Post on 27-Feb-2022
totipotentes
Stade 8 cellulesovocyte fécondé blastocyste cellules souches
embryonnaires (ES)
auto-renouvellement
activité télomérase élevée
pluripotence
Endoderme
PancréasThyroïdePoumonIntestin
Hépatocytes
Mésoderme
CardiomyocytesChondrocytes
AdipocytesLymphocytes, GR
MuscleMacrophagesEndothéliales
Ectoderme
KératinocytesNeurones
Crête neurales(mélanocytes, …)
Germinales
OvocytesSpermatogonies
Transplantation dans des sites « immuno-
privilégiés »
Différentes possibilités d’induction de tolérance
Banque de lignées huES immunotypées
(HLA)
Induction de tolérance par chimérisme hématopoiétique
(MSC)
Génération d’une lignée universelle
(KO HLA classe ½)
transfert nucléaire(clonage thérapeutique)
noyauadulte
cellule adulte
« Clonage thérapeutique »
embryon pré-implantatoire
5 j o u r s
e n c u l t u r e ovocyte
sans noyau
culture des cellules souches
embryonnairesneurones
différenciation
greffe thérapeutique(autogreffe!!)
« Clonage reproductif »
R é - i m p l a n t a t i o n
d a n s l ’ u t é r u s
(Dolly 1998)
« Clonage thérapeutique »
embryon pré-implantatoire
culture des cellules souches
embryonnairesneurones
différenciation
greffe thérapeutique(autogreffe!!)
R é - i m p l a n t a t i o n
d a n s l ’ u t é r u s
« Clonage reproductif »
- statut de l’embryon (âge, droit)- dignité humaine (statut enfant issu du NT)
- marchandisation du corps de la femme- espèces hybride (technique et problèmes)
Impossibilité sur l’homme mais: une barrière technique ne peut être une réponse à une question d’éthique.
p53, le gardien du génome
p53
apoptose
Arrêt du cycle
réparation
cellules somatiques
S
G2 M
G1
S
checkpoint
différenciationterminale
division asymétrique
nanog-
p53 induces differentiation of mouse ES cells by suppressing Nanog expressionNat Cell Biol. 2005
G1G2M
cellules ES
S
Pluripotence des cellules couches embryonnaires (I)
Cellules ES(+ LIF)
- LIFGouttes pendantes
.. . . .0
3
5Jo
urs d
e cu
lture
et d
e di
ffér
enci
atio
nAdhésion et
croissance des corps 20
Culture en suspension(boites de Pétri)
Ectoderme (feuillet externe)
Mésoderme(feuillet médian)
Endoderme (feuillet interne)
Cellules épidermiquesCellules neuronales
Cellules cardiaquesCellules musculairesGlobules rouges…
Cellules pancréatiquesCellules thyroïdiennesCellules pulmonaires
Femelleporteuse
souris chimérique
Pluripotence des cellules couches embryonnaires (II)
Cellules ES
Recombinaison homologue
Cellules ESdont un gène est modifié
Injection dans le blastocyste
Pluripotence des cellules couches embryonnaires (III)
Tératome: Tumeur bénigne ou maligne formée à partir de tissus multiples étrangers à la
région qui l'entoure
Bone
Gut kidney
neuroectoderm
ES
Utilité et perspectives d’utilisation des cellules ESEtude des stades précoces du développement:- Déterminer les conditions de différenciation- Comprendre les pathologies congénitales.
Utilité et perspectives d’utilisation des cellules ESEtude des stades précoces du développement:- Déterminer les conditions de différenciation- Comprendre les pathologies congénitales.
Tests pharmacologiques:- Remplacer en partie essais de toxicité sur l’homme (phase 1). - Tests des effets tératogènes de produits (Thalidomide).
Utilité et perspectives d’utilisation des cellules ESEtude des stades précoces du développement:
- Déterminer les conditions de différenciation- Comprendre les pathologies congénitales.
