รายงานจากหองปฏบตการ วกรมวทยพ2562;61(1):18-30

18 วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 61 ฉบบท 1 มกราคม - มนาคม 2562

สภาพร สภารกษ* ตะวนฉาย แสงเจรญ* และบษราวรรณ ศรวรรธนะ***สถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข **ส�านกวชาการวทยาศาสตรการแพทย กรมวทยาศาสตรการแพทย ถนนตวานนท

นนทบร 11000

การสรางเซลลลกผสม Dendritic cells กบเซลล

มะเรงเตานมในหลอดทดลองเพอกระตนเซลลภมคมกน

1

Corresponding author E-mail: supaporn.su@dmsc.mail.go.th

Received: 23 November 2017 Revised: 31 August 2018 Accepted: 18 March 2019

บทคดยอ Dendriticcells(DCs)ของผปวยมะเรงไมสามารถตรวจจบและน�าเสนอเซลลมะเรงเพอกระตนเซลลเมดเลอดขาว

ใหท�างานไดอยางมประสทธภาพท�าใหเกดการแพรกระจายของเซลลมะเรงการศกษานเพอเพมประสทธภาพDCsในหลอดทดลอง

และกระตนเซลลเมดเลอดขาวชนด T lymphocyte และ Natural Killer (NK) cell ใหท�าลายเซลลมะเรงเตานม

โดยคดแยกเซลลเมดเลอดขาวชนดโมโนซยทจากBuffy coat ของโลหตบรจาคจ�านวน 6 ราย กระตนใหเปนDCs ดวย

GM-CSFและIL-4เปนเวลา6วนและตรวจวดคณสมบตของDCsดวยวธFlowCytometryพบวาเซลลดงกลาวมการ

แสดงออกของCD11cและHLA-DRและลดการแสดงออกของCD14จากนนน�าDCsมาสรางเซลลลกผสมกบเซลลมะเรง

เตานม(MCF-7)ตรวจวดผลส�าเรจการสรางเซลลลกผสมดวยวธFlowCytometryพบวาสามารถสรางเซลลลกผสมไดคด

เปนรอยละเฉลย34.67จากการทดสอบประสทธภาพของเซลลลกผสมพบวาสามารถกระตนการเพมจ�านวนTlymphocyte

เฉลยจากรอยละ24.55เปนรอยละ72.00และเพมประสทธภาพNKcellในการท�าลายเซลลมะเรงเตานมเฉลยจากรอยละ22.91

เปนรอยละ65.59การศกษานสามารถเปนตนแบบในการเพาะเลยงเซลลลกผสมDCsและเพอใชพฒนาเปนทางเลอกส�าหรบ

รกษาผปวยมะเรงเตานมตอไป

การสรางเซลลลกผสม DCs กบเซลลมะเรงเตานม สภาพร สภารกษ และคณะ

19วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 61 ฉบบท 1 มกราคม - มนาคม 2562

บทน�า

รายงานอบตการณมะเรงรายใหมของประเทศไทย พบมะเรงเตานมสงเปนอนดบหนงในหญงไทย คดเปน

รอยละ 41.96 ของผปวยมะเรงทงหมด(1) การรกษามะเรงดวยการผาตด การฉายแสง และการใหยาเคมบ�าบด

ไมสามารถท�าลายเซลลมะเรงไดทงหมดยงมการแพรกระจายของเซลลมะเรงไปยงอวยวะตางๆ ไดทวรางกายเนองจาก

เซลลมะเรงของผปวยสามารถยบยงการท�างานของระบบภมคมกนท�าใหเกดการแพรกระจายของเซลลมะเรงมากขน(2)

การวจยพฒนาวธรกษามะเรงใหมประสทธภาพไมกลบมาเปนซ�าหรอแพรกระจายจงมความจ�าเปนปจจบนมการพฒนา

รกษามะเรงโดยกระตนภมตานทานในผปวยโดยใชวธกระตนเซลลของผปวยเองหรอน�าเซลลของผอนมากระตนภมคมกน

ในผปวย เพอท�าใหสามารถท�าลายและยบยงการแพรกระจายของเซลลมะเรงได ปจจบนการเพมประสทธภาพ

ของDendriticcells(DCs)เปนทางเลอกทไดรบความสนใจอยางมากเนองจากDCsเปนเซลลทตรวจจบน�าเสนอ

เซลลมะเรงและกระตนการแบงตวของTlymphocyteเพอเสรมการตอบสนองทางภมคมกนและกระตนการท�างาน

ของNKcellเพอท�าลายเซลลมะเรงอยางมประสทธภาพ(3-4)โดยมรายงานวาการสรางเซลลลกผสมDCsกบเซลลมะเรง

ชนดตางๆสามารถกระตนเซลลภมคมกนใหตอบสนองและท�าลายเซลลมะเรงอยางมประสทธภาพ(5,6)

