UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE QUÍMICA
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Bioquímica)
WALCIANE DA SILVA
Proteínas envolvidas na secreção microapócrina na
lagarta de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera)
Versão corrigida da Tese conforme Resolução CoPGr 5890
São Paulo
Data do Depósito na SPG: 03/10/2012
WALCIANE DA SILVA
Proteínas envolvidas na secreção microapócrina na
lagarta de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera)
Tese apresentada ao Instituto de Química da
Universidade de São Paulo para obtenção do
Título de Doutor em Ciências (Bioquímica).
Orientadora: Profa. Dra. Clélia Ferreira
São Paulo
2012
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO _________________________________ INSTITUTO DE QUÍMICA
“Proteínas envolvidas na secreção microapócrina na lagarta de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera)”
Tese de Doutorado submetida ao Instituto de Química da Universidade de São Paulo como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutora em Ciências - Área: Bioquímica.
Aprovada por:
__________________________________________ Profa. Dra. Clélia Ferreira Terra
Orientadora e Presidente
__________________________________________
Profa. Dra. Carla Columbano de Oliveira IQ - USP
__________________________________________
Prof. Dr. Carlos Takeshi Hotta IQ - USP
__________________________________________ Prof. Dr. Carlos Eduardo Winter
ICB - USP
__________________________________________
Prof. Dr. Ednildo de Alcantara Machado UFRJ
SÃO PAULO 23 de novembro de 2012
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Fátima e Donizete, pelo apoio incondicional
Aos meus irmãos Franciscarlla e Danilo
À minha avó Maria Jorge (in memoriam)
À Deus
À minha orientadora Profa. Dra. Clélia Ferreira, pela orientação, paciência, empenho e intensa dedicação. Ao Professor Dr. Walter Ribeiro Terra pelas valiosas discussões e sugestões em todas as etapas do trabalho. Aos amigos de laboratório pela convivência agradável e pela troca de experiências de bancada, Dr. Marcelo Padilha, Dr. Fábio Tamaki, Dra. Thaís Bifano, Dr. Ivan Bragatto, Juliene Jéssica, Guilherme Pereira, Daniela de Jesus. Em especial à Nathália Ramalho, Ticiane Damasceno, Katia Rebola e André Pimentel. À Dra. Fabiane Cançado, pela ajuda em experimentos, pelas discussões construtivas, pelos momentos de descontração e pela amizade. À Dra. Daniela Beton e Dra. Maria Cícera da Silva pela ajuda principalmente nas técnicas de biologia molecular. À técnica Christiane Cardoso pela importante ajuda nas análises de bioinformática. Aos técnicos: Gilliard de Faria, Ivanilde Marcelino, Izaura Toma, Dra. Layla Martins, Claudia Siqueira, Luci Navarro, Alexandre Sanchez e em especial a técnica Luiza Nakabayashi. Ao Professor Alberto de Freitas Ribeiro e ao técnico Waldir Caldeira pela colaboração em experimentos de microscopia eletrônica. Aos membros da banca examinadora pelas importantes sugestões e correções. Aos professores do Departamento de Bioquímica do IQ-USP por disponibilizarem os equipamentos de seus laboratórios. Aos colegas: Dra. Adriana Lopes, Ana Laura Borges, Antônio Filho, Marcio Cabral, Daniela Cunha, Dra. Daniela Gonzales e Alexsandra Scalfo. Às amigas do alojamento 102 Luziene Grandi, Sandra Andrade, Elaine Martins, Renata, Milessa Afonso. Em especial a Ana Paula Batista pela ajuda em química, pela convivência e amizade. Ao José Augusto pela ajuda, apoio e dedicação. Aos meus familiares e amigos pelo apoio e carinho apesar da distância. Às agências de fomento Capes, CNPq e Fapesp, pelo suporte financeiro.
RESUMO
Silva, W. Proteínas envolvidas na secreção microapócrina na lagarta de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera). 2012. 124p. Tese de Doutorado - Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.
A região anterior do intestino médio de Lepidoptera apresenta uma secreção
microapócrina de enzimas digestivas com vesículas migrando pelo interior das
microvilosidades. Essas vesículas brotam das microvilosidades intestinais como
vesículas de membrana dupla e são descarregadas dentro do lúmen. O objetivo
desse trabalho foi identificar as proteínas secretadas e aquelas envolvidas na
maquinaria secretória microapócrina em Spodoptera frugiperda. Para isso, vesículas
microapócrinas foram preparadas e usadas para a produção de anticorpo policlonal.
Esse anticorpo foi utilizado para varrer uma biblioteca de expressão de cDNA do
intestino médio de S. frugiperda. Também obtivemos um transcriptoma por
pirosequenciamento de uma biblioteca de cDNA proveniente dos transcritos do
intestino médio do mesmo inseto. Os clones positivos da varredura foram
sequenciados, montados e submetidos a um BLASTN contra as sequências obtidas
pelo pirosequenciamento, o que resultou na extensão dessas sequências.
Usamos ainda as sequências geradas pelo pirosequenciamento para
reanalisar sequências de proteínas presentes nas membranas microvilares, que
tinham sido obtidas anteriormente em nosso laboratório (Ferreira et al., 2007). A
reanálise das sequências de proteínas microvilares gerou 66 proteínas preditas.
Dessas, 18 foram consideradas contaminantes de outros compartimentos celulares
e 48 associadas às membranas microvilares. A análise das sequências obtidas das
vesículas microapócrinas gerou 50 proteínas preditas que podem ser secretadas por
essa rota.
As sequências encontradas tanto em membrana microvilar quanto em
vesículas microapócrinas podem ser classificadas em 8 grupos, de acordo com sua
função: (1) enzimas digestivas; (2) proteínas da membrana peritrófica; (3)
envolvidas com proteção; (4) transportadores; (5) receptores; (6) proteínas da
maquinaria secretória; (7) proteínas de citoesqueleto; (8) com função desconhecida
nesse local. Em ambas as preparações existem uma predominância de sequências
de enzimas digestivas. Nas membranas microvilares a maioria das sequências são
aminopeptidases, enquanto nas vesículas microapócrinas a maioria são lipases.
Os cDNAs correspondentes as proteínas que poderiam estar envolvidas na
maquinaria secretória foram clonados e sequenciados. São elas: fimbrina, cofilina,
gelsolina-1 e miosina I. RT-PCRs semi-quantitativas dessas proteínas em diferentes
tecidos do inseto (intestino, túbulos de Malpighi, corpo gorduroso e carcaça)
mostraram que somente gelsolina-1 está presente exclusivamente no intestino.
Os domínios G1-G3 da gelsolina característica do intestino (gelsolina-1)
foram expressos e usados para produzir anticorpos em coelhos. Esses anticorpos
reconhecem a proteína recombinante e uma proteína presente no epitélio intestinal
com massa molecular compatível com a massa predita para gelsolina-1.
Foi possível diminuir a expressão de gelsolina-1 utilizando RNA interferente.
Palavras-chave: Lepidoptera, Spodoptera frugiperda, secreção microapócrina, proteínas microvilares, pirosequenciamento, gelsolina.
ABSTRACT Silva, W. Proteins involved in microapocrine secretion in Spodoptera frugiperda caterpillar (Lepidoptera). 2012. 124p. PhD Thesis - Graduate Program in Biochemistry. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.
Lepidoptera anterior midgut presents a microapocrine secretion of digestive
enzymes with secretory vesicles migrating inside the microvilli. These vesicles bud
from the midgut microvilli as double membrane vesicles and are discharged into the
lumen. The aim of this work was to identify the proteins secreted and those involved
in the microapocrine secretory machinery in Spodoptera frugiperda larvae. For this,
microapocrine vesicles were prepared and used for polyclonal antibody production.
This antibody was used to screen a cDNA expression library of S. frugiperda midgut.
We also obtained a transcriptome by pyrosequencing a cDNA library derived from
transcripts of the midgut. Positive clones from the screening were sequenced,
assembled and N-blasted against S. frugiperda sequences obtained by
pyrosequencing. This procedure led to the extension of the sequences previously
obtained.
We also used the sequences generated by pyrosequencing to reanalyze the
sequences of microvillar membrane proteins obtained previously by Ferreira et al.
(2007). This reanalysis generated 66 predicted proteins that are present in the
microvillar membranes. Eighteen were considered to be contaminants from other
compartments and 48 associated with the microvillar membranes. Analysing the
sequences from microapocrine vesicles we found 50 predicted proteins that should
be secreted by microapocrine vesicles.
The sequences found in both microvillar membrane and microapocrine
vesicles may be classified into 8 groups, according to their function: (1) digestive
enzymes; (2) peritrophic membrane proteins; (3) protection; (4) transporters; (5)
receptors; (6) secretory machinery; (7) cytoskeleton; (8) with unknown function. In
both preparations there is a predominance of sequences of digestive enzymes. In
microvillar membranes, there is a remarkable amount of aminopeptidases, while in
microapocrine vesicles this is true for lipases.
cDNAs coding for proteins that could be involved in the microapocrine
secretory machinery were cloned and sequenced. They are: fimbrin, cofilin, gelsolin-
1 and myosin I. Using RT-PCR, we showed that mRNAs coding for gelsolin-1 and
myosin I are present only in the intestinal tissue. The mRNAs coding for other
proteins were found in all tissues.
The domains G1-G3 from gelsolin specific from intestinal midgut (gelsolin 1)
were expressed and used to raise antibodies in rabbit. These antibodies were able to
recognize the recombinant protein and a protein from the midgut epithelium that has
a molecular weight similar to the one predicted from gelsolin-1 sequence.
We succeed in decreasing the expression of gelsolin-1 by using interfering
RNA.
Keywords: Lepidoptera, Spodoptera frugiperda, microapocrine secretion, microvillar proteins, pyrosequencing, gelsolin.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Lagarta (a) e adulto (b) de Spodoptera frugiperda. ...................................... 17
Figura 2: Esquema representativo do sistema digestório dos insetos. ........................ 19
Figura 3: Modelos de processos secretórios de enzimas digestivas de insetos. ......... 22
Figura 4: Representação esquemática da formação de F-actina e reciclagem de G-
actina. ......................................................................................................................... 29
Figura 5: Representação esquemática da organização dos domínios de proteínas da
superfamília gelsolina. ................................................................................................ 32
Figura 6: Esquema representativo da obtenção das amostras P1 e P3 de S.
frugiperda. ................................................................................................................... 38
Figura 7: Microscopia eletrônica de transmissão da preparação de VM e ápice de uma
célula intestinal da região anterior do ventrículo de S. frugiperda. ............................... 60
Figura 8: Especificidade de anticorpos produzidos contra proteínas presentes em VM,
P1 e P3. ...................................................................................................................... 61
Figura 9: Distribuição do número de reads segundo seu tamanho em pb, obtida no
pirosequenciamento da biblioteca de cDNA do IM de S. frugiperda. ........................... 64
Figura 10: Porcentagem de sequências diferentes encontradas em membranas
microvilares (MM), ou vesículas microapócrinas (VM). ............................................... 77
Figura 11: Cladograma (neighbor joining) de sequências de aminopeptidases de S.
frugiperda e outros lepidópteros .................................................................................. 80
Figura 12: Cladograma (neighbor joining) de sequências de amilase de S. frugiperda e
outros lepidópteros, um transportador de aminoácido e um transportador de ácido
orgânico ...................................................................................................................... 81
Figura 13: Cladograma (neighbor joining) de sequências de lipases de S. frugiperda e
sequências similares ................................................................................................... 81
Figura 14: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da PDI-1 de S.
frugiperda. ................................................................................................................... 85
Figura 15: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da PDI-2 de S.
frugiperda. ................................................................................................................... 86
Figura 16: Alinhamento de sequências de aminoácidos de duas PDIs de S. frugiperda.
.................................................................................................................................... 88
Figura 17: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da fimbrina de S.
frugiperda. ................................................................................................................... 90
Figura 18: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da miosina I de S.
frugiperda. ................................................................................................................... 93
Figura 19: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da cofilina de S.
frugiperda. ................................................................................................................... 95
Figura 20: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da gelsolina-1 de S.
frugiperda. ................................................................................................................... 97
Figura 21: Padrão de expressão dos mRNAs codificantes de proteínas possivelmente
envolvidas com a maquinaria da secreção em diferentes tecidos de lagartas de S.
frugiperda mostrados por RT-PCR semi-quantitativa. ................................................. 99
Figura 22: Análise da construção pAE-gelsolina. ..................................................... 100
Figura 23: Análise do perfil de indução de células de E. coli BL21(DE3) transformadas
com o vetor pAE/gelsolina com IPTG 1 mM a 37ºC, 25ºC e 20ºC por 20 h. .............. 102
Figura 24: Solubilidade da gelsolina recombinante de S. frugiperda a 37ºC, 25ºC e
20ºC. ......................................................................................................................... 103
Figura 25: Análise por SDS-PAGE 12% das frações obtidas após a segunda
cromatografia de afinidade para purificação da gelsolina expressa em E. coli
BL21(DE3). ............................................................................................................... 104
Figura 26: Western blot após SDS-PAGE (12%) da proteína recombinante do epitélio
do ventrículo com o anticorpo anti-gelsolina.............................................................. 105
Figura 27: RT-PCR semi-quantitativa para confirmação da diminuição do número de
transcritos do gene da gelsolina de S. frugiperda. ..................................................... 107
Figura 28: Peso médio das lagartas de S. frugiperda após injeções com água livre de
nucleases e dsRNA-gelsolina. .................................................................................. 107
Figura 29: Células colunares da região anterior do ventrículo de larvas S. frugiperda 3
dias após a injeção de água livre de nucleases ou dsRNA-gelsolina . ...................... 109
Figura 30: Células colunares da região anterior do ventrículo de larvas S. frugiperda 3
dias após a injeção de água livre de nucleases ou dsRNA-gelsolina . ...................... 110
Figura 31: Células colunares da região anterior do ventrículo de larvas de S.
frugiperda 3 dias após a injeção de RNA interferente. .............................................. 111
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Sequência dos iniciadores utilizados para a obtenção do cDNA completo
codificante das proteínas de interesse. ....................................................................... 41
Tabela 2: Sequência dos iniciadores utilizados na realização da RT-PCR semi-
quantitativa.................................................................................................................. 45
Tabela 3: Atividades específicas (mU/mg proteína) de enzimas digestivas em
diferentes amostras preparadas do intestino de S. frugiperda. .................................... 63
Tabela 4: Resumo dos dados obtidos no pirosequenciamento da biblioteca de cDNA
obtida a partir dos mRNAs do IM de S. frugiperda ..................................................... 64
Tabela 5: Contigs codificando proteínas encontradas em membranas microvilares
classificadas como contaminantes ou com função desconhecida. .............................. 66
Tabela 6: Contigs codificando proteínas encontradas nas membranas microvilares
intestinais de S. frugiperda. ............................................................................................ 67
Tabela 7: Contigs codificando proteínas encontradas nas vesículas microapócrinas
que contêm peptídeo sinal. ............................................................................................ 71
Tabela 8: Contigs codificando proteínas encontradas em vesículas microapócrinas
sem peptídeo sinal ou que não possuem a porção N-terminal. .................................... 73
Tabela 9: Contigs codificando proteínas presentes nas vesículas microapócrinas
classificados como contaminantes ou outras com sequência incompleta e proteínas
sem peptídeo sinal. ......................................................................................................... 74
Tabela 10: Proteínas preditas que podem estar envolvidas na maquinaria de secreção
microapócrina de secreção microapócrina selecionadas como candidatas a partir de
pesquisa na literatura e encontradas no Spodobase..................................................... 83
Tabela 11: Identidades e similaridades das sequências de PDI-1 e PDI-2 de S.
frugiperda com PDIs presentes em outros insetos. ....................................................... 87
Tabela 12: Identidades e similaridades das PDIs de S. frugiperda e humanos. .......... 88
Tabela 13: Identidades e similaridades da sequência de fimbrina de S. frugiperda com
as de outros insetos. ....................................................................................................... 91
Tabela 14: Identidades e similaridades da sequência de miosina I de S. frugiperda
com as de outros insetos. ............................................................................................... 94
Tabela 15: Identidades e similaridades da sequência de cofilina de S. frugiperda com
as de outros insetos. ....................................................................................................... 95
Tabela 16: Identidades e similaridades da sequência de gelsolina de S. frugiperda com
as de outros insetos. ....................................................................................................... 98
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Abs Absorbância ABD Domínio ligante de actina ABP Proteína ligante de actina ADP Adenosina bifosfato ATP Adenosina trifosfato Blast Basic local aligment search BSA Albumina do soro bovino cDNA Ácido desoxirribonucleico complementar DEPC Dietilpirocarbonato dNTPs Desoxirribonucleotídeos trifosfatados dsRNA RNA de fita dupla EDTA Etilenodiaminotetracetato de sódio EST Expressed sequence tags F-actina Filamento de actina G1-G3 Domínios G1, G2 e G3 da gelsolina 1 de S. frugiperda G-actina Actina globular GFP Gene codificador da green fluorescent protein GPI Âncora de glicosilfosfatidilinositol IM Intestino médio IPTG Isopropiltiol beta-D-galactopiranosídeo KDa Quilodaltons LB Meio de cultura de Luria-Bertani mRNA RNA mensageiro MP Membrana peritrófica mU Miliunidades NCBI National Center for Biotechnology Information NTPs nucleotídeos trifosfatados NZ-amina caseína hidrolisada enzimaticamente NZY meio de cultura com NZ-amina P1 e P3 Preparações de um fracionamento celular de membranas
microvilares pb Pares de bases PCR Reação em cadeia da polimerase PDI Proteína dissulfeto isomerase PMSF Fenilmetilsulfonil fluoreto RNAi RNA interferente rpm Rotações por minuto RT-PCR Transcriptase reversa SDS Dodecil sulfato de sódio SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS SM Meio de suspensão TAE Tampão Tris acetato EDTA TBS Tampão Tris salina Tris Tri (hidroximetil) amino metano VM Vesículas microapócrinas X-gal 5-bromo-4-cloro-3-indoil-β-D-galactopiranosídeo
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 15
1.1. Considerações iniciais ....................................................................................... 15 1.2. Sistema digestório dos insetos .......................................................................... 18 1.3. Processos de secreção de proteínas ................................................................ 19 1.4. Proteínas microvilares intestinais de insetos ..................................................... 25 1.5. Proteínas potencialmente envolvidas na secreção microapócrina .................... 27
2. OBJETIVOS ......................................................................................................... 36 3. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ................................................................ 37
3.1. Animais .............................................................................................................. 37 3.2. Preparação das amostras de S. frugiperda ....................................................... 37 3.3. Microscopia eletrônica ....................................................................................... 38 3.4. Ensaios de atividades enzimáticas .................................................................... 39 3.5. Procedimentos para manipulação e análises de ácidos nucléicos .................... 40
3.5.1. Iniciadores para amplificação do cDNA codificante de PDIs (1 e 2), fimbrina, miosina I, cofilina e gelsolina-1. ............................................................................ 40 3.5.2. PCR ............................................................................................................ 42 3.5.3. Eletroforese em gel de agarose .................................................................. 42 3.5.4. Purificação do produto de PCR a partir do gel de agarose ......................... 42 3.5.5. Ligação de produtos de PCR em plasmídeo ............................................... 43 3.5.6. Transformações de células competentes .................................................... 43 3.5.7. Purificação de plasmídeos .......................................................................... 44 3.5.8. Sequenciamento de DNA ............................................................................ 44 3.5.9. RT-PCR semi-quantitativa .......................................................................... 44
3.6. Procedimentos para varreduras de biblioteca de cDNA .................................... 46
3.6.1. Preparação de anticorpos anti-P1, anti-P3 e anti-VM ................................. 46 3.6.2. Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE) ........... 47 3.6.3. Western blotting .......................................................................................... 47 3.6.4. Plaqueamento e indução das bibliotecas de cDNA..................................... 48 3.6.5. Imunoensaios nas membranas de nitrocelulose ......................................... 49 3.6.6. Coleta dos clones positivos ......................................................................... 50 3.6.7. Excisão do plasmídeo Bluescript ................................................................ 50
3.7. Procedimentos para o pirosequenciamento ...................................................... 52
3.7.1. Purificação do mRNA das amostras do IM ................................................. 52 3.7.2. Pirosequenciamento de uma biblioteca de cDNA obtida a partir dos mRNAs do IM de S. frugiperda .......................................................................................... 52
3.8. Análises de bioinformática ................................................................................. 53 3.9. Procedimentos para obtenção e análise de gelsolina recombinante ................. 54
3.9.1. Expressão da gelsolina em Escherichia coli ............................................... 54 3.9.2. Teste de solubilidade da gelsolina recombinante ....................................... 55 3.9.3. Purificação parcial da gelsolina recombinante ............................................ 56 3.9.4. Produção de anticorpos policlonais anti-gelsolina ...................................... 56 3.9.5. Detecção imunológica de proteínas ............................................................ 57
3.10. RNA interferente de gelsolina .......................................................................... 57
4. RESULTADOS ..................................................................................................... 59
4.1. Preparação das amostras de vesículas microapócrinas, frações subcelulares (P1 e P3) e obtenção de anticorpos ......................................................................... 59 4.2. Enzimologia de vesículas microapócrinas ......................................................... 62 4.3. Pirosequenciamento de uma biblioteca de cDNA proveniente dos mRNAs do IM de S. frugiperda ........................................................................................................ 63 4.4. Identificação de proteínas microvilares intestinais de S. frugiperda .................. 64 4.5. Identificação de proteínas presentes nas vesículas microapócrinas de S. frugiperda ................................................................................................................. 69 4.6. Comparação das sequências presentes nas microvilosidades e vesículas micrapócrinas ........................................................................................................... 76 4.7. Comparação de algumas sequências selecionadas de enzimas digestivas ..... 78 4.8. Sequências de proteínas que poderiam estar relacionadas ao mecanismo da secreção microapócrina ........................................................................................... 82
4.8.1. Proteína dissulfeto isomerase (PDI)............................................................ 84 4.8.2. Fimbrina ...................................................................................................... 89 4.8.3. Miosina I ...................................................................................................... 91 4.8.4. Cofilina ........................................................................................................ 94 4.8.5. Gelsolina-1 .................................................................................................. 95
4.9. RT-PCR semi-quantitativa das proteínas que poderiam estar envolvidas na secreção microapócrina ........................................................................................... 98 4.10. Gelsolina-1: Expressão heteróloga, produção de anticorpos e supressão da expressão com RNA interferente .............................................................................. 99
4.10.1. Produção de gelsolina recombinante ...................................................... 100 4.10.2. Produção do anticorpo anti-gelsolina e imunocitolocalização no epitélio intestinal de S. frugiperda ................................................................................... 105 4.10.3. Diminuição da expressão de gelsolina utilizando RNA interferente ........ 106
5. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 113
5.1. Proteínas presentes em diferentes compartimentos celulares ........................ 113 5.2. Proteínas presentes nas microvilosidades de S. frugiperda ............................ 114 5.3. Secreção microapócrina em S. frugiperda....................................................... 117
6. CONCLUSÕES .................................................................................................. 121 7. REFERÊNCIAS .................................................................................................. 123 SÚMULA CURRICULAR ........................................................................................ 139
15
1. INTRODUÇÃO
1.1. Considerações iniciais
Com uma projeção populacional humana de 10 bilhões para 2050, uma
prioridade imediata para a agricultura é o aumento da produtividade das culturas de
uma maneira sustentável e rentável (Gatehouse et al., 2011). Atualmente a
produção mundial de alimentos torna-se ameaçada diante ao ataque de pragas, que
acarretam perdas de aproximadamente um terço da produção de alimentos durante
o processo de crescimento, colheita e estocagem (Ware, 1994; Sarmento et al.,
2002). Dentre as diversas pragas que atacam as culturas, destacam-se os insetos.