Tests pharmacologiques:- Remplacer en partie essais de toxicité sur l’homme (phase 1). - Tests des effets tératogènes de produits (Thalidomide).
Utilisation en thérapie cellulaire: - Neurodégénératrices: Parkinson, sclérose en plaque, Alzheimer, chorée de Huntington, para-tétraplégie. - Déficit cellulaire: diabète de type I (HES produisent insuline in vivo); infarctus du myocarde; hépatite. - Manipulation génique des ES avant transplantation pour réverter un phénotype pathologique.
Utilité et perspectives d’utilisation des cellules ESEtude des stades précoces du développement:
- Déterminer les conditions de différenciation- Comprendre les pathologies congénitales.
Tests pharmacologiques:- Remplacer en partie essais de toxicité sur l’homme (phase 1). - Tests des effets tératogènes de produits (Thalidomide).
Utilisation en thérapie cellulaire: - Neurodégénératrices: Parkinson, sclérose en plaque, Alzheimer, chorée de Huntington, para-tétraplégie. - Déficit cellulaire: diabète de type I (HES produisent insuline in vivo); infarctus du myocarde; hépatite. - Manipulation génique des ES avant transplantation pour réverter un phénotype pathologique.
Délivrance de médicamentsproduction massive de protéines recombinantes ou endogènes…
Utilité et perspectives d’utilisation des cellules ESEtude des stades précoces du développement:
- Déterminer les conditions de différenciation- Comprendre les pathologies congénitales.
Tests pharmacologiques:- Remplacer en partie essais de toxicité sur l’homme (phase 1). - Tests des effets tératogènes de produits (Thalidomide).
Utilisation en thérapie cellulaire: - Neurodégénératrices: Parkinson, sclérose en plaque, Alzheimer, chorée de Huntington, para-tétraplégie. - Déficit cellulaire: diabète de type I; infarctus du myocarde; hépatite. - Manipulation génique des ES avant transplantation pour corriger un phénotype pathologique.
Délivrance de médicamentsproduction massive de protéines recombinantes ou endogènes…
Regénération tissulaire contre le viellissement
Thérapie des cancers?
Conditions d’utilisation des cellules ES en thérapie
* Savoir et pouvoir cultiver durablement les cellules ES humaines
* Contrôler leur différenciation de manière sélective
•Pureté cellulaire: FACS, sélection génique, clones
•Contrôler le rejet de tissus
• Eviter les tératomes (indiff. cells?)
* Problème d’éthique lié à l’utilisation d’embryons surnuméraires
Conditions d’utilisation des cellules ES en thérapie
* Savoir et pouvoir cultiver durablement les cellules ES humaines
* Contrôler leur différenciation de manière sélective
* Pureté cellulaire: FACS, antibio, clones
•Contrôler le rejet de tissus
• Eviter les tératomes (indiff. cells?)
* Problème d’éthique lié à l’utilisation d’embryons surnuméraires
Prévalence: ~ 100 000 patients en France
Pathologie: Perte des neurones dopaminergiques de la substance noire (pars compacta)
Symptômes:Tremblements, Rigidité musculaire,Ralentissement des gestes (akinésie, bradykinésie) Instabilité posturale
La maladie de Parkinson
Dopamine neurons derived from embryonic stem cells function in an animal model of Parkinson's disease J KIM*, J M. AUERBACH*†, J A. RODRÍGUEZ-GÓMEZ, I VELASCO, D GAVIN, N LUMELSKY, S LEE†, J NGUYEN†, R SÁNCHEZ-PERNAUTE†, K BANKIEWICZ† & R MCKAY NIH, Bethesda.
Modèle animal de la maladie de Parkinson:Administration de 6-OH-DA dans le striatum détruit les neurones dopaminergiques.
Commutateur de différenciation: promoteur nurr-1 + SHH + FGF8: - Isolement de neurones DOPA (78%) - Injection des cellules dans le striatum.