วธการสรางเซลลลกผสมDCs ในระดบหองปฏบตการสามารถท�าไดหลายวธ ไดแก 1) วธทางกายภาพ

เชนการใชกระแสไฟฟาเหนยวน�าใหเกดการเชอมกนระหวางเซลล(7)2)วธทางชวภาพเชนการใชไวรสเปนตวน�าพา

ใหสรางเซลลลกผสมในเซลลเปาหมาย(8)และ3)วธการใชสารเคมทมคณสมบตท�าใหเกดการเชอมกนระหวางDCs

และเซลลมะเรงเชนสารเคมpolyethyleneglycol(9)lysplecithin(10)และfusogen(11)เปนตน

การศกษานไดกระตนDCs โดยสรางเซลลลกผสมDCsกบเซลลมะเรงเตานมเพาะเลยงในหลอดทดลอง

โดยใชpolyethyleneglycolและทดสอบประสทธภาพของเซลลลกผสมDCsตอการแบงตวของTlymphocyte

และกระตนการท�างานของNKcell

วสดและวธการ

การเพาะเลยงเซลลมะเรงเตานม

เพาะเลยงเซลลมะเรงเตานมMCF-7(ATCC®HTB-22™,humanbreastcanceradenocarcinoma

cell line) ใน culture flask ทมอาหารเลยงเซลลDulbeccoModifiedEagleMedium (ThermoFisher

Scientific,Carlsbad,CA,USA)1%Penicillin/Streptomycin(ThermoFisherScientific,Carlsbad,

CA,USA)และ10%fetalbovineserum(FBS;GrandIslandBiologicalCompany,GrandIsland,

NY, USA) บมเซลลมะเรงในตเพาะเลยงเซลล ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส (๐ซ) ในสภาวะทม 5% CO2

ตรวจดการเจรญของเซลลมะเรงภายใตกลองจลทรรศน เมอเซลลมะเรงแบงตวจนไดเซลลประมาณรอยละ 80-90

ของพนทเพาะเลยงจงน�ามายอยดวยสารละลาย0.05%Trypsin-EDTA(ThermoFisherScientific,Carlsbad,

CA,USA)ทอณหภม37๐ซในสภาวะทม5%CO2นาน2-5นาทแลวน�าเซลลทยอยไดไปเพาะเลยงตอหรอน�าไป

ทดลองในขนตอนตอไป

การเตรยม DCs

น�า Leukocyte-EnrichedBuffy coats จากอาสาสมครจ�านวน 6 ราย มาปนคดแยก Peripheral

BloodMononuclearCells(PBMC)โดยใชIsoPrep(RobbinsScientific,Sunny-vale,CA,USA)แลว

น�ามาคดแยกเซลลโมโนซยทดวยวธCD14positivecellspurificationโดยใชImmunomagneticMicrobeads

(MiltenyiBiotech, BergischGladbach,Germany) ตรวจสอบความบรสทธ (purity) และความเหมอน

(identity)ของเซลลโมโนซยทโดยวธFlowcytometryดวยเครองFACSCaliburinstrument(BDBiosciences,

In vitro Generation of DCs-Breast Cancer Cell Hybrids Supaporn Suparak et al.

20 วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 61 ฉบบท 1 มกราคม - มนาคม 2562

San Jose,CA,USA)น�าเซลลโมโนซยท ทไดมากระตนใหเปนDCs โดยเพาะเลยงทอณหภม 37๐ซ ในสภาวะ

ทม5%CO2ในอาหารเลยงเซลลRPMI1640Medium(ThermoFisherScientific,Carlsbad,CA,USA)

ทมไซโตไคน 1,000 unit/ml Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF;

Miltenyi Biotech, BergischGladbach, Germany) 500 unit/ml interleukin-4 (IL-4;Miltenyi

Biotech,BergischGladbach,Germany)10%FBSและ1%penicillin/streptomycinเปนเวลา5-7วน

โดยเปลยนอาหารเลยงเซลลทก2วนเมอครบเวลาตรวจสอบการเปลยนแปลงของเซลลโมโนซยทไปเปนเซลลDCs

โดยยอมกลมของโปรตนบนผวเซลล(Clusterofdifferentiation,CD)ทปรากฏขนหรอเปลยนแปลงไปหลงจาก

การกระตนเซลลโมโนซยทดวยไซโตไคน GM-CSF และ IL-4 โดยยอมดวยสาร antibody ทจ�าเพาะกบโปรตน

ชนดตางๆ บนผวเซลลและตดฉลากดวยสารเรองแสง(fluorophore)ไดแกanti-CD14-FITC,anti-CD11c-FITC,

anti-HLA-DR-PEmonoclonalantibody;ThermoFisherScientific,Carlsbad,CA,USA)ตรวจวดโปรตน

บนผวเซลลทจบกบantibodyดวยเครองFACSCaliburinstrument(BDBiosciences,SanJose,CA,USA).

