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Diagnostic moléculaireL’ADN au service du choix thérapeutique
Pr Jean-Louis MerlinUnité de Biologie des TumeursCentre Alexis Vautrin - NancyEA 4421 SiGReTO Nancy Université
jl.merlin@nancy.fnclcc.fr
Diagnostic moléculaire (1)
La meilleur connaissance de l’oncogenèse permet d’identification de marqueurs moléculaires spécifiques des tissus tumoraux
Les progrès technologiques rendent accessibles en clinique des techniques de pointe issues du monde de la recherche préclinique
La recherche translationnelle permet de valider en situation clinique des « pistes » moléculaires issues d’hypothèses scientifiques précliniques
Diagnostic moléculaire (2)
La biologie moléculaire permet d’apporter des données complémentaires à celles de l’histopathologie conventionnelle dans tous les domaines du diagnostic y compris en per-opératoire
Les analyses moléculaires peuvent être réalisées dans les laboratoires de pathologie (FISH, CISH,…) ou dans des plateformes spécialisées (plateforme de génétique moléculaire INCa)
Plateforme de Bio-pathologie intégrée
Circuit en per-opératoire
Prescription de l’analyse
1 - Oncologue 2 - Pathologiste
3 - Biologiste moléculaire
Validation de l’échantillon et transmission
Analyse et rendu de résultats
Cahier des charges en per-opératoire
Représentativité de l’échantillon
Niveau de qualité de l’échantillon analysé
Quantité de matériel biologique adéquate pour la technique envisagée
Durée de l’analyse et délai de réponse compatibles avec l’attente des chirurgiens
Contraintes
Logistiques
Biologiques
Techniques
Ex 1 : Génétique tumorale et thérapies ciblées
Facteurs prédictifs de réponseFacteurs pronostiques
KRAS, BRAF dans les CRC métastatiquesEGFR dans le NSCLC métastatiquesCKIT dans les GISTBCR-ABL dans les LMC…
Plateformes de génétique moléculaire des tumeurs
Programme initié par l’INCa en 2006
Structures régionales regroupant Laboratoires de génétiqueLaboratoires de pathologieLaboratoires de biologie moléculaire tumorale
Destiné à donner accès au diagnostic moléculaire à tous les patients et optimiser la prise en charge thérapeutique
En France
28 plateformes labélisées par l’INCa
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En lorraine…CHU et CAV
KRAS , BRAF mCRC au CAV (Pr JL Merlin)
EGFR mNSCLC au CHU (Pr JM Vignaud)
BCR-ABL au CHU (Pr P Jonveaux)
CKIT externalisé (Besançon)
La signalisation cellulaire…
… c’est complexe …
Mais avec un bon plan…
…on s’y retrouve…
Cibles / Cellule Tumorale
CRC et Mab anti-EGFR
membrane
P
Ligand EGFR
P PIP3
AKT1/2
mTOR
PIP2
PDK1/2
(EGF, TGF�, amphiréguline, épiréguline…)
eIF4E
4EBP1
p70S6K
TraductionSynthèse protéique
BAD
Survie cellulaire
VEGF
Angiogenèse
GSK3p21p27
Survie cellulaire
GrbhSOS
MEK1MEK2
ERK1/2
Voie PI3K/AKT
VoieRas/MAPK
transcriptionSurvie cellulaire
ProliferationAngiogenèse
Migration
PI3K
Ras
Raf
Facteurs de transcription
ADN
PTEN
Mutation 15-20%
Mutation 30-40%
10-20%
Mutation 15-40%
Plateforme KRAS CAV
3 techniques (HRM, Taqman, RFLP)2 « rapides », 1 « longue »Juin 2008 – décembre 2009 : 844 analyses549 analyses avec les trois techniques, 2.7 % discordance
Résultats rendus si 2 « rapides » concordent (env7 jours)Recours « RFLP » si discordance (env 10 jours)
Ex 2 : Ganglion sentinelle
� Approche conventionelle
� Analyse per-opératoireCoupes en congélationcoloration H&E
� Sensibilité faible(échantillonage)
� Analyse post-opératoireCoupes en paraffine:H&E + IHC
� Sensibilité moyenne
� Deuxième Opérationnécessaire si le ganglion sentinelle est positif dansl’analyse post-opératoire
� Biologie moléculaire
� Analyse per-opératoireGanglion sentinelle homogéniéséen intégralité.
