I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Protein adalah molekul organik terbanyak yang terdapat dalam sel. Fungsi

protein antara lain memicu kontraksi dalam melakukan gerak dan memicu terjadinya

berbagai proses metabolisme dalam bentuk enzim. Protein dapat pula berperan

membawa informasi dari luar ke dalam sel dan di dalam bagian-bagian sel sendiri.

Selain itu protein juga mengendalikan dapat tidaknya, serta waktu yang tepat untuk

pengungkapan informasi yang terkandung di dalam DNA, yang diperlukan untuk

sintesis protein itu sendiri. Secara kimia, protein adalah heteropolimer dari asam-

asam amino yang terikat satu sama lain dengan ikatan peptida.

Protein jenis apapun dan berasal dari makhluk apapun tersusun atas 20 asam

amino. Jadi sebenarnya perbedaan antara protein yang satu dengan yang lainnya

disebabkan oleh jumlah dan kedudukan asam-asam amino di dalam tiap-tiap

molekul. Molekul protein berinteraksi dengan molekul air melalui ikatan hidrogen

dan membentuk mantel air. Dikarenakan molekul protein besar, maka di dalam air

protein membentuk larutan koloid. Adanya sejumlah elektrolit dengan konsentrasi

encer sangat meningkatkan kelarutan suatu protein (salting in). Sifat ini, yakni

kelarutan dalam bentuk larutan koloid yang dipermudah oleh mantel air dan elektrolit

encer, dimanfaatkan untuk pemisahan protein.

Selain sifat tersebut, protein juga mempunyai sifat lain yang berperan penting

dan menjadi dasar dalam pemisahan protein yaitu ukuran molekulnya yang berbeda-

beda sebagai akibat dari perbedaan jumlah asam amino penyusun protein serta

muatan yang dikandungnya. Sifat-sifat protein tersebut menjadi dasar pemisahan

protein yang digunakan untuk deteksi atau diagnosis molekuler. Pemisahan protein

dapat dilakukan dengan tiga cara, yaitu kromatografi gel, elektroforesis, dan salting

out.

Dasar dari proses elektroforesis adalah fakta bahwa protein adalah

makromolekul yang terdiri dari asam amino yang terikat secara kovalen. Setiap

protein dibedakan dari muatan elektronnya yang berikatan secara kovalen atau ionik.

Hal inilah yang menyebabkan suatu larutan dengan pH tertentu dapatmengandung

protein dengan muatan listrik yang berbeda-beda. Sebab, susunan dan jumlah asam

amino setiap protein tidaklah sama. Apabila larutan protein diletakkan dalam suatu

medan listrik, tiap protein akan bermigrasi ke kutub yang berlawanan dari muatan

yang dikandung protein tersebut. Protein yang bermuatan negatif akan bergerak ke

anode yang adalah kutub positif. Sementara itu, protein yang tidak bermuatan tidak

akan bergerak. Suatu molekul harus dapat berinteraksi dengan molekul air dengan

membentuk ikatan hidrogen sehingga molekul tersebut tersebar rata di antara

molekul-molekul air. Adanya muatan listrik pada molekul terlarut sangat membantu

kelarutan karena muatan yang sama saling menjauhi sehingga agregasimolekul tidak

terjadi. Inilah yang mendasari proses salting out. Setiap keadaan yang menyebabkan

ditariknya air yang mengelilingi molekul protein sangat mengurangi kelarutan

protein sehingga protein mengendap.

Pada percobaan salting out, larutan garam bivalen lebih efisien dalam

mengendapkan protein karena berdisosiasi menjadi tiga ion yang berinteraksi

sempurna dengan air. Globulin dapat diendapkan dengan ammonium sulfat setengah

jenuh, sedangkan albumin dapat diendapkan oleh ammonium sulfat jenuh, tidak

dapat mengendap dengan NaCl jenuh, kecuali dengan penambahan asama mineral

yang sangat kecil.

1.2 Tujuan

1. Memperlihatkan, bahwa protein mempunyai ikatan peptida yang bereaksi

positif dengan uji biuret. Reaksi ini tidak terjadi pada makromolekul lain.

2. Memperlihatkan, bahwa sebagai makromolekul yang larut dalam bentuk

larutan koloid, protein dapat dipisahkan satu dari yang lain, dengan menggunakan

larutan garam divalen konsentrasi tinggi.

II. TINJAUAN PUSTAKA

Untuk larut dalam air, suatu molekul dapat berinteraksi dengan molekul air

dengan cara membentuk ikatan hidrogen sehingga molekul tersebut tersebar rata di

antara molekul-molekul air. Adanya muatan listrik pada pada molekul terlarut sangat

membantu kelarutan, karena muatan yang sama saling menjauhi, sehingga agregasi

molekul tidak terjadi.