ตวอยางLeukocyte-EnrichedBuffycoatsจากอาสาสมครไดรบความอนเคราะหจากศนยบรการโลหต

แหงชาตสภากาชาดไทยโดยไดรบการยนยอมตามกระบวนการบรจาคโลหตและไมสามารถระบถงตวบคคลผบรจาคได

การคดแยก T lymphocyte (CD3+) หรอ NK cell (CD3- CD56+)

คดแยก T lymphocyte (CD3+) ดวยชด EasySep™HumanCD3 Positive SelectionKit

(STEMCELL technologies, Vancouver, Canada) และคดแยก NK cell (CD3- CD56+) ดวยชด

EasySep™HumanCD56PositiveSelectionKit(STEMCELLtechnologies,Vancouver,Canada)

โดยน�า PBMCs ปรมาณ 1 x 108 เซลล เตมลงในEasySep® CD3Positive selection cocktail ปรมาตร

100ไมโครลตร/มลลลตรส�าหรบคดแยกTlymphocyteหรอEasySep®CD56Positiveselectioncocktail

ส�าหรบคดแยกNKcellผสมเบาๆ แลวบมท25±5๐ซเปนเวลา15นาทแลวเตมEasySep®magneticnanoparticles

cocktailปรมาตร50ไมโครลตร/มลลลตรส�าหรบTlymphocyteหรอNKcellน�าไปบมท25±5๐ซเปนเวลา

10 นาท แลวปรบปรมาตรใหได 2.5 มลลลตร ดวยอาหารเลยงเซลล RPMI 1640 และ 10% FBS จากนน

น�าไปวางในEasySep®Magnetเปนเวลา5นาทจงเทsupernatantทงแลวเตมRPMI1640และ10%FBS

ปรมาตร2.5มลลลตรท�าซ�าเชนเดมหลงจากนนตรวจวดคณสมบตของเซลลดวยเครองFACSCaliburinstrument

(BDBiosciences,SanJose,CA,USA)

การสรางเซลลลกผสม DCs กบเซลลมะเรงเตานม (DCs - MCF-7 fusion cells)

ผสมเซลลเพาะเลยงDCsจากอาสาสมครแตละราย(มการแสดงออกของโปรตนHLA-DRบนผวเซลล,

HLA-DR+)กบเซลลมะเรงเตานมเพาะเลยงMCF-7(มการแสดงออกของโปรตนMUC1บนผวเซลล,MUC1+)

ในอตราสวน 10:1 แลวปรบปรมาตรใหเปน 10 มลลลตร ดวยRPMI 1640 และ 10%FBS จากนนน�าไปปนท

1,500rpmเปนเวลา10นาทแลวเตม50%polyethyleneglycol(Sigma,St.Louis,MO,USA)ปรมาตร

1มลลลตรน�าไปบมท37๐ซในสภาวะทม5%CO2เปนเวลา5นาทเมอครบเวลาเตมRPMI1640และ10%FBS

ปรมาตร 5 มลลลตร แลวน�าไปปนท 1,500 rpm เปนเวลา 5 นาท จากนนเตมRPMI 1640 และ 10%FBS ท

ม1,000unit/mlGM-CSFและ500unit/mlIL-4และน�าไปเลยงท37๐ซในสภาวะทม5%CO2เปนเวลา

24-48 ชวโมง เมอครบเวลาตรวจวดคณสมบตของเซลลลกผสมทไดดวยเครอง FACSCalibur instrument

(BDBiosciences,SanJose,CA,USA)โดยเซลลลกผสมDCs(DCs-MCF-7fusioncells)ตองมการ

แสดงออกของโปรตนทงHLA-DRและMUC1บนผวเซลลน�าเซลลลกผสมไปปนท1,200rpmเปนเวลา10นาท

แลวน�าไปทดสอบประสทธภาพตอไป

การสรางเซลลลกผสม DCs กบเซลลมะเรงเตานม สภาพร สภารกษ และคณะ

21วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 61 ฉบบท 1 มกราคม - มนาคม 2562

การทดสอบประสทธภาพเซลลลกผสม DCs

การเพมจ�านวน T lymphocytesน�าเซลลลกผสมDCsกบเซลลมะเรงเตานม(DCs-MCF-7fusioncells)

ทเตรยมไดมาทดสอบประสทธภาพ ดวยการวดผลกระตนการเพมจ�านวนT lymphocyte โดยน�า T lymphocyte

ทแยกไวมายอมดวยสารเรองแสงCarboxyfluoresceinsuccinimidylester(CFSE;ThermoFisherScientific,

Carlsbad,CA,USA)ทความเขมขน5ไมโครโมลารเปนเวลา15นาทแลวน�ามาเพาะเลยงรวมกบเซลลลกผสมโดยน�าไป