Os insetos são organismos bem sucedidos e apresentam o maior sucesso
evolutivo na história da vida na Terra. Provavelmente um pouco mais de 1 milhão de
espécies já foram descritas, ou registradas em alguma publicação taxonômica
(Gullan e Cranston, 2010). Uma melhor ideia da representatividade desses
organismos na Terra é percebida quando notamos que esse 1 milhão de espécies já
descritas corresponde a mais de 50% de todos os seres vivos, considerando
animais, plantas, fungos, bactérias e vírus. As espécies de insetos descritas estão
distribuídas desigualmente entre os grupos taxonômicos chamados ordens. Cinco
principais ordens destacam-se por sua alta riqueza de espécies: Coleoptera
(besouros), Diptera (moscas), Hymenoptera (vespas, formigas e abelhas),
Hemiptera (percevejos) e Lepidoptera (borboletas e mariposas) (Gullan e Cranston,
2010).
Estima-se que cerca de 10-20% das perdas na produção das principais
plantações globais sejam devido aos insetos-praga (Ferry et al., 2006). Os insetos-
praga não apenas provocam perdas na produtividade diretamente, devido ao ataque
herbívoro, mas também indiretamente por atuarem como vetores de vários
patógenos de plantas (Hilder e Bouter, 1999).
Os danos causados por insetos na agricultura ainda persistem apesar de
muitos anos de pesquisa para desenvolver métodos eficazes de controle. Os
insetos-praga têm sido controlados principalmente com a utilização de inseticidas
químicos. Desde sua introdução em 1947, os inseticidas são a principal contribuição
para a produção de alimentos, entretanto, sabe-se que esses produtos representam
16
preocupações ambientais e de saúde (Gatehouse et al., 2011). O uso indiscriminado
destes compostos sintéticos tem originado problemas graves e bem conhecidos,
incluindo resistência genética de espécies pragas, resíduos tóxicos em produtos
armazenados, aumento nos custos de aplicação, riscos de manipulação, poluição
ambiental, entre outros (Rembold, 1994; Adeyemi, 2010). Embora alguns processos
alternativos de controle já tenham sido implantados, estamos longe de podermos
dispensar os agrotóxicos.
Existem poucos exemplos de substâncias químicas que foram desenvolvidas
a partir da identificação de um processo específico ou proteína alvo envolvida na
invasão de hospedeiro ou doença (Belay et al., 2012). Em decorrência disso, insetos
benéficos como as abelhas e mariposas selvagens além dos parasitóides e
predadores das pragas agrícolas também são afetados. Dessa forma, além de
eliminar os inimigos naturais, selecionamos artificialmente, de forma global, pragas
cada vez mais resistentes a agentes químicos.
Nos últimos anos, as plantações expressando δ-endotoxinas de Bacillus
thuringiensis (Bt) também conhecidas como proteínas Cry tiveram um impacto
benéfico e significativo na agricultura global em termos de redução de pragas e
melhorias na qualidade de plantações (Gatehouse et al., 2011). Na ingestão, as
toxinas Bt são solubilizadas no intestino onde são proteoliticamente clivadas na
região N-terminal na sua forma ativa, responsável por ligar-se a receptores
presentes nas células epiteliais intestinais, formando poros que resulta na morte
celular por lise osmótica, seguida pela morte do inseto (Gatehouse et al. 2011).
Culturas transgênicas foram primeiro comercializadas em meados da década de
1990 com a introdução de plantas de milho, batatas e algodão expressando toxinas
Bt. Em 2010, 148 milhões de hectares de plantações biotecnológicas foram
cultivadas em 29 países, representando 10% de todos 1,5 bilhões de hectares de
terras cultivadas do mundo (Gatehouse et al., 2011). Entretanto, por causa do
potencial dos insetos-praga em desenvolver resistência, e também devido ao risco
de plantas transgênicas atingirem organismos não alvos, vários tipos de estratégias
alternativas continuam sendo desenvolvidas. Atualmente os estudos envolvem
conhecimentos básicos sobre a bioquímica de digestão dos insetos, genes de
vegetais codificando proteínas com atividade inseticida, a utilização da genômica
funcional para identificar genes de resistência endógena e uso de RNA interferente
(Gatehouse et al., 2011).
17
Pelo exposto acima, fica claro o quanto o desenvolvimento de novas formas
de controle de insetos é necessário. O sistema digestório dos insetos constitui a
maior interface desprotegida de contato entre o inseto e o meio ambiente, tornando-
se um alvo relativamente mais frágil para ser atacado por substâncias que visem
desorganizar alguma de suas propriedades. Desta forma, certificamos que é
necessário um aprofundamento nos estudos relacionados com a fisiologia e
bioquímica do sistema digestório dos insetos a fim de obter maior conhecimento dos
processos que nele ocorrem, o que poderia levar a um aprimoramento eficiente nas
técnicas de controle dos insetos-praga.
O inseto-praga utilizado nesse estudo é o Lepidoptera Spodoptera frugiperda
(Lepidoptera: Noctuidae) (Figura 1). Sua lagarta é conhecida como a lagarta do
cartucho do milho ou lagarta militar. No Brasil, S. frugiperda é a principal praga do
milho e também causa prejuízo significativo na cultura de algodão. S. frugiperda
pode ainda atacar alfafa, amendoim, arroz, aveia, batata, batata doce, cana-de-
açúcar, hortaliças, soja e trigo (Pashley, 1988). As lagartas recém emergidas
alimentam-se das folhas mais novas do milho (cartucho do milho) e em seguida,
atacam todas as folhas centrais, destruindo-as completamente (Gallo et al., 1988).
Assim, S. frugiperda afeta a capacidade fotossintética da planta e,
consequentemente, a produção (Sarmento et al., 2002). Em ocorrências tardias,
pode atacar a espiga e propiciar a entrada de patógenos e umidade (Ávila et al.,
1997) aumentando os prejuízos.
Figura 1: Lagarta (a) e adulto (b) de Spodoptera frugiperda (Fotos: Embrapa arroz e feijão e
Ivan Cruz).
18
1.2. Sistema digestório dos insetos
O sistema digestório dos insetos embora apresente considerável variação
entre as ordens, pode ser esquematizado na figura 2 (Terra e Ferreira, 1994). Ele é
formado por uma região anterior, uma média e uma posterior.
O intestino anterior começa na boca e inclui a faringe, o esôfago, o papo e o
proventrículo, que é um órgão triturador em alguns insetos e em outros apenas uma
válvula que regula a entrada de alimento no intestino médio (IM), principal sítio de
digestão e absorção de nutrientes. O papo é um órgão de armazenamento em
alguns insetos.
O intestino posterior inclui os túbulos de Malpighi (órgãos excretores), o íleo,
o cólon e o reto (envolvidos na absorção de água e íons) e o ânus.
O intestino médio é a única região que não é revestida por quitina e é
responsável pela secreção de enzimas e pela absorção de nutrientes. Ele pode ser
apenas um cilindro, denominado ventrículo, ou apresentar cecos gástricos em
número, tamanho e localização variável conforme a espécie. O bolo alimentar é
contido em uma membrana semipermeável denominada membrana peritrófica (MP)
composta por quitina e proteínas. A MP delimita o espaço endoperitrófico (onde se
encontra o bolo alimentar) e o espaço ectoperitrófico (espaço luminal entre a MP e o
epitélio).
Os Lepidoptera não possuem cecos gástricos, seu IM é bem maior que as
demais regiões e tem o formato de um cilindro de igual diâmetro, que é também
denominado ventrículo. No ventrículo dos Lepidoptera encontramos, além de células
colunares (responsáveis pela absorção de nutrientes e secreção de enzimas e
outras proteínas), umas poucas células endócrinas, e células caliciformes
(responsáveis pela secreção de potássio).
O ventrículo dos Lepidoptera, embora não apresente diferenças
macroscópicas, possui alguma diferenciação antero-posterior. A região anterior do
ventrículo absorve fluidos e a região posterior do ventrículo secreta. Além disso, as
células caliciformes dessas duas regiões apresentam morfologia diferente, sendo
que na região anterior a maior parte da cavidade formada pela invaginação da
membrana apical encontra-se na região basal da célula, enquanto na região
posterior essa cavidade é mais apical. Outra diferenciação refere-se às
microvilosidades das células caliciformes que apresentam nas duas regiões
19
quantidades diferentes de portassomos e mitocôndrias (Santos et al., 1984).
Entretanto, a diferença mais interessante encontrada entre essas regiões é o modo
pelo qual as proteínas são secretadas.
Figura 2: Esquema representativo do sistema digestório dos insetos (adaptado de Terra e
Ferreira, 1994).
1.3. Processos de secreção de proteínas
Um importante avanço no estudo de mecanismos secretórios resultou da
combinação de procedimentos bioquímicos e citológicos (Cristofoletti et al., 2001).
Enzimas digestivas, como todas as proteínas animais, são sintetizadas no retículo
endoplasmático rugoso, processadas no Complexo de Golgi e empacotadas dentro
de vesículas de secreção. Existem diversos mecanismos pelos quais os conteúdos
das vesículas secretórias são liberados no lúmen intestinal dos insetos e os
mecanismos secretórios dependem grandemente da região do IM. Os mecanismos
principais de secreção de proteínas são: secreção holócrina, exocitose e a secreção
apócrina. Um mecanismo peculiar, a secreção microapócrina está presente em
lepidópteros.
Na secreção holócrina, vesículas secretórias são armazenadas no citoplasma
até sua liberação, sendo que toda a célula secretória é perdida para o espaço
extracelular. Jarial (2005) examinou por microscopia eletrônica a região anterior do
IM de adultos de Cenocorixa bifida (Hemiptera: Corixidae) e verificou a presença de
células degenerando contendo grânulos secretórios na superfície luminal e a
ocorrência de vesículas vazias e fragmentos celulares no lúmen consistentes com a
20
secreção holócrina de enzimas digestivas (Jarial, 2005). Em insetos Stomoxys
calcitrans adultos, dados imunocitoquímicos mostraram que vesículas contendo
tripsina juntamente com organelas são descarregadas por células da zona opaca,
sugerindo secreção holócrina (Jordão et al., 1996).
Durante a secreção exocítica (Figura 3A), as vesículas de secreção fundem-
se com a membrana apical da célula intestinal esvaziando seu conteúdo sem perda
do citoplasma. Em todas as células eucarióticas, há uma corrente fixa de vesículas
exocíticas que brotam da rede trans de Golgi e se fusionam com a membrana
plasmática que trabalha continuamente e supre a membrana plasmática de
proteínas e lipídeos recém formados, além de liberar proteínas no espaço
extracelular (Alberts et al., 2011). Desde sua descoberta em 1950 (Palade, 1959), a
exocitose foi e ainda é grandemente investigada como sendo um processo para
descarregar produtos secretórios hidrofílicos (por exemplo, neurotransmissores,
hormônios e enzimas) para o espaço extracelular (Chieregatti e Meldolesi, 2005).
Pytelkova e colaboradores (2009) verificaram através de imunomarcação que α-
amilases são secretadas por secreção exocítica nas células intestinais da mariposa
da farinha Ephestia kuehniella. Tripsina é secretada na região posterior do IM de
mosquitos adultos (Graf et al., 1986), larvas de moscas (Jordão et al., 1996) e
lagartas (Jordão et al., 1999) também por exocitose. Jarial (2005) verificou a
presença de grânulos secretórios próximos à membrana plasmática apical de C.
bifida, sugerindo a liberação de secreção por exocitose.
Na secreção apócrina (Figura 3B) o processo secretório é acompanhado de
perda de parte do citoplasma apical (Gesase e Satoh, 2003). Cristofoletti e
colaboradores (2001) utilizaram anticorpos anti-amilase e anti-tripsina para
imunocitolocalizar amilase e tripsina respectivamente em células intestinais de
Tenebrio molitor (Coleoptera). Eles verificaram que amilases são encontradas no
interior de vesículas em uma protuberância apical na região anterior do IM enquanto
que tripsinas são encontradas na região posterior do IM sendo liberadas por
exocitose. Alguns autores interpretam a liberação dessas protuberâncias celulares
como secreção holócrina, ao invés de apócrina, enquanto outros sugerem que elas
são parte de um processo de renovação celular (Terra e Ferreira, 1994; Cristofoletti
et al., 2001). Assim o processo de secreção apócrina em inseto envolve vesículas
secretórias originadas de áreas do Golgi que aparentemente fundem-se antes de
serem liberadas com a protuberância apical, contrastando com mecanismos
21
apócrinos conhecidos para vertebrados. No mecanismo secretório apócrino humano
a protuberância apical é de estrutura homogênea e nenhuma organela é encontrada
nessas protuberâncias (Schaumburg-Lever e Lever, 1975; Stoeckelhuber et al.,
2003). As moléculas secretadas pelo mecanismo apócrino são sintetizadas dentro
do citoplasma e concentradas na região formadora da protuberância apical da
membrana plasmática (Wilhelm et al., 1998). Desta forma essas moléculas podem
ser secretadas apesar de elas não terem um peptídeo sinal que as direcionem para
a membrana plasmática por exocitose. Em humanos, glândulas apócrinas estão
distribuídas em várias áreas do corpo, como axilas, órgãos genitais femininos
externos, regiões inguinal, periumbilical, perianal, periareolar e também próstata que
usam mecanismos apócrinos para liberar seus produtos (Requena et al., 1998;
Saga, 2002; Wilhelm et al., 2003; Stoeckelhuber et al., 2011).
O mecanismo de secreção apócrina em glândulas da axila humana foi
investigada por Schaumburg-Lever e Lever (1975) através de microscopia
eletrônica. Inicialmente ocorre a formação de uma protuberância apical e então a
formação de uma membrana divisória horizontal na base da protuberância e
finalmente ocorre o aparecimento de túbulos sobre e paralelos à membrana divisória
causando a decapitação da protuberância seguida do provimento da membrana
plasmática para ambos, protuberância apical e membrana plasmática da célula.
Esses processos são similares aos que ocorrem durante a citocinese na divisão
celular, os quais são promovidos e regulados por muitos componentes
(Stoeckelhuber et al., 2011). As proteínas envolvidas na citocinese são
principalmente proteínas de citoesqueleto. Para investigar quais proteínas estão
envolvidas no mecanismo secretório apócrino em glândulas apócrinas axilares
humana, Stolckelhuber e colaboradores (2011) procuraram por proteínas
associadas à citocinese por tratar-se de um processo comparável com células
glandulares apócrinas. Através de imunohistoquímica, eles detectaram actina,
miosina II, citoqueratina 7 e 19, α e β-tubulina, anilina, cofilina, sintaxina 2, vamp
8/endobrevina e septina 2. Nas células glandulares altamente ativas estas proteínas
estão localizadas na base da protuberância apical, quando a protuberância está em
processo de liberação ou estão concentradas no topo da protuberância apical.
A ordem Lepidoptera apresenta um mecanismo de secreção peculiar, nunca
antes descrito, em que pequenas vesículas de secreção percorrem o interior de
microvilosidades na região anterior do ventrículo. Este tipo de secreção é
22
denominado secreção microapócrina e consiste na liberação de vesículas de dupla
membrana (Figura 3C), ou uma fusão de vesículas entre si e com o topo da
microvilosidade formando “bolhas” que se desprendem para o lúmen (Figura 3D).
Em ambos os casos, os conteúdos são liberados por solubilização causada pelo alto
pH existente no fluido ectoperitrófico ou por detergentes luminais (Terra e Ferreira,
2012).
M
VS
CG
N
RER
EC
VS
VS
Figura 3: Modelos de processos secretórios de enzimas digestivas de insetos. (A) Secreção
exocítica; (B) secreção apócrina; (C) secreção microapócrina com brotamento de vesículas;
(D) secreção microapócrina com vesículas formando “bolhas” que se destacam das
extremidades das microvilosidades. CG, complexo de Golgi; EC, extrusão celular; M,
microvilosidade; N, núcleo; RER, retículo endoplasmático rugoso; VS, vesícula de secreção
(adaptado de Terra e Ferreira, 2012). As vesículas liberadas na secreção microapócrina
podem ser recuperadas centrifugando-se o material presente no fluido ectoperitrófico.
Os modelos de secreção microapócrina de enzimas digestivas (Figuras 3C e
3D) foram propostos a partir de diversos estudos realizados por nosso grupo de
pesquisa. Santos et al., (1986), trabalhando com Erinniys ello e Ferreira et al.
(1994), trabalhando com Spodoptera frugiperda, reuniram dados experimentais para
um modelo de secreção de amilase e tripsina. Os autores realizaram
fracionamentos subcelulares do epitélio do ventrículo anterior e cada sedimento
obtido era diluído, congelado e descongelado, novamente homogeneizado e
centrifugado para poder distinguir-se entre uma enzima integrante de membrana de
23
uma envolta por membrana (por exemplo, uma proteína solúvel dentro de uma
vesícula de secreção). O fluido ectoperitrófico foi centrifugado e o mesmo
procedimento foi realizado com o material sedimentado. Atividades específicas de
marcadores celulares além de amilase e tripsina foram determinadas em todas as
frações. Cada material particulado obtido após o fracionamento subcelular foi
observado ao microscópio eletrônico. Segundo o modelo proposto, tripsina é
sintetizada ligada a membrana de pequenas vesículas que tem tamanho bem menor
que as vesículas exocíticas clássicas e migram por dentro das microvilosidades
celulares, brotando lateralmente ou fundindo-se com a membrana plasmática apical
dessas estruturas (secreção microapócrina).
O fato de destacarem-se porções específicas das microvilosidades para o
lúmen intestinal de S. frugiperda é confirmado pelo fato do material particulado
recuperado a partir do fluido ectoperitrófico apresentar atividade específica maior
para tripsina e amilase e menor para aminopeptidase (marcadora de membrana
microvilar) do que a verificada em preparações de microvilosidades (Bolognesi et
al., 2001). Esse modelo foi bastante corroborado quando imunocitolocalizações
utilizando anticorpos anti-tripsina e anti-amilase mostraram que as enzimas
realmente estavam presentes nas pequenas vesículas (Jordão et al., 1999 e
Bolognesi et al., 2001). A tripsina localiza-se preferencialmente nas bordas das
vesículas de secreção, indicando estar localizada na membrana da vesícula,
enquanto a amilase aparece mais em seu interior, indicando estar presente
preferencialmente na forma solúvel dentro das vesículas.
No enterócito de mamíferos, pequenas vesículas se destacam do topo das
microvilosidades (McConnell et al., 2009). Essas vesículas são compostas apenas
pela membrana microvilar e tem uma composição de enzimas digestivas diferente
daquela apresentada pela membrana microvilar total. A atividade de maltase-
glicoamilase, lactase-florizina hidrolase e sucrase isomaltase são menores nessas
vesículas do que na membrana microvilar. Por outro lado, a vesícula é enriquecida
de fosfatase alcalina (McConnell et al., 2009).
Essas vesículas são diferentes daquelas encontradas na secreção
microapócrina de Lepidoptera. Nos mamíferos elas correspondem a um brotamento
somente da membrana plasmática do topo da microvilosidade, não envolvendo uma
vesícula de secreção (McConnell e Tyska, 2007). Outra diferença é que para sua
secreção não há necessidade de grandes alterações no citoesqueleto da
24
microvilosidade inteira como em Lepidoptera, pois nesse último há uma vesícula
percorrendo o interior da microvilosidade.
A função dos dois tipos de vesículas também parece ser diferente. As
vesículas encontradas no lúmen de Lepidoptera contêm enzimas digestivas e outras
proteínas no seu interior, sendo responsáveis, pelo menos em parte, por sua
secreção (Jordão et al., 1999; Bolognesi et al., 2001). As vesículas encontradas em
mamíferos não parecem contribuir para a secreção digestiva, pois, conforme
comentado acima, elas ocorrem nesse compartimento em menor quantidade.
Pelo fato dessas vesículas intestinais dos mamíferos conterem grandes
quantidades de fosfatase alcalina, sua suposta função é de defesa contra infecções.
Fosfatase alcalina desfosforila e desintoxica lipopolissacarídeos bacterianos que
estão presentes em abundância na membrana externa de bactérias gram-negativas
(ver McConnell et al., 2009). A desfosforilação desse lipopolissacarídeo reduz sua
toxicidade em pelo menos 100 vezes (Schromm et al., 1998).
A presença desse mecanismo de secreção peculiar de lepidópteros, em que
pequenas vesículas de secreção enzimáticas percorrem o interior da
microvilosidade, deve ser possível, entre outras coisas, devido às propriedades
particulares do citoesqueleto dessas microvilosidades. Propriedades diferentes para
o citoesqueleto das microvilosidades das células da região anterior do ventrículo de
Lepidoptera foram encontradas. Quando se obtém uma fração rica em
microvilosidades, seja do intestino de mamíferos seja de insetos, elas continuam
bastante contaminadas com citoesqueleto (Jordão et al., 1995). Um tratamento
dessas microvilosidades com Tris hiperosmótico permite separar as membranas dos
elementos de citoesqueleto, tanto em mamíferos (Critchley et al., 1975) como em
insetos (Jordão et al., 1995; Capella et al., 1997). Quando esse tratamento é feito, a
atividade específica de enzimas marcadoras de membranas microvilares aumenta
nessa fração, pela remoção de proteínas do citoesqueleto. Isso acontece utilizando
intestino de mamíferos e diferentes regiões do tubo digestório de Tenebrio molitor
(Coleoptera), cecos de Rhynchosciara americana, partes do ventrículo de Musca
domestica (ambos Diptera) e a região posterior do ventrículo do Lepidoptera
Spodoptera frugiperda. Por outro lado, tratamento das microvilosidades obtidas da
região anterior desse último inseto não leva a nenhuma alteração na atividade
específica das enzimas marcadoras de membranas microvilares, indicando que os
elementos do citoesqueleto são mais facilmente removidos e são retirados já
25
quando se faz a preparação de microvilosidades. Esse resultado é confirmado
observando-se preparações de microvilosidades, onde se observa que as da região
anterior são bem mais livres de elementos eletrodensos (Capella et al., 1997).
A diferença de comportamento do citoesqueleto em Lepidoptera pode ser
devida a ausência de uma ou mais proteínas do citoesqueleto, a presença de
proteínas diferentes ou a presença das mesmas proteínas em quantidades muito
diferentes. Talvez não seja somente o citoesqueleto que sofre alterações, uma vez
que as vesículas de secreção microapócrina são bem menores que as exocíticas
clássicas, que aparecem na região posterior do mesmo ventrículo (Jordão et al.,
1999; Bolognesi et al., 2001).
Os mecanismos de secreção apócrina e microapócrina de enzimas digestivas
em células da região anterior do IM com a liberação de vesículas contendo enzimas
pode ser uma adaptação para aumentar a dispersão dos conteúdos das vesículas
dentro do lúmen intestinal de tecidos que absorvem água (Terra e Ferreira, 2012). O
movimento de fluidos em direção as células do ventrículo anterior poderia prevenir
uma difusão uniforme dos materiais secretados pela exocitose. Como as células do
intestino médio posterior secretam fluidos, não haveria problemas de dispersão do
material lançado por exocitose dessas células. Baseado em exemplos conhecidos,
mecanismos apócrinos parecem estar espalhados entre os insetos menos derivados
enquanto que os insetos mais derivados usam mecanismos microapócrinos em
tecidos que absorvem água (Terra e Ferreira, 2012).
