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• Experiências das aulas laboratoriais
• Fraccionamento celular:
• centrifugação diferencial
• centrifugação em gradiente de densidade
• Quantificação proteica
• Na+/K+ ATPase
• Definição dos grupos de trabalho.
BIOENERGÉTICA E
METABOLISMO
5 de Março de 2009
Aula Teorico/Prática
Sumário:
Experiências das aulas laboratoriais
Parte I
1- Homogeneização de um Tecido
2- Fraccionamento Celular por Centrifugação Diferencial e em
Gradiente de Densidade
3- Determinação da Concentração de Proteína da Fracção Sub-celular
Objectivos:
1) Proceder à separação de diferentes fracções subcelulares de
células de cérebro de rato por centrifugação diferencial e em
gradiente de densidade.
2) Determinar a concentração de proteína total da fracção
enriquecida em membranas plasmáticas sinápticas (SPM),
utilizando o método colorimétrico do Reagente de Biureto.
Células eucarióticas: plantas versus animais
As células eucarióticas possuem uma variedade de
organelos, que podem ser isolados para posterior
estudo de função na célula, sendo esse o objectivo
do trabalho prático proposto no âmbito da disciplina
de Bioenergética e Metabolismo
Como podemos fazer esse isolamento?
Fraccionamento celular
> Isolamento e identificação de organelos celulares
ou macromoléculas com vista ao seu estudo
bioquímico
1. homogeneização do tecido ou da suspensão
celular, conduzindo à ruptura das células e à
libertação dos núcleos, mitocôndrias, lisossomas,
etc
2. separação e purificação dos diferentes
organelos recorrendo a centrifugações diferenciais
e/ou em gradiente
Homogeneização
> Primeiro passo do processo
de fraccionamento
> A membrana plasmática
é rompida em condições que
não conduzem à destruição dos
componentes internos da célula
Exs:
- Sonicação (sons de elevada frequência)
- Esferas de vidro
- Potter-helvehjein
- Ultra-Turrax
- Waring-blender
- French press
Fraccionamento celular
Centrifugação diferencial
> Técnica proposta em 1940 por
Albert Claude, Christian de Duve e
colaboradores para separar
componentes celulares com base
no seu tamanho e densidade
Fraccionamento celular
Centrifugação em gradiente de densidade
> Para se conseguir um grau
de purificação mais elevado
> Os organelos são separados
por sedimentação através de um
gradiente de uma substância densa
(ex. Sacarose, ficoll), diferencial de
densidade
> Partículas de diferentes
tamanhos sedimentam através do
gradiente a taxas diferentes,
movendo-se como bandas discretas
Os organelos sedimentam até que a
sua densidade seja igual a do
gradiente
Fraccionamento celular
Fraccionamento celular
UltracentrifugaçãoAté 100 000 rpm
Fraccionamento Sub-celular
Quantificação da proteina pelo
método do Biureto
The Biuret assay is a copper ion based protein assay, protein
solutions are mixed with an alkaline solution of copper salt, cupric
ions (Cu2+). The protein assay is based on the interaction of cupric
ions with protein in an alkaline solution. The interaction of cupric
ions (Cu2+) with protein results in a purple color that can be read at
540nm. The amount of color produced is proportional to protein
concentration.
Construção duma curva padrão com
BSA (Albumina do soro de Bovino) – D.O. 540 nm
“Problems Based Learning (PBL)”
PBL1: Explique qual a diferença entre o fraccionamento celular por centrifugação diferencial e por centrifugação em gradiente de densidade?
PBL2: Uma vez isolada uma determinada fracção sub-celular que métodos o investigador poderá utilizar para caracterizar a pureza da fracção?
Parte II
• DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE DA NA+/K+ ATPASE EM
MEMBRANAS PLASMÁTICAS SINÁPTICAS ISOLADAS DE
CÉREBRO DE RATO
Objectivo:
• Determinar a actividade da Na+/K+- ATPase em membranas
plasmáticas (SPM-isoladas do cérebro de rato), pela análise
do fosfato resultante da hidrólise de ATP, em diferentes
condições experimentais, utilizando uma curva padrão de
fosfato.
Experiências das aulas
laboratoriais
Figura - Por cada molécula de ATP hidrolisada dentro da célula, são bombeados 3
Na+ para fora e 2 K+ para dentro, contra os respectivos gradientes de
concentração. O inibidor específico desta bomba (uabaína) compete com o K+ pelo
mesmo local de ligação na enzima, no exterior da célula.
Bomba NA+/K+ ATPASE
O gradiente de Na+ produzido pela actividade da bomba Na+/K+, regula indirectamente o volume
celular e o potencial de membrana. Em células nervosas electricamente activas, a Na+/K+- ATPase
tem por função restabelecer o potencial de repouso depois de cada ciclo de despolarização, pelo
que cerca de 2/3 da energia total, utilizada por estas células, é consumido na actividade desta
enzima.
Bomba NA+/K+ ATPASE
Objectivo:
Determinar a actividade da Na+/K+- ATPase em membranas plasmáticas (isoladas do
cérebro de rato), pela análise do fosfato resultante da hidrólise de ATP, em
diferentes condições experimentais, utilizando uma curva padrão de fosfato.
Quantificação do fosfato
(Pi) pelo Reagente de
Molibdato (D.O. 660 nm).
A quantidade de fosfato será proporcional
à quantidade de ATP hidrolisado resultante
da actividade da Na+/K+- ATPase
nas membranas plasmáticas
“Problems Based Learning (PBL)”
PBL3: Porque razão se faz a determinação da actividade da
bomba Na+/K+ ATPase nas membranas plasmáticas
sinápticas?
PBL4: Que tipo de transporte membranar se dá na Na+/K+
ATPase nas membranas plasmáticas sinápticas?