15941346

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Xie%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15941346

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sockovie%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15941346

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Khanizadeh%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15941346

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0023643812001892#aff1

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0023643812001892#aff1

54

97. Wolfe K, Wu X, Liu RH. Antioxidant Activity of Apple Peels. J Agric Food Chem. 2003 Jan

29; 51(3):609-14.

98. Zhang XJ, Wang LX, Liu YL, Chen XX, Yang YZ, Zhao ZY. Differential gene expression

analysis of ‘Granny Smith’ apple (Malus domestica Borkh.) during fruit skin coloration. S Afr

J Bot. 2013 Sep; 88:125–31.

99. Zhao Y, Hou Y, Tang G, Cai E, Liu S, Yang H et al. Optimization of Ultrasonic Extraction of

Phenolic Compounds from Epimedium brevicornum Maxim Using Response Surface

Methodology and Evaluation of Its Antioxidant Activities In Vitro. J Anal Methods

Chem. 2014; 2014:864654.

100. FAOSTAT. Food and agriculture organization of the united nations statistics division. Prieiga

per internetą: http://faostat3.fao.org/browse/Q/QC/E Peržiūros data: 2014 01 16

55

9. PRIEDAI

Dalyvavimas mokslinėse konfenrencijose:

1. Gediminas Zvicevičius, Mindaugas Liaudanskas, Jonas Viškelis. Phenolic compound

quantification and antioxidant activity determination in ethanol extracts of apple pulp and

peels. The 5th

International Conference on Pharmaceutical Sciences and Pharmacy Practice.

November 22, 2014. Kaunas, Lithuania. Stendinis pranešimas.

FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKYBINĖS SUDĖTIES ...

Documents

Transcript of FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKYBINĖS SUDĖTIES ...