1.4. Proteínas microvilares intestinais de insetos
As membranas desempenham papel crítico na estrutura celular por fornecer
uma barreira física entre a célula e seu meio e os vários compartimentos
subcelulares dentro das células eucarióticas. Apesar da estrutura básica das
membranas biológicas ser fornecida pela bicamada lipídica, as proteínas de
membrana desempenham a maioria das funções específicas das membranas
(Alberts et al., 2008). Assim sendo, as quantidades e os tipos de proteínas em uma
membrana são altamente variáveis. As diferentes proteínas de membrana estão
associadas às membranas de formas diferentes. As proteínas transmembrana se
estendem através da bicamada por uma α-hélice, ou múltiplas α-hélice ou folhas β-
dobradas (barril β). Outras proteínas estão localizadas no citosol, porém ficam
26
associadas à membrana por meio de uma α-hélice anfipática exposta na superfície
da membrana. Algumas proteínas podem se ligar a um dos lados da bicamada por
um ou mais grupos lipídicos covalentemente ligados. Há ainda proteínas ligadas
indiretamente a uma das faces da membrana por meio de ligações não covalentes
com outras proteínas de membrana (Alberts et al., 2011).
As membranas microvilares presentes nas células intestinais de inseto são
homólogas as que foram descritas para vertebrados e revisado por Bement e
Mooseker (1996). As microvilosidades intestinais de insetos foram isoladas pela
primeira vez por Ferreira e Terra (1980) usando uma técnica de precipitação
diferencial com cálcio (Schmitz et al., 1973) desenvolvida para mamíferos. Em
seguida Hanozet e colaboradores (1980) usaram a mesma técnica para isolar
microvilosidade de células colunares do intestino de lagarta de lepidóptero.
A técnica consiste em homogeneizar o tecido e em seguida adicionar um
cátion bivalente (usualmente Ca++). Os íons Ca++ causam aglutinação de
membranas, exceto das microvilares, por causa da carga eletrônica associada com
o glicocálix. O sobrenadante de uma centrifugação em baixa velocidade é
enriquecido em microvilosidades que podem ser recolhidas através de uma
subsequente centrifugação com média velocidade (ver Terra et al., 2006).
As preparações de microvilosidades podem ser usadas para mostrar que
enzimas digestivas integrais variam entre os diferentes taxa. Frequentemente elas
são: aminopeptidase, fosfatase alcalina, carboxipeptidase, dipeptidase e α-
glicosidase (Terra e Ferreira, 1994). As preparações de microvilosidades também
são usadas para encontrar transportadores de aminoácidos (Terra et al., 2006).
Transportadores de íons (Pullikuth et al., 2003) e aquaporinas (Le Caherec et al.,
1997) foram encontradas em membranas celulares apicais de insetos e acredita-se
serem proteínas microvilares. Além desses estudos, a pesquisa com receptores da
toxina Cry de B. thuringiensis tem levado a identificação de diversas proteínas
microvilares intestinais de lepidópteros como aminopeptidase (Knight et al., 1994) e
caderinas (Vadlamudi et al, 1995).
A densidade de membranas microvilares varia grandemente, com os insetos
que apareceram de modo tardio na evolução (insetos mais derivados) tendo
membranas mais densas (e, portanto maior conteúdo de proteínas) que insetos que
apareceram anteriormente na evolução (insetos menos derivados, Terra et al.,
2006). Embora um maior conteúdo de proteínas não necessariamente signifique
27
uma maior variedade de proteínas, há evidências que apóiam isso. Eletroforese em
gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE) de proteínas microvilares
intestinais de coleópteros (densidade de membranas 1,08-1,10) resulta em menos
bandas visíveis que em lepidópteros e dípteros (densidade de membrana 1,14 -
1,16) (Jordão et al., 1995; Capella et al., 1997). Caso realmente seja verdade que
insetos mais derivados têm maior variedade de proteínas microvilares que insetos
menos derivados, a superfície celular intestinal parece desempenhar um papel mais
sofisticado em insetos mais derivados que nos menos derivados. A identificação das
proteínas presentes nas microvilosidades pode ajudar no entendimento da função
microvilar no mecanismo de secreção microapócrina.
Duas diferentes abordagens para o estudo do proteoma de preparações de
microvilosidades intestinais de vários lepidópteros têm sido realizadas. A primeira é
baseada na capacidade de separação por eletroforese em gel bidimensional (2D-
PAGE), com focalização isoelétrica na primeira dimensão seguida por SDS-PAGE
na segunda dimensão (Candas et al., 2003; Krishnamoorthy et al., 2007; McNall e
Adang, 2003). A segunda abordagem é baseada na varredura de uma biblioteca de
cDNA intestinal usando anticorpos produzidos contra preparações microvilares livre
de citoesqueleto (Ferreira et al., 2007). Pauchet e colaboradores (2009a) analisaram
o proteoma de microvilosidades intestinais de Manduca sexta através de duas
diferentes abordagens acopladas ao espectrômetro de massa para identificação das
proteínas. Na primeira, eles realizaram uma separação por cromatografia de troca
iônica de proteínas de microvilosidades solubilizadas por Triton X-100, seguida por
SDS-PAGE das frações contendo proteínas e na segunda abordagem foi feita uma
eletroforese nativa (blue Native-PAGE) seguida por SDS-PAGE numa segunda
dimensão. Eles identificaram proteínas classificadas como enzimas digestivas, alvos
ligantes da toxina Cry e proteínas envolvidas na transdução de sinais, ATP sintases
e uma proteína ligante da clorofila. Outras análises proteômicas de preparações de
membranas microvilares intestinais de lepidópteros encontraram as enzimas
digestivas descritas anteriormente além de outras proteínas como transportadores
ABC (ATP-binding cassette), ATPase, actina, caderina, afadina, etc (McNall e
Adang, 2003; Krishnamoorthy et al., 2007).
1.5. Proteínas potencialmente envolvidas na secreção microapócrina
28
Actina é um dos principais componentes do esqueleto celular que é essencial
para esculpir e manter a forma da célula, além de apoiar a dinâmica de inúmeros
processos como mobilidade celular, divisão celular e morfogênese para o tráfico
proteico intracelular (Cingolani e Goda, 2008). A actina foi descoberta pela primeira
vez em 1942 como sendo o principal componente proteico do músculo esquelético
de coelhos (Straub, 1942) e desde então diversos trabalhos científicos
demonstraram que esta proteína está presente em todas as células eucarióticas.
Os filamentos de actina são estruturas polarizadas consistindo de duas
extremidades com crescimento diferenciado, uma extremidade “mais”, onde o
crescimento é rápido e a outra “menos”, onde o crescimento é lento. A
reorganização dinâmica do citoesqueleto de actina é requerida para um grande
número de processos celulares, incluindo mobilidade celular, citocinese, e
morfogênese (Mohri, et al., 2006). Os filamentos de actina são regulados por um
mecanismo complexo envolvendo diversas proteínas ligantes de actina. A
maquinaria central de um rápido turnover de actina requer a nucleação de actina,
desmontagem dos filamentos e cobertura da extremidade “mais”, para limitar o
número de sítios de alongamento (Cooper e Schafer, 2000; Carlier et al., 2003;
Pollard e Borisy, 2003; Nicholson-Dykstra et al., 2005).
Actina existe em duas formas na célula, uma globular, a G-actina
monomérica e uma filamentosa e polimérica, a F-actina. G-actina é uma proteína de
cerca de 375 aminoácidos consistindo de 4 subdomínios que cercam uma fenda
geralmente ocupada por ATP (Kasai e Oosawa, 1969). F-actina é composta por
uma cadeia espiralada de moléculas idênticas de G-actina, todas “apontadas” para
a mesma direção em relação ao eixo da cadeia. Dentro da célula, estes filamentos
de actina são organizados para formar feixes ou redes tridimensionais. Podemos
verificar na figura 4 que F-actina apresenta uma polaridade estrutural com uma
extremidade mais e outra menos. Cada monômero livre de actina carrega uma
molécula de ATP, a qual é hidrolisada em ADP momentos após a incorporação do
monômero de actina ao filamento. Esta hidrólise reduz a resistência da ligação entre
os monômeros e diminui a estabilidade do polímero favorecendo a despolimerização
e contribuindo assim para a dinâmica da polimerização/despolimerização dos
filamentos de actina requerido pela célula. Assim, a dinâmica dos filamentos de
actina requer ATP, com a polimerização de ATP-actina ocorrendo na extremidade
29
“mais”, enquanto que ADP-actina dissocia-se da extremidade “menos” (Cooper,
2000).
As duas formas de actina, globular e filamentosa, coexistem em um estado
dinâmico sob o controle de múltiplos fatores, incluindo força iônica intracelular, pH e
diversas proteínas ligantes de actina (ABPs) (Remedios et al., 2003).
Extremidade (+) Extremidade (-)
ADP-Pi-actinaATP- actina ADP-actina
Figura 4: Representação esquemática da formação de F-actina e reciclagem de G-actina.
ATP-G-actina liga-se à extremidade (+) dos filamentos. A hidrólise de ATP facilita a
despolimerização removendo moléculas de G-actina da extremidade (-). ADP-G-actina
desassociada pode ser novamente fosforilada, e a ATP-G-actina formada é capaz de nova
polimerização (adaptado de Gungabissoon e Bamburg, 2003).
Células intestinais estão associadas umas com as outras por junções que
separam a membrana plasmática em um domínio basolateral e outro apical (Terra e
Ferreira, 2012). O domínio apical é geralmente modificado em microvilosidades que
são sustentadas por um citoesqueleto abundante em forma de feixes, composto de
filamentos de actina associados às proteínas ligantes destes filamentos. (Mooseker,
1985).
30
As microvilosidades estão onipresentes em células epiteliais em diferentes
filos de invertebrados, inclusive artrópodes e a morfologia das células intestinais de
diferentes espécies foram descritas (Noirot e Noirot-Timothée, 1972; Santos et al.,
1984; Camatini et al., 1993). Esses estudos demonstraram que a morfologia de
microvilosidades é similar a descrita para células intestinais de vertebrados e seu
interior também é constituído por F-actina (Kukulies et al., 1984; Camatini et al.,
1993). O epitélio do intestino de lepidópteros consiste de uma única camada de
células, e é o principal sítio de secreção de enzimas digestivas e absorção de
nutriente além de desempenhar importante papel na regulação de íons. Suas
células colunares são caracterizadas pela presença de microvilosidades cilíndricas
com cerca de 0,1µm de diâmetro e 5-7 µm de comprimento, contendo cerca de 8-12
feixes de F-actina (Camatini et al., 1993). Cerca de dois terços dos feixes de actina
das microvilosidades estão rodeados pela membrana plasmática, e um terço
remanescente projeta-se para o citoplasma apical como radículas (Bretscher, 1991).
A dinâmica da montagem e desmontagem dos filamentos de actina, sua
organização em feixes ou redes e sua associação com outras estruturas, tais como,
membrana plasmática, são reguladas por uma variedade de proteínas ligantes de
actina (ABPs), as quais são componentes críticos do citoesqueleto de actina.
Em 2003 Remedios e colaboradores enumeraram 162 diferentes ABPs
existentes, sem incluir suas isoformas. Tentativas de classificação destas ABPs
resultam em alguns “órfãos” que não se enquadram em nenhumas das famílias
(Remedios et al., 2003). Embora a classificação destas ABPs de acordo com suas
funções seja problemática, estas ABPs podem ser organizados nos seguintes
grupos: proteínas ligantes de monômeros, proteínas despolimerizantes, proteínas
que cortam os filamentos de actina, proteínas que cruzam F-actina, proteínas que
estabilizam os filamentos de actina e proteínas motoras (Ma, 2009).
Existe, portanto, um amplo espectro de ABPs responsáveis pelo rearranjo do
citoesqueleto de actina em uma variedade de processos celulares. Entre essas, as
proteínas da superfamília gelsolina controlam a organização da actina através de
suas funções de cortes dos filamentos e /ou ligação a extremidade do filamento de
actina impedindo nova polimerização.
Todos os membros da família gelsolina contêm de 3 a 6 cópias de um
domínio denominado gelsolina (G) de aproximadamente 120 aminoácidos.
Entretanto, alguns dos membros como, por exemplo, vilina, supervilina, flightless-I,
31
protovilina e EhABPH tem domínios adicionais no N-terminal ou C-terminal ou em
ambos (Figura 5).
A proteína gelsolina é a proteína mais estudada desta família
(Chumnarnsilpa, 2009). Gelsolina é uma proteína reguladora da dinâmica dos
filamentos de actina. Possui 6 domínios homólogos (G1-G6), cada um contendo um
sítio conservado ligante de cálcio. A função ligante de actina de gelsolina resulta de
três sítios ligantes de actina independentes (G1, G2 e G4). A atividade de corte está
localizada na metade N-terminal da molécula, nos segmentos G1-G3 (Way et al.,
1989).
Gelsolina foi isolada pela primeira vez de macrófagos de coelhos em 1979
por Yin e Stossel em estudos baseados na sua habilidade de regular a estrutura
citoplasmática de uma maneira dependente de cálcio. Em humanos existem duas
formas de gelsolina conhecidas, uma intracelular (ou citoplasmática) e uma
extracelular encontrada no plasma (Wen et al., 1996). Muito pouco é conhecido a
respeito da diferença entre as duas formas. Ambas as formas contêm 6 domínios do
tipo gelsolina (G1-G6), entretanto a forma extracelular contém uma extensão da
sequência N-terminal de 25 aminoácidos de função desconhecida (Kwiatkowski et
al., 1988).
Gelsolina está envolvida na regulação da motilidade celular, na transdução de
sinas em rearranjos da arquitetura citoesquelética e até na estimulação da morte
celular programada em certas células de vertebrados (Kwiatkowiski et al., 1989; Yin,
1999; McGough et al., 2003). Devido a sua função de cortes de F-actina,
acreditamos que gelsolina possa estar envolvida no processo de secreção
microapócrina, uma vez que deve ser necessária a desorganização destes
filamentos para permitir a passagem das vesículas de secreção pelo interior da
microvilosidade. Gelsolina controla o remodelamento dos filamentos de actina de
uma maneira regulada por Ca2+, pH intracelular, fosfoinositídeos e fosforilação de
tirosina. O processo de cortes em F-actina ocorre devido ao rompimento de ligações
não-covalentes entre os monômeros de actina do polímero, causado pela ligação de
gelsolina. Este processo é de fundamental importância na fisiologia celular. Células
de camundongo gelsolina knockout exibem uma variedade de defeitos na actina e
na motilidade (Ma, 2009). Fibroblastos gelsolina nulos têm excesso de fibras de
estresse de actina e migram mais lentamente que fibroblastos selvagens. Este
32
resultado é consistente com a incapacidade de corte e remodelamento dos
filamentos de actina na ausência de gelsolina (Witke et al., 1995).
Gelsolina/Adseverina 1 2 3 4 5 6
Severina/Fragmina/CapG 1 2 3
Flightless I 1 2 3 4 5 6LRR
EhABPH 2 3 4 5 6Coronina HP
Supervilina 1 2 3 4 5 6NLS HP
Vilina/Advilina 1 2 3 4 5 6 HP
Protovilina 1 2 3 4 5 6 HPNeck
Figura 5: Representação esquemática da organização dos domínios de proteínas da
superfamília gelsolina. As proteínas que apresentam apenas 3 domínios do tipo gelsolina
conservados (G1-G3) são severina, fragmina e CapG. Gelsolina e adseverina apresentam 6
desses domínios (G1-G6). Flightless I possui 6 domínios do tipo gelsolina e o domínio LRR
(repetições ricas em leucina) adicional na região N-terminal. Vilina e advilina além dos 6
domínios do tipo gelsolina, possuem um domínio headpiece (HP) na região C-terminal.
Supervilina possui G1-G6, HP e um domínio NLS (sinais de localização nuclear) N-terminal.
Protovilina possui G1-G6, HP e um domínio neck adicional. Na EhABPH G1 está ausente e
possui um domínio tipo coronina N-terminal, além do HP C-terminal.
Os filamentos de actina do citoesqueleto estão organizados em feixes e redes
ortogonais (Klein et al., 2004). Quando estes filamentos de actina se dispõem em
feixes, como ocorre nas microvilosidades, eles estão alinhados paralelamente e a
proteína que liga-se à actina sendo uma das responsáveis pela formação dessas
estruturas é a fimbrina.
Fimbrina pertence a uma família de proteínas caracterizada por um domínio
ligante de F-actina (ABD) de aproximadamente 250 aminoácidos. Ela possui 2 ABDs
e se liga aos filamentos de actina como um monômero mantendo os dois filamentos
próximos (Cooper e Hausman, 2004). Esses ABDs são compostos por 2 arranjos
sequenciais de aproximadamente 125 aminoácidos de domínios homólogos à
33
calponina (CH). Além desses domínios, fimbrina possui um headpiece N-terminal
com função ligante de Ca ++.
As miosinas constituem uma grande família de motores moleculares. Atuais
análises filogenéticas organizam as miosinas dentro de 15 classes (Sellers, 2000).
Miosinas geralmente consistem de uma cadeia pesada que contém 3 domínios: um
domínio motor N-terminal com atividade ATPase, um domínio intermediário que age
como uma alavanca mecânica e um domínio cauda C-terminal que medeia
interações com outras proteínas ou lipídeos de membrana (Nambiar et al., 2010).
Embora altamente conservado, diferenças sutis na sequência do domínio motor
resulta em uma ampla gama de propriedades cinéticas e mecânicas que são
utilizadas para funções específicas no interior das células (Nambiar et al., 2010).
As microvilosidades são altamente enriquecidas em miosinas motoras. Uma
das mais abundantes encontradas nas microvilosidades são as miosinas da classe
I. Miosinas I são motores monoméricos conhecidos por interagir com fosfolipídios
ácidos na membrana interna da membrana microvilar através de um domínio C-
terminal altamente básico (Nambiar et al., 2010).
A proteína fator despolimerizante de actina ADF/cofilina é uma das proteínas
essenciais que aceleram a renovação dos filamentos actina através da
despolimerização nos monômeros de actina das extremidades “mais” e cortes nos
filamentos (Bamburg, 1999; Carlier et al., 1999; Maciver e Hussey, 2002; DesMarais
et al., 2005; Mohi et al., 2006). A família da cofilina consiste de proteínas de baixo
peso molecular que são despolimerizantes dos filamentos de actina e que estão
provavelmente presentes em todos os filos eucarióticos de protistas até humanos. A
atividade de cofilina é regulada por diversos mecanismos, incluindo
fosforilação/desfosforilação, pH, fosfoinositídeos e competição com outras proteínas
ligantes de actina (DesMarais et al., 2005; Mohri et al., 2006).
Outra proteína que poderia estar envolvida na secreção microapócrina é a
proteína dissulfeto isomerase (PDI). Ela é membro da superfamília tiorredoxina e da
família PDI a qual têm sido agregados vários outros membros (Ellgaard e Ruddock,
2005). Em humanos há 17 tipos de PDIs, que diferem no número de domínios
catalíticos, na quantidade de sítios de glicosilação, na presença de determinados
resíduos de arginina conservados, no tipo de sinal de retenção no retículo
endoplasmático e no par de resíduos catalíticos envolvido com reações de
transferência de prótons (Ellgaard e Ruddock, 2005).
34
Aparentemente PDI é uma enzima que pode desempenhar diversos papéis.
Ela participa do dobramento e da modificação pós-traducional de proteínas no
retículo endoplasmático (RE) (Wilkinson e Gilbert, 2004). PDI catalisa tanto a
oxidação e isomerização de dissulfetos de polipeptídeos nascentes, funcionando
como uma enzima e como uma chaperona. Atuando como enzima, ela aumenta a
taxa de formação de ligação dissulfeto sem alterar o dobramento de proteína (Noiva,
1999). Como chaperona, ela promove o correto dobramento de proteínas por
prevenir erros no dobramento e agregação de peptídeos parcialmente dobrados ou
mal dobrados e auxilia na maturação e transporte de muitas proteínas que serão
secretadas (Noiva, 1999; Freedman et al., 2002; Barak et al., 2009). Ela está
presente no RE em concentrações razoavelmente altas. Entretanto, algumas
evidências apontam que pelo menos três membros da família PDI, a denominada
PDI, a ERp57 e a ERp72 são encontrados fora do RE e possuem atividades que
podem diferir daquelas exibidas no lúmen do RE (Wilkinson e Gilbert, 2004). PDI
que normalmente possui na região C-terminal um sinal de retenção no RE é
secretada em baixos níveis em uma variedade de tipos celulares, incluindo
hepatócitos, células exócrinas pancreáticas, células endoteliais e plaquetas ativadas
(Turano et al., 2002). Além disso, PDI foi encontrada na superfície celular de
linfócitos B. Pelo menos uma proteína relacionada à PDI, ERp57, foi encontrada no
citosol e no núcleo (Turano et al., 2002). O mecanismo pelo qual as proteínas da
família de PDI que possuem um sinal de retenção no RE podem escapar do RE não
é conhecido e o papel da PDI secretada, ligada à superfície, citosólica e nuclear
permanece desconhecido (Wilkinson e Gilbert, 2004).
A PDI pode estar em alguns casos, relacionada a processos de fusão entre
membranas. O processo de fusão de membranas ocorre devido à atuação de
proteínas de membrana específicas através de interações com lipídeos e outras
proteínas (Ellerman et al., 2006). Os dois sistemas de fusão mais estudados são o
tráfico de vesículas e fusão viral. No caso de fusão de vírus com a célula hospedeira
a ativação de proteínas de fusão pode ser desencadeada, por exemplo, por
mudanças em reações tiol-dissulfeto que são catalisadas por proteínas com
atividade de dissulfeto isomerase (Sanders, 2000). Ellerman et al. (2006)
investigaram se mudanças tiol-dissulfeto estariam envolvidas na fusão de gametas
em mamíferos. Eles verificaram que o pré-tratamento de esperma com inibidores de
35
PDI reduzem a sua capacidade de fusão com o gameta feminino (Ellerman et al.,
2006).
36
2. OBJETIVOS
Nosso objetivo é aumentar o conhecimento sobre a secreção microapócrina
em Lepidóptera, identificando quais são as proteínas secretadas por esse
mecanismo e quais proteínas estariam envolvidas nesse tipo de secreção. Usamos
como modelo a lagarta de S. frugiperda.
Para atingir nosso objetivo, nos propusemos a:
1) Gerar anticorpos contra as proteínas presentes nas preparações de vesículas;
2) Varrer com os anticorpos uma biblioteca de cDNA preparada com material do
intestino médio;
3) Realizar pirosequenciamento de uma biblioteca de cDNA proveniente dos
mRNAs do epitélio do ventrículo, para completar ou aumentar as sequências obtidas
nas varreduras;
4) Reanalisar as sequencias obtidas anteriormente em uma varredura de biblioteca
de cDNA do IM, realizada com anticorpos contra preparação de microvilosidades;
5) Selecionar proteínas possivelmente envolvidas no processo secretório, obter
suas sequências completas, verificar sua distribuição intracelular, suprimir sua
expressão utilizando RNA interferente e verificar alterações causadas por essa
supressão.
37
3. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
3.1. Animais
S. frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) foram criadas em laboratório de
acordo com Parra (1986). As lagartas foram colocadas individualmente em frascos
de vidro em uma dieta baseada em feijões roxos (Phaseolus vulgaris), germe de
trigo, levedura e ágar, e foram mantidas em um fotoregime natural a 25ºC. Os
adultos foram alimentados com solução 10 % de mel. Lagartas de quinto instar
(último instar) de ambos os sexos foram usadas nas preparações.
3.2. Preparação das amostras de S. frugiperda
As lagartas de S. frugiperda foram anestesiadas em gelo, sendo em seguida
dissecadas em solução de NaCl 125 mM, exceto quando indicado. O tubo digestório
foi retirado e o epitélio do intestino foi separado da MP mais conteúdo luminal.
Para coletar as vesículas presentes no espaço ectoperitrófico, o epitélio foi
lavado com salina 125 mM para dentro de um tubo de centrífuga (Ferreira et al.,
1994). Esse material foi centrifugado a 600x g, 10 min, 4ºC. O sobrenadante
resultante foi separado do precipitado após a centrifugação e novamente
centrifugado a 25.000x g, 10 min, 4ºC e o precipitado final foi ressuspendido em
água milli-Q gelada e utilizado como fonte de vesículas microapócrinas (VM).