On retrouve les corps de cellules ES TH+ dans la
région de la greffe (a-c)
mais des prolongements dans le parenchyme du
striatum hôte jusqu’à 2 mm de la greffe (d-g).
Marquage anti-Tyrosine Hydroxylase (TH).
800 rotations/70 min
1 rotation/5 sec
Administration d’amphétamine aux animaux lésés par le 6-OH-DA induit une rotation autour du site d’injection.
By demonstrating efficacy while avoiding tumour formation, Kim et al. have achieved a proof of principle, although ES cells that have been genetically modified in this way might not be desirable for use in people.
800 rotations/70 min
1 rotation/5 sec
Administration d’amphétamine aux animaux lésés par le 6-OH-DA induit une rotation autour du site d’injection.
Embryos lacking the Id1, Id2, and Id3 genes display multiple cardiac abnormalities and die around E13.5.
DiscontinousEndocardial
cell lining
Reducedmyocardial proliferation
B. Injection of a small number of wild-type ES cells carrying a lacZ marker into Id mutant blastocysts resulted in about 20% chimerism of heart tissue and complete rescue of the Id mutant phenotype.
Injection de cellules ES
Niches de ES
Short-range signals
C. Wnt5a, a locally secreted factor, and IGF-1, a bloodstream factor that promotes myocyte proliferation--were identified as potential candidates involved in the rescue process.
Injection de IGF-1 ou cellules ES
Long-range signals
166 genodermatosis (139 genes)
DISORDERS OF KERATINIZATION Ichthyosiform dermatoses Ichthyosis vulgaris X-linked ichthyosis Lamellar ichthyosis Congenital ichthyosiform erythroderma Epidermolytic hyperkeratosis Harlequin fetus Palmoplantar keratodermas Darier disease
DISORDERS OF COHESION Epidermolysis bullosa Kindler syndrome
PIGMENTATION DISORDERS Oculocutaneous albinism Tyrosinase-negative Tyrosinase-positive Ocular albinism Piebaldism Waardenburg syndrome Incontinentia pigmenti Neurofibromatosis type 1 Neurofibromatosis type 2 Tuberous sclerosis
VASCULAR DISORDERS Ataxia-telangiectasia Hereditary hemorrhagic telangiectasia
ECTODERMAL DYSPLASIA SYNDROMES Anhidrotic ectodermal dysplasia Hypohidrotic ectodermal dysplasia with immunodeficiency Hidrotic ectodermal dysplasia
p63-related ectodermal dysplasia Pachyonychia congenita
DISORDERS WITH MALIGNANT POTENTIAL Basal cell nevus syndrome Gardner's syndrome Peutz-Jegher syndrome Xeroderma pigmentosum Epidermolysis bullosa syndromes
dermalfibroblasts
epidermal cells
(K5/K14)
Ectoderm
Mesoderm
Gastrulation derme
épiderme
ectodermalcells
(K8/K18)
BMP-4
Neuroectoderm
BMP-4 NogginChordin
DorsalVentral
Epidermis
Mesoderm
Endoderm DORSALVENTRAL
neuralcells
3 114
stromal fixed-feeders
(- serum) neurons
Days in cultureES cells
Neural precursors (sox-1+)
sox-1
Neural cells(most TH+)
3 114
stromal fixed-feeders
(- serum) neurons
Days in cultureES cells
Neural cells(most TH+)
NeuFNestin
tuJ
3 115
mesenchymal fixed-feeders
(- serum) neurons
Days in cultureES cells
BMP-4
K18
Neural cells(NeuN, NeuroFNestin, β-III tubulin)
3 114