บมท37๐ซในสภาวะทม5%CO2เปนเวลา72ชวโมงเมอครบเวลาน�าเซลลมายอมดวยสารเรองแสงPropidiumiodide

(PI; Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA) ตรวจวด T lymphocyte ทเพมจ�านวนดวย

เครอง Guava®easyCyte FlowCytometer (MilliporeCorp,Hayward,CA,USA) โดยท negative

controlคอTlymphocyteทถกกระตนดวยDCsทไมสรางเซลลลกผสม(DCsnon-fusioncells)และpositive

controlคอTlymphocyteทถกกระตนดวยPhytohemagglutinin(PHA;Sigma,St.Louis,MO,USA)

ความเขมขน 10 ไมโครกรม/มลลลตร โดย T lymphocyte ทถกกระตน (แสดงผลเปน%) มการตดส CFSE

และยอมไมตดสPI

การเพมความสามารถ NK cell ในการท�าลายเซลลมะเรงเตานมน�าNKcellทคดแยกไวมากระตนดวยเซลล

ลกผสม(DCs-MCF-7fusioncells)เปนเวลา24ชวโมงเมอครบเวลาน�าNKcellทถกกระตนมาเพาะเลยง

รวมกบเซลลมะเรงเตานมเพาะเลยงMCF-7ทยอมดวยสารเรองแสงCFSEทขนาดความเขมขน 5 ไมโครโมลาร

เปนเวลา15นาทหลงจากบมท37๐ซในสภาวะทม5%CO2เปนเวลา4-6ชวโมงจงน�ามายอมสารเรองแสงPI

และตรวจวดการท�าลายเซลลมะเรงเตานมดวยเครองGuava ®easyCyteFlowCytometers(MilliporeCorp,

Hayward,CA,USA) โดยท negative control คอNK cell ทถกกระตนดวยDCs ทไมสรางเซลลลกผสม

(DCsnon-fusioncells)และpositivecontrolคอNKcellทถกกระตนดวยPHAความเขมขน10ไมโครกรม/

มลลลตรโดยเซลลมะเรงเตานมทถกท�าลาย(แสดงผลเปน%)ยอมตดสCFSEและสPI

ผล

การเพาะเลยง DCs

ผลการคดแยกเซลลโมโนซยทและน�ามาเพาะเลยงกระตนดวยไซโตไคนGM-CSF และ IL-4 เพอให

เปลยนคณสมบตจากเซลลโมโนซยทไปเปนDCs จากการตรวจสอบคณสมบตของเซลลโมโนซยทหลงกระตนพบวา

บนผวเซลลโมโนซยททเปลยนเปน DCs ของอาสาสมครแตละราย มการแสดงออกของโปรตน CD14 บนผวเซลล

ลดลง ขณะท CD11c และHLA-DRมการแสดงออกเพมมากขน ไดเซลลเพาะเลยงDCs (DCs generation)

ส�าเรจเฉลยรอยละ97.33(ตารางท1)ผลตรวจวดคณสมบตของDCsจากอาสาสมคร6รายดวยเครองflowcytometer

(ภาพท 1) โดยเซลลเพาะเลยง DCs ลดการแสดงออกของโปรตน CD 14 และมการแสดงออกของโปรตน

ทงCD11cและHLA-DR(CD11c+ HLA-DR+)บนผวเซลล

In vitro Generation of DCs-Breast Cancer Cell Hybrids Supaporn Suparak et al.

22 วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 61 ฉบบท 1 มกราคม - มนาคม 2562

ภาพท 1 คณสมบตเซลลเพาะเลยงDCsจากอาสาสมคร(Donor)ทงหมด6รายหลงจากคดแยกเซลลโมโนซยท

และกระตนดวยGM-CSFและIL-4เพอเปลยนเปนเซลลDCsตรวจวดดวยเครองFlowcytometer

โดยคดแยกตามขนาดสวนประกอบโครงสรางภายในเซลล(sidescatter,SSC-Height)และการแสดงออก

ของโปรตนCD14CD11cและHLA-DRบนผวเซลล

การสรางเซลลลกผสม DCs กบเซลลมะเรงเตานม สภาพร สภารกษ และคณะ

23วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 61 ฉบบท 1 มกราคม - มนาคม 2562

การสรางเซลลลกผสม DCs กบเซลลมะเรงเตานม (DCs - MCF-7 fusion cells)

สรางเซลลลกผสมDCsกบเซลลมะเรงเตานม(DCs-MCF-7fusioncells)โดยน�าเซลลเพาะเลยงDCs

ของอาสาสมครแตละรายทมคณสมบตแสดงออกโปรตนHLA-DRบนผวเซลล(HLA-DR+)มาผสมกบเซลลมะเรง

เตานมเพาะเลยงทมคณสมบตแสดงออกโปรตนMUC1บนผวเซลล(MUC1+)โดยใชสารเคมpolyethyleneglycol