Protein merupakan makromolekul karena memiliki BM (Berat Molekul)

besar. Pada umumnya protein mudah larut dalam air karena protein mempunyai

kedua sifat berikut. Gugus –CO-dan –NH- yang pada ikatan peptida dapat

berinteraksi dengan molekul air melalui ikatan hidrogen, sedangkan berbagai rantai

samping , yang diantaranya ada yang hidrofilik, bahkan juga bermuatan, sangat

mudah berinteraksi dengan molekuk air. Selain itu,muatan listrik yang sama dalam 2

partikel molekul protein yang sama, akan bertolakan, sehingga membantu

meningkatkan kelarutan protein (salting out).

Setiap keadaan yang menyebabkan ditariknya air yang mengelilingi molekul

protein, sangat mengurangi kelarutan protein, sehingga protein mengendap. Larutan

garam berkonsentrasi tinggi bersifat demikian. Selain itu, larutan garam

berkonsentrasi tinggi akan menetralkan muatan listrik sehingga kelarutan akan makin

berkurang.

Oleh karena pengendapan dengan cara ini hanya bersifat menarik, air di

sekeliling protein, sedangkan molekul protein sendiri tidak mengalami perubahan

kimia, maka perubahan tersebut bersifat reversibel. Kelarutan dan fungsi protein

umumnya akan pulih kembali bila dikembalikan ke keadaan semula.1

Larutan garam divalen lebih efisien dalam mengendapkan protein, karena di

dalam air garam tersebut akan berdisosiasi menjadi 3 ion, yang masing-masing

berinteraksi sempurna dengan air. Sebagai contoh, globulin dapat diendapkan oleh

(NH4)2SO4 setengah jeaptnuh, sedangkan NaCl baru dapat mengendapkan protein

tersebut bila berada dalam larutan jenuh. Albumin, yang baru akan mengendap oleh

jenuh, tidak dapat diendapkan oleh NaCl jenuh, kecuali dengan penambahan asam

mineral dalam jumlah yang sangat kecil.

III. METODOLOGI PRAKTIKUM

III.1 Waktu Dan Tempat

Praktikum salting out dan uji biuret ini berlangsung pada hari rabu, 04 Mei

2014 di ruang praktikum Fakultas Kedokteran Universitas Palangka Raya.

3.2 Alat Dan Bahan

- Serum sapi 10 mL

- Larutan Amonnium sulfat (NH4)2SO4 jenuh 25 mL

- Kristal Amonnium sulfat (NH4)2SO4 jenuh 10 mL

- Larutan NaCl 0,9% 1 mL

- Larutan NaOH 10% 2ml

- Larutan CuSO4 0,1% beberapa tetes

- Aquades

- Spectrophotometer

- Spatula

- Kertas Penyaring

- Corong

- Tabung reaksi

- Gelas Kimia

- Pipet tetes

- Kertas Labe

IV. CARA KERJA

Cara kerja untuk pengendapan protein dengan larutan garam konsentrasi

tinggi (salting out) dan uji biuret pada filtrat dan presipitate 50%:

1. Siapkan tabung reaksi, gelas ukur, corong, pipet, dan kertas saring.

2. Ambil 10 mL serum sapi lalu tambahkan dengan 10 mL larutan ammonium sulfat

(NH4)2SO4 jenuh.

3. Aduk dengan cara putar gelas tersebut namun tidak boleh sampai berbusa.

4. Lipat kertas saring menjadi dua bagian lalu ambil bagian tengahnya sehingga

membentuk seperti corong.

5. Kemudian larutan tersebut disaring dengan kertas saring dengan cara

meletakkannya diatas corong

6. Ambil 1 mL filrat 50%. Kemudian, lakukan uji Biuret dengan menambahkan

CuSO4 1 tetes untuk tabung 1.

7. Ambil sedikit presipitannya (presipitate 50%) dengan sendok pengaduk,

tambahkan 1 mL NaCl 0,9%. Kemudian, lakukan uji Biuret dengan menambahkan

CuSO4 1 tetes untuk tabung 2.

Cara kerja untuk pengendapan protein dengan larutan garam konsentrasi

tinggi (salting out) dan uji biuret pada filtrat dan presipitate 100%:

1. Siapkan tabung reaksi, gelas ukur, corong, pipet, dan kertas saring.

2. Ambil 10 mL serum sapi lalu tambahkan dengan 10 mL larutan ammonium sulfat

(NH4)2SO4 jenuh.

3. Putar gelas tersebut namun tidak boleh sampai berbusa.

4. Lipat kertas saring menjadi dua bagian lalu ambil bagian tengahnya sehingga

membentuk seperti corong

5. Kemudian larutan terebut disaring dengan kertas saring dengan cara

meletakkannya diatas corong

6. Ambil 1 mL filrat 50%. Kemudian, lakukan uji Biuret dengan menambahkan

CuSO4 1 tetes untuk tabung 1.