Para a preparação do material do epitélio do ventrículo e da membrana
peritrófica mais conteúdo utilizados nos ensaios enzimáticos eles foram
homogeneizados com água milli-Q gelada com o auxílio de um homogeneizador tipo
Potter-Elvehjem. A membrana peritrófica com seu conteúdo foi a seguir centrifugada
a 10.000x g por 10 min a 4ºC e o sobrenadante foi utilizado nos ensaios, exceto
quando indicado.
As microvilosidades foram preparadas a partir do intestino médio inteiro como
descrito por Ferreira et al. (2007). O método é essencialmente aquele descrito por
Schmitz et al. (1973), onde as microvilosidades são obtidas após sedimentação de
outros tipos de membranas presentes em um homogeneizado por adição de cátions
divalentes. Ferreira e colaboradores (2007) fizeram a sedimentação usando Mg++
por duas vezes para obter microvilosidades mais livres de contaminantes.
38
Para a obtenção das amostras utilizadas na preparação de anticorpos o terço
anterior do epitélio ventricular foi utilizado. Ele foi homogeneizado e submetido a um
fracionamento subcelular como descrito por Ferreira e colaboradores (1994) e os
sedimentos P1 e P3 utilizados separadamente para a obtenção dos anticorpos. O
esquema de centrifugação (Figura 6) mostra como essas preparações foram
obtidas.
Sobrenadante 1
Sobrenadante 2
Homogeneizado
Precipitado 1 (P1)600 x g10 min
Precipitado2 (P2)3.300 x g10 min
Sobrenadante final
25.000 x g10 min
Precipitado 3 (P3)
Figura 6: Esquema representativo da obtenção das amostras P1 e P3 de S. frugiperda
utilizadas para a obtenção de anticorpos.
Para a extração de RNA, a dissecação foi feita utilizando pinças e lâminas
previamente esterelizados em estufa a 150ºC por 4 horas. Os tecidos dissecados
(epitélio intestinal inteiro, epitélio do ventrículo anterior, médio e posterior, túbulos de
Malpighi, corpo gorduroso ou carcaça) foram mantidos em gelo seco e
armazenados a -80°C. O RNA total foi extraído com Trizol (Invitrogen) de acordo
com instruções do fabricante, o qual é baseado em Chomczynski e Sacchi (1987) e
ressuspenso em 100µL de água tratada com DEPC (0,1% (v/v). A contaminação por
DNA genômico foi removida por tratamento com DNase (Turbo DNase, Ambion) por
30 minutos a 37°C. O RNA total foi purificado usando-se o kit RNease Clean up
(Qiagen) seguindo o protocolo do fabricante.
3.3. Microscopia eletrônica
39
As análises de microscopias eletrônicas foram feitas no Instituto de
Biociências da USP-SP em colaboração com o Prof. Dr. Alberto de Freitas Ribeiro.
A preparação de vesículas microapócrinas (VM) foi obtida como descrito no
item anterior e então fixada em glutaraldeído 2,5 % em tampão cacodilato 0,1 M
pH7,4 e ácido pícrico por 2 horas a 4 °C. A amostra foi posteriormente fixada em
tetróxido de ósmio a 1% e em seguida desidratadas em soluções com
concentrações crescentes de etanol embebidas em uma resina acrílica LR White
(Electron Microscopy Sciences, Ft Washington, USA).
Para a realização das imunomarcações, as lagartas de S. frugiperda foram
dissecadas e o IM foi dividido em três partes: ventrículo anterior, ventrículo médio e
ventrículo posterior. O epitélio ventricular foi separado do conteúdo luminal, e
apenas os tecidos epiteliais foram fixados (paraformaldeído 4% (m/v), glutaraldeído
5% (v/v) em tampão fosfato de sódio 100 mM pH 7,4) e embebidos na resina acrílica
L. R. White (Agar Aids, USA) por 24 horas a 50ºC. Secções finas de tecidos foram
obtidas em ultramicrótomo e transferidas para telas de níquel. A cada um dos cortes
foi aplicada uma gota de TBS (tris 0,1M, NaCl 0,3M, NaN3 0,1% (m/v)) contendo
albumina sérica bovina 1% (TBS-BSA). Após 30 minutos foi adicionado o anticorpo
desejado, nas diluições de 1:50, 1:100 e 1:200 em TBS-BSA e incubado por 90
minutos a temperatura ambiente. Em seguida, o corte foi lavado com TBS-BSA e
incubado com o anticorpo anti-IgG de coelho, conjugado a partículas de 10 nm de
ouro coloidal. Esse último foi diluído na proporção de 1:15 em tampão TBS-BSA.
Dois tipos de controles foram realizados: utilizando o soro pré-imune e omitindo o
anticorpo primário.
Os cortes foram finalmente lavados com água milli-Q e corados com acetato
de urânio e citrato de chumbo (Reynolds, 1963) e visualizados em um microscópio
eletrônico de transmissão Zeiss EM 900.
3.4. Ensaios de atividades enzimáticas
A concentração de proteína foi determinada de acordo com o método de
Bradford (1976) usando ovoalbumina como padrão.
Aminopeptidase e tripsina foram ensaiadas em 50 mM de tampão Tris-HCL
(pH7.5) usando respectivamente 1 mM de L-leucina-p-nitroanilida (LpNA) ou 1 mM
α-N-benzoil-DL- arginina p-nitroanilida (BApNA) de acordo com Erlanger et al.
40
(1961). Amilase foi medida pela determinação do aparecimento de grupos redutores
(Noelting e Bernfeld, 1948) em tampão glicina–NaCl 50 mM em pH 9.5 com amido
0.5% (w/v) como substrato na presença de 10 mM de NaCl.
Carboxipeptidase A foi determinada usando 15 mM de N-carbobenzoxi-glicil-
L-fenilalanina (ZGlyPhe) em tampão Tris-HCl 50 mM pH 8 na presença de NaCl 50
mM. A liberação de fenilalanina foi seguida como descrito por Micholson e Kim
(1975).
Celobiase e maltase foram ensaiadas usando ou 7mM de celobiose ou 7mM
de maltose em tampão citrato-fosfato de sódio 50 mM de pH 7 e pH 5
respectivamente. A glicose produzida foi detectada como descrito por Dahlqvist
(1968).
Incubações foram realizadas a 30 °C por pelo menos quatro períodos
diferentes de tempo e as taxas iniciais de hidrólise foram calculadas. Todos os
ensaios foram realizados sob condições onde o produto era proporcional a
concentração de enzima e ao tempo de incubação. Controles sem enzimas e outros
sem substratos foram incluídos. Uma unidade de enzima é a quantidade que
hidrolisa 1 µmol de substrato (ou ligação) por minuto. As atividades enzimáticas
foram expressas em miliunidades (mU).
3.5. Procedimentos para manipulação e análises de ácidos nucléicos
Os procedimentos experimentais de técnicas de DNA recombinante que
serão comentados a seguir foram adaptados de manuais dos fabricantes e de
protocolos descritos por Sambrook e colaboradores (1989).
3.5.1. Iniciadores para amplificação do cDNA codificante de PDIs (1 e 2),
fimbrina, miosina I, cofilina e gelsolina-1.
Para amplificação das sequências de fimbrina, PDIs, cofilina, gelsolina-1 e
miosina-1 de S. frugiperda foram realizadas reações de PCRs utilizando um dos
iniciadores universais T7 (5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’) ou T3 (5’
ATTAACCCTCACTAAAGGGA 3’) presentes nos “braços” do fago λ Zap II (utilizado
como vetor da biblioteca de expressão com iniciadores específicos.
41
Para a clonagem do cDNA codificante da fimbrina, PDI-1, PDI-2, cofilina e
gelsolina foram inicialmente utilizados iniciadores desenhados a partir de uma
sequência parcial obtida nas varreduras de biblioteca de cDNA com anticorpos.
Para a clonagem do cDNA codificante de miosina 1 foram inicialmente utilizados
iniciadores desenhados a partir de uma sequência parcial obtida no banco de dados
Spodobase (http://bioweb.ensam.inra.fr/spodobase/). Conforme a sequência de
cada cDNA era aumentada, novos iniciadores foram sendo desenhados, específicos
para cada sequência. Para amplificação completa dos cDNAs codificantes dessas
proteínas, foram utilizados os seguintes iniciadores presentes na tabela 1.
Tabela 1: Sequência dos iniciadores utilizados para a obtenção do cDNA
completo codificante das proteínas de interesse
Proteína Oligonucleotídeo Sequência de DNA
Fimbrina
Fimb-1_FW 5’ ATGGCAGATAATTCAAAATTG 3’ Fimb-2_RV 5’ GTCGGGGCACGAGTGGTTTAT 3’ Fimb-3_FW 5’ ATCAAACCTGGCATTGTTAAC 3’ Fimb-4_FW 5’ AAGATGATCATGACAGTGTTC 3’ Fimb-5_RV 5’ CTAGTGATTATTAACCCTCAC 3’
Cofilina Cof-1_FW 5’ ATGGCGTCTGGTGTGACAGTT 3’; Cof-2_RV 5’ TTATTGGCGGTCGGTGGCGCG 3’;
PDI-1
PDI-1-1_FW 5’ ATGTTGGGGTCACTAAAAATT 3' PDI-1-2_FW 5’ AAGGAACTGAAGACTGTTGCT 3' PDI-1-3_RV 5’ AGCAACAGTCTTCAGTTCCTT 3’ PDI-1-4_FW 5’ AACATCCGTGACTTCACCGAT 3’ PDI-1-5_FW 5’ GCCCCATGGTGCGGACATTGC 3' PDI-1-6_RV 5’ TTAGAGCTCTTCCTTCT 3’
PDI-2
PDI-2-1_FW 5’ ATGAGAGTAATCTTATTTACG3' PDI-2-2_FW 5’ TGGGTGTTCGTCCAGAGCATG 3’; PDI-2-3_RV 5’ ACTCTGAAGTTCTTCAGGAAC 3' PDI-2-4_RV 5’ TCCCAACTTGTCGTAGATAGG 3’; PDI-2-5_RV 5’ TTATAACTCGTCTCTGGATGG 3’;
Gelsolina
Gels-1-1_FW 5’ ATGGCGACACACGAGGCGTTC 3’ Gels-1-2_FW 5’ CCCTGAATAAACCATACAAGC 3’ Gels-1-3_FW 5’ GAGACGGCTGATAACTGGAAG 3’ Gels-1-4_FW 5’ CTTCCAGTTATCAGCCGTCTC 3’ Gels-1-5_FW 5’ GCTGAGGCCGGTGCCAATCCG 3’ Gels-1-6_FW 5’ GGTTCTGCTCAGCATCATCATCA 3’ Gels-1-7_FW 5’ TATGTGGTGAAATACCAGTAC 3’ Gels-1-8_RV 5’ GCTTGTATGGTTTATTCAGGG 3’ Gels-1-9_RV 5' TTACTTAGAATTGGCTGCTTT 3’
Miosina-1
Mio1-1_FW 5’ ATGGAGCACGCCCTCGTGCAC 3’ Mio1-2_FW 5’ CACAGAGAACAGTGCATTTTG 3’ Mio1-3_FW 5’ TTCGAGATTGTCGCCAGCGTC 3’ Mio1-4_FW 5’ ATCAACTTCTGTAACGAGAAG 3’ Mio1-5_FW 5’ CTACCGACGAAGGTACTGGAC 3’ Mio1-6_RV 5’ GCGGAACAGCAGGTCGTTGTT 3’. Mio1-7_RV 5’ GTACGCGAACCCAGCTCGGCG 3’ Mio1-8_RV 5’ TCAGGGAGTTGCGATAACGAG 3’
Mio1-9_RV 5’ TCCAGTACCTTCGTCGGTAG 3’
42
3.5.2. PCR
Nas reações de PCR foram utilizadas a enzima Taq DNA polimerase
(InvitrogenTM Life Technologies) em reações de 50 µL contendo os iniciadores a 1
µM, dNTPs 0,2 mM (para cada nucleotídeo), tampão da Taq DNA polimerase e
cloreto de magnésio 1,5 mM, utilizando como molde a biblioteca de cDNA de S.
frugiperda clonada previamente em fago λ zap II.
As reações foram realizadas em termociclador GeneAmp® PCR System 9700
(AB Applied Biosystems) com desnaturação inicial por 2 minutos a 94ºC. Seguiu-se
uma sequência de 15 a 35 ciclos, sendo que as condições de cada ciclo foram de
94ºC para desnaturação da fita dupla de DNA por 30 segundos, de 50ºC a 65ºC
(variável em relação ao iniciador utilizado) para o pareamento iniciador-molde
(anelamento) por 45 segundos e 72ºC para o passo de alongamento (extensão) por
1 a 2 minutos. Por fim, a solução permaneceu por 10 minutos a 72ºC.
3.5.3. Eletroforese em gel de agarose
Géis de garose foram preparados na concentração de 2% (m/v) em tampão
TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM pH 8,0) e a eletroforese foi realizada nesse
mesmo tampão com cerca de 100 V. O material amplificado a ser analisado foi
misturado com 0,1 volumes de tampão de amostra contendo azul de bromofenol
0,25% (m/v) e glicerol 30% (v/v). Esse corante monitorou a movimentação da
amostra e determinou o encerramento da eletroforese. Posteriormente, o DNA foi
corado utilizando-se solução de brometo de etídeo (0,5 µg/mL) e visualizado em
transluminador de luz UV a 312 nm (Translluminator 2040 EV da Stratagene). Os
tamanhos dos fragmentos foram estimados mediante comparação com a mobilidade
de fragmentos de DNA conhecidos.
3.5.4. Purificação do produto de PCR a partir do gel de agarose
Os produtos amplificados em reações de PCR foram recuperado diretamente
do gel de agarose usando o protocolo do produto QIAquick gel extraction kit
43
(Qiagen), o qual se baseia na dissolução da agarose em uma tampão de alta força
iônica e ligação do DNA em uma resina de troca iônica. O procedimento foi
realizado seguindo as instruções do fabricante.
3.5.5. Ligação de produtos de PCR em plasmídeo
Para clonagem dos fragmentos de cDNAs obtidos a partir da amplificação por
PCR, foi utilizado o kit de ligação pGEM-T EASY vector System (Promega). Foi
utilizada uma mistura de reação que consistia de 1 unidade de T4 DNA ligase,
tampão apropriado, plasmídeo (pGEM-T) e produto de PCR (purificado do gel de
agarose). O plasmídeo e o produto de PCR foram utilizados em uma concentração
1:3. Essa mistura foi incubada por 16 horas 4ºC. O produto de ligação foi utilizado
para transformar bactérias competentes.
Para inserir fragmentos de cDNAs ao vetor pAE (Ramos et. al., 2004), tanto o
inserto quanto o vetor foram digeridos com enzimas de restrição apropriadas,
purificadas do gel de agarose e a seguir foram misturados em uma proporção de 3
volumes de inserto para 1 volume de plasmídeo adicionando 1 unidade de T4 DNA
ligase e tampão apropriado. A amostra foi incubada a 16ºC por 16 horas e a seguir
usada para transformar bactérias competentes.
3.5.6. Transformações de células competentes
Alíquotas de 1 uL dos respectivos plasmídeos foram adicionadas a 50uL de
células XL1-blue competentes e mantidas em gelo por 30 minutos. Em seguida as
células foram submetidas a um choque térmico a 42ºC por 30 segundos e
novamente transferidas para o gelo por mais 2 minutos. Adicionamos então, 1 mL
de meio LB, e essa solução foi incubada por 1 hora a 37ºC, para recuperação das
bactérias e expressão das proteínas envolvidas na resistência ao antibiótico de
seleção. Em seguida a mistura era plaqueada em LB ágar com o antibiótico
apropriado e incubada overnight a 37 ºC, obtendo-se dessa forma colônias isoladas.
44
3.5.7. Purificação de plasmídeos
Os plasmídeos foram purificados utilizando-se o protocolo do kit wizard Miniprep
(Promega) a partir de 3,0 mL de cultura de bactérias cultivadas durante 16 horas a
37 ºC. O rendimento e a pureza da amostra de plasmídeo foram avaliados através
da determinação da absorbância a 260 nm e 280 nm.
3.5.8. Sequenciamento de DNA
A reação de sequenciamento foi realizada utilizando-se 2 µL da mistura da
reação Big Dye terminator mix (Applied Biosystems), 100-200 ng de DNA, 15 pmol
de iniciador, Tris-HCl 200 mM pH 9, contendo MgCl2 5 mM em volume final de 15
µL. A reação foi incubada por 2 minutos a 95ºC, seguindo-se 35 ciclos de 45
segundos a 96ºC, 30 segundos a 50ºC e 4 minutos a 60ºC em termociclador Applied
Biosystems GeneAmp® 9700.
Uma vez encerrada a amplificação, as amostras foram precipitadas com
etanol 100% e glicogênio 1 mg/mL, lavadas com etanol 70%, suspensas em
formamida, desnaturadas. Em seguida as amostras foram sequenciadas pelo
serviço de sequenciamento de cDNA do Departamento de Bioquímica, Instituto de
Química, utilizando um sequenciador automático ABI PRISMTM 3100 (Applied
Biosystems).
3.5.9. RT-PCR semi-quantitativa
O RNA total dos tecidos dissecados (ventrículo total, ventrículo dividido em
anterior, médio e posterior, túbulos de Malpighi, corpo gorduroso e carcaça) foi
extraído com Trizol (item 3.2) e usado para a síntese dos cDNAs correspondentes,
utilizando-se da transcriptase reversa fornecida pelo kit SuperScript First-Strand
Synthesis for RT-PCR (Invitrogen).
O cDNA resultante foi usado como molde para a amplificação das sequências
por PCR com iniciadores específicos para as sequências das proteínas
selecionadas. Os iniciadores estão apresentados na tabela 2. Os iniciadores para as
45
sequências das proteínas anexina, cofilina, fimbrina, gelsolina-1, PDIs (1 e 2) e
miosina VI foram desenhados a partir de ESTs encontrados nas varreduras de
biblioteca de cDNA de S. frugiperda (ver adiante). Os iniciadores para as
sequências das proteínas ARP2/3, gelsolina-2, moesina, profilina, miosina I e
profilina foram desenhados a partir de ESTs encontradas no banco de dados
Spodobase (http://bioweb.ensam.inra.fr/spodobase/).
A PCR foi realizada como descrito no item 3.5.2. O número de ciclos foi
escolhido após várias tentativas, assim que a amplificação estava em fase log,
resultando em bandas claras e visíveis. O tamanho dos produtos de PCR foi
compatível com os tamanhos teóricos esperados, assim eliminando a possibilidade
de contaminação por DNA genômico na preparação.
Tabela 2: Sequência dos iniciadores utilizados na realização da RT-
PCR semi-quantitativa
Oligonucleotídeo Sequência de DNA
Anexina_FW 5’ ATGAGTGGACAACAGTACTAC 3’ Anexina_RV 5’ TTAAGCACAAAGTGTGACTAG 3’ ARP 2/3_FW 5' GGAGCAGATGAGCTTCTCAAA 3' ARP 2/3_RV 5' GAACAGCACGAACGTAACATA 3' Cofilina_FW 5’ ATGGCGTCTGGTGTGACAGTT 3’; Cofilina_RV 5’ TTATTGGCGGTCGGTGGCGCG 3’ Fimbrina_FW 5’ GCTAACCTTAAAGCACAACA 3’ Fimbrina_RV 5’ GTCGGGGCACGAGTGGTTTAT 3’ Gelsolina-1_FW 5’ GCTGAGGCCGGTGCTAATCCG 3’ Gelsolina-1_RV 5’ GCTTGTATGGTTTATTCAGGG 3’ Gelsolina-2_FW 5' GTACATCCAGCTTTCGCCAAC 3' Gelsolina-2_RV 5' GATGAAGCAGTCTCCTTTGTT 3' Moesina_FW 5' AACGTCCGTGTGACGACGATG 3' Moesina_ RV 5' GATCTCGAAGTAGTTGACTCC 3' Miosina I_FW 5’ CTGCCGACGAAGGTACTGGAC 3’ Miosina I_RV 5’ TCAGGGAGTTGCGATAACGAG 3’ Miosin VI_FW 5’ CAACTGGTTTGGGTGAGGGAC 3’ Miosin VI_RV 5’ TAGGATGTTGGCTACATATGT 3’ PDI-1_FW 5’ GAGCTGCCGAAGAAGATGT 3’ PDI-1_RV 5’ AGCAACAGTCTTCAGTTCCTT 3’ PDI-2_FW 5’ TGGGTGTTCGTCCAGAGCATG 3’ PDI-2_RV 5’ TTATAACTCGTCTCTGGATGG 3’ Profilina_FW 5' ATGAGCTGGCAAGATTATGTC 3' Profilina_RV 5' CTAATAACCACAGGTAATTAA 3' β-actina_FW 5’ CGATGACGCGCCTGGCGCCGT 3’ β-actina_RV 5’ GACAGGACTGTGTTGGCGTAC 3’
46
3.6. Procedimentos para varreduras de biblioteca de cDNA
3.6.1. Preparação de anticorpos anti-P1, anti-P3 e anti-VM
A produção de anticorpos foi feita de modo semelhante ao descrito em
Jordão et al. (1996). Os procedimentos experimentais realizados com coelhos
seguiram protocolos aprovados pela Comissão de Ética em Cuidados e Uso Animal
(CECUA), do Instituto de Química da USP. Antes da aplicação do material para a
produção do anticorpo, foram retirados 5 mL de sangue do coelho, com o intuito de
se obter o soro pré-imune. Esse (em uma diluição 200x) foi usado em Western blots
para verificar o possível reconhecimento das proteínas presentes em S. frugiperda
antes da imunização dos coelhos com as mesmas. Foram inoculados em diferentes
coelhos 7 mg de proteína total do P1 e P3 e 9 mg de VM.
Às amostras de P1, P3 e material VM de S. frugiperda em um volume total de
1,0 mL foram misturados com igual volume de adjuvante completo de Freund e
aplicadas em coelhos. Uma segunda aplicação contendo igual quantidade de
proteínas foi feita trinta dias após a primeira, utilizando o mesmo procedimento
anterior, mas usando adjuvante incompleto de Freund. Após dez dias o sangue do
coelho foi retirado para se obter o soro imune através de uma punção cardíaca.
O sangue coletado antes da aplicação (pré-imune) e o sangue coletado após
as aplicações (imune) foram deixados por 1 hora a 37ºC e, em seguida, por 18
horas a 4ºC. Esse material foi então centrifugado (3.000x g; 10 minutos; 4ºC). Ao
sobrenadante resultante (soro) foi acrescentada uma solução de sulfato de amônio
saturada preparada em tampão fosfato, 200 mM, pH 6,7 em uma proporção de 1:1.
Após permanecer 18 horas a temperatura ambiente, a suspensão obtida foi
centrifugada (12.000x g; 15 minutos; 4ºC). O precipitado foi então ressuspendido em
solução 50 % saturada de sulfato de amônio pH 6,7 e novamente centrifugado nas
condições anteriores. Este passo foi repetido e o precipitado final obtido
ressuspendido em 0,125 M de NaCl. Esse material foi dialisado por 20 horas contra
1.000 volumes da mesma solução sendo realizada uma troca. O material dialisado
foi aliquotado e mantido a -80ºC até o uso.
47
3.6.2. Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE)
As amostras a serem separadas por eletroforese foram aquecidas durante 5
minutos a 95 °C em tampão de amostra (Tris-HCl 60 mM, pH 6,8; SDS 2,5% p/v; 2-
β-mercaptoetanol 0,36 mM; glicerol 10 % v/v; azul de bromofenol 0,05% p/v).