เพอใหเซลลรวมกนไดเซลลลกผสมพบวาDCsของอาสาสมครทง6รายสามารถรวมกบMCF-7ไดผลอตราการสราง

เซลลลกผสมส�าเรจเฉลยรอยละ34.67(ตารางท1)ผลตรวจวดคณสมบตของเซลลลกผสมจากเซลลเพาะเลยงDCs

จากอาสาสมคร 6 ราย ดวยเครอง flow cytometer (ภาพท 2) โดยเซลลลกผสมมการแสดงออกของโปรตน

บนผวเซลลทงHLA-DRและMUC1(HLA-DR+ MUC1+)ขณะทเซลลเพาะเลยงDCsทไมสรางเซลลลกผสม

มการแสดงออกเฉพาะโปรตนHLA-DRบนผวเทานน(HLA-DR+)

ภาพท 2 คณสมบตเซลลลกผสมDCsกบเซลลมะเรงเตานม(DCs-MCF-7fusioncells)จากอาสาสมคร(Donor)

ทงหมด6รายตรวจวดโปรตนHLA-DRและMUC1บนผวเซลลดวยเครองFlowcytometer

In vitro Generation of DCs-Breast Cancer Cell Hybrids Supaporn Suparak et al.

24 วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 61 ฉบบท 1 มกราคม - มนาคม 2562

การทดสอบประสทธภาพเซลลลกผสม DCs กบเซลลมะเรงเตานม (DCs - MCF-7 fusion cells)

การกระตนเพมจ�านวนของ T lymphocyte

น�าเซลลลกผสมDCs (DCs-MCF-7 fusion cells)มาทดสอบประสทธภาพกระตนการเพมจ�านวน

Tlymphocyteพบวาเซลลลกผสมของอาสาสมครทง6รายสามารถกระตนการเพมจ�านวนTlymphocyteไดเฉลย

รอยละ75.89ขณะทเซลลเพาะเลยงDCsทไมสรางเซลลลกผสม(DCsnon-fusioncells)กระตนTlymphocyte

เฉลยรอยละ24.55(ตารางท1)ผลทดสอบกระตนTlymphocyteดวยเซลลลกผสมDCs-MCF-7fusioncells

จากอาสาสมคร 6 ราย (ภาพท 3) โดย T lymphocyte ทถกกระตนและเพมจ�านวนมการตดส CFSE ลดลง

และไมตดสPI

ภาพท 3 ผลทดสอบประสทธภาพเซลลลกผสมกระตนการเพมจ�านวนTlymphocytesจากอาสาสมคร(Donor)

ทงหมด6รายตรวจวดดวยเครองFlowcytometer

Negativecontrol:TlymphocytesถกกระตนดวยDCsทไมไดสรางเซลลลกผสม(แสดงเฉพาะDonor1)

Positivecontrol:TlymphocytesถกกระตนดวยPHA(แสดงเฉพาะDonor1)

การสรางเซลลลกผสม DCs กบเซลลมะเรงเตานม สภาพร สภารกษ และคณะ

25วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 61 ฉบบท 1 มกราคม - มนาคม 2562

การท�าลายเซลลมะเรงเตานมเพาะเลยงโดย NK cell

ผลทดสอบประสทธภาพเซลลลกผสมDCs(DCs-MCF-7fusioncells)ตอการกระตนNKcellใหท�าลาย

เซลลมะเรงเตานมเพาะเลยงMCF-7พบวาเซลลลกผสมDCsสามารถเพมประสทธภาพNKcellใหท�าลายเซลล

มะเรงเตานมไดสงสดถงรอยละ68.89ขณะทเซลลเพาะเลยงDCsทไมสรางเซลลลกผสม(DCsnon-fusioncells)

กระตนNKcellท�าลายเซลลมะเรงเตานมเฉลยรอยละ22.91(ตารางท1)ผลทดสอบเซลลลกผสมDCs-MCF-7

fusioncellsจากอาสาสมคร6ราย(ภาพท4)โดยเซลลมะเรงเตานมทถกท�าลายจะยอมตดทงสCFSEและสPI

ภาพท 4 ผลทดสอบประสทธภาพเซลลลกผสมกระตนNKcellsท�าลายเซลลมะเรงเตานมจากอาสาสมคร(Donor)

ทงหมด6รายตรวจวดดวยเครองFlowcytometer

Negativecontrol:NKcellsถกกระตนดวยDCsทไมไดสรางเซลลลกผสม(แสดงเฉพาะDonor1)

Positivecontrol:NKcellsถกกระตนดวยPHA(แสดงเฉพาะDonor1)

In vitro Generation of DCs-Breast Cancer Cell Hybrids Supaporn Suparak et al.

