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UE1 Biochimie – Biologie cellulaire Pr Cavé Le 27/09/12 de 8h30 à 10h30 Ronéotypeuse : Eléonore Simon Ronéolectrice : Alice Marsaux

UE1 Biochimie – Biologie moléculaire : Mécanisme moléculaire de la transmission des signaux

Partie 1 : le métabolisme de l’information Petite présentation de l’UE : Elle comporte 10 cours magistraux et deux ED « obligatoires » L’examen dure 1h30 et sera composer de 2 questions rédactionnelles, de QCM, et de QROC. Les supports de cours sont sur Didel et sont disponible avant chaque cours. Ce cours est divisé en deux parties, la deuxième se déroulant le 28/09/12

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Sommaire Généralités

A. L’information cellulaire

B. La transmission

C. Qu’est-ce qu’un récepteur ?

I- Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)

A. Organisation générale

Le récepteur

Les protéines G

B. Rappel de notions fondamentales :

Commutateurs moléculaires

Phosphorylation/déphosphorylation

C. Fonctionnement des RCPG : le cycle des protéines G

II- Les grandes voies de signalisation

A. Les seconds messagers

B. La voie de l’adénylate cyclase (Gs)

Second messagers : l’AMPc

Les PKA

Interférences

C. La voie de la phospholipase C (Gq)

Les phosphoinositides

Seconds messagers : DAG et IP3

Importance du calcium

III- L’arrêt du signal

A. L’extinction

Au niveau du ligand

Au niveau du récepteur

Post récepteur

B. La désensibilistation (propre aux RCPG)

IV- Physiopathologie : exemple du cholera

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Généralités

A. L’information cellulaire La transduction des signaux fait appel aux mêmes types de voies de signalisation que le métabolisme énergétique, on peut ainsi parler de métabolisme de l’information. Ce n’est pas de l’énergie qui est créée et stockée, mais une information qui circule dans la cellule. Dans ce cours, nous sommes donc au niveau moléculaire et non au niveau cellulaire. La cellule est un compartiment clos qui n’est pas capable de travailler seule dans un organisme pluricellulaire comme celui de l’Homme. Elle doit donc s’adapter à son environnement pour maintenir l’homéostasie de cet organisme. Pour cela, elle reçoit en permanence des signaux de son milieu environnant, informations qui sont pour la plupart des molécules chimiques. On trouve par exemple :

- les hormones, - les cytokines, - les facteurs de croissance, - les ions - les contacts cellule/cellule ou cellule/MEC, - au niveau des cellules nerveuses, les neurotransmetteurs - plus spécifiquement, au niveau des cellules neurosensorielles, les odeurs, la

lumière et les aromes. Dans un premier temps, la cellule détecte ces signaux, elle reçoit l’information. Puis, la cellule doit produire une réponse biochimique. Il lui faut pour cela intégrer l’information. De plus, à un instant donné, la cellule reçoit de nombreux signaux extracellulaires qu’elle doit intégrer, pour ensuite fournir une réponse. Même si les cellules sont spécifiques à certains signaux, chacune peut répondre à plusieurs types. La signalisation cellulaire n’est pas si complexe qu’elle n’y parait, puisqu’elle se base sur quelques voies majeures seulement, qu’il est important de connaitre.

B. La transmission La membrane plasmique protège la cellule, et la sépare physiquement de son environnement. Elle est en effet imperméable, seules les petites molécules lipidiques peuvent diffuser à travers la membrane (ex : hormones stéroïdes). La plupart ne peuvent pas passer (ex : les ions, les polypeptides ou encore les protéines). L’information est transmise de l’extérieur à l’intérieur de la cellule à partir de deux principes :

- Soit il y a tout de même un passage de la molécule de signalisation par le biais d’une molécule membranaire particulière. Celle-ci est alors appelé transporteur, et peut être sous forme de canaux ioniques, ou d’un transporteur spécifique. C’est le cas pour les ions, les sucres…

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- Mais généralement la molécule signal n’a pas les moyens de passer à l’intérieur de la cellule. Il y a donc la transduction du signal (= une transmission) : ce n’est pas une molécule qui passe physiquement, c’est une information qui est transmise. Le médiateur de cette information est le récepteur membranaire.