mesenchymal fixed-feeders
(- serum) neurons
Days in cultureES cells
BMP-4
K18
Neural cells(NeuN, NeuroFNestin, β-III tubulin)
serum
K14
BMP-4Contrôle
Iodure dePropidium
contrôle
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4FL1-H
DIOC6
(dommage mitochondrial)apoptotic
cells
living cells
dead cells
DIOC6: -retains in intact cells-excluded in apoptotic cells
Iodure de Propidium: -excluded in living cells-retains in death cells
Iodure dePropidium
BMP-4contrôle
0 200 400 600 800FSC-H
R1
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4FL1-H
58
16
18
8
0 200 400 600 800FSC -H
R1
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4FL1-H
12
6
73
9
DIOC6
(dommage mitochondrial)
BMP-4 induit l’apoptose des cellules ESGambaro et al. (2006) Cell Death Diff. 13. 1075-1087
apoptosespontanée
apoptoseinduite
Caspase-3clivée
- +BMP-4
Procaspase-3
ß-tubuline
Caspase-3clivée
- + - +ß-tubuline
BMP-4
Procaspase-3
contrôle
% d
e ce
llule
s vi
vant
es
20
25
30
35
40
45
50
55
Milieu 1µM 3µM 10µM
ContrôleBMP-4
PD169316
BMP-4
BMP-4 R
Smad 1TAK 1 (MAPKKK)
p38 MK
Apoptosis
PD169316
Gènes cibles: msx-1 et msx-2
Smad-1, 5, 8
P
P
GS box P
P
Type II Type I
BMP-4
Smad-1, 5, 8
P
Smad4+/-
Smad-4
R-Smad
P
Smad-4
BMP-4 induit l’apoptose des ES cells via la voie des Smad
Flag
-Sm
ad-6
Β-ga
l
- + - + - + - +BMP-4
Cleaved Caspase-3
Procaspase-3
ß-tubulin
β -galactosidase
flag
2025303540455055
contrôle AdV- smad-6
% d
e ce
llule
s vi
van
tes
AdV-LacZ
noBMP-4
Smad 6
BMP-4
BMP-4 R
Smad 1TAK 1 (MAPKKK)
p38 MK
Apoptosis
3 104
Sox-1
Jours en culture
ES sur feeders
2
β-III tubuline, NeuN, Nestine, NeuF
β-III tubuline
Nb
ab
solu
de
cellu
les
(x
10-4)
20
16
12
8
4
0
Sox1- Sox1+
+ Ad-Smad6BMP-4 - + - +
% d
e ce
llule
s N
euro
fila
men
t po
siti
ves
Adv Smad6
Adv LacZ
0
5
10
15
20
25
30
Contrôle
_ _ _+ + +BMP-4
BMP-4 induit l’apoptose des précurseurs neuronaux sox-1+
Sox-1 Caspase-3 clivée
co-marquage
NO
BMP-4
ESCommitted neural precursorsox-1+ neurones
(NeuN, NeuroFNestine, β−III tubuline)
K14
+ serum
BMP - 4
apoptosis of neural sox-1+ precursors
sox-1-
précurseur neuroectodermal ?
cellules ectodermales(K8/K18)
Smad
Gambaro et al. (2006) Cell Death Diff. 13. 1075-1087
BMP-4 induit l’apoptose des progéniteurs neuronaux issus de cellules ES
BMP-4 - + - +
∆Np63 is activated during BMP-4-induced ES cell commitment
3 114
mesenchymal fixed-feeders
(- serum) neurons
Days in cultureES cells
BMP-4 ∆Np63
transcriptome analysis +/- BMP-4:
(1979)
(1998)
(1998)
p53
p63
p73
p63 belongs to the p53 gene family
TAp63∆Np63
proapoptotic
cell proliferation
cell adhesion
p21, Notch
lama3, Itgb4, Perp
cellular senescence genomic stability
(SKPs)
ectrodactyly
(Celli J. et al. Cell 1999)
ectodermal dysplasia Cleft lip/palate Ankyblepharon
p63-related ectodermal dysplasia syndromes
Ectodermal Dysplasia
Cleft lip and/or palate
Limb defect
EEC
AEC
ADULT
SHFM
p63-/-p63 WT
(Mills, Nature 1999; Yang, Nature 1999)
What is the function and regulation of p63 during development and in pathology ?