26 วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 61 ฉบบท 1 มกราคม - มนาคม 2562

ตารางท 1ผลการเพาะเลยงDCs(DCsgeneration)การสรางเซลลลกผสม(DCs-MCF-7fusioncells)

และประสทธภาพของเซลลลกผสมตอการเพมจ�านวนของTlymphocyteและการท�าลายเซลลมะเรงเตานม

ของNKcellของอาสาสมคร(Donor)6ราย

DCsfeatures(%) Donor Mean(%)

1 2 3 4 5 6

DCsgeneration

DCs–MCF-7fusioncells

DCs-MCF-7fusioncellsinduced

Tcellproliferation

DCsnon-fusioncellsinduced

Tcellproliferation

DCs-MCF-7fusioncellsinduced

NKcellkillMCF-7cells

DCsnon-fusioncellsinduced

NKcellkillMCF-7cells

98

35

72.68

27.13

68.78

23.13

97

33

70.69

25.47

65.79

24.58

96

36

75.89

26.48

67.87

25.34

98

36

74.87

24.15

60.08

23.47

97

34

69.39

22.64

66.89

23.78

98

34

68.49

21.47

64.74

21.89

97.33

34.67

72.00

24.55

65.69

22.91

วจารณ

การสรางเซลลลกผสมเปนทางเลอกเพอเพมประสทธภาพของDCsในหลอดทดลองเพอใหDCsสามารถ

ตรวจจบน�าเสนอเซลลมะเรงและกระตนการตอบสนองทางภมคมกนการศกษานใชpolyethyleneglycolมวลโมเลกล

1450ความเขมขน50%ซงสามารถเพมแรงตงผวชกน�าใหเกดความไมเสถยรท�าลายเยอหมเซลลท�าใหเกดการเชอมกน

ระหวางเซลล และไมเกดผลเสยตอเซลล (9, 12) เพอสรางเซลลลกผสมDCs จากอาสาสมครสขภาพดกบเซลลมะเรง

เตานมเพาะเลยงทไดอตราความส�าเรจเฉลย34.67%สอดคลองกบรายงานการสรางเซลลลกผสมDCs-tumorcells

ในผปวยมะเรงเตานม ทอตราสวนDCs ตอเซลลมะเรง 3:1 ถง 10:1 ใน 50% polyethylene glycol พบวา

ไดผลความส�าเรจ18-71%แตกตางกนในผปวยแตละราย(13)การสรางเซลลลกผสมในผปวยเนองอกไกลโอมา(Glioma)

ในอตราสวนDCsตอเซลลมะเรง3:1ใน50%polyethyleneglycolพบวาไดผลความส�าเรจ66.2%(14)และการสราง

เซลลลกผสมDCsกบเซลลมะเรงล�าไสทอตราสวน10:1ใน50%polyethyleneglycolพบวาผลจากเซลลมะเรง

ล�าไสเพาะเลยงไดความส�าเรจ 34.50% และผลจากเซลลมะเรงล�าไสจากตวผปวยเองไดความส�าเรจ 33.28% (15)

ซงปจจยทมผลตอความส�าเรจการสรางเซลลลกผสม ไดแก แหลงทมาของDCs ชนดของเซลลมะเรงทน�ามากระตน

และวธการสรางเซลลลกผสม(16,17)

การสรางเซลลลกผสม DCs กบเซลลมะเรงเตานม สภาพร สภารกษ และคณะ

27วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 61 ฉบบท 1 มกราคม - มนาคม 2562

ผลทดสอบประสทธภาพเซลลลกผสมDCsพบวาเซลลลกผสมDCsทเตรยมจากอาสาสมครกบเซลลมะเรง

เตานมเพาะเลยง สามารถกระตนการเพมจ�านวนT lymphocyte และเพมประสทธภาพNK cell ใหท�าลายเซลล

มะเรงเตานมเพมมากขน สอดคลองกบรายงานวจยอนทพบวาเซลลลกผสมDCs สามารถกระตน T lymphocyte

เมอทดสอบกบมะเรงหลายชนดทงในระดบหองปฏบตการสตวทดลองและการวจยทางคลนกดงเชนเซลลลกผสมDCs

จากผปวยมะเรงเตานมสามารถกระตนการเพมจ�านวนของTlymphocyteและเมอน�าไปฉดกระตนในผปวยมะเรงเตานม

สามารถกระตนCD4+andCD8+TlymphocyteใหสรางไซโตไคนINF-γ เพมมากขน(18,19)รวมทงรายงานวจย

ทดสอบเซลลลกผสมDCsกบเซลลมะเรงเตานมจากหนทดลองเพาะเลยงและเซลลลกผสมDCsกบเซลลมะเรงล�าไส

พบวากระตนการเพมจ�านวนของTlymphocyteและกระตนspecificCD8+Tlymphocyteใหสามารถท�าลาย

เซลลมะเรงล�าไสไดเพมมากขน (20, 21) เชนเดยวกบการทดสอบเซลลลกผสมDCs กบเซลลมะเรงศรษะและคอ