C. Les récepteurs Dans ce cours, nous nous intéresseront seulement aux récepteurs membranaires. La fixation au ligand est extracellulaire et spécifique. Elle induit un changement de conformation, donc une modification de la structure. Cette modification induit une nouvelle activité enzymatique dans la cellule, directement ou indirectement. De façon générale, ces récepteurs sont des protéines qui possèdent 3 domaines : extracellulaire, intracellulaire, et un domaine de fixation à la protéine qui est souvent hydrophobe. Au niveau de la partie extracellulaire, se trouve le site de reconnaissance qui a une très grande affinité pour le ligand (comme les enzymes et leur substrat, la constante de dissociation est de l’ordre de10-10).Les récepteurs sont donc très sensibles, il suffit de quelques molécules signal pour déclencher une réponse. Il est également possible d’observer le phénomène de coopération : un récepteur va pouvoir fixer plusieurs molécules de ligand ; Il y une coopérativité lors de cette fixation, ce qui augmente la sensibilité et la rapidité de la réponse. On distingue 2 grands types de récepteurs membranaires :

- Récepteurs couplés à une protéine kinase (traités dans le cours du 28/09/12) - Récepteurs couplé aux protéines G (= RCPG)

I- Les récepteurs couplés aux protéines G : RCPG

A. Organisation

Le récepteur

Il est composé de 7 domaines transmembranaires hydrophobes, qui forment des plis dans la membrane. La partie N terminale est à l’extérieure de la cellule, et fixe le ligand.

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La partie C terminale est intracellulaire, en relation avec le cytosquelette qui se modifie lui aussi lorsque le récepteur change de conformation.

Les protéines G

Ces récepteurs sont associés à des protéines G, des petites molécules trimériques (3 sous-unités : alpha, beta, gamma). Elles sont hydrophobes, globulaires, et sont toujours localisées au niveau de la membrane coté cytoplasme, car elles ont subies des modifications post traductionnelles. Ces modifications permettent, pour des molécules qui étaient hydrophiles après leur traduction, de leur attribuer des propriétés d’adressage à la membrane qui sont en fait des rajouts de radicaux lipidiques (myristoyle, palmitoyle, prénylation) liés entre eux par des liaisons hydrophobes. Il existe un très grand nombre de récepteurs avec l’intervention de multiples ligands : la lumière (= photons), les ions (Ca2+ extracellulaire), les stimuli sensoriels, les molécules endogènes (acides aminés, lipides, prostaglandines...), les protéines (glucagon)...

B. Rappel de notions fondamentales

Les commutateurs moléculaires

Dans la cellule, certaines réactions se font de façon continue mais un grand nombre se produisent aussi de manière oscillante (type ON/OFF ou activé/désactivé).

Elles sont contrôlées par des commutateurs moléculaires qui fonctionnent majoritairement avec le GTP (Guanosine TriPhosphate) et le GDP (Guanosine DiPhosphate). Le point commun des protéines G est leur changement structural selon qu’elles sont liées au GTP ou GDP. Les commutateurs possèdent donc une activité GTPasique pouvant hydrolyser le dernier phosphate du GTP pour produire du GDP.

La protéine liée au GTP est active, puis après hydrolyse, elle devient inactive car liée au GDP. Il y a pour cela l’intervention :

- d’un facteur d’échange : GEF (Guanosyl Exchange Factor) - d’une protéine qui active l’activité GTPasique nommée GAP (GTPase

Activating Protein). Concernant les protéines G, c’est la sous unité alpha qui est un commutateur moléculaire, qui porte l’activité GTPasique et qui est capable de lier un GTP. Pourquoi au cours de l’évolution, la cellule a-t-elle sélectionné le nucléotide triphosphate pour le commutateur moléculaire ? Car cela permet un couplage entre les mécanismes de transduction des signaux et l’état énergétique de base de la cellule. En effet, les GTP sont d’autant plus présents que l’état énergétique est élevé.