A eletroforese foi realizada em placa fina de poliacrilamida na presença de
SDS utilizando o equipamento BioRad (USA) Mini-Protein II em um sistema
descontínuo de tampões descrito por Laemmli (1970). Foi usado gel de corrida na
concentração de 12% de poliacrilamida e o gel de empilhamento na concentração
de 4 %, ambos contendo SDS 0,1%. A eletroforese foi realizada em voltagem
constante de 200 V a temperatura ambiente, até que o azul de bromofenol, utilizado
como marcador de frente, estivesse na borda inferior da placa.
Após a eletroforese, o gel foi corado pela técnica de Coomassie Blue R. Essa
consiste em deixar o gel em uma solução contendo 0,1% (p/v) de Coomassie Blue
R-250, 40% (v/v) de metanol e 10% (v/v) de ácido acético por meia hora. Em
seguida, a coloração de fundo do gel era retirada passando diversas vezes por
banhos de metanol 40% (v/v) mais ácido acético 10% (v/v) até que as bandas
pudessem ser visualizadas.
3.6.3. Western blotting
As proteínas foram inicialmente submetidas a uma eletroforese em SDS-
PAGE 12 % em placa de 1,0 mm. Após a separação eletroforética, o gel foi
submetido ao método de transferência de proteínas para membranas de
nitrocelulose descrito por Towbin et al. (1979). Inicialmente o gel foi equilibrado por
15 minutos em tampão Tris-HCl 25 mM ph8,6, glicina 192 mM e metanol 20% (v/v).
Em seguida foi realizada a transferência eletroforética das proteínas do gel para
uma membrana de nitrocelulose de poro de 0,45 μm, também previamente
equilibrada por 15 minutos no mesmo tampão. Foi utilizado o sistema de
transferência de proteínas semi-seco (Bio-Rad) na presença do tampão acima nas
condições indicadas pelo manual do aparelho (15 V; 5,5 mA/cm2 de gel; 30
minutos). A eficácia da transferência das proteínas foi monitorada por marcadores
48
de peso molecular pré-corados Low-Range (Bio-Rad, usados 3 μL) aplicados na
eletroforese.
Antes de serem imunoensaiadas, as membranas de nitrocelulose foram
deixadas imersas em uma solução 5 % (p/v) de leite em pó desnatado dissolvido em
TBS (tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, contendo NaCl 0,15 M) por 1 hora a
temperatura ambiente (ou 18h a 4ºC). Esse procedimento é utilizado para bloquear
os sítios da membrana de nitrocelulose que não contêm proteína transferida do gel,
evitando assim ligações inespecíficas nos passos que se seguem. As membranas
de nitrocelulose foram então lavadas 4 vezes por 5 minutos cada com TBS
contendo Tween-20 0,05 % (v/v) (TBS-T) e incubadas por 2 horas com o anticorpo
na diluição apropriada (200x) em TBS-T. As membranas de nitrocelulose foram a
seguir lavadas com TBS-T 4 vezes, por 5 minutos cada, e incubadas por mais 2
horas com uma solução de anti-IgG de coelho acoplada a peroxidase diluída 1:1000
em TBS-T. Após 4 lavagens por 5 minutos cada com TBS, as membranas foram
incubadas com uma solução feita com 20 mg de 4-cloro-1-naftol dissolvidas em 4
mL de metanol, a qual foram adicionados 20 mL de TBS aquecido a 37ºC e 15 μL
de H2O2, até que bandas escuras pudessem ser visualizadas (máximo de 15
minutos). Após serem extensivamente lavadas com água destilada, as membranas
de nitrocelulose foram deixadas para secar entre duas folhas de papel de filtro.
Para determinar a diluição de anticorpo imune a ser usada foram feitos
Western blots (dados não mostrados) onde as diversas preparações foram
submetidas à eletroforese em SDS-PAGE (70 μg de proteína), transferidas para
membrana de nitrocelulose e testadas com diversas diluições do anticorpo imune
gerado pelas respectivas preparações (50, 100, 200, 500 e 800 x). A diluição
escolhida foi aquela onde ainda era observada uma boa marcação na maior diluição
de anticorpo.
3.6.4. Plaqueamento e indução das bibliotecas de cDNA
Células XL1-blue MRF’ foram crescidas em LB-líquido contendo maltose
0,2% (p/v) e MgSO4 10 mM durante cerca de 16 h, a 30ºC e sob agitação a 250
rpm. Em seguida foram precipitadas por centrifugação (2.000x g; 10 minutos;
temperatura ambiente) e então ressuspensas em MgSO4 10 mM para uma Abs600 =
49
0,5. Uma alíquota de 2 mL destas células foi incubada com alíquotas da biblioteca
de cDNA de IM de S. frugiperda que foi preparada como descrito por Marana e
colaboradores (2001). As alíquotas continham 1x104 pfu e a incubação foi feita por
15 minutos a 37ºC. Em seguida, foram adicionados 25 mL de NZY-agarose a 55ºC à
mistura de incubação e essa derramada sobre uma placa NZY-ágar de 240 x
240mm. As placas de NZY-ágar permaneciam por um período de cerca de 6 h a
37ºC para o aparecimento dos primeiros sinais de placas de lise. A escolha da
quantidade de fagos a serem plaqueados foi feita de forma a possibilitar uma
densidade na placa de cultura que permitia a obtenção de clones isolados na
varredura.
Após o aparecimento dos primeiros sinais do surgimento de placas de lise,
iniciava-se o procedimento de indução do promotor da β-Galactosidase com IPTG.
Pra isso eram usadas membranas de nitrocelulose (Bio Agency) previamente
esterilizadas através da exposição por 15 minutos à luz UV de cada face das
membranas. Essas eram então embebidas em IPTG 10 mM estéril e deixadas secar
no fluxo. As membranas contendo IPTG eram então colocadas cuidadosamente
sobre o meio de cultura evitando a formação de bolhas. Em seguida, as placas eram
colocadas novamente para incubar a 37ºC, desta vez, por um período de 4 horas.
Durante o processo de indução, as proteínas de fusão (β-Galactosidase +
polipeptídeo codificado pelo cDNA do inserto) induzidas em cada placa de lise
ficavam aderidas às membranas de nitrocelulose. Após o término da indução, as
placas eram deixadas pelo menos 2 horas a 4ºC para evitar que pedaços de
agarose ficassem aderidos às membranas de nitrocelulose quando essas fossem
retiradas da placa. Marcas eram feitas nas membranas e nas placas de NZY-ágar
usando agulhas, com o intuito de orientar o posicionamento da membrana na placa.
Esse procedimento é importante para permitir a localização dos clones de interesse.
Após serem retiradas dos meios de cultura, as membranas de nitrocelulose eram
então submetidas aos imunoensaios.
3.6.5. Imunoensaios nas membranas de nitrocelulose
As membranas de nitrocelulose foram imunoensaiadas como descrito no item
3.6.3. Durante o procedimento de revelação, os sinais positivos que fossem
50
aparecendo eram marcados com lápis de ponta fina de forma a evitar que o sinal
fosse perdido após o término da revelação. As diluições dos anticorpos usadas para
os imunoensaios foram de 200 vezes para as varreduras de preparações de
precipitado 1 (P1), precipitado 3 (P3) e VM.
3.6.6. Coleta dos clones positivos
Após o imunoensaio, as membranas de nitrocelulose foram lavadas com
água destilada e usadas para fazer uma réplica com o auxílio de uma transparência.
Essa réplica foi usada para localizar na placa de cultura quais eram as placas de
lise marcadas pelo anticorpo e que, consequentemente continha os fagos
apresentando os cDNAs de interesse. As placas de lise eram então recolhidas do
meio de cultura com o auxílio de uma agulha de seringa com ponta romba. Pedaços
do meio de cultura contendo apenas placas de lise isoladas eram então retirados e
transferidos para um dos poços de uma placa de 96 poços contendo 100 μL de
tampão SM (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl; 8mM Mg2 SO4; 0,0025 % p/v de
gelatina). Nesse tampão os fagos λ Zap II se mantém estáveis por cerca de 6
meses. Depois de incubados por 2 horas a temperatura ambiente ou 16 horas a
4ºC, a suspensão de fagos já podia ser usada para experimentos posteriores. Após
o preenchimento de uma placa de 96 poços, era feito o procedimento de excisão de
plasmídeos a partir desses fagos.
3.6.7. Excisão do plasmídeo Bluescript
Inicialmente foi feita a preparação do estoque de células XL1-blue MRF’ e
SOLR no dia a ser feita a excisão. Essas células foram crescidas em LB-líquido
contendo maltose 0,2 % (p/v) e MgSO4 10 mM durante cerca de 16 horas a 30ºC
sob agitação de 250 rpm. Em seguida, as células foram precipitadas por
centrifugação (2.000x g; 10 minutos; temperatura ambiente) e ressuspensas em
MgSO4 10 mM para uma Abs600 = 1,0.
O protocolo de excisão foi feito em placas de 96 poços estéreis que tem a
capacidade para 300 L de solução em cada poço. A cada poço foram adicionados
51
13,3 μL de células XL1-blue MRF’ que foram co-infectadas com 10 μL da amostra
de fago λ Zap II isolado, obtido da varredura da biblioteca de cDNA, e 0,06 μL de
fago helper ExAssist. Essa mistura era então incubada a 37ºC por 16 horas.
Em células XL1-blue MRF' coinfectadas por esses dois fagos, proteínas
codificadas pelo fago helper reconhecem especificamente regiões do DNA do fago λ
Zap II e promovem a excisão e circularização de uma fita simples de DNA, dando
origem ao plasmídeo p-Bluescript, plasmídeo esse que contém o cDNA de
interesse. Esse plasmídeo é então encapsulado pelas proteínas do fago helper e
eliminado pelas células XL1-blue MRF'.
Para purificar os fagos, a cultura obtida após a incubação por 16 horas foi
incubada a 65ºC por 15 minutos, período esse suficiente para matar as células XL1-
blue MRF' presentes no meio. A cultura era então centrifugada (2.000x g, 10
minutos, temperatura ambiente) e o sobrenadante, contendo os fagos carregando o
plasmídeo p-Bluescript e fagos λ Zap II, recuperados.
Para finalizar, as células SOLR foram transformadas com 50 μL da
preparação de fagos obtida no passo anterior. Após 15 minutos de incubação a
37ºC essas células foram plaqueadas em meio LB-ágar contendo ampicilina (50
μg/mL). As placas foram incubadas por 16 horas a 37ºC.
Na transformação, os fagos helper ExAssist infectam essas células, mas
essas não são capazes de crescer em meio contendo ampicilina. Os fagos λ Zap II
não são capazes de infectar as células SOLR. Células infectadas pelos fagos helper
ExAssist contendo como material genético o plasmídeo p-Bluescript são
selecionadas positivamente em meios contendo ampicilina.
As colônias isoladas obtidas no meio LB-ágar contendo ampicilina foram
crescidas em meio LB-líquido contendo o mesmo antibiótico (50 μg/mL). Essas
culturas foram feitas em placas de cultura de 96 poços de 300 μL de volume com
fundo em “U”, com tampa e estéreis. Essas culturas foram usadas como fonte de
DNA para a realização da PCR. As reações de PCR foram realizadas como no item
3.5.2 utilizando os iniciadores M13 foward (5' CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG
3') e M13 reverse (5' AGCGGATAACAATTTCACACAGG 3'). Esses iniciadores
anelam nos braços do plasmídeo p-Bluescript nas vizinhanças do sítio múltiplo de
clonagem, permitindo amplificar os cDNAs que estão clonados nesse plasmídeo.
Para a análise dos fragmentos de DNA derivados da amplificação com PCR foram
feitas eletroforeses em gel de agarose como no item 3.5.3. Os produtos das PCR
52
feitos com os DNAs das bactérias transformadas, após terem sido verificados
através de gel de agarose foram utilizados na reação de sequenciamento. A reação
foi realizada com auxílio do carimbo de replicação, e o produto das PCRs foi
carimbado em uma placa de PCR contendo a mistura para a reação de
sequenciamento, usando o iniciador T3. A reação de sequenciamento foi realizada
como no item 3.5.8.
3.7. Procedimentos para o pirosequenciamento
3.7.1. Purificação do mRNA das amostras do IM
O RNA total purificado foi quantificado utilizando o kit Quanti-iT TM Ribogreen
(Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante. Em seguida iniciou-se o processo de
purificação do mRNA com a utilização do kit Dynabeads mRNA. Uma quantidade
de 50 µg de RNA total foi utilizada. Este procedimento permite recuperar mRNAs e
excluir todos os demais RNAs contaminantes da amostra, pois as beads presentes
no kit possuem oligo-dT (desoxitimina) covalentemente ligadas onde os mRNAs
através de suas caudas de poliadenilação se ligam e podem ser recuperados
posteriormente. Na sequência o kit RNA 6000Pico Chip do equipamento Agilent
2100 Bioanalyser foi utilizado para verificar a qualidade da amostra de mRNA. Uma
vez aprovada a qualidade e a integridade da amostra de mRNA, iniciou-se o
processo de síntese de cDNA e pirosequenciamento.
3.7.2. Pirosequenciamento de uma biblioteca de cDNA obtida a partir dos
mRNAs do IM de S. frugiperda
O serviço de pirosequenciamento foi realizado junto ao laboratório CATG (IQ-
USP). A sequência de trabalho do sistema Genome Sequencer FLX Titanium
baseia-se em um sistema de preparação de bibliotecas de cDNA a partir de mRNA
enriquecido. Para a obtenção de cDNA, 200ng de mRNA anteriormente purificado
foi fragmentado por meio de uma solução de ZnCl2, seguida de uma purificação dos
fragmentos de tamanhos desejados. A síntese das duas fitas de cDNA é realizada
53
utilizando o kit cDNA synthesis system (Roche), utilizando Roche random primer.
Em seguida a amostra é enriquecida em uma biblioteca de cDNA que será
quantificada e utilizada posteriormente. Pequenos adaptadores (A e B) específicos
são ligados nas extremidades 3’ e 5’ de cada fragmento de cDNA. Cada fragmento
de cDNA único da biblioteca é imobilizado em uma bead. A amostra é então
purificada gerando microreatores únicos onde cada bead representa uma sequência
única da biblioteca. Cada fragmento único ligado a uma bead é amplificado,
excluindo sequências competidoras e contaminantes, gerando para cada
microreator único, a ligação com vários milhões de sequências idênticas. As beads
carregando sequências únicas são então adicionados em uma placa (Pico Titer
Plate) onde se executa o sequenciamento. O diâmetro de cada cavidade na placa
(Pico Titer Plate) permite a inserção de somente uma bead. Por fim a placa é
carregada no aparelho GS FLX e a leitura é feita por sinais de quimiluminescência e
registrados em uma câmera acoplada ao equipamento.
3.8. Análises de bioinformática
Os arquivos (. sff) resultantes pirosequenciamento, contendo todos os reads
foram processados pelo GS De Novo Assembler (Newbler v.2.3), formando contigs.
Esses e os contigs formados pelo procedimento de Sanger descrito no item 3.5.8
foram anotados com a ajuda do programa dCAS (Guo et al., 2009), o qual deleta a
sequência do vetor, monta contigs e realiza análises através de BLASTX em bancos
de dados (nr, pfam, GO). A anotação das sequências selecionadas foi confirmada
por múltiplos alinhamentos (Bioedit version 7.1.3.0, Hall, 1999) com sequências
referentes.
As sequências obtidas por immunoscreening foram submetidas a um
BLASTN contra as sequências de S. frugiperda originadas do pirosequenciamento
de uma biblioteca de cDNA proveniente dos mRNAs do IM. As sequências foram
consideradas iguais se os e-values fossem menor que 10-10 e a identidade maior
que 95%. Ocasionalmente a identidade foi checada por múltiplos alinhamentos.
Esse procedimento levou a extensão das sequências. As sequências que não
tinham sequências homólogas com aquelas obtidas por pirosequenciamento
correspondiam a clusters com um único EST e foram descartadas.
54
Outras análises foram realizadas para identificar a presença de peptídeo sinal
(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP), alça transmembrana
(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/), âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI)
(www.mendel.imp.ac.at/sat/gpi/gpi_server.html) e sítios de glicosilação
(www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ ou www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/).
Análises filogenéticas usando sequências de aminopeptidases, amilases ou
lipases foram realizadas usando o programa MEGA 4.1 (Tamura et al., 2007). Os
cladogramas das sequências escolhidas foram inferidos usando o algoritmo
neighbor-joining (Saitou e Nei, 1987). Bootstraps (Felsenstein, 1985; Hillis e Bull,
1993) foram determinados baseados em 10.000 réplicas. Os ramos correspondendo
a separações em menos que 50% das réplicas (10.000) foram colapsados.
Massa molecular teórica foi determinada por Prot Param tool
(http://web.expasy.org/protparam/).
As traduções das sequências de aminoácidos foram determinadas usando
Translate tool (http://web.expasy.org/translate/).
3.9. Procedimentos para obtenção e análise de gelsolina recombinante
3.9.1. Expressão da gelsolina em Escherichia coli
Para a clonagem de três domínios da gelsolina (G1-G3) no vetor de
expressão pAE (Ramos et al., 2004) foram utilizados os iniciadores (GelsG1_FW e
GelsG3_RV) que se pareiam respectivamente com a região equivalente ao N-
terminal e C-terminal da gelsolina recombinante e correspondem à região marcada
em negrito. Foram acrescidos ainda sítios de restrição para XhoI e EcoRI
respectivamente (em itálico) e uma extensão que visa aumentar a eficiência de
digestão pelas respectivas enzimas de restrição (sublinhado): GelsG1_FW: (5’
CCGCTCGAGGAAATCTGGACCATAGAGCAA 3’) e GelsG3_RV (5’
CCGGAATTCTTACCAGCTGACGAAGTATTGCTT 3’).
Os iniciadores utilizados nas reações de sequenciamento do plasmídeo pAE
contendo o inserto do gene correspondente à gelsolina foram o T7 (ver item 3.5.1) e
T7 terminador (5’ GCTAGTTATTGCTCAGCGGCT 3’). Eles se pareiam
respectivamente com a fita sense e antisense do vetor pAE.
55
E. coli BL21 (DE3) foram transformadas com a construção pAE-Gels. Os
clones de interesse foram inoculados em 10 mL de meio LB contendo 50 g/mL de
carbenicilina e crescidos a 37°C, sob agitação contínua de 160 rpm, durante 18 h.
Em seguida, essa cultura foi diluída para uma Abs600nm = 0,1-0,15 em 50 mL de
meio LB contendo antibiótico na mesma concentração anterior, prosseguindo-se a
incubação em diferentes temperaturas (20°C, 25°C e 37°C). Quando a cultura
atingiu uma Abs600nm = 0,4 - 0,8, uma alíquota de 1mL foi retirada (cultura não
induzida), submetida à centrifugação a 16.000 xg, por 5 minutos, a temperatura
ambiente. O sobrenadante foi descartado e o sedimento de bactérias suspenso em
100 L de tampão de amostra para eletroforese. O isopropil -D-
tiogalactopiranosídeo (IPTG) foi então adicionado a essa cultura para concentração
final de 1 mM e alíquotas da suspensão bacteriana (cultura induzida) foram retiradas
após 20 horas de incubação a 20°C, 25°C e 37°C e processadas da mesma forma,
exceto que o sedimento de bactérias foi suspenso em 200 L de tampão de amostra
para SDS-PAGE. As amostras de cultura não induzida e induzida foram
armazenadas a -20°C até a sua utilização. O perfil de indução da proteína
recombinante foi analisado por separação eletroforética em gel de poliacrilamida
12% contendo SDS (SDS-PAGE) (ver item 3.6.2), de acordo com Laemmli et al.
(1970). Os géis foram corados com Coomassie Blue R (item 3.6.2). O restante da
cultura foi submetido à centrifugação a 3.000 xg por, 30 minutos, a 4°C e
armazenado a -80°C, por no máximo uma semana.
3.9.2. Teste de solubilidade da gelsolina recombinante
Para os testes de solubilidade, o sedimento, proveniente das culturas
bacterianas induzidas com IPTG 1mM em diferentes temperaturas (20ºC, 25ºC e
37ºC) (armazenados a -80ºC), foi suspenso em 1mL de tampão de lise [Tris-HCl 10
mM pH 7, NaCl 100 mM, imidazol 20 mM, PMSF 1mM e glicerol 10% (v/v)] e
submetido a sonicação com 3 pulsos de 15 segundos cada, out put 3 (Branson
Sonifier 450) com intervalos em gelo de 1 minuto entre cada pulso. O lisado foi
centrifugado a 10.000 xg, por 30 minutos, a 4ºC. O sobrenadante foi recolhido e o
sedimento suspenso em 1 mL do mesmo tampão de lise, sendo ambos analisados
em seguida por SDS-PAGE 12% e coloração com Coomassie Blue (item 3.6.2).
56
3.9.3. Purificação parcial da gelsolina recombinante
A gelsolina recombinante foi parcialmente purificada por meio de duas
cromatografias de afinidade, utilizando uma resina de Ni+2-agarose (Qiagen).
Inicialmente o sobrenadante (1 mL), proveniente do lisado bacteriano induzido a
20ºC foi misturado com 200 µL de resina de níquel, previamente equilibrada com 2,5
mL de tampão de lise [Tris-HCl 10 mM pH 7, NaCl 100 mM, imidazol 20 mM, PMSF
1 mM e glicerol 10% (v/v)]. Essa suspensão foi incubada a 4ºC, por 70 minutos, em
homogeneizador (Heavy dietyrotator, Cole Parmer) sob baixa velocidade. Foram
realizadas cinco lavagens com 750 L de tampão de lise por centrifugação a 16.000
xg, por 1 minuto. A proteína foi eluída com 150 L de tampão de lise acrescido de
25, 50, 75, 100, 150 e 300 mM de imidazol, seguindo-se incubação por 15 minutos
em gelo, centrifugação nas condições anteriores e coleta do sobrenadante.
Posteriormente, foi feito um pool do material eluído em condições crescentes
de imidazol e o mesmo submetido a uma diálise em tampão Tris-HCl 10 mM pH 7,
por 18 h, a 4ºC. No processo de diálise, três trocas foram realizadas, sendo que em
cada troca o material foi dialisado contra 1000 volumes de tampão.
O material dialisado foi novamente aplicado na resina de Ni+2-agarose, dessa
vez equilibrada com uma solução tampão um pouco mais estringente [Tris-HCl 10
mM, NaCl 200 mM, imidazol 20 mM, PMSF 1 mM, glicerol 10% (v/v) e β-
mercaptoetanol 5 mM]. As demais condições experimentais foram mantidas em
relação à primeira cromatografia de afinidade, sendo a proteína eluída nesse
mesmo tampão acrescido de 25, 50, 75, 100, 150 e 300 mM de imidazol. O material
eluído foi dialisado em tampão Tris-HCl 10 mM pH 7 e armazenado a -20ºC.
3.9.4. Produção de anticorpos policlonais anti-gelsolina
Na imunização de um coelho macho foram utilizadas duas alíquotas de 300
g de gelsolina (G1-G3) recombinante. Antes da imunização, um volume total de 5
mL de sangue foram retirados de cada coelho para a obtenção do soro pré-imune.
Para a primeira imunização, alíquotas de proteína recombinante semi-purificada
foram submetidas à eletroforese em SDS-PAGE 12%, seguida de coloração com
57
nitrato de prata (Yan et al., 2000) e as bandas cortadas do gel. Em seguida, o gel foi
descorado com uma solução 1:1 de ferricianeto de potássio 30 mmol/L e tiossulfato
de sódio 100 mmol/L. Após a coloração ser removida, o gel foi lavado com água
Milli-Q e homogeneizado em água Milli-Q com um homogeneizador do tipo Potter-
Elvehjem. A amostra acima com um volume final de 1 mL foi misturada a 1 mL de
adjuvante de Freund completo (Sigma) e injetada no coelho como descrito no item
3.6.1.