� Haute sensibilité(pas d’erreur d’échantillonnage)
� Analyse post-opératoiren’est pas nécessaire
� Evite la 2 ème opération
Ganglion sentinelle - techniques PCR
Approche par PCR classique : BLN Gene Search® Veridex
Approche par PCR « isotherme » : OSNA Sysmex
Deux techniques basées sur expression de CK19
Choix de CK19 mRNA
1.0E+001.0E+011.0E+021.0E+031.0E+041.0E+051.0E+061.0E+071.0E+08
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59Molecular ID
mR
NA
exp
ress
ion
leve
l in
HE
(+)
sam
ple
CEA CK19MUC1 CK18 CK20 ß-actin
Amount of expression in metastase-pos lymphnodes
1.0E+00
1.0E+01
1.0E+02
1.0E+03
1.0E+04
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59Molecular ID
mR
NA
exp
ress
ion
ratio
betw
een
HE
(+)
and
HE
(-)
sam
ple
Quality of differentiation pos/neg
Source Sysmex®
Ganglion sentinelle - OSNA
Méthode: OSNA= One Step Nucleic acid A mplification,procédure isothermique sans extractionpréalable d‘acides nucléiques
(LAMP = Loop-mediated Isothermal Amplification)
Amplification
5 min
Homogénisation Centrifugation
1 min 16 min; 65 °°°°C
Ganglionlymphatique
Détermination de la quantité/nombre de RNA
Tamaki et al. Clin Cancer Res 2009
Étude 450 GASSpécificité : 94,3% (348/369)Sensibilité : 87,7% (71/81)NPV : 97,2% (348/358)PPV : 77,2% (71/92)
Ganglion sentinelle - OSNA
Mise en place STIC 2010 : Essai randomiséprocédure histopathologique vs OSNA
Implantation en cours dans 12 sites en France(CLCC, CHU)
Mise en place au CAV en routine en cours
Ex 3 : signature génomique(Puce à ADN)
Amsterdam 70 gene signature in N- breast carcinomas
Van’t Veer et al , Nature, 2002 Van de Vijver et al, NEJM, 2002
M+ <5y M+ <5y N=34N=34
((poorpoor signsign.).)
MM-- >5y >5y N=44N=44
(good (good signsign.).)
Validation in N- breast carcinoma
Year
Pro
babi
lity
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 2 4 6 8 10 12 14
Patients Events Risk group
113 16 Genetic low risk194 66 Genetic high risk
113 112 105 101 98 82 69 45 38 CLR194 185 168 147 130 110 90 53 39 CHR
Number at risk
Buyse M. et al JNCI 2006
307
MINDACT (6,000 PTS)
Clinical and Genomic
BOTH HIGH RISK
DISCORDANT Clinical
and Genomic RisksClinical and Genomic
BOTH LOW RISK
RANDOMIZE
Chemotherapy No chemotherapy
Use genomic riskUse clinical risk
High risk Low riskHigh risk Low risk
Assess clinical risk and genomic risk
N=3300 N=780
N=1920
55% 32% 13%
Mammaprint
Proposition commerciale Agendia
3000 euros
Non validé
Attente des résultats MINDACT
Ex 4 : Cellules circulantes
Détection d’évènements rares<1 cellule / 100 000 cellules sanguines
Nécessite une étape d’enrichissement (sélection) des CTC
Puis une méthode de détection spécifique et performante
Cellules circulantes - systèmes industriels
Adnagen®Séparation immunomagnétique non automatisée des CTCExtraction des ARNmPCR multiplexRésultats en positif/négatif (pas de numération)
Metagenex®Technique ISET : séparation des CTC par filtration (critère de taille)Système ouvert quant à la technique d’identificationNon automatisé (délai de séparation puis congélation )
Cell Search Veridex®Mostert et al, Cancer Treat Rev, 2009, Bidart, Bull Cancer, 2009
Cellules tumorales circulantescell Search ® Veridex
Technique cytologique automatisée« Clé en main »4 jours de conservation de prélèvementsEnrichissement immunomagnétique (EpCAM)Identification CK8, CK18, CK19 (CTC) vs CD45 (PBMC)Immunomarquage additionnel spécifique : HER2, EGFRUtilisation validée par la FDA (sein, colon, prostate)Technique fermée
Mostert et al, Cancer Treat Rev, 2009, Bidart, Bull Cancer, 2009
En résumé…
TumeurLe « somatique »
(ex : KRAS, BRAF, EGFR, CKIT…)
PatientLe « constitutionnel »
(ex : DPD, UGT, CYP, FcγRIIa/RIIIa …)
L’analyse d’ADN au service du choix thérapeutique… aujourd’hui et demain
Pharmacogénomique (génotypage tumoral)Thérapies ciblées : utilisation indissociable d’un d iagnostic moléculaire ( KRAS , EGFR, …)Chimiothérapie : signature génomique (cancer du sein N -), CTC et GAS : envahissement et maladie métastatique
Pharmacogénétique (polymorphisme génétique)Thérapie ciblées : prédiction de réponseChimio : prédiction de réponse / toxicité
Nouveaux critères diagnostiques, rationnel de prescriptionEnjeux médico-social et médico-économique
Les enjeux stratégiques…
Nécessité de disposer de plateforme associant des compétences en pathologie (validation des échantillons analysés) et en biologie moléculaire (expertise en génétique moléculaire des tumeurs)
« Bio-pathologie moléculaire intégrée »
Per-opératoire : plateforme à proximité immédiate des blocs opératoires (optimisation des délais de prise en charge et qualité des échantillons)
Médecine et thérapie individualisée…
“A surgeon who uses the wrong side of the scalpel cuts his own fingers and not the patient.
If the same applied to drugs they would have been investigated very carefully a long time ago”
Rudolph BucheimBeitrage zur Arzneimittellehre, 1849
Howard Mc Leod, Chapel Hill, North Carolina