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Phosphorylation/déphosphorylation

Certains acides aminés possédent un radical hydroxyl pouvant être phosphorylé. Il s’agit de la Sérine, la Thréonine et la Tyrosine.

La phosphorylation est réalisée par une protéine kinase, qui utilise un ATP donneur de phosphate. Il existe deux grandes classes de kinases :

- les Sérine-Thréonine kinases - les Tyrosines kinases

Les phosphatases (un peu moins connues) sont toutes aussi importantes puisqu’elles permettent la réaction opposée à celle des kinases : elles hydrolysent un phosphate inorganique qui quitte la protéine (rôle dans sa désactivation…).

La phosphorylation est un type de régulation efficace car le radical se retrouve chargé négativement. Cela a deux conséquences :

- il y a une modification de la structure de la protéine (encore…) et donc de son activité

- et cela attribue à la protéine une capacité de fixation à autre protéine : le domaine protéique nommé SH2 de l’une reconnait spécifiquement le groupement phosphate qui a été rajouté sur l’autre.

Petit exemple pour en illustrer l’intérêt : Une protéine nommé 14,3,3 est exclusivement cytoplasmique. Une fois phosphorylée, elle peut donc séquestrer dans le cytoplasme une protéine au groupement SH2 qui se fixerait dessus. Il s’agit donc d’un mode d’inactivation. Au contraire, une protéine peut en attirer une autre à l’endroit où elle doit agir.

La compartimentation cellulaire est très importante pour cela. On considère que 30% des protéines peuvent être régulées par phosphorylation, qu’il existe 520 kinases pour 150 phosphatases. Ces protéines représentent 1 à 2% du génome humain.

C. Fonctionnement des RCPG : Cycle des protéines G Lorsque la cellule ne reçoit pas de signal, les protéines G sont sous forme trimérique à proximité du récepteur transmembranaire. La sous-unité alpha est liée au récepteur et au GDP ainsi qu’au sous-unité bêta et gamma. Lorsque le ligand se fixe, cela entraine un changement de conformation de sa partie cytoplasmique du récepteur, ce qui modifie également la sous-unité

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alpha puisque « la poche » dans laquelle se trouve le GDP s’ouvre. C’est ainsi qu’un GTP le remplace, car il y a statistiquement plus de chance que ce soit un GTP qui se retrouve dans la poche (sa concentration cellulaire est 10 à 50 fois supérieure à celle du GDP). Cela induit l’activation de la protéine G et la sous-unité alpha se sépare des sous-unités bêta et gamma. Des interfaces présentes entre les sous-unités sont libérées, et peuvent maintenant interagirent avec des effecteurs. C’est ainsi que le signal est transmis. La sous-unité alpha qui possède l’activité GTPasique hydrolyse rapidement le GTP en GDP, ce qui inactive la protéine G. Les 3 sous-unités se réassemblent alors au récepteur. Ceci est une constante de la signalisation : lorsqu’on active un signal, on permet aussi à ce signal de s’éteindre (aussi vite qu’il a démarré). En effet la cellule s’adapte à son environnement à chaque instant, il faut donc que ces systèmes puissent s’arrêter rapidement Ce processus est catalytique, c'est-à-dire qu’il n’y a pas de consommation de molécules. Le récepteur peut donc activer successivement plusieurs protéines G lorsqu’un ligand se fixe. Cela permet une amplification du signal qui est multi-étage. Une fois la protéine G activée, elle agit sur des effecteurs capables de modifier l’activité biochimique de la cellule. Il existe de nombreux effecteurs et plusieurs isoformes de ces effecteurs.

On trouve également différentes protéines G et notamment plusieurs sous-unité alpha (Gαs, Gαi…) qui agissent sur des effecteurs différents.

Ex : Gαq active la phospholipase C, et Gs a pour effecteur l’adénylate cyclase.