สามารถกระตนการเพมจ�านวนT lymphocyte และกระตนการสราง INF-γ ในระดบสง และเซลลลกผสมเมอน�าไปฉดในหนทดลองทท�าใหปวยเปนมะเรงศรษะและคอ พบวาหนมอตราการรอดชวตสงขน (22)ทงนอาจเกดจากการท

DCsสามารถน�าเสนอเซลลมะเรงไดทงทางMHCclassIและMHCclassIIจงกระตนTlymphocyteไดทงชนด

Thelpercell(CD4+)และTcytotoxicitycell(CD8+)ท�าใหเกดการตอบสนองทางภมคมกนไดมากขน(15,23)

การศกษานเปนการสรางเซลลลกผสมDCsทเตรยมจากอาสาสมครกบเซลลมะเรงเพาะเลยงในหองปฏบต

การการศกษาคณสมบตในการกระตนในสตวทดลองและประยกตใชเซลลลกผสมDCsส�าหรบการศกษาทางคลนก

จะน�าไปสการประยกตใชรกษาผปวยมะเรงตอไป

สรป

การเพาะเลยงDCs จากอาสาสมครสขภาพดโดยกระตนดวยเซลลมะเรงเตานมเพาะเลยงเพอสรางเซลล

ลกผสมในหลอดทดลองสามารถกระตนการเพมจ�านวนTlymphocyteและเพมประสทธภาพNKCellใหท�าลาย

เซลลมะเรงเตานมเพมมากขนซงอาจน�าไปสการศกษาทางคลนกเพอสรางเซลลลกผสมส�าหรบกระตนระบบภมคมกน

ในผปวยมะเรงเตานมทอาจเปนประโยชนตอการรกษาผปวยมะเรงเตานมแตละรายได

กตตกรรมประกาศ

การศกษานไดรบการสนบสนนงบประมาณจากกรมวทยาศาสตรการแพทย ขอขอบคณนายแพทยสมชาย

แสงกจพรทสนบสนนการด�าเนนการวจยนายสมภพคชหารและนางสาวทศนยทองดทชวยเพาะเลยงเซลลมะเรง

เตานม และขอขอบคณหองปฏบตการดานโรคเอดสและโรคตดตอทางเพศสมพนธ ศนยความรวมมอไทย-สหรฐฯ

ดานสาธารณสขทใหความอนเคราะหการใชเครองGuava®easyCyteFlowCytometer

In vitro Generation of DCs-Breast Cancer Cell Hybrids Supaporn Suparak et al.

28 วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 61 ฉบบท 1 มกราคม - มนาคม 2562

เอกสารอางอง

1. สถาบนมะเรงแหงชาต,กรมการแพทยกระทรวงสาธารณสข.ทะเบยนมะเรงระดบโรงพยาบาลพ.ศ.2558.กรงเทพฯ:

บรษทพรทรพยการพมพจ�ากด;2560.

2. DalgleishAG,BrowningMJ.Tumorimmunology:immunotherapyandcancervaccines.NewYork:

CambridgeUniversityPress;1996.

3. BanchereauJ,SteinmanRM.Dendriticcellsandthecontrolofimmunity.Nature1998;392:245-52.

4. SteinmanRM,BanchereauJ.Takingdendriticcellsintomedicine.Nature2007;449:419-26.

5. GongJ,ChenD,KashiwabaM,KufeD.Inductionofantitumoractivitybyimmunizationwithfusions

ofdendriticandcarcinomacells.NatMed1997;3:558-61.

6. KoidoS,HommaS,HaraE,NamikiY,TakaharaA,KomitaH,etal.Regulationoftumorimmunity

bytumor/dendriticcellfusions.ClinDevImmunol2010;2010:516768.(14p.).

7. Hayashi T, TanakaH, Tanaka J,WangR,AverbookBJ,CohenPA, et al. Immunogenicity and

therapeuticefficacyofdendritic-tumorhybridcellsgeneratedbyelectrofusion.ClinImmunol2002;

104:14-20.

8. RoosDS,DuchalaCS,StephensenCB,HolmesKV,ChoppinPW.Controlofvirus-inducedcellfusion

byhostcelllipidcomposition.Virology1990;175:345-57.

9. LentzBR.PEGasatooltogaininsightintomembranefusion.EurBiophysJ2007;36:315-26.

10. TurksenK,editor.Embryonicstemcells:methodsandprotocols.2nded.Totowa,N.J.:HumanaPress;

2002.

11. AguilarPS,BayliesMK,FleissnerA,HelmingL,InoueN,PodbilewiczB,etal.Geneticbasisof

cell-cellfusionmechanisms.TrendsGenet2013;29:427-37.

12. DavidsonRL,O'MalleyKA,WheelerTB.Polyethyleneglycol-inducedmammaliancellhybridization:

effectofpolyethyleneglycolmolecularweightandconcentration.SomaticCellGenet1976;2:271-80.