3.9.5. Detecção imunológica de proteínas
Após SDS-PAGE (item 3.6.2), foi feita a transferência eletroforética da
proteína recombinante para a membrana de nitrocelulose em sistema semi-seco,
conforme descrito no item 3.6.3. As lavagens e incubações com diferentes
concentrações do anticorpo policlonal anti-gelsolina (G1-G3) em TBS-tween 20
(1:50, 1:100, 1:200 e 1:500) foram feitas de modo semelhante ao descrito em 3.6.3.
Em seguida, as membranas foram incubadas com o anticorpo secundário (anti-IgG
de coelho) (1:2000) diluído em TBS-tween 20, por 2 horas. As membranas de
nitrocelulose foram lavadas por 6 vezes de 10 minutos com TBST e então reveladas
com o método fornecido pelo kit Imobbilon Western Chemiluminescent HRP
substrate (Millipore). Nesse método a atividade enzimática da peroxidase leva a
emissão de luminescência que é detectada utilizando-se filmes específicos (Hyperfil-
ECL, Amersham) através de tempos de exposição de 5 a 30 minutos executada
conforme instruções do fabricante.
3.10. RNA interferente de gelsolina
Os RNAs dupla fita foram produzidos com o auxílio do kit T7Megascript
(Ambion), utilizando-se como template para a T7 RNA polimerase a região
codificante amplificada com iniciadores contendo a sequência do promotor T7. Os
iniciadores utilizados para a amplificação da transcriptase reversa foram:
SfRNAi_RV (5'-TAATACGACTCACTATAGGTTACCACCTTCCATGTATCT-3') e
SfRNAi_FW (5'-TAATACGACTCACTATAGATGGCGACACACGAGGCGTTC-3').
58
A reação de transcrição in vitro foi montada conforme manual fornecido pelo
fabricante, contendo água livre de nucleases, NTPs, 1 µg de DNA template, tampão
e T7 RNA polimerase. A reação é então incubada a 37°C durante seis horas e em
seguida é colocada sobre a bancada por 10 minutos para permitir o anelamento das
fitas complementares. A reação é então tratada com DNase para eliminar o DNA
template. O RNA de dupla fita foi purificado por extração com fenol/clorofórmio
seguido de precipitação com acetato de amônio.
Para a fabricação do dsRNA controle, foi utilizado um gene exógeno à S.
frugiperda, o Green fluorescence protein (GFP). Para a síntese deste dsRNA,
utilizou-se iniciadores desenhados a partir de uma construção de GFP (GFP_FW 5'
TAATACGACTCACTATAGGGAGAAGAACTTTTCACTGGAG 3' e GFP_RV
5'TAATACGACTCACTATAGATCCATGCCATGTGTAATCCC 3'). O dsRNA-gels e
dsRNA-gfp continham 300 pares de base (pb) e às suas sequências foi adicionada
uma região do promotor T7.
As injeções de 5µL de dsRNA-gels (10 µg), 5µL de dsRNA-gfp (10 µg) e 5µL
de água livre de nucleases em lagartas de S. frugiperda foram realizadas utilizando-
se uma microseringa Hamilton (1701LT). Após 3, 4 e 6 dias, o silenciamento do
gene alvo em S. frugiperda foi verificado através da quantificação de transcritos de
gelsolina por RT-PCR semi-quantitativa (item 3.5.9). O peso médio das lagartas
experimental e controle também foi analisado. O efeito do silenciamento na
ultraestura do epitélio do ventrículo foi averiguado após análises de microscopias
eletrônicas (item 3.3).
59
4. RESULTADOS
4.1. Preparação das amostras de vesículas microapócrinas, frações
subcelulares (P1 e P3) e obtenção de anticorpos
Com o objetivo de identificar proteínas relacionadas à secreção
microapócrina, amostras do material do fluido ectoperitrófico rico em vesículas
microapócrinas (VM) e frações subcelulares da região anterior do ventrículo (P1 e
P3) foram inicialmente preparadas.
As frações P1 e P3 foram utilizadas na tentativa de obter proteínas
relacionadas ao citoesqueleto microvilar que poderiam não estar representadas nas
vesículas microapócrinas, mesmo essas sendo revestidas por membranas
plasmáticas microvilares, uma vez que para a vesícula migrar no interior da
microvilosidade é necessário haver desorganização dos microfilamentos de actina
(Jordão et al., 1999). Essas duas frações foram escolhidas porque P1 apresenta a
maior quantidade de aminopeptidase (marcadora de membranas microvilares nesse
tecido) e P3 apresenta a maior atividade específica dessa enzima (Ferreira et al.,
1994).
A preparação de vesículas foi examinada em microscopia eletrônica (Figura
7), onde se verifica vesículas bem preservadas (Figura 7A) que apresentam
tamanhos (0,25 µm) semelhantes aos das vesículas que ocorrem no interior das
microvilosidades (Figura 7B).
Essas três preparações (VM, P1, P3) foram utilizadas separadamente para a
produção de anticorpos em coelhos.
60
A
B
Figura 7: Microscopia eletrônica de transmissão da preparação de VM e ápice de uma
célula intestinal da região anterior do ventrículo de S. frugiperda. As setas apontam
vesículas de secreção microapócrina: presentes no conteúdo do fluido ectoperitrófico (A) e
brotando de microvilosidades (B). Note que as vesículas microapócrinas em (A) e (B)
possuem tamanhos semelhantes. MV, microvilosidade
As amostras VM, P1 e P3 foram submetidas a uma eletroforese e o resultado
está apresentado na figura 8. Verificamos que as três amostras possuem ampla
variedade de proteínas de diferentes tamanhos.
As preparações VM, P1 e P3 foram utilizadas em imunizações de coelhos
para a produção de anticorpos anti-VM, anti-P1 e anti-P3, respectivamente. Para a
obtenção dos anticorpos foram realizadas três imunizações que totalizaram 7 mg de
proteínas para P1 e P3 e 9 mg para VM.
61
Para testar o reconhecimento das proteínas presentes nas preparações VM,
P1 e P3, estas foram submetidas a uma eletroforese em gel 12% de poliacrilamida e
em seguida transferidas para uma membrana de nitrocelulose e incubadas com os
seus respectivos anticorpos nas diluições 1:100, 1:200, 1:500 e 1:1000. Na figura 8,
os westerns blots após SDS-PAGE revelaram o reconhecimento da maioria das
proteínas presente em cada preparação pelos seus anticorpos feitos após a
detecção padrão com anti-IgG de coelho acoplado com peroxidase e revelado com
TBS contendo água oxigenada 0,075% e 4-cloro-naftol 0,1% previamente dissolvido
em metanol. O reconhecimento das proteínas das preparações VM, P1 e P3 pelos
seus respectivos anticorpos ocorreu em todas as diluições utilizadas (dados não
mostrados). Os soros pré-imunes dos coelhos utilizados na produção dos anticorpos
não reconheceram qualquer proteína nas diluições 1:100 e 1:200 (dados não
mostrados), atestando que antes da imunização nenhuma proteína/anticorpo dos
coelhos reconhecia as proteínas das preparações utilizadas. Grande parte das
proteínas com maior massa molecular são reconhecidas pelos anticorpos.
Resultados semelhantes foram obtidos por Ferreira et al. (2007).
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52,5
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Figura 8: Especificidade de anticorpos produzidos contra proteínas presentes em VM, P1 e
P3. (A) Western blot feito com anticorpos anti-VM (1) e detecção de proteínas das
preparações de VM após SDS-PAGE 12% (2). (B) Western blot feito com anticorpos anti-P1
(1) e detecção de proteínas das preparações de P1 após SDS-PAGE 12% (2) (C) Western
blot feito com anticorpos anti-P3 (1) e detecção de proteínas das preparações de P3 após
SDS-PAGE 12% (2). O reconhecimento das proteínas pelos anticorpos foi realizado após a
detecção padrão com anti-IgG de coelho acoplado com a peroxidase e revelado com TBS
contendo água oxigenada 0,075% e 4-cloro-naftol 1% previamente dissolvido em metanol.
70 µg de proteína foram aplicadas em cada raia. (P), padrão de massa molecular.
62
4.2. Enzimologia de vesículas microapócrinas
Vesículas microapócrinas já foram preparadas anteriormente, porém usando
diferentes faixas de centrifugação do fluido ectoperitrófico (Ferreira et al.,1994;
Bolognesi et al., 2001). Estes estudos mostraram que essas vesículas carregam
enzimas digestivas (como amilase, carboxipeptidase e tripsina), incluindo algumas
inseridas nas membranas microapócrinas (como a aminopeptidase) e peritrofina
(Ferreira et al., 1994; Bolognesi et al., 2001). Essas vesículas descarregam seus
conteúdos dentro do fluido ectoperitrófico que corresponde ao conteúdo luminal
entre o tecido e a MP e são incorporadas em parte dentro da porção gelatinosa da
MP, explicando assim a atividade enzimática ligada à MP (Ferreira et al., 1994;
Bolognesi et al., 2001).
Apesar de atividades específicas de diferentes enzimas já terem sido
determinadas anteriormente em tecidos intestinais, microvilosidades e conteúdos
intestinais, as condições eram diferentes, dificultando uma apropriada comparação
entre suas atividades específicas. Devido a isso, decidimos reinvestigar a
distribuição de enzimas nas vesículas microapócrinas.
Amostras de epitélio do ventrículo, microvilosidades, VM e conteúdo do
lúmen intestinal foram preparadas como descrito no item 3.2. Nessas amostras
foram determinadas as atividades específicas de aminopeptidase, amilase,
carboxipeptidase, tripsina, celobiase e maltase (Tabela 3).
A atividade específica de aminopeptidase é maior na microvilosidade, quando
comparada ao epitélio intestinal, e diminui nas VM e conteúdo da MP. Este
resultado indica que aminopeptidase é uma enzima microvilar que contamina as
VM.
As atividades específicas de amilase, carboxipeptidase e tripsina aumentam
gradualmente quando se compara epitélio do ventrículo, microvilosidades, VM e
conteúdo luminal. Isso favorece a hipótese que essas enzimas estão
verdadeiramente presentes nas VM, contaminando a microvilosidade e são
acumuladas no conteúdo da MP.
As atividades específicas de celobiase e maltase não estão enriquecidas (em
relação ao tecido intestinal) na microvilosidade nem no conteúdo da MP e suas
atividades nas VM são baixas. Esses resultados sugerem que estas enzimas são
secretadas por uma rota diferente do mecanismo microapócrino e que a maioria
63
delas está associada à superfície celular. Essa localização está de acordo com
aquela sugerida pela distribuição de suas atividades nas frações subcelulares
(Ferreira et al., 1994).
Tabela 3: Atividades específicas (mU/mg proteína) de enzimas digestivas em diferentes
amostras preparadas do intestino de S. frugiperda
Enzima Epitélio do
ventrículo Microvilosidades
Vesículas
microapócrinas
Conteúdo do
lúmen
intestinal
Aminopeptidase 600 ± 80 3500 ± 300 2100 ± 300 140 ± 10
Amilase 100 ± 15 400 ± 50 1100 ± 100 3100 ± 300*
Carboxipeptidase 33 ± 5 50 ± 10 70 ± 10 100 ± 20
Celobiase 30 ± 5 9,1 ± 0,9 3,5 ± 0,8 2,4 ± 0,2
Maltase 800± 100 400± 40 200± 20 47± 3
Tripsina 0,90 ± 0,06 5,9 ± 0,7 32 ± 8 80 ± 5
Dados são média e desvio padrão da média de determinações feitas em preparações
obtidas de 10 lagartas cada para epitélio do ventrículo e conteúdo do lúmen intestinal e 50
lagartas cada para microvilosidades e vesículas microapócrinas. (*) Ensaiada no sedimento
da centrifugação, onde a maior atividade é encontrada.
4.3. Pirosequenciamento de uma biblioteca de cDNA proveniente dos mRNAs
do IM de S. frugiperda
Pirosequenciamento é uma técnica eficiente que tem sido aplicada para a
análise do perfil de expressão gênica em tecidos específicos de insetos (Pauchet et
al., 2009b). Fizemos o pirosequenciamento dos transcritos proveniente do IM de S.
frugiperda, utilizando 200 ng de mRNA com alto grau de pureza e de boa qualidade.
O sequenciamento foi realizado como descrito no item 3.7.2, utilizando-se reagentes
da série titânio (GS-FLX Titanium Series Reagents) e o equipamento 454 Genome
Sequencer FLX (454 Life Sciences/Roche) instalado no laboratório CATG-USP. As
sequências obtidas foram submetidas ao programa Newbler (454 Life
Sciences/Roche) para uma montagem preliminar. Com o pirosequenciamento foram
obtidos 253,998 reads do IM. Os dados resultantes do transcriptoma estão
64
resumidos na tabela 4 e a distribuição do tamanho dos reads está apresentada na
figura 9.
Tabela 4: Resumo dos dados obtidos no pirosequenciamento da biblioteca de cDNA
obtida a partir dos mRNAs do IM de S. frugiperda
IM
Total de bases sequenciadas 91.768.684
Total de reads 253.998
Tamanho médio dos reads 361 pb
Tamanho do maior read 783 pb
Mediana do tamanho dos reads 392 pb
Total de contigs gerados pelo Newbler 3675
Figura 9: Distribuição do número de reads segundo seu tamanho em pb, obtida no
pirosequenciamento da biblioteca de cDNA do IM de S. frugiperda. O gráfico foi fornecido
diretamente pelo software do sequenciador 454 Life Sciences/Roche após o processamento
das imagens e conversão em sequências.
4.4. Identificação de proteínas microvilares intestinais de S. frugiperda
65
As VM que brotam das microvilosidades carregam proteínas microvilares.
Assim, é interessante separar quais das proteínas de VM vieram das
microvilosidades daquelas que efetivamente estão sendo secretadas por
mecanismos microapócrinos. Proteínas microvilares de S. frugiperda foram
identificadas anteriormente em nosso laboratório por Ferreira e colaboradores
(2007) através de varredura de biblioteca de cDNA com anticorpos contra
membranas microvilares purificadas, onde o citoesqueleto é removido. Apesar de
terem sido obtidas 137 sequências únicas, somente clusters com duas ou mais
sequências foram levados em consideração (com apenas uma exceção), resultando
em 27 sequências. A disponibilidade de dados de pirosequenciamento da biblioteca
de cDNA obtida a partir dos mRNAs do IM de S. frugiperda levou-nos a reanalisar
todas as sequências únicas obtidas naquele estudo. Os procedimentos usados para
obter, estender e anotar as sequências foram os mesmos descritos no item 3.8.
O resultado da reanálise gerou um total de 66 proteínas preditas que ocorrem
nessas membranas microvilares. Dessas, 18 foram consideradas como
contaminantes por serem típicas de mitocôndria ou de outra parte celular ou por
serem proteínas desconhecidas (Tabela 5). Concluindo, 48 proteínas foram
associadas às membranas microvilares, quase o dobro das 27 proteínas
microvilares identificadas por Ferreira e colaboradores (2007). Essas sequências
estão apresentadas na tabela 6.
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4.5. Identificação de proteínas presentes nas vesículas microapócrinas de
S. frugiperda
O anticorpo anti-VM foi usado para varrer uma biblioteca de expressão de
cDNA do intestino de S. frugiperda. O resultado esperado era que proteínas de
clones reconhecidas pelo anticorpo correspondessem a proteínas de VM. Essas
proteínas estão em fase de leitura com o gene da β-Galactosidase do plasmídeo p-
Bluescript onde estão clonadas, indicando que elas estão sendo expressas como
proteínas recombinantes na indução da biblioteca de cDNA com IPTG. O
sequenciamento correspondente a 500 clones positivos gerou ESTs que foram
submetidos a filtros de qualidade de sequência de nucleotídeos. Em seguida os
ESTs foram usados em um frame positivo para serem agrupados com o programa
CAP3, resultando em 51 contigs e 196 singlets. As sequências obtidas pela
varredura foram submetidas a BLASTN contra sequências de S. frugiperda
originadas do pirosequenciamento da biblioteca de cDNA obtida a partir dos mRNAs
do IM. Este procedimento levou à extensão de sequências microapócrinas. As
sequências microapócrinas que não tinham sequências homólogas entre aquelas
obtidas por pirosequenciamento foram descartadas e o mesmo foi feito para
proteínas que não tinham sequências similares no GenBank ou tinham muitos
códons de terminação preditos. As sequências microapócrinas aceitas foram
anotadas com o software dCas e submetidas a diversas ferramentas
computacionais.
No total 92 sequências únicas foram aceitas, das quais 50 sequências estão
listadas nas tabelas 7 e 8 e 42 sequências foram descartadas de análises
adicionais, porque elas foram consideradas contaminantes da preparação das VM
ou porque eram muito pequenas para serem identificadas com segurança (Tabela
9).
A tabela 7 apresenta as proteínas preditas que podem ser secretadas por
secreção microapócrina. Os critérios usados para selecionar estas proteínas foram:
(1) elas são encontradas nas VM; (2) apresentam peptídeo sinal predito e (3) elas
supostamente atuam no conteúdo luminal na digestão, mecanismo de
desintoxicação ou estão associadas com a MP. Duas sequências de proteína
dissulfeto isomerases (PDIs) foram incluídas nessa tabela porque, embora seu
papel seja desconhecido, elas podem estar envolvidas em processo de proteção ou
70
fusão de membranas. A tabela 8 mostra as proteínas que podem ser secretadas
pela secreção microapócrina pelos mesmos critérios que aqueles usados na tabela
6, mas para as quais não temos dados sobre a ocorrência de peptídeo sinal.
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76
4.6. Comparação das sequências presentes nas microvilosidades e
vesículas micrapócrinas
As proteínas preditas como presentes nas duas preparações podem ser
reunidas em 8 classes: enzimas digestivas, proteínas de MP, envolvidas com
proteção, receptores, transportadores, proteínas da maquinaria secretória, proteínas
de citoesqueleto e proteínas de função desconhecida nesse compartimento celular
(Figura 10 e Tabelas 6, 7 e 8).
Na figura 10 está representada a porcentagem do número de sequências
encontrada em cada classe em cada uma das preparações. Podemos ver que a
composição das duas preparações no que se refere a classes de enzimas é muito
semelhante. Em ambas há um predomínio de sequências de enzimas digestivas (o
que se acentua nas vesículas microapócrinas). As outras classes predominantes na
preparação de membranas microvilares são as proteínas da MP e proteínas
envolvidas com proteção. A quantidade de sequências relacionadas à MP é menor
nas vesículas do que nas membranas microvilares, e nas vesículas acentua-se o
número de transportadores que são principalmente ATPases que devem estar
regulando a concentração de íons (tais como H+) no interior das vesículas.
Como as enzimas digestivas são a classe de proteínas amplamente
predominantes nas duas preparações, nós analisamos a porcentagem de
sequências diferentes de cada enzima digestiva encontrada nas preparações de
membranas microvilares e de vesículas microapócrinas (Figura 10).
77
Classes
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Abundância relativa de sequências
VMMM
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Figura 10: Porcentagem de sequências diferentes encontradas em membranas microvilares
(MM), ou vesículas microapócrinas (VM). As sequências foram separadas em classes
funcionais e dentro da classe de enzimas digestivas, nos diferentes tipos de enzimas. C,
citoesqueleto; ED, enzimas digestivas; MP, membrana peritrófica; PRO, proteção; REC,
receptor; MS, maquinaria secretória; TRA, transportador; DES, desconhecida; AMI, amilase;
AAC, aminoacilase; ANP, aminopeptidase; AST, astacina; CCE, carboxil-colina esterase;
CAR, carboxipeptidase; QUI, quimotripsina; DIP, dipeptidase; ECT, ectonuclease, LIPG,
lipase gástrica; GLI, glicosídeo hidrolase; LIPI lipase inativa; LIP, lipasse; SER, serina
proteinase; ESF, esfingosina fosfodiesterase; AMIT, amilase semelhante a transportador de
aminoácido; TRI, tripsina.
Essa distribuição apresentou diferenças maiores, sendo que algumas
enzimas pouco representadas aparecem em uma ou na outra preparação (ver
tabelas 6, 7 e 8) e não serão comentadas aqui. As microvilosidades apresentam
uma predominância de aminopeptidases (32%), seguida de carboxipeptidase (18%),
enquanto que nas VM o maior número de sequências encontrado foi de lipases
(20%) que não são detectadas nas membranas microvilares. Além das lipases, as
VM apresentam um número expressivo de sequências de aminopeptidases (16,7%),
carboxipeptidases (10%) e serina proteinases (10%).
78
É interessante notar que enzimas responsáveis pela digestão de proteínas
são as predominantes. Isso deve refletir o fato de enzimas responsáveis pela
digestão de outra classe de compostos, tais como carboidratos, não estão presentes
predominantemente nas membranas microvilares nem são secretadas
majoritariamente pela rota microapócrina.
4.7. Comparação de algumas sequências selecionadas de enzimas digestivas
Seis aminopeptidases têm sequências completas o suficiente para serem
comparadas com sequências pertencentes a diferentes classes identificadas em
outros lepidópteros (Angelucci et al., 2008). As sequências de S. frugiperda estão
agrupadas nas classes 1, 2, 3, 5 e 6, das quais SfAPN546 (classe 1) é a mais
expressa (3701 reads). SfAPN591 não forma um ramo com nenhuma classe de
aminopeptidase conhecida (Figura 11).
As aminopeptidases presentes nas membranas microvilares podem ser
enquadradas nas classes 1, 3, 5 e 6 das aminopeptidases de Lepidoptera, enquanto
as aminopeptidases das vesículas estão presentes na classe 2 ou não puderam ser
classificadas porque no cladograma elas não se agrupam a nenhuma sequência.
Existem 3 sequências de amilase que estão completas (contigs 420 e 438) ou
estão incompletas, mas todas têm os resíduos críticos para sua atividade (resíduos
catalíticos e resíduos ligantes de Ca++) (contig 509). Sfamy420 é encontrada junto
com outras amilases de lepidópteros no cladograma, enquanto que os contigs 438 e
509 formam um ramo diferente com a sequência NP_001182391-1 de Bombyx mori
e um transportador de aminoácido (Figura 12). Proteínas de mamíferos envolvidas
no transporte de aminoácidos têm similaridade com proteínas da família α-amilase
(família 13 das glicosídeo-hidrolases) (Janecek et al., 1997). Não está claro o papel
fisiológico dessas amilases semelhantes aos transportadores de aminoácidos em
Spodoptera frugiperda.
As sequências de lipase ausentes do cladograma são: uma sequência que
não tem a serina catalítica (contig 287) e uma sequência muito curta (contig 516).
Seis sequências de lipases de S. frugiperda formam dois grupos monofiléticos
(bootstrap 58 e 99) que são similares a lipases pancreáticas (Figura 13). A
semelhança com lipases pancreáticas é reforçada pelo fato dos contigs 452, 456 e
448 terem a mesma sequência consenso na região do sítio ativo (GXSLGAH). Os
79
contigs 549, 379 e 584 têm uma região consenso similar, mas não idêntica, com
aquela apresentada pela lipase pancreática. O contig 379 tem uma alça
transmembrana predita, cujo significado ainda não está claro. O contig 456 pode ser
uma proteína citoplasmática contaminando as VM, uma vez que ela está completa e
não possui um peptídeo sinal. O contig 673 forma um ramo com uma lipase gástrica
humana (GHL na figura 13).