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II- Les grandes voies de signalisations

A. Les seconds messagers

Ce sont des molécules dont le niveau quantitatif est régulé par la signalisation : leur concentration varie dans la cellule. Ils peuvent être de natures très diverses :

- nucléotides modifiés (AMPc), - liquides membranaires, - ions, - dérivés phospholipidiques

Certains sont localisés à des endroits précis de la cellule (liquides membranaires), d’autres sont très diffusibles (ions, nucléotides modifiés).

B. La voie de l’adénylate cyclase (Gs)

Second messager : l’AMPc

L’adénylate cyclase est un effecteur activé pas la Gs qui catalyse la réaction irréversible de l’ATP en AMPc : il y a clivage d’un pyrophosphate (PPi) ainsi qu’une

estérification interne (formation d’un cycle). L’AMPc formé, molécule diffusible, peut alors jouer son rôle de second messager et activer un groupe protéines, les protéines kinases A (PKA). NB : il existe de nombreuses variantes et de classes de kinases, issues d’un gène ancestral commun qui s’est dupliqué au cours de l’évolution.

Les PKA

Les PKA possèdent 2 sous-unités régulatrices, et 2 sous-unités catalytiques, qui sont liées dans la forme inactive (une unité de chaque type face à face). Entre, se trouve une molécule nommé peptide pseudo-substrat (petit triangle sur la diapo). Le substrat des PKA est un petit motif contenant un acide aminé phosphorylable, entouré d’autres acides aminés spécifiques pour être reconnu. Le peptide pseudo-substrat possède la même séquence que le substrat, sauf que l’acide aminé phosphorylable est remplacé par une Arginine. Il ne peut donc pas être phosphorylé et il bloque le site catalytique (= inhibiteur compétitif). Lorsque l’AMPc est formé, deux molécules se fixent sur chaque unité régulatrice de la PKA => changement conformationnel de la PKA => les sous-unités catalytiques

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ainsi que le pseudo-substrat ne peuvent plus se fixer, ils s’éloignent => le vrai substrat (protéine à phosphoryler) peut accéder au site actif des sous-unités catalytiques de la PKA. Pour une protéine kinase activée, plusieurs cibles sont activées. La désactivation est également rapide. L’AMPc est hydrolysé par les phosphodiésterases, et sa concentration baisse de telle sorte que les sous-unités

des PKA se réassemblent. Les sous-unités catalytiques des PKA peuvent passer dans le noyau pour phosphoryler les CREB. Ce sont des facteurs de transcription qui se fixent sur le promoteur CRE d’un gène. Au final, en réponse à l’augmentation d’AMPc permet à ce gène d’être transcrit.

Interférences Cependant, dans la cellule, il y a plusieurs types de récepteurs couplé à des protéines G pouvant avoir des effets opposés :

- le récepteur au glucagon/hormones parathyroïdiennes => Gs => active l’adélylate cyclase

- le récepteur à l’acétylcholine/neuromediateurs => Gi => inhibe l’adélylate cyclase.

- Le recepteur à l’insuline => active les phosphodiésterases (hydrolyse AMPc)

Il y a donc une compétition entre les trois. Ainsi, le niveau d’un second messager est la résultante d’un équilibre.

C. La voie de la phospholipase C (Gq)

La phospholipase C est un effecteur activé par les sous-unités Gq.

Les phosphoinositides Notions de chimie : les phosphoinositides sont des molécules qui contiennent un

carbohydrate inositol. Chaque carbone porte un groupement hydroxyle pouvant être phosphorylé. Un de ces hydroxyles est lié au glycérol par le biais d’un groupement phosphate. Le glycérol peut lui-même fixer des acides gras (AG). L’ensemble donne un phosphatidyl-inositol.