p63 is required for normal ectodermal development
p63-/-p63 WT
No stratified epithelia: skin remains single ectodermal layer.
p63-/-
p63 WT
No limbs: no AER (apical ectodermal ridge) formationand cranio-facial defects
no BMP4
K18 / ∆Np63
ES
BMP-4 ectodermal cells (K8/K18)
neural cells
BMP4 + serum
K14 / ∆Np63
X 40
p63 is not necessary for ectodermal commitmentbut may be required for epidermal fate
epidermal cells (K5/K14)serum
X
tub
ES wt
ES pSuper
ctrl
P63-
1P6
3-2
P63-
3
∆Np63
∆Np63 - + + + + +
∆Np63 is required for epidermal differentiation of ES cells
ES
BMP-4 ectodermal cells (K8/K18)
epidermal cells (K5/K14)
neural cells
serumsh-p63 X
sh-∆Np63:sh-pSuper:
TAp63
ES cells
ECM
BMP-4
Ectodermal progenitors
∆Np63α is necessary to induce epidermal differentiation of ES-derived ectodermal cells
∆Np63
K14
merge
∆Np63α
Target genesKGF-R miR 125 BMP-7 miR 328Notch miR 515-516IKKα miR 720PERP ……ITGB4ITGA6Lamc2U3 ligase,….
3 115Days in cultureES cells
p63
epidermalcells
(K5/K14)
fixed stromalfeeders
(- serum)ectodermal progenitors(K8/K18)
Could p63 replace BMP-4 to induce epidermal fate?
?
3 115Days in cultureES cells
p63
epidermalcells
(K5/K14)
fixed stromalfeeders
(- serum)ectodermal progenitors(K8/K18)
p63 cannot replace BMP-4 to induce epidermal fate
Link to cardiogenesis?
Pluripotent state
Primitive streak
(mesendoderm)
Endoderm
Mesoderm
Cardiac mesoderm
Brachyury, Fgf8
Sox-17
Mesp-1
The cardiac developmental pathways
Tbx5
Islet1 Tbx1
Nkx2.5Mef2c
First Heart Field
Second Heart Field
Anteriorsplanchnic mesoderm
Pharyangeal mesoderm
Left ventricleAtrial
Right ventricleOFT
Cardiac
crescent
Alain Medawar, Matthieu Rouleau
shctrl
shp63
sictrl
si∆Np63
siTAp63
shctrl
shp63
sictrl
si∆Np63
siTAp63
TAp63 is required for in vitro cardiogenesis
EpiblastEpiblast
MultipotentMultipotentCardiovascularCardiovascular
progenitorsprogenitors(Mesp1/2, sox-7(Mesp1/2, sox-7++, Flk1), Flk1)
Cardiac progenitors(Nkx2.5,Tbx5,
Mef2c,Isl1)
Cardiac cells(TpnT, α-actinin)
PrimitivePrimitiveMesodermMesoderm
(Brachyury T)(Brachyury T)
PrimitivePrimitive streak (EMT)streak (EMT)
sh-ctrlsh-p63
Mesp1
6080
100
Day 2 Day 50
102040
Brachyury
81012
Day 2 Day 50246
Fold
Indu
ctio
n / c
trl d
ay 0
Which cells are producing p63?