13. AviganD,VasirB,GongJ,BorgesV,WuZ,UhlL,etal.Fusioncellvaccinationofpatientswith

metastaticbreastandrenalcancerinducesimmunologicalandclinicalresponses.ClinCancerRes

2004;10:4699-708.

14. KikuchiT,AkasakiY,AbeT,FukudaT,SaotomeH,RyanJL,etal.Vaccinationofgliomapatients

withfusionsofdendriticandgliomacellsandrecombinanthumaninterleukin12.JImmunother

2004;27:452-9.

15. Koido S,HaraE,HommaS, ToriiA, ToyamaY,KawaharaH, et al.Dendritic cells fusedwith

allogeneiccolorectalcancercelllinepresentmultiplecolorectalcancer-specificantigensandinduce

antitumorimmunityagainstautologoustumorcells.ClinCancerRes2005;11:7891-900.

16. KoidoS,HaraE,HommaS,NamikiY,OhkusaT,GongJ,etal.Cancervaccinebyfusionsofdendritic

andcancercells.ClinDevImmunol2009;2009:657369.(13p.).

17. TimmermanJM,LevyR.Dendriticcellvaccinesforcancerimmunotherapy.AnnuRevMed1999;

50:507-29.

18. GelaoL,CriscitielloC,EspositoA,DeLaurentiisM,FumagalliL,LocatelliMA,etal.Dendritic

cell-basedvaccines:clinicalapplicationsinbreastcancer.Immunotherapy2014;6:349-60.

การสรางเซลลลกผสม DCs กบเซลลมะเรงเตานม สภาพร สภารกษ และคณะ

29วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 61 ฉบบท 1 มกราคม - มนาคม 2562

19. Allahverdiyev A, Tari G, BagirovaM, Abamor ES. Current approaches in development of

immunotherapeuticvaccinesforbreastcancer.JBreastCancer2018;21:343-53.

20. GongJ,ApostolopoulosV,ChenD,ChenH,KoidoS,GendlerSJ,etal.Selectionandcharacterization

ofMUC1-specificCD8+TcellsfromMUC1transgenicmiceimmunizedwithdendritic-carcinoma

fusioncells.Immunology2000;101:316-24.

21. KoidoS,HaraE,ToriiA,HommaS,ToyamaY,KawaharaH,etal.Inductionofantigen-specific

CD4-andCD8-mediatedT-cell responsesby fusionofautologousdendritic cellsandmetastatic

colorectalcancercells.IntJCancer2005;117:587-95.

22. MouY,XieH,HuangX,HanW,NiY,SuH,etal.Immunologicalsuppressionofheadandneck

carcinomabydendriticcelltumorfusionvaccine.OncolLett2013;6:1799-803.

23. KoidoS.Dendritic-tumorfusioncell-basedcancervaccines.IntJMolSci2016;17:828.(16p.).

In vitro Generation of DCs-Breast Cancer Cell Hybrids Supaporn Suparak et al.

30 วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 61 ฉบบท 1 มกราคม - มนาคม 2562

In vitro Generation of Dendritic Cell - Breast Cancer Cell Hybrids

For Induction of Cellular Immunity

Supaporn Suparak* Tawanchai Sangcharoen* and Busarawan Sriwanthana***National Institute of Health ** Medical Sciences Technical Office, Department of Medical Sciences,

Tiwanond Road, Nonthaburi 11000, Thailand

Abstract Dendriticcells(DCs)ofcancerpatientsareunabletoeffectivelyprocessandpresenttumorassociatedantigenstoimmunecells,resultinginaspreadofcancercells.Ourstudywastoenhancein vitro efficacyofDCstofurtherinduceactivitiesofTlymphocytesandNaturalKiller(NK)cellsforinhibition/reduction of a growth of a breast cancer cell line (MCF-7).Humanmonocytes, derived frombuffy coat of six normal blood donors,were positively selected and generatedDCs by culturingwith recombinant GM-CSFandIL-4for6days.Humanmonocyte-derivedDCsweredeterminedbyadecreaseinalevelofCD14 andanincreaseinCD11candHLA-DRlevelsbyflowcytometry.TheDCswerefurtherpulsedwithbreast cancercelllines(MCF-7)togenerateDCs-MCF-7tumorfusioncellswithameansuccessrateat34.67%. TheDCs-MCF-7fusioncellswereabletostimulateTcellproliferationaswellastoenhanceNKcells activities to killMCF-7 from an average of 22.45% to 72.00% and 22.91% to 65.69%, respectively. Ourstudydemonstratedamodelforin vitrogenerationofeffectivehumanmonocytederivedDCs-tumorfusioncellsandapossibilitytofurtherdevelopalternativemethodtotreatcancerpatients.

Keywords: Dendritic cells, T lymphocyte, NK cell, MCF-7, breast cancer