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Lorsque la molécule est phosphorylée, elle devient un phosphatidyl-inositol phosphate qui est hydrophobe et peut s’insérer dans la membrane (ils représentent (10% des phospholipides membranaires) Le phosphatidylinositol 4,5 diphosphate (= PIP2) est un précurseur des seconds messagers de la phospholipase C. Cette dernière hydrolyse la liaison ester du PIP2. Le clivage de PIP2 permet d’obtenir :

- Le Diacylglycérol (= DAG) qui reste dans la membrane (glycérol + AG)

- L’Inositol 1, 4, 5 triphosphate (= IP3) qui peut diffuser dans la membrane Ces deux molécules sont complémentaires.

Seconds messagers : DAG et IP3 DAG active les kinases PKC : ces protéines ont un domaine C2 pouvant se lier aux phospholipides membranaires, et deux domaines C1A et C1B de liaison au DAG. La PKC a également un pseudo-substrat, qui fait partie intégrante de la protéine. Celui-ci bloque l’accès au substrat et induit un repliement. Le DAG, membranaire, attire les domaines C1A et C1B. Le pseudo-substrat s’écarte et la PKC active se fixe à la membrane.

IP3 quant à lui, se fixe sur les vésicules calciques du réticulum endoplasmique. Les pores s’ouvrent permettant à un flux de calcium d’être libéré, dans la cellule. Le calcium se fixe sur la Calmoduline, qui elle-même active les Cam-Kinases. Celles-ci phosphorylent d’autres protéines. Le signal est fugace : IP3 est hydrolysé (son temps de demi-vie est très court) et le calcium est expulsé hors de la cellule.

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Importance du calcium

L’intérêt de cet ion calcium est sa dangerosité (eh oui !). On trouve des complexes calciques indispensables dans la cellule, mais ces derniers sont très insolubles. S’il y en a trop, ils précipitent et cela abime voire détruit la cellule. Elle doit donc se protéger de ce calcium qui lui est néanmoins indispensable. La cellule le séquestre donc (réticulum endoplasmique) ou l’expulse dans le milieu extracellulaire. Ainsi, on observe des différences de concentrations très importantes :

- dans le sang, la calcémie est de 2,5mmol - dans le cytoplasme, elle est de 100nmol (différentiel de 104).

La calcémie est aussi très élevée dans les vésicules du réticulum endoplasmique. La cellule se sert de ce potentiel dans la signalisation : les signaux calciques sont donc ubiquitaires. Dès qu’un pore s’ouvre, la calcémie intracellulaire augmente très rapidement du fait du gradient. Le rôle d’un second messager est d’agir sur l’activité des protéines. Le calcium peut en effet entrer en liaison avec les oxygènes présents dans les radicaux des protéines (entre 6 et 8 oxygènes). Cela induit des replis et donc une modification d’activité.

III- Arrêt du signal

A. Extinction

Le signal doit être court (de la seconde à la minute). Il y a donc un certain nombre de mécanismes successif participant à l’extinction :

Au niveau du ligand :

- Dissociation ligand - récepteur

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- Devenir de ce ligand : Détruit. Ex : les acétylcholinestérases agissent dans la fente

synaptique et détruisent rapidement l’acétylcholine. Recapté. Ex : la cocaïne (inhibiteur, pas un médicament !) induit

le recaptage de la noradrénaline Les antidépresseurs jouent sur le recaptage de la sérotonine

Au niveau du récepteur :

- Phénomène de désensibilisation (voir la partie qui lui est dédiée) - Diminution de synthèse (échéance plus tardive)

Au niveau post-récepteur :

- Activité GTPase au niveau des commutateurs moléculaires (GTP en GDP) - Catabolisme des seconds messagers (AMPc, IP3)

B. Le phénomène de désensibilisation L’an dernier, cette notion n’avait pas été bien comprise, la prof a donc rajouté deux diapos pour l’explication. Il faut donc bien les connaître et les comprendre. Ce phénomène est propre aux RCPG. Comme nous l’avons vu, le ligand se lie : dissociation des sous-unités de la protéine G. Le signal est transmis.