As carboxipeptidases digestivas encontradas em insetos ou outros
organismos tais como mamíferos são metalocarboxipeptidases da família M14. Elas
são classificadas em carboxipeptidases A e B. A especificidade primária das
carboxipeptidases A e B é determinada pela interação do resíduo localizado na
extremidade carbóxi-terminal do substrato com a bolsa de especificidade presente
na enzima, a qual tem o aminoácido 255 (numeração da carboxipeptidase A1
humana) no fundo (Titani et al., 1975).
Nas carboxipeptidases do tipo A, o resíduo C-terminal do substrato é
hidrofóbico ou aromático, nas carboxipeptidases do tipo B ele é básico. Em
Helicoverpa armigera Bown e Gatehouse (2004) descreveram uma
metalocarboxipeptidase que atua principalmente em Glu no carboxi-terminal, tendo
uma pequena atividade quando esse resíduo é um Asp. Essa enzima tem uma Arg
no sítio de especificidade. Os autores comentam que a melhor nomenclatura para
essa enzima seria carboxipeptidase C, para enfatizar sua semelhança com as
carboxipeptidases A e B, mas como essa denominação já é usada para uma
subclasse de serina carboxipeptidases, a melhor alternativa seria “Glu
carboxipeptidase MC”, sendo MC o clã ao qual essa enzima pertence (Rawlings et
al., 2012).
Alinhamentos não mostrados permitiram classificar as carboxipeptidases
presentes nas membranas microvilares como sendo tipo A (contigs 418 e 393), do
tipo B (contig 480) e do tipo MC (contig 492). As vesículas apresentam uma
carboxipeptidase tipo A (contig 710), uma tipo B (contig 480, o mesmo presente nas
microvilosidades) e uma carboxipeptidase da família S28, que provavelmente não é
digestiva (contig 577).
80
Figura 11: Cladograma (neighbor joining) de sequências de aminopeptidases de S.
frugiperda (identificadas como SfAPN mais um número do contig) e outros lepidópteros . Os
ramos correspondendo a separações em menos que 50% das réplicas (10000) foram
colapsados. As sequências de Helicoverpa armigera, Spodoptera exigua, e Spodoptera
litura são: Haclass1 AAL34109, Haclass2 HaAAW72993, Haclass3 AAL14117, Haclass4
AAP37950, Haclass5 AAK85539, HaClass6 Eu328183, Haclass7 Eu328183, Seclass1
AAP44964, Seclass2, AAP44965, Seclass3 AAP44966, Seclass4 AAP44967, Slclass4
AAK69605.
81
Figura 12: Cladograma (neighbor joining) de sequências de amilase de S. frugiperda
(identificadas como SfAmy mais um número de contig) e outros lepidópteros, um
transportador de aminoácido (aatransporter AAB26524) e um transportador de ácido
orgânico (oatransporter CAB77184). Os ramos correspondendo a divisões em menos que
50% das réplicas (10000) foram colapsados. As outras sequências são: Bombyx mori
BmAmy ACT64133.1, BmNP001182391.1; Diatraea saccharalis DsAmy1 AAP92665.1,
DsAmy2 AAP97393.1, DsAmy3 AAP97394.1; Helicoverpa armigera HaAmy1 ABU98614.1,
HaAmy2 ABU98613.1.
Figura 13: Cladograma (neighbor joining) de sequências de lipases de S. frugiperda
(identificadas como SfLip mais o número do contig) e sequências similares. Os ramos
correspondendo a divisões em menos que 50% das réplicas (10000) foram colapsados.
GHL, lipase gástrica de Homo sapiens; GPLRP2, galactolipase de Cavia porcellus, proteína
relacionada a lipase pancreática, HPL, lipase pancreática de Homo sapiens; DolmA1,
fosfolipase 1 de Dolichovespula maculate.
82
4.8. Sequências de proteínas que poderiam estar relacionadas ao mecanismo
da secreção microapócrina
Ao mesmo tempo que era feita a varredura com anticorpo contra vesículas
microvilares, nós decidimos utilizar anticorpos gerados contra duas frações
subcelulares (P1 e P3), que continham grande quantidade de membranas
microvilares para fazer varreduras semelhantes. Nosso intuito era conseguir o maior
número possível de proteínas de citoesqueleto ou proteínas envolvidas no processo
de secreção microapócrina.
As preparações feitas anteriormente (Ferreira et al., 2007) utilizaram
membranas microvilares purificadas submetidas a tratamento para remover
citoesqueleto e nós não sabíamos se as VM que nós coletamos do lúmen
apresentariam essas proteínas em grande quantidade.
Na época que esses experimentos foram feitos, não dispúnhamos ainda das
sequências geradas pelo pirosequenciamento e somente depois esses dados foram
utilizados para comparar com as sequências obtidas após a varredura,
completando-as ou aumentando sua sequência.
No que se refere a proteínas componentes de citoesqueleto ou maquinaria
secretória, somente uma sequência parcial de miosina VI foi encontrada. Miosina VI
foi primeiro descoberta em Drosophila como uma proteína ligante de actina sensível
a ATP (Kellerman e Miller, 1992). Miosina VI, diferente de quase todas as outras
miosinas, move-se em direção a extremidade “menos” de filamentos de actina e
está relacionada a uma variedade de processos intracelulares, tais como tráfico de
membrana vesicular, migração celular e mitose (Buss et al., 2004).
No que se refere a enzimas digestivas, várias foram detectadas nas outras
varreduras, mas uma sequência parcial de β-1,3-glucanase foi detectada somente
na varredura com o anticorpo anti-P1. A sequência de nucleotídeos correspondente
a essa enzima foi previamente sequenciada e estudada pelo nosso grupo (Bragatto
et al., 2010).
As proteínas que poderiam estar envolvidas no processo microapócrino
encontradas nas varreduras foram: anexina, cofilina, fimbrina, gelsolina-1, miosina
VI e PDIs (1 e 2). Procuramos também no Spodobase
(http://bioweb.ensam.inra.fr/spodobase/) sequências de proteínas preditas que
83
pudessem ter papel na secreção, baseado em pesquisas na literatura. Essas
sequências estão apresentadas na tabela 10.
A sequência completa de nucleotídeos correspondente a anexina tinha sido
obtida anteriormente por nosso grupo usando iniciadores específicos. Como nós
ainda não havíamos realizado o pirosequenciamento, utilizamos iniciadores
específicos para também obter as sequências das PDIs (1 e 2), fimbrina, cofilina,
miosina I e gelsolina-1. Nosso intuito era conseguir todas as sequências completas,
expressá-las em bactéria ou levedura para produção de anticorpos que seriam
utilizados em imunocitolocalização. Também gostaríamos de obter o silenciamento
da expressão de cada uma delas com RNA interferente.
A seguir faremos uma breve apresentação das proteínas que tiveram suas
sequências de nucleotídeos obtidas após sequenciamento dos cDNAs
correspondentes, usando iniciadores específicos desenhados a partir de sequências
parciais obtidas nas varreduras de biblioteca de cDNA (PDI-1, PDI-2, fimbrina,
cofilina e gelsolina) ou no Spodobase (miosina I).
Tabela 10: Proteínas preditas que podem estar envolvidas na maquinaria de
secreção microapócrina de secreção microapócrina selecionadas como candidatas a
partir de pesquisa na literatura e encontradas no Spodobase
(http://bioweb.ensam.inra.fr/spodobase/)
Acesso no GenBank
Acesso no Spodobase
Reads PS AT GPI N-gli O-gli Proteína predita
Obs.
Sf2M09970-5-1 8 N N N S S Arp 2/3 Completa
EF071985 Sf2L00914-5-1 134 N N N N N Moesina Completa
Sf2M00173-5-1 180 N N N S S Miosina I Completa
JX087453 Sf1M08205-5-1 195 N N N S N Profilina Completa
Sf1P09723-5-1 0 - - - S S Gelsolina 2 −
PS, peptídeo sinal; AT, alça transmembrana; GPI, âncora de glicosilfosfatidilinositol; N-gli,
N-glicosilação predita; O-gli, O-glicosilação predita; S, encontrado; N, não encontrado; (−)
a sequência está incompleta.
84
4.8.1. Proteína dissulfeto isomerase (PDI)
Encontramos duas PDIs nas varreduras realizadas nesse trabalho, que
denominamos PDI-1 e PDI-2. A PDI-1 foi encontrada em preparações de VM e
microvilosidades e a PDI-2 foi encontrada somente na preparação de VM. Uma
comparação da arquitetura dessas duas proteínas com as humanas mostra que elas
são mais semelhantes à PDI e a ERp57 (Ellgaard e Ruddock, 2005), pois todas elas
possuem 2 domínios catalíticos (a e a’) separados por 2 domínios não catalíticos (b
e b’) e não possuem sítios de glicosilação (ver figura 14 e 15). Cada um dos
domínios catalíticos possui um sítio ativo com o motivo WCGHCK (Wallis et al.,
2009), sendo que os dois aminoácidos que existem entre os dois resíduos de
cisteína possuem um papel importante na determinação do potencial redox da
enzima e consequentemente na sua função como tiol-dissulfeto redutase, oxidase
ou isomerase (Ellgaard e Ruddock, 2005).
Conforme comentado na introdução, a PDI pode estar envolvida em
processos de fusão de membranas. Uma vez que inúmeras fusões de membrana
ocorrem nas membranas microvilares de S. frugiperda, devido à secreção
microapócrina, talvez essa proteína tenha o papel de possibilitar ou facilitar essas
fusões. É interessante ressaltar que a PDI deve apresentar papel importante nas
microvilosidades, pelo menos em Lepidoptera. Além das duas PDIs que
encontramos em S. frugiperda, uma PDI foi encontrada nas microvilosidades das
células intestinais de Manduca sexta (Pauchet et al., 2009a).
Nas figuras 14 e 15 estão apresentadas as sequências das PDI-1 e PDI-2
respectivamente e na figura 16 as duas sequências são comparadas. A tabela 11
apresenta as proteínas com as quais elas apresentam maiores identidades e
similaridades após a realização de um BLASTP
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
85
1 atgttggggtcactaaaaattgttttattattaggtgtaatttatttatgtagagctgcc 60
1 M L G S L K I V L L L G V I Y L C R A A 20
61 gaagaagatgtattggatcttacagattccgacttttcgtcggtgttgagccaacatgat 120
21 E E D V L D L T D S D F S S V L S Q H D 40
121 actgctcttgtcatgttttacgcaccatggtgcggtcattgtaagagatcgaagccggag 180
41 T A L V M F Y A P W C G H C K R S K P E 60
181 tacgcggtagcggccggcgtgctaaagaacgatgaccctcctgtcgcgctggcgaaggta 240
61 Y A V A A G V L K N D D P P V A L A K V 80
241 gactgtaccgagggtggcaagagcacatgtgagcagttctcagtgtctgggtaccccaca 300
81 D C T E G G K S T C E Q F S V S G Y P T 100
301 ctgaagatcttcagaaagggagaagtttcccaggagtacaatggccccagggaatcaaac 360
101 L K I F R K G E V S Q E Y N G P R E S N 120
361 ggcattgtgaaatacatgcgtgctcaagtcgggcccagctctaaggaactgaagactgtt 420
121 G I V K Y M R A Q V G P S S K E L K T V 140
421 gctgattacgaagcattcctgaagaaggatgaggtgctcgtcatcggcttcttcgagaag 480
141 A D Y E A F L K K D E V L V I G F F E K 160
481 gagactgatctcaagggtgatttcgttaagactgctgacaagatgcgcgaagaagtcacc 540
161 E T D L K G D F V K T A D K M R E E V T 180
541 tttgcacacacttctgctaaggaggtccttgacaaggctggatacaagaacgacgttgta 600
181 F A H T S A K E V L D K A G Y K N D V V 200
601 ttgttccgtcccaaacgcctgcagaacaagtttgaagactcgtccgtcgtgtacaaggga 660
201 L F R P K R L Q N K F E D S S V V Y K G 220
661 gagcctgagacctactcactcaaggctttcatcaaggagaacttccacggtctggtcggc 720
221 E P E T Y S L K A F I K E N F H G L V G 240
721 atccgccagaaggacaacatccgtgacttcaccgatcccctggtggtcgcctactatgat 780
241 I R Q K D N I R D F T D P L V V A Y Y D 260
781 gtggactacgtcaagaaccccaagggcacaaactactggaggaaccgtgtgctcaaagtt 840
261 V D Y V K N P K G T N Y W R N R V L K V 280
841 gccaaggaacagacagaggttacgttcacagtgagcgacaaggacgacttcacccacgaa 900
281 A K E Q T E V T F T V S D K D D F T H E 300
901 ctgaatgagtatggcattgactacgccaagggtgacaagccagtcgtcgccggccgtgac 960
301 L N E Y G I D Y A K G D K P V V A G R D 320
961 gctgatggcaacaagtttgtcatgtccaccgagttcagcattgaaaacctgttggccttc 1020
321 A D G N K F V M S T E F S I E N L L A F 340
1021 acaaaggatctgctggacggtaaattggagcctttcgtcaagtctgagcctgtacctgag 1080
341 T K D L L D G K L E P F V K S E P V P E 360
1081 agcaacgacggaccagtgaaggtagctgtcggcaagaacttcaaggagctggtcaccgac 1140
361 S N D G P V K V A V G K N F K E L V T D 380
1141 agtggacgtgatgccctcatcgagttctacgccccatggtgcggacattgccagaaactc 1200
381 S G R D A L I E F Y A P W C G H C Q K L 400
1201 gctccagtgtgggacgagcttggtgaaaagctcaaggacgaggctgtggacatcgtgaag 1260
401 A P V W D E L G E K L K D E A V D I V K 420
1261 atcgacgctaccgccaacgactggcccaagtcgcagttcgacgtgtctggtttccccacc 1320
421 I D A T A N D W P K S Q F D V S G F P T 440
1321 atctactggaaacccgctgacaactccaagaaacccgtcagatacaatggtggccgtgct 1380
441 I Y W K P A D N S K K P V R Y N G G R A 460
1381 ctcgaaaatttcgtcaagtatgtagctgaacaagcttccagcgagctcaacggctgggac 1440
461 L E N F V K Y V A E Q A S S E L N G W D 480
1441 agaaagggcaagccaaagaaggaagagctctaa 1473
481 R K G K P K K E E L - 490
a b b’ a’N C
Figura 14: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da PDI-1 de S. frugiperda.
Os domínios tiorredoxina de PDI (a, b, b’, a’) estão destacados por cores em (A) e
correspondem ao diagrama dos domínios da sequência em (B). O motivo WCGHCK do sítio
ativo está representado em (A) com caixa preta e em (B) com pontas de setas pretas. A
arginina catalítica está marcada em (A) com caixa vermelha e em (B) com ponta de seta
vermelha. O sinal de residência no RE está destacado em (A) com caixa descontínua. O
códon de terminação está em itálico.
A B
n
B B
n
86
1 atgagagtaatcttatttacggcgatagcccttttgggcgccgctttggctgatgaaata 60
1 M R V I L F T A I A L L G A A L A D E I 20
61 cccacagaagaaaatgtactcgtgctgagcaaatccaacttcgacggtgcaatctcatca 120
21 P T E E N V L V L S K S N F D G A I S S 40
121 aacaacttcattttagttgaatctatgcgccatggtgcggtcactgcaagtccctcgct 180
41 N N F I L V E F Y A P W C G H C K S L A 60
181 ccggaatacgccaaggctgccaccaaattggcggaagaagagtcctccatcaagttggcc 240
61 P E Y A K A A T K L A E E E S S I K L A 80
241 aaggtagatgccacgcaagaacaagagctcgctgagagctacggcgtcaggggatacccg 300
81 K V D A T Q E Q E L A E S Y G V R G Y P 100
301 actctgaagttcttcaggaacggcagccctattgattacacaggtggtcgccaggctgat 360
101 T L K F F R N G S P I D Y T G G R Q A D 120
361 gacatcatcacttggctgaagaagaagaccggtcctcctgctgttgaagtgtcatctgct 420
121 D I I T W L K K K T G P P A V E V S S A 140
421 gagcaagccaaggagctcattgctgccaacaatgtcatcatcttcggtttcttctctgac 480
141 E Q A K E L I A A N N V I I F G F F S D 160
481 tccaacactgctaaagccaacaccttcacaagtgtagccagtgctgttgatgaccatgtc 540
161 S N T A K A N T F T S V A S A V D D H V 180
541 tttgccttggtctctgaccctaaagttattactgaactggaagctgaagccaagtgcgga 600
181 F A L V S D P K V I T E L E A E A K C G 200
601 tcgatcgtgctctacaagaacttcgaagagcccagcgtgaagtatgatgctgagaaattc 660
201 S I V L Y K N F E E P S V K Y D A E K F 220
661 gacgaggacctgttcaagacctgggtgttcgtccagagcatgcccaccattgtggagttc 720
221 D E D L F K T W V F V Q S M P T I V E F 240
721 tcccacgagaccgcctccaagatcttcggtggccagatcaaataccaccttctgttgttc 780
241 S H E T A S K I F G G Q I K Y H L L L F 260
781 ctgtccaagaaaaatggcgatttcgacaagtacactgaggagctcaagcccgttgccaag 840
261 L S K K N G D F D K Y T E E L K P V A K 280
841 aactaccgtgacagggttatgtccgtcgccattgacgctgacgaagatgaacaccagaga 900
281 N Y R D R V M S V A I D A D E D E H Q R 300
901 atccttgagttcttcggcatgaagaaggaggagattccctctgcccgcctgattgccctg 960
301 I L E F F G M K K E E I P S A R L I A L 320
961 gaacaggacatggccaaatacaagcccactagcgacgaactttctgccaactccattgag 1020
321 E Q D M A K Y K P T S D E L S A N S I E 340
1021 gaattcatccagtcattcttcgctggtaccctgaagcagcacttgttgagcgaggacctg 1080
341 E F I Q S F F A G T L K Q H L L S E D L 360
1081 cccgccgactgggccgccaagcccgtcaagaccctggtcgccaccaacttcgatgaagtc 1140
361 P A D W A A K P V K T L V A T N F D E V 380
1141 gtcttcgacaacagcaagaaggtcctcgttgaattctatgccccatggtgcggtcactgc 1200
381 V F D N S K K V L V E F Y A P W C G H C 400
1201 aagcagttggctcctatctacgacaagttgggagagcacttcgagaaggacgatgacgtc 1260
401 K Q L A P I Y D K L G E H F E K D D D V 420
1261 atcatcgccaagatggacgccaccgccaacgagctggaacacaccaagatcacctccttc 1320
421 I I A K M D A T A N E L E H T K I T S F 440
1321 cccaccatcaaactgtacactaaggacaaccaggtgaaagactacaacggcgagagaacg 1380
441 P T I K L Y T K D N Q V K D Y N G E R T 460
1381 ttggcagctatgaccaagttcgtagagaccgatggtgaaggcgccgagcctacacctagt 1440
461 L A A M T K F V E T D G E G A E P T P S 480
1441 gtgagcgaggaggatgaagaagacgaacagccatccagagacgagttataa 1491
481 V S E E D E E D E Q P S R D E L - 496
a b b’ a’N C
Figura 15: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da PDI-2 de S. frugiperda.
Os domínios tiorredoxinas de PDI (a, b, b’, a’) estão destacados por cores em (A) e
correspondem ao diagrama dos domínios da sequência em (B). O motivo WCGHCK do sítio
ativo está representado em (A) com caixa preta e em (B) com pontas de setas pretas. A
arginina catalítica está marcada em (A) com caixa vermelha e em (B) com ponta de seta
vermelha. O sinal de residência no RE está destacado em (A) com caixa descontínua. O
códon de terminação está em itálico.
B B
n
A B
n
87
Tabela 11: Identidades e similaridades das sequências de PDI-1 e PDI-2 de S.
frugiperda com PDIs presentes em outros insetos
Proteína Organismo % Identidade % Similaridade Número de
acesso (Bank)
Bombyx mori 426/492 (87%) 460/492 (93%) BAD93613.1
Bombyx mori 425/492 (86%) 459/492 (93%) BAD93614.1
PDI-1 Danaus plexippus 410/490 (84%) 454/490 (93%) EHJ76798.1
Papilio xuthus 401/490 (82%) 447/490 (91%) BAM17874.1
Tribolium castaneum 314/488 (64%) 383/488 (78%) EFA11421.1
Papilio xuthus 382/448 (85%) 414/448 (92%) BAM17793.1
Papilio polytes 379/448 (85%) 413/448 (92%) BAM18927.1
PDI-2 Bombyx mori 372/448 (83%) 408/448 (91%) AAG45936.1
Danaus plexippus 352/448 (79%) 395/448 (88%) EHJ68070.1
Culex quinquefasciatus 269/449 (60%) 341/449 (76%) EDS26398.1
Comparando a sequência das duas enzimas de S. frugiperda com as
proteínas humanas, verificamos que a PDI-2 tem maior identidade e similaridade
com a PDI humana do que com a ERp57 humana, sendo que o oposto é verdadeiro
para a PDI-1 (ver tabela 12). É interessante ressaltar que as proteínas de S.
frugiperda têm menor identidade (32%) e similaridade (49%) entre si do que com
uma das proteínas humanas. O mesmo é verdadeiro quando se compara as duas
proteínas humanas, que apresentam 32% de identidade e 54% de similaridade entre
si. O alinhamento das duas sequências de PDIs confirma que elas possuem baixa
similaridade entre si (Figura 16).
A proteína ERp57 com a qual a PDI-1 de S. frugiperda detectada na
membrana apresenta maior identidade, interage com proteínas glicosiladas
secretadas e com proteínas de membrana (Wilkinson e Gilbert, 2004). A proteína
ERp60 (também referida como ERp57, ver Coe e Michalak, 2010) foi detectada em
C. elegans e ela tem atividade de transglutaminase que faz ligações cruzadas entre
Gln e Lys, criando estabilidade tecidual na cutícula desses nematóides (Eschenlauer
e Page, 2003). Embora a detecção de alguns membros da família PDI na superfície
celular esteja cada vez mais frequente seu mecanismo de secreção, sua interação
com a membrana e sua função nessa região ainda não estão completamente
esclarecidos e precisam de um estudo mais detalhado. Como a ERp57 pode ligar
porções glicosiladas de proteínas (Wilkinson e Gilbert, 2004) e pode ser encontrada
em rafts na membrana plasmática (Turano et al., 2002), talvez seu processo de
88
secreção, sua localização e seu papel seja semelhante a da galectina, uma lectina
responsável pelo direcionamento de algumas proteínas para a membrana microvilar
intestinal de mamíferos. É interessante notar que a galectina é uma proteína
secretada sem um sinal para a translocação através da membrana, indicando que
ela é secretada por um mecanismo não clássico de secreção (ver Braccia et al.,
2003).