7. Ambil sedikit presipitannya (presipitate 50%) dengan sendok pengaduk,

tambahkan 1 mL NaCl 0,9%. Kemudian, lakukan uji Biuret dengan menambahkan

CuSO4 1 tetes untuk tabung 2.

V. HASIL

Tabung Warna Hasil Uji Biuret AnalisisFiltrat 50% Lembayung + Mengandung albuminPresipitat 50% Lembayung + Mengandung globulinFiltrat 100% Biru - Tidak mengandung proteinPresipitat 100% Lembayung + Mengandung albumin

Foto-foto hasil Uji Biuret

Ket : Tabung 1

Presipitat 50% + uji biuret -> warna Lembayung (+)

Ket :Tabung 2Filtrat 50% + uji biuret -> warna Lembayung (+)

Ket :Tabung 3

Presipitat 100% + uji biuret -> warna Lembayung (+)

Ket :Tabung 4Filtrat 100% + uji biuret -> tidak berwarna Lembayung (-)

VI. PEMBAHASAN

Presipitat atau endapan I, merupakan presipitat setengah jenuh yang

kemudian diencerkan dengan menambahkan NaCl 0,1 % sebanyak 2 ml

dan dilakukan uji biuret dengan menambahkan 2 ml NaOH 10% kedalam

larutan setengah jenuh (presipitat 50%) dan kemudian ditambahkan

CuSO4 0,1 % tetes demi tetes hingga terjadi perubahan warna pada

larutan. Setelah ditetesi CuSO4 larutan berubah warna menjadi lembayung

yang menandakan bahwa di dalam larutan tersebut terdapat protein

globulin. Hal ini dikarenakan berat dan ukuran protein globulin lebih

besar dibanding protein albumin sehingga pada proses pengendapan

setengah jenuh protein globulin tidak dapat melewati kertas penyaring.

Filtrat I, merupakan filtrat setengah jenuh yang kemudian diencerkan

dengan menambahkan NaCl 0,1% sebanyak 2 ml kemudian dilakukan uji

biuret dengan menambahkan NaOH 10% sebayak 2 ml dan kemudian

ditambahkan CuSO4 tetes demi tetes hingga terjadi perubahan warna pada

larutan. Setelah diberikan CuSO4 tetes demi tetes, larutan berubah warna

menjadi lembayung yang membuktikan adanya protein yang terkandung

dalam larutan tersebut. Protein yang terkandung dalam larutan tersebut

ialah Albumin, sebab albumin tidak mengendap pada larutan setengah

jenuh sehingga akan melewati kertas penyaring sehingga akan tetap

berada dalam filtrat. Pemberian amonium sulfat pada tahap 2

menyebabkan sebagian protein larut air (salting in) dan lolos dari kertas

saring sedangkan sebagian lainnya tertahan. Hal ini juga yang

memberikan intensitas warna lembayung yang mirip pada tabung 1 dan 2.

Endapan II, merupakan presipitat jenuh yang kemudian diencerkan

dengan menambahkan NaCl 0,1 % sebanyak 2 ml dan dilakukan uji biuret

dengan menambahkan 2 ml NaOH 10% kedalam larutan jenuh (presipitat

100%) dan kemudian ditambahkan CuSO4 0,1 % tetes demi tetes hingga

terjadi perubahan warna pada larutan. Setelah ditetesi CuSO4 larutan

berubah warna menjadi lembayung yang menandakan bahwa di dalam

larutan tersebut terdapat protein. Presipitat jenuh ini mengandung protein

albumin. Semakin kuat intensitas warna ungu yang dihasilkan, semakin

besar konsentrasi protein.

Filtrat II, merupakan filtrat jenuh yang kemudian diencerkan dengan

menambahkan NaCl 0,1% sebanyak 2 ml kemudian dilakukan uji biuret

dengan menambahkan NaOH 10% sebayak 2 ml dan kemudian

ditambahkan CuSO4 tetes demi tetes hingga terjadi perubahan warna pada

larutan. Setelah diberikan CuSO4 tetes demi tetes, larutan berubah warna

menjadi biru yang membuktikan bahwa tidak ada protein yang terkandung

dalam larutan tersebut. Perubahan warna biru pada larutan menunjukkan

tidak adanya ikatan peptida pada larutan yang diuji.