Mais l’induction du signal induit aussi l’extinction du signal. La sous-unité alpha recrute une classe de kinases particulières : les GRK (Kinases liés aux Récepteurs à protéine G). Elles sont activées par la sous-unité gamma, et elles phosphorylent le récepteur ce qui entraine un découplage entre le récepteur et la sous-unité alpha. Découplage : arrêt de communication entre deux éléments sans qu’ils aient disparu.

La Bêta-arrestine, une molécule cytoplasmique, se fixe alors sur le récepteur pour parfaire ce découplage, et attirer les éléments nécessaires à l’endocytose du RCPG (vésicule de clathrine) Cette vésicule peut être dirigée vers les lysosomes ou être recyclée à la membrane.

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Il y a une diminution temporaire du nombre de récepteurs, cela évite qu’un signal ne sature une cellule. C’est une désensibilisation homologue car c’est la transduction du signal qui induit sa propre extinction. En pharmacologie, le renouvellement des RCPG empêche qu’un médicament ne devienne inactif dans le temps parce que sa cible serait devenue insensible. Il existe aussi une désensibilisation hétérologue où une voie de signalisation provoque l’extinction d’une autre.

IV- Physiopathologie : exemple du choléra

Dans des conditions sanitaires insalubres, il peut y avoir l’apparition de cette maladie grave. Il y a une importante déshydratation qui est généralement la cause de la mort. Le choléra est dû au Vibrion cholérique. Sa toxine est composée de deux sous-unités fonctionnelles :

- une sous-unité B qui se fixent aux gangliosides de l’épithélium intestinal,

- et une sous-unité A qui catalysent une

modification covalente de Gs : la fixation d’un ADP ribose, qui empêche l’hydrolyse du GTP en GDP.

Cela entraine une hyperactivation de la

signalisation médiée par Gs au niveau de l’épithélium intestinal, avec une surproduction d’AMPc... L’action du canal chlore à ce niveau est très perturbé car il est ouvert en permanence, d’où une importante deshydratation. Chez les sujets, cela provoque des diarhées, et surtout cette perte d’eau pouvant aller jusqu’à deux fois leur poids en liquide, d’où l’importance de la réhydratation immédiate pour éviter le décès. Ainsi les bactéries et les germes utilisent les voies de signalisations pour établir leur pathogénicité. Suite dans le prochain cours (et donc dans la prochaine ronéo) !

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Le meilleur pour la fin ! A ma ronéolectrice bien sur, Alice ! Qui est également ma sauveuse :

Vous vous souvenez du jour où il fallait aller chercher les tickets numérotés pour le stage de sémio ? Eh bien j’étais la ronéotypeuse (!), obligée de rester vaillamment dans l’amphi, me voyant déjà prendre le ticket numéro n°327… ! Alors merci Alice de t’être battu pour moi, merci pour le ticket n°161 que j’ai pu jeter ! A ma sous-colle de P1 adorée : Mathilde, Corinne et Jérémie, merci de votre

patience, de vos réponses, de votre soutien ! Sans oublier Alexis et Adrien (oui, oui, j’y suis allée en mode serial killeuse) !

A tous ceux de la rue d’Assas, qui est un peu mon deuxième chez-moi ! Pas besoin de vous citer, vous vous reconnaitrez !

A Clara, Pauline, Manon, et à toutes mes rencontres en amphi !

A mes co-stagiaires Lauriane et Alexandre (parce que Catherine elle est « cool » !) et à ceux d’uro : Pauline (encore !), Quentin et William !

A ma sous-colle de foliiiie cette année : Séverine (my twin sister), Anna, Maud et Amaury, ainsi que Mathilde ! Le maitre-mot étant : motivation !

A toi Anne-Solène, je crois en toi ! ainsi qu’à Camille 1 et Camille 2, Juan, Laetitia, Agathe, Kajeni, et tous les autres : je compte sur vous pour vous servir de ma ronéo l’an prochain, alors ACCROCHEZ-VOUS !!!

A tout mon soutien extérieur : parce qu’il n’y a pas que médecine dans la vie !