TnT2
*Day 12
101
102
103
Mlc2vα-actinin0
****
Nkx2.5
0123456789
Day 5 Day 11
*
*
Tbx5
0
10
20
30
40
50
60
Day 5 Day 11
**
*
Islet1
0
40
80
120
Day 5 Day 11
*
EpiblastEpiblast
MultipotentMultipotentCardiovascularCardiovascular
progenitorsprogenitors(Mesp1/2, sox-7(Mesp1/2, sox-7++, Flk1), Flk1)
Cardiac progenitors(Nkx2.5,Tbx5,
Mef2c,Isl1)
Cardiac cells(TpnT, α-actinin)
PrimitivePrimitiveMesodermMesoderm
(Brachyury T)(Brachyury T)
PrimitivePrimitive streak (EMT)streak (EMT)
Alain Medawar
EndodermEndoderm(sox-17(sox-17++))
(primitive and/or extra-embryonic)(primitive and/or extra-embryonic)
Sox17p63 Merge
EpiblastEpiblast
MultipotentMultipotentCardiovascularCardiovascular
progenitorsprogenitors(Mesp1/2, sox-7(Mesp1/2, sox-7++, Flk1), Flk1)
Cardiac progenitors(Nkx2.5,Tbx5,
Mef2c,Isl1)
Cardiac cells(TpnT, α-actinin)
PrimitivePrimitiveMesodermMesoderm
(Brachyury T)(Brachyury T)
PrimitivePrimitive streak (EMT)streak (EMT)
EndodermEndoderm(sox-17(sox-17++))
Alain Medawar
(primitive and/or extra-embryonic)(primitive and/or extra-embryonic)
Sox17p63 Merge
E7.5
Marja L Mikkola, Stockholm)
Cell non-autonomous effect of p63 on cardiogenesis
Matthieu Rouleau
WT ES
GFP-shp63 ES
Beating cells+++
+/-
02468
101214161820
sh-ctrl
% of TnT2+ cells (among GFP+ cells)
sh-p63-gfp
Matthieu Rouleau
Non-cell autonomous effect of p63 on cardiogenesis
WT ES
GFP-shp63 ES
Beating cells+++
+/-
02468
101214161820
sh-ctrl
% of TnT2+ cells (among GFP+ cells)
sh-p63-gfp Mixed ES ++
AmongGFP+ cells
- +sh-ctrl cells
*
Matthieu Rouleau, Michel Pucéat
WT
shp63
shp63-GATA
Cardiac rescue by ectopic GATA6%
bea
ting
/EB
s
day of differentiation7 8 9 10
shp63
shp63 + GATA6
WT ES cells
wild type newborn heart tissue p63-/- newborn heart tissue
M
M
Myofibrillar fragmentation and disorganization. Mitochondria were randomly distributed, large and swollen
Intracellular Ca2+ transient in embryonic hearts (E10.5)
Fluo
-4 fl
uore
scen
ce F
-F0/
F0
-505
101520
2min
wild type
p63 -/-
-202468
2minMichel Puceat (Evry)
Could p63-related ED patients suffer from unexpected heart defect?
TAp63
From H. Van BOKHOVENFrom H. Van BOKHOVEN
∆Np63
Patient 1 with a systolic murmurPatient 3 with an atrial septal defect
Rinne T. et al. (2008) Human Mol Genet. 17: 1968-77:
Pluripotent state
Primitive streak
(mesendoderm)
Mesoderm
Cardiac mesoderm
Anteriorsplanchnic mesoderm
Pharyangeal mesoderm
Left ventricleAtrial
Right ventricleOFT
Tbx5
Islet1 Tbx1
Nkx2.5Mef2c
Brachyury, Fgf8
Sox-17
Mesp-1
Cardiac
crescentFirst Heart Field
Second Heart Field
The cardiac developmental pathways
Endoderm
Sox-17, activin-A, GATA4/6Wnt,...?
TAp63
Pluripotent state
Primitive streak
(mesendoderm)
Mesoderm
Cardiac mesoderm
Anteriorsplanchnic mesoderm
Pharyangeal mesoderm
Left ventricleAtrial
Right ventricleOFT
Tbx5
Islet1 Tbx1
Nkx2.5Mef2c
Brachyury, Fgf8
Sox-17
Mesp-1
Cardiac
crescentFirst Heart Field
Second Heart Field
The cardiac developmental pathways
Endoderm
Sox-17, activin-A, GATA4/6Wnt,...?
TAp63