Tabela 12: Identidades e similaridades das PDIs de S. frugiperda e humanos
PDI humana
ERp57 humana
% Identidade % Similaridade %
Identidade % Similaridade
PDI-1 36 53
46 64 PDI-2 51 70 35 53
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
PDI-1 1 --MLGSLKIVLLLGVIYLCRAAEEDVLDLTDSDFSSVLSQHDTALVMFYAPWCGHCKRSK 58
PDI-2 1 MRVILFTAIALLGAALADEIPTEENVLVLSKSNFDGAISSNNFILVEFYAPWCGHCKSLA 60
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
PDI-1 59 PEYAVAAGVLKNDDPPVALAKVDCTEGGKSTCEQFSVSGYPTLKIFRKGEVSQEYNGPRE 118
PDI-2 61 PEYAKAATKLAEEESSIKLAKVDATQE-QELAESYGVRGYPTLKFFRNG-SPIDYTGGRQ 118
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
PDI-1 119 SNGIVKYMRAQVGPSSKELKTVADYEAFLKKDEVLVIGFFEKETDLKGDFVKTADKMREE 178
PDI-2 119 ADDIITWLKKKTGPPAVEVSSAEQAKELIAANNVIIFGFFSDSNTAKANTFTSVASAVDD 178
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
PDI-1 179 VTFAHTSAKEVLDKAGYKNDVVLFRPKRLQNKFEDSSVVYKGE--PETYSLKAFIKENFH 236
PDI-2 179 HVFALVSDPKVITEL---EAEAKCGSIVLYKNFEEPSVKYDAEKFDEDLFKTWVFVQSMP 235
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
PDI-1 237 GLVGIRQKDNIRDFTDPLVVAYYDVDYVKNPKGTNYWRNR--VLKVAKEQTEVTFTVSDK 294
PDI-2 236 TIVEFSHETASKIFGGQIKYHLLLFLSKKNGDFDKYTEELKPVAKNYRDRVMSVAIDADE 295
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
PDI-1 295 DDFTHELNEYGIDYAKGDKPVVAGRDADGNKFVMS-TEFSIENLLAFTKDLLDGKLEPFV 353
PDI-2 296 DEHQRILEFFGMKKEEIPSARLIALEQDMAKYKPTSDELSANSIEEFIQSFFAGTLKQHL 355
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
PDI-1 354 KSEPVPESNDG-PVKVAVGKNFKELVTDSGRDALIEFYAPWCGHCQKLAPVWDELGEKLK 411
PDI-2 356 LSEDLPADWAAKPVKTLVATNFDEVVFDNSKKVLVEFYAPWCGHCKQLAPIYDKLGEHFE 415
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
PDI-1 412 -DEAVDIVKIDATANDWPKSQFDVSGFPTIYWKPADNSKKPVRYNGGRALENFVKYVAEQ 471
PDI-2 416 KDDDVIIAKMDATANELEHT--KITSFPTIKLYTKDNQVK--DYNGERTLAAMTKFVETD 471
....|....|....|....|....|
PDI-1 472 AS------SELNGWDRKGKPKKEEL 490
PDI-2 472 GEGAEPTPSVSEEDEEDEQPSRDEL 496
Figura 16: Alinhamento de sequências de aminoácidos de duas PDIs de S. frugiperda. PDI-
1 foi encontrada nas preparações de VM e de membranas microvilares, enquanto que a
PDI-2 foi encontrada somente na preparação de VM. Caixas pretas referem-se a resíduos
idênticos, e caixas cinzas representam resíduos com cadeias laterais semelhantes. Os
alinhamentos foram feitos usando o CLUSTALW dentro do Programa Expasy
(http://expasy.org/tools/).
89
4.8.2. Fimbrina
A sequência de fimbrina foi encontrada na varredura usando anticorpo contra
preparação de membranas microvilares. Devido a suas propriedades, a fimbrina
auxilia na organização do citoesqueleto no interior das microvilosidades e poderia
estar implicada nas propriedades particulares apresentadas por essa estrutura no
ventrículo anterior de S. frugiperda. A figura 17 mostra a sequência de nucleotídeos
e a sua sequência deduzida de aminoácidos que possui 666 resíduos e apresenta
todos os 4 domínios CH que formam 2 ABDs, além do headpiece N-terminal. A
tabela 13 apresenta as proteínas com as quais a fimbrina de S. frugiperda apresenta
maiores identidades e similaridades após a realização de um BLASTP
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
1 atggcagataattcaaaattgaccgacgaggagagggctgagatcagggagcagtttgag 60
1 M A D N S K L T D E E R A E I R E Q F E 20
61 cagttggacacaaacagcagcggttatatcgacctgaaagaattgaaagaagcactcgac 120
21 Q L D T N S S G Y I D L K E L K E A L D 40
121 agtgtcggatacaaaattccacaatggaaggtccggtgtatgatcgaggagtactacgac 180
41 S V G Y K I P Q W K V R C M I E E Y Y D 60
181 aatggcaacaagcgcggtgtcaacggcagcatgaatggagacgccaggaagaatgccatc 240
61 N G N K R G V N G S M N G D A R K N A I 80
241 agtctcaccgagttcgaggagctttgcgctaaccttaaagcacaacaggtgtccagcacg 300
81 S L T E F E E L C A N L K A Q Q V S S T 100
301 ttcaaacaggcggtcagtaaaaaggagaacctggaacacttgggcggtatgagcgaagcc 360
101 F K Q A V S K K E N L E H L G G M S E A 120
361 tccagtgatggcacaactcactcggttcgacttgaggagcagatggcgttctctggctgg 420
121 S S D G T T H S V R L E E Q M A F S G W 140
421 ataaacagcaacctggaacacgaccccgacctgaagcacctgctgcccatagaccacgag 480
141 I N S N L E H D P D L K H L L P I D H E 160
481 gggaagcagctgtatgagaagctgaaagacggtctcatattatgtaaagtgataaaccac 540
161 G K Q L Y E K L K D G L I L C K V I N H 180
541 tcgtgccccgacacgatagacgagcgtgccatcaacaacaagaacctgactctgtacacg 600
181 S C P D T I D E R A I N N K N L T L Y T 200
601 aagcacgagaacctcacgctggcgctcgtctcctcgcaggctatcggctgcagtatcgtc 660
201 K H E N L T L A L V S S Q A I G C S I V 220
661 aatattgatgctcatgatttggctaaaggcaaacctcacttggtgttgggtctgctgtgg 720
221 N I D A H D L A K G K P H L V L G L L W 240
721 cagatcatccgaatcggtttgttcaaccagatcacattggaacactgccccggtcttact 780
241 Q I I R I G L F N Q I T L E H C P G L T 260
781 gagctgctcaatgaccaggaacgcatcgaggacctgctggcactgtcaccagaggcgatc 840
261 E L L N D Q E R I E D L L A L S P E A I 280
841 ctgctgcgctgggtgaaccaccagctgcagagcgccggcgtcacgcgccgctgcaccaac 900
281 L L R W V N H Q L Q S A G V T R R C T N 300
901 ttccagcaggatgtcgccgactccgagatctactcgtacctgctcaaacagatcgcgcct 960
A n
90
301 F Q Q D V A D S E I Y S Y L L K Q I A P 320
961 gacgactctggagttacgcttgatgctttgagggaaaccgacctactccgtcgtgcggaa 1020
321 D D S G V T L D A L R E T D L L R R A E 340
1021 ctcatgctgcaacaagcggcgaagctcaggtgtcgcgcgttcgtgactccggccgacgtg 1080
341 L M L Q Q A A K L R C R A F V T P A D V 360
1081 gtgggcggagtatacaagctgaacttggcgttcgtggccaacctgttcaaccagcatcct 1140
361 V G G V Y K L N L A F V A N L F N Q H P 380
1141 ggcctgcagcgcactgctgacactgaggaactgcaccagctagacgagaccagggaggag 1200
381 G L Q R T A D T E E L H Q L D E T R E E 400
1201 aagacttaccgcaactggatgaactcgatgggcgtggcgccgcacgtgaactggctgtac 1260
401 K T Y R N W M N S M G V A P H V N W L Y 420
1261 tcggacctgacggacgggctcgtcatcttccagctctacgacatcatcaaacctggcatt 1320
421 S D L T D G L V I F Q L Y D I I K P G I 440
1321 gttaactggaagaaggtgcaccgccagttctcgaagctgcgtaagttcatggagcggctg 1380
441 V N W K K V H R Q F S K L R K F M E R L 460
1381 gagaactgcaactacgccgtggagctcggccggcagctcgggttctcgctcgtcggcatc 1440
461 E N C N Y A V E L G R Q L G F S L V G I 480
1441 gcgggcgccgacatcaacgaggggaatgctacgcttacactcgccctgatctggcagttg 1500
481 A G A D I N E G N A T L T L A L I W Q L 500
1501 atgcgcgcgtacacgctgtcggtgctgacccggctggccaataccgggaaccccatcatc 1560
501 M R A Y T L S V L T R L A N T G N P I I 520
1561 gagaaggagatcgtgcagtgggtcaacaacaaactcgccggcgccggcaagacctcatct 1620
521 E K E I V Q W V N N K L A G A G K T S S 540
1621 attaggagcttccaggatgaggtgttggctgacggtaaggtggtgatcgacctgatcgac 1680
541 I R S F Q D E V L A D G K V V I D L I D 560
1681 gccatcaagcctggctccatcaactacgacctcgtgctgcccggaggcaacgaggaggag 1740
561 A I K P G S I N Y D L V L P G G N E E E 580
1741 aacctagccaacgcgaaatacgcgatttcaatggcgcgtcgttgcggagcgcgcgtatac 1800
581 N L A N A K Y A I S M A R R C G A R V Y 600
1801 gcgctaccggaggacattacggagaggaaaccgaagatgatcatgacagtgttcgcgtgc 1860
601 A L P E D I T E R K P K M I M T V F A C 620
1861 ctcatggcgctcgactacatcccggctcgtgccgaattcctgcagcccgggggatccact 1920
621 L M A L D Y I P A R A E F L Q P G G S T 640
1921 agttctagagcggccgccaccgcggtggagctccagcttttgttccctttagtgagggtt 1980
641 S S R A A A T A V E L Q L L F P L V R V 660
1981 Aataatcactag 1992
661 N N H - 663
Figura 17: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da fimbrina de S.
frugiperda. O domínio headpiece e todos os domínios CH estão destacados por cores em
(A) e correspondem ao diagrama dos domínios da sequência (B). O códon de terminação
está em itálico.
B B
n
91
Tabela 13: Identidades e similaridades da sequência de fimbrina de S. frugiperda com as
de outros insetos
Organismo % Identidade % Similaridade Número de
acesso (GenBank)
Danaus plexippus 584/631 (93%) 605/631 (96%) EHJ77539.1
Aedes aegypti 458/612 (75%) 528/612 (86%) EAT46255.1|
Anopheles gambiae 456/622 (73%) 535/622 (86%) EAA05335.4
Anopheles darlingi 452/628 (72%) 529/628 (84%) EFR22119.1
Anopheles gambiae 451/628 (72%) 531/628 (85%) EGK96319.1
4.8.3. Miosina I
As miosinas presentes nas microvilosidades intestinais poderiam estar de
alguma maneira relacionadas com os processos de secreção microapócrina devido
as suas funções motoras e sua capacidade de conectar os filamentos de actina com
a membrana microvilar. Na figura 18 está apresentada a sequência completa de
uma miosina I de S. frugiperda, obtida a partir de um EST encontrado no banco de
dados Spodobase (Sf 2M00173-5-1). A proteína possui 1032 aminoácidos e todos
os domínios presentes na classe I das miosinas. A tabela 14 apresenta as proteínas
com as quais a miosina I de S. frugiperda apresenta maiores identidades e
similaridades após a realização de um BLASTP
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
1 atggagcacgccctcgtgcaccgcgagcgcgtcggagtgcaagacttcgtgctgctcgag 60
1 M E H A L V H R E R V G V Q D F V L L E 20
61 gacttccgatctgaagccgctttcattgacaacctcaggaaacgattcaacgagaacatt 120
21 D F R S E A A F I D N L R K R F N E N I 40
121 atttatacgtacatcggcaacgtgcttatatccgtgaacccgtacaagaacctgcctatc 180
41 I Y T Y I G N V L I S V N P Y K N L P I 60
181 tacacggaggagaagaccaaactatactacaaaaaggctttctttgaggcaccaccacac 240
61 Y T E E K T K L Y Y K K A F F E A P P H 80
241 gtattcgcaattgcagacaacgcctacaggtccttggtatacgaacacagagaacagtgc 300
81 V F A I A D N A Y R S L V Y E H R E Q C 100
301 attttgatctcaggtgaatctggttcaggcaaaacagaggcgtccaaaaaagtcctagag 360
101 I L I S G E S G S G K T E A S K K V L E 120
361 tacatagcagcaagaacaaatcaccttcgcaacgtagaaactgttaaggacaaacttctt 420
A B
n
92
121 Y I A A R T N H L R N V E T V K D K L L 140
421 caaacgaaccccctacttgaagccttcggtaatgctaaaacacacagaaatgacaactct 480
141 Q T N P L L E A F G N A K T H R N D N S 160
481 agtcgttttggaaagtacatggacgtccagttcaactatgaaggagcccctgaaggtgga 540
161 S R F G K Y M D V Q F N Y E G A P E G G 180
541 cacatccttaactaccttttggagaagtccagggtagtcagtcaaatgtctggagagagg 600
181 H I L N Y L L E K S R V V S Q M S G E R 200
601 aacttccacatcttctatcagctattggctggagcagaccaggacttgttaagacagttg 660
201 N F H I F Y Q L L A G A D Q D L L R Q L 220
661 aagctgcaaggaaggccggaagcttacaaatacactactgatgcgggtgcccaaggaaac 720
221 K L Q G R P E A Y K Y T T D A G A Q G N 240
721 caacgtaaccaagacgccgagcagttccgtacagtgcaggaagccatgaaagtcatcgag 780
241 Q R N Q D A E Q F R T V Q E A M K V I E 260
781 atcaaccaaacggaacagactgagattttcgagattgtcgccagcgtccttcatctagga 840
261 I N Q T E Q T E I F E I V A S V L H L G 280
841 aatgcgaagttcgtgcagaatgacaagggatatgctgaaattctgtcacacgatgctaac 900
281 N A K F V Q N D K G Y A E I L S H D A N 300
901 tctaacaatgtcgctgagcttctgaaagtggacagcacaaaattaaaagaggtacttacc 960
301 S N N V A E L L K V D S T K L K E V L T 320
961 agccgtaccatcagcgctcgtggggatgtagtcaacacccccctggacctggagcaggcg 1020
321 S R T I S A R G D V V N T P L D L E Q A 340
1021 cagtacgccagagatgccctcgccaaggccatctatgacaagcacttcagctggctggtc 1080
341 Q Y A R D A L A K A I Y D K H F S W L V 360
1081 tccaggctgaacgcctccctcgcacccaaggacaaagacagtcagtcgtccgtcattggt 1140
361 S R L N A S L A P K D K D S Q S S V I G 380
1141 attctggacatctacggatttgaaatcttccctaagaatagcttcgagcagttctgcatc 1200
381 I L D I Y G F E I F P K N S F E Q F C I 400
1201 aacttctgtaacgagaagctgcagcagctgttcatccagctgacgctgaagcaggagcag 1260
401 N F C N E K L Q Q L F I Q L T L K Q E Q 420
1261 gaggagtatctgcgcgagggcatcgagtgggagcccgtcgagtacttcaacaacatcgtc 1320
421 E E Y L R E G I E W E P V E Y F N N I V 440
1321 atctgcgacctcatcgaggccaggcacactggtataatcgcgatcctggacgacgagtgc 1380
441 I C D L I E A R H T G I I A I L D D E C 460
1381 ctgaggccgggagacgccacggacctgagcttactggagaagctgacgcagaacctggaa 1440
461 L R P G D A T D L S L L E K L T Q N L E 480
1441 ccccacccccactacaagtcacatcgccgctccgacatcaagacacagaagatcatggga 1500
481 P H P H Y K S H R R S D I K T Q K I M G 500
1501 cgtgatgagttctgcctggtgcactacgcgggcgaggtgacgtacaacgtgagcacgttc 1560
501 R D E F C L V H Y A G E V T Y N V S T F 520
1561 ctggagaagaacaacgacctgctgttccgcgacatccagagcctcatggccaccagcggg 1620
521 L E K N N D L L F R D I Q S L M A T S G 540
1621 aacaccatcgtcgccacctgcttcaaggacatcaacctaacgagcaagaagcgaccagag 1680
541 N T I V A T C F K D I N L T S K K R P E 560
1681 acagcgatcactcagttcaagaactcgttgaacgagctgatcaagatcctgagcagcaag 1740
561 T A I T Q F K N S L N E L I K I L S S K 580
1741 gagccttcctacatccgatgcatcaagcctaatgacttcaaggcgcctatgcaatttgac 1800
581 E P S Y I R C I K P N D F K A P M Q F D 600
1801 gacaagctcgtgtctcaccaagtgaagtacctcgggctgatggagaacttgcgcgtgcgc 1860
601 D K L V S H Q V K Y L G L M E N L R V R 620
1861 cgagctgggttcgcgtacaggagaacttacgaggccttccttgagagatacaagtgcctg 1920
621 R A G F A Y R R T Y E A F L E R Y K C L 640
1921 tcccgcgacacatggcccaacttccgcggcgcgccgcgagatggcgcgcagaaactggtc 1980
641 S R D T W P N F R G A P R D G A Q K L V 660
1981 gaagtactcaacttcgagaaggaagactataggatgggcaacacaaaaatcttcatccgt 2040
661 E V L N F E K E D Y R M G N T K I F I R 680
2041 ttcccgaagacgctattcgagacagaaaacgcttaccagatcaagaagaatgacatcgcg 2100
93
681 F P K T L F E T E N A Y Q I K K N D I A 700
2101 accatcatccagagcaggtggcgagggtactggcagaggaagcagtacctcaagatgcga 2160
701 T I I Q S R W R G Y W Q R K Q Y L K M R 720
2161 gaggcggccatcgtcatacagaagtgggtgcgaaggttcctcgcgcaaaggcttctggcc 2220
721 E A A I V I Q K W V R R F L A Q R L L A 740
2221 aggagaaagaaggccgcgatggtcatcagagcttttatcaaaggcttcatcacccgcaac 2280
741 R R K K A A M V I R A F I K G F I T R N 760
2281 ggtccggagactccagagaacctgctgttcctgggtatcgcgaaggtccactggctgaag 2340
761 G P E T P E N L L F L G I A K V H W L K 780
2341 cggctggcgagccaactaccgacgaaggtactggacttatcatggccgacatgtcccgcc 2400
781 R L A S Q L P T K V L D L S W P T C P A 800
2401 acgtgccaggcggcctcccgcgagctgcaccgcctgcaccgcgcccacctcgcgcgcaag 2460
801 T C Q A A S R E L H R L H R A H L A R K 820
2461 taccgcctcgcgctctccccgcaggacaagaagcagttcgagctcaaagtactcgctgag 2520
821 Y R L A L S P Q D K K Q F E L K V L A E 840
2521 aagatgttcaagggcaagaagaacagctaccaagccagcgtcggcgagcggttccaggac 2580
841 K M F K G K K N S Y Q A S V G E R F Q D 860
2581 gaccgcctgacttcggaacaccagacactcaggaataccttcatggcgtcaccttcctgg 2640
861 D R L T S E H Q T L R N T F M A S P S W 880
2641 cctaccggggaacaacttatttactcatgcgaggcagtgaagtacgaccgccgtgggtac 2700
881 P T G E Q L I Y S C E A V K Y D R R G Y 900
2701 aagccccgcgagcgcgccctgctggcctcggacaaggcgctgtacgtactggacgcggcc 2760
901 K P R E R A L L A S D K A L Y V L D A A 920
2761 ggccgcaagacgtacaagctcaagcatcgcctgccgctggacaaactgcgcgtcgtcgtt 2820
921 G R K T Y K L K H R L P L D K L R V V V 940
2821 accaacgagactgacacgctcgtactcatcaagataccgcaggaacttaagaaggataag 2880
941 T N E T D T L V L I K I P Q E L K K D K 960
2881 ggcgacctgatcatctccgtgtcgcacctgatcgaggcgctgaccatcgtcaccgactac 2940
961 G D L I I S V S H L I E A L T I V T D Y 980
2941 accaagaaacccgaacttatcgagatcgtcgacaccaggactatcgcgcacaactttgtg 3000
981 T K K P E L I E I V D T R T I A H N F V 1000
3001 aatggtaagcagggcggcaccatcgaggtacagaacggtccgcaggccaacatacaccgc 3060
1001 N G K Q G G T I E V Q N G P Q A N I H R 1020
3061 gccaagaagggaaacctgctcgttttcgcaactccctga 3099
1021 A K K G N L L V F A T P - 1032
Domínio motor de miosina IQ
Cauda de miosinaN C
Sítio ligante de actina
Figura 18: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da miosina I de S.
frugiperda. Os domínios: motor, IQ (motivo ligante de calmodulina) e da cauda estão
destacados por cores em (A) e correspondem ao diagrama dos domínios da sequência em
(B). Os sítios ligantes de ATP estão representados em (A) com caixa preta e em (B) com
setas pretas. O códon de terminação está em itálico.
B B
n
94
Tabela 14: Identidades e similaridades da sequência de miosina I de S. frugiperda com
as de outros insetos
Organismo % Identidade % Similaridade Número de acesso
Megachile rotundata 632/1034 (61%) 797/1034 (77%) XP_003701694.1
Harpegnathos saltador 629/1030 (61%) 797/1031 (77%) EFN88334.1
Apis mellifera 630/1034 (61%) 792/1034 (76%) XP_394436.2
Bombus impatiens 629/1034 (61%) 793/1034 (77%) XP_003489473.1
Drosophila grimshawi 637/1034 (62%) 784/1034 (76%) XP_001984060.1
Apis florea 628/1034 (61%) 790/1034 (76%) XP_003698773.1
Embora a miosina I não tenha sido encontrada em nossas varreduras,
achamos interessante avançar um pouco os estudos com ela, para futuramente
cloná-la, sequenciá-la e produzir anticorpos uma vez que sua sequência é
específica de IM (ver a seguir).
4.8.4. Cofilina
A proteína cofilina encontrada na varredura de VM pode estar envolvida no
processo de secreção microapócrina atuando na desorganização dos filamentos de
actina presentes nas microvilosidades das células epiteliais, permitindo assim, a
passagem das vesículas de secreção pelo interior dessas microvilosidades. Na
figura 19 mostramos a sequência completa da cofilina. Esta proteína apresenta 148
aminoácidos e um único domínio denominado fator despolimerizante de actina
(ADF). A tabela 15 apresenta as proteínas com as quais a cofilina de S. frugiperda
apresenta maiores identidades e similaridades após a realização de um BLASTP
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Podemos verificar que ela demonstra-se bem
conservada entre as espécies da ordem Lepidoptera e Diptera.
95
1 atggcgtctggtgtgacagtttcggacgcgtgcaaaacgacgtacgaggagattaagaaa 60
1 M A S G V T V S D A C K T T Y E E I K K 20
61 gacaagaagcaccgctacgtggtgttctacatcagggatgagaaacaaattgacgtagag 120
21 D K K H R Y V V F Y I R D E K Q I D V E 40
121 accgtcggcgaacgtaacgcggaatacgatcagttccttgaggatctgcagaagggtggc 180
41 T V G E R N A E Y D Q F L E D L Q K G G 60
181 accggagagtgcagatatggcctcttcgacttcgagtatacgcaccagtgtcaaggcacg 240
61 T G E C R Y G L F D F E Y T H Q C Q G T 80
241 tcggaagccagtaagaaacagaagctcttcctcatgtcatggtgccccgacaccgctaag 300
81 S E A S K K Q K L F L M S W C P D T A K 100
301 gttaagaagaagatgttgtactccagctctttcgacgcactgaagaagtcgctggtcggc 360
101 V K K K M L Y S S S F D A L K K S L V G 120
361 gttcagaagtacatccaggcgaccgacctctcggaggcctcgcaggaggctgttgaagag 420
121 V Q K Y I Q A T D L S E A S Q E A V E E 140
421 aagctgcgcgccaccgaccgccaataa 447
141 K L R A T D R Q - 148
Figura 19: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da cofilina de S.
frugiperda. O domínio ADF (fator despolimerizante de actina) está destacado por cor em (A)
e corresponde ao diagrama do domínio da sequência (B). O códon de terminação está em
itálico.
Tabela 15: Identidades e similaridades da sequência de cofilina de S. frugiperda com as de
outros insetos
Organismo % Identidade % Similaridade Número de acesso
(GenBank)
Bombyx mori 147/148 (99%) 148/148 (100%) ABF51212.1
Biston betularia 146/148 (98%) 147/148 (99%) AD033068.1
Drosophila willistoni