Ditemukannya albumin pada presipitat jenuh sedangkan globulin tidak

disebabkan oleh dua hal, yakni berat molekul dan konsentrasi kedua

protein tersebut. Protein albumin memiliki berat molekul yang lebih besar

daripada berat molekul globulin (Berat molekul albumin serum adalah 69

kDa sedangkan β2-mikroglobulin memiliki berat molekul 11.5 kDa). Hal

tersebut terkait pula dengan tingkat konsentrasi kedua protein dalam

plasma. Konsentrasi albumin serum dalam plasma adalah 35 – 45 mg/ml

sedangkan konsentrasi β2-mikroglobulin dalam plasma adalah 0.0013

mg/ml. Tingginya konsentrasi albumin serum dalam plasma

mengindikasikan keberadaannya dalam fase presipitat 100% sedangkan

rendahnya konsentrasi β2-mikroglobulin dalam plasma mengindikasikan

keberadaannya dalam fase filtrat 100% yang nol (tidak ada).

VII. KESIMPULAN

Tabung 1,2 dan 3 berubah warna menjadi ungu setelah diuji dengan uji biuret

m enunjukkan adanya protein. Intensitas warna ungu yang lebih kuat pada tabung

3 menunjukkan larutan pada tabung 3 memiliki konsentrasi protein yang lebih

besar dibandingkan tabung 1 dan tabung 2. Tabung 3 menunjukkan perubahan

warna menjadi biru sebagai tanda bahwa tidak ada protein pada larutan ini.

Sedangkan tabung 4 tidak bereaksi negatif dengan menghasilkan warna biru.

Globulin merupakan protein yang berukuran lebih besar sehingga dapat

dipisahkan pada penyaringan pertama. Albumin berukuran lebih kecil daripada

globulin sehingga bovine serum harus diberi garam sampai jenuh untuk dapat

dipisahkan. Pada campuran setengah jenuh, presipitan mengandung globulin dan

filtrat mengandung albumin. Pada campuran jenuh, presepitan mengandung

albumin dan filtrat tidak mengandung protein.

DAFTAR PUSTAKA1. Buku Pedoman Praktikum Modul Biologi. PSPD.

Universitas Palangka Raya.2014.2. Panil, Zulbadar. Teori dan Praktik Biokimia Dasar

Medis. Jakarta : EGC. 2007.3. Murray, RK. Granner. DK., Rodwel. Vw.Editor.

Brahm. Biokimia Herper. Ed .27. Jakarta : EGC, 2009.

4. Soewoto H, Sodikin M, Kurniati M. Biokimia Eksperimen Laboratorium. Jakarta : Widyo Melika. 2000.

LAMPIRAN

Ket :

Hasil pencampuran serum sapi 25 ml dengan (NH)4SO4 kristal 25 ml

Ket :

Penyaringan hasil campuranserum sapi 25 ml dengan (NH)4SO4

kristal 25 ml

Ket :

Presipitat hasil penyaringan campuran serum sapi 25 ml dengan (NH)4SO4 kristal 25 ml

Ket :

Filtrat hasil penyaringan campuran serum sapi 25 ml dengan (NH)4SO4

kristal 25 ml

Ket :

Hasil uji biuret presipitat 1 dengan campuran 2 ml NaCl dan beberapa tetes CuSO4 hingga warnanya berubah menjadi lembayung

Ket :

Hasil uji biuret filtrat 1 dengan campuran 1 ml fitrat dengan 1 ml NaOH dan beberapa tetes CuSO4 hingga warnanya berubah menjadi lembayung

Ket :

Hasil pencampuran fitrat 1 10ml dengan kristal (NH)4SO4 10 ml

Ket :

Penyaringan hasil campuranFiltrat 1 10 ml dengan Kristal (NH)4SO4 10 ml

Ket :

Presipitat hasil penyaringan filtrat 1 dengan Kristal (NH)4SO4 10 ml

Ket :

Filtrat 2 hasil penyaringan campuran filtrat 1 dengan Kristal (NH)4SO4 10 ml

Ket :

Hasil uji biuret presipitat 2 dengan campuran 2 ml NaCl dan beberapa tetes CuSO4 hingga warnanya berubah menjadi lembayung

Ket :

Hasil uji biuret filtrat 2 dengan campuran 1 ml filtrat 2 dengan 1 ml NaCl ditambah 2ml NaOH dan beberapa tetes CuSO4

hingga warnanya berubah

menjadi lembayung

MODUL BIOLOGI MOLEKULER

LAPORAN PRAKTIKUM

SALTING OUT

Kelompok 2

Puspa Negara FAA 113 013

Nurul Hidayanti Maharani FAA 113 014

Efraim Said Sudarto FAA 113 015

Dian Triyeni Asi FAA 113 016

Sheren Vinera Lin’s FAA 113 017

Feromiya Oksa FAA 113 018

Sofia Eugenia Manginte FAA 113 019

Mira Aprilia FAA 113 020

Ismi Sholihah FAA 113 021

Widi Cahya Utami FAA 113 022

Pipin Septiana FAA 113 023

FASILITATOR/TUTOR:

Fatmaria,S.Farm.,Apt

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS PALANGKA RAYA

2014