Post on 17-Oct-2020
結核菌藥物感受性試驗
長庚紀念醫院 醫檢部
郭安靜
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大綱 • 結核菌藥物感受性原理
• 結核菌藥物感受性操作流程
• 結核菌藥物感受性品管作業
• 結核菌藥物感受性試驗判讀
• 重要事項提醒
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結核菌藥物感受性原理
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建議使用時機 • 第一套分離的MTBC
• 治療失敗或是治療三個月未陰轉
• 臨床治療没有反應,醫師要求作藥敏試驗
• MDR-TB指對isoniazid, rifampicin呈抗藥
• XDR-TB指MDR-TB再加上一種fluoroqguinolone及一種第二線針劑(如capreomycin, kanamycin, amikacin)呈抗藥性
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CLSI-M24 A2 • M. tuberculosis complex
• 瓊脂平板法 Agar proportion method
o Middlebrook 7H10 medium
o Middlebrook 7H11 medium
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臨界濃度Critical concentration • 可以抑制95%特定菌種野生株生長的濃度
• The lowest concentrations of drugs that inhibit 95% of wild strains of M. tuberculosis that have never been exposed to the drugs.
CLSI M24-A2
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Resistance of agar proportion
method • Growth of greater than 1% of an inoculum of bacterial cells in the presence of a critical concentration of antituberculous drug.
• 大於1%的細菌出現在抗結核桿菌群的藥物臨界濃度下。當用來測試的臨床分離菌株暴露在藥物臨界濃度下,菌株生長超過1%,則該藥物即不適合繼續當做抗結核治療藥物。
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CLSI M24-A2 傳染病標準檢驗方法手冊
適用濃度
8 CLSI M24-A2
Not recommended
瓊脂平板法Agar proportion
method
• 經過消化去汙處理且抹片鏡檢陽性檢體
直接法
Direct testing
• 從固態培養基純化之MTBC菌株
間接法
Indirect testing
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藥物感受性試驗快速方法 • 美國 FDA核准液態培養系統
o BACTECTM 460
o BACTECTM MGITTM 960
o VersaTREK®
• 結果與瓊脂平板法結果呈現相關
• 若有抗藥結果可以先發初報,但需使用瓊脂平板法再行確認。
• 液態培養系統結果有疑義或有其他新的藥物需要測試時,都需使用瓊脂平板法。
10 CLSI M24-A2
結核菌藥物感受性操作流程
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四分格培養基
不含藥培養基
(control)
0.2 μg/mL Isoniazid(INH)
1.0 μg/mL Rifampin(RMP)
1.0 μg/mL Isoniazid(INH)
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2.0 μg/mL Streptomycin(SM)
10.0 μg/mL Streptomycin
(SM)
10.0 μg/mL Ethambutol
(EMB)
5.0 μg/mL Ethambutol(EMB)
接種菌液製備—固態培養基
• 足量新鮮pure菌落(不要超過4-5週)
• 盡可能挑取大範圍菌落
• 不要刮到培養基
• 盡可能使用初次培養基,使用液態次培養菌液可能因慢速生長菌落不足導致false-susceptible
1.刮取新鮮菌落
• 16*125 mm無菌試管
• 3~5 mL無菌水或生理食鹽水或PBS
• 6~10顆玻璃或塑膠珠 (直徑3 mm)
• 濃度大於McFarland No. 1
• 整個操作過程須避免噴濺及飛沫產生。
2. 加入試管
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操作時,物品擺設及動線設計勿使手越過無菌區,例如已開蓋朝上的檢體及蓋子。
file:///E:/結核分枝桿菌檢驗作業/結核分枝桿菌檢驗作業(藥敏試驗).wmv
接種菌液製備—固態培養基 •使用接種環將菌落沿管壁乳化(emulsify)
•確認上蓋鎖緊
•使用振盪器以足夠速度、漩渦式離心混合1-2分鐘
•震盪時保持液面不超過試管2/3高度
•避免菌液翻騰以減少氣膠生成
3.混合菌液
• 靜置30分鐘或以上,讓大菌落沉降,避免開蓋時氣膠溢散。
• 試管拿起時宜輕緩,勿使已沉澱的大顆粒漂浮在要吸取的菌液中。
4.靜置沉降
• 取上清液至另一無菌管
• 以加入無菌水方式調整濃度至0.5~1 McFarland 5.調整濃度
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接種與培養 •無菌水或生理食鹽水或PBS
•以調整好濃度的菌液進行系列稀釋成10-2與10-4 1.系列稀釋
• 以無菌微量吸管吸取0.1 mL10-2稀釋液(106CFU/mL)至含藥與不含藥培養基;或以無菌吸管於各培養基不同處接種3滴。(可輕微搖晃,使菌液均勻散開)
• 以相同方式將10-4稀釋液(104CFU/mL)接種到另一套含藥與不含藥培養基
2.接種
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Modified indirect susceptibility method: 10-2稀釋液接種到含藥與不含要培養基,10-4稀釋液只接種到不含藥培養基。
•沿管壁混合均勻,須更換drop。 •連續稀釋時稀釋倍數須精確及須確實混合均勻 •操作過程須避免噴濺及飛沫產生 •dropper丟入有裝消毒劑的桶子內,注意丟棄動線沒有因dropper內的殘留液體,產生噴濺至操作台上的檢體及培養基的疑慮。
接種與培養 •培養基需正面向上擺放至水份已經被培養基吸收
•將培養基放入二氧化碳可以進入的PE塑膠袋封口 3.密封
•將培養基正面向下放入培養箱培養
•36℃+/-1℃、5-10% CO2 •培養基須避免暴露於陽光下以防止甲醛氣體生成
4.培養
• 為了避免視覺干擾,可以將放置培養基的塑膠袋從培養箱取出,正放方式在室溫下放置數小時或overnight
• 利用解剖顯微鏡每週觀察
5.觀察
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結核菌藥物感受性品管作業
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品管菌株種類 • Pan-susceptible菌株
o M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294)
o M. tuberculosis H37Ra (ATCC 25177)
• 抗藥菌株
o 可考慮選擇單抗低濃度INH菌株(ATCC BAA-812)
o 安全考量下,不建議使用具二種藥物之抗藥性菌株
• 若無法取得標準菌株,可從能力試驗菌株或臨床經過確認的菌株挑選
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品管菌株使用 • 執行頻率
o 新批號培養基(培養基或藥物)
o 若病人檢體每週操作,M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) 至少需每週執行一次。
o 抗藥菌株執行頻率可以減少
• 避免繼代培養以減少突變機會
o 菌株以多管小量分裝於-60℃以下且不會自動除霜冰箱(-20℃可保存期限短)
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結核菌藥物感受性試驗判讀
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生長情形記錄 生長情形 記錄方式
>500 colonies
(confluent growth) 生長融合
4+
200-500 colonies
(almost confluent growth)
幾乎融合
3+
100-200 colonies 2+(建議實際計數菌落數)
50-100 colonies 1+(建議實際計數菌落數)
判讀時間 • 每週觀察,若有汙染可提早處理。觀察時間以三週為限。
• 如果不含藥培養基已有50個菌落,可於三週內發出抗藥報告;敏感結果則需觀察滿三週確認後才可發出。
• 21天菌株生長不佳,不建議再放至28天觀察
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判讀條件 • 品管菌株
o 通常10-2不含藥培養基需有200-400個菌落生長,10-4不含藥培養基需有20-40個菌落生長。
Clinical Microbiology Procedure Handbook, 2010
• 臨床菌株
o 不含藥培養基至少需有50個菌落生長 (實際作業建議至少有100個菌落生長)
o 不含藥培養基需有分開可數的菌落
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判讀方法 • 以計算百分比決定抗藥與否
10-2/10-4X
10-2 含藥/10-4control*100
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判讀方法 • 以不含藥培養基生長數達100個菌落以上且可數之稀釋濃度比較為原則
• 如果同稀釋倍數無法計數時,可計算不同濃度的菌落數後乘以稀釋倍數進行比較
• 需要重新操作
o 不含藥培養基菌落數生長不足
o 當10-2與10-4 菌落數不成比例而影響結果判讀時
o 當計算之抗藥菌落數比率在1%附近易有疑義時
o 含藥培養基比不含藥培養基生長量少,但不含藥培養基生長融合無法計算菌落數時
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結果判讀--範例一
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以不含藥培養基生長數達50個菌落以上且可數之稀釋濃度比較為原則
結果判讀--範例二
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如果同稀釋倍數無法計數時,可計算不同濃度的菌落數後乘以稀釋倍數進行比較。
結果判讀--範例三
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如果同稀釋倍數無法計數時,可計算不同濃度的菌落數後乘以稀釋倍數進行比較。
重要事項提醒
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菌落型態確認 • MTBC菌落型態認知
• 單一型態確認
o 建議使用解剖顯微鏡
o 結果無法判讀時,不可由含藥的培養皿直接調菌再作藥敏
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操作細節 • 振盪器振盪時間不足
o 振盪器振盪須配合使用計時器
• 濁度調整不正確(過度接種)
o 調濁度時,使用濁度計輔助。
• 連續稀釋時稀釋倍數不精確及未確實混合均勻
o 稀釋倍數須正確及確實的連續稀釋
o 使用塑膠滴管置換儘可能大量的混合均勻, 同時要避免氣泡及飛沫、噴濺的產生。
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操作細節 • 接種時超過3滴
o 接種量須確實
o 等量接種
• 未確實計算菌落數目
o 確實計算菌落數目,由 10‐2及10‐4的結果正確綜判藥敏結果。
• 生安問題: 操作過程噴濺及飛沫產生
o 加強優良微生物技術
o 加強生安訓練及落實操作過程防止噴濺及飛沫產生
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敬請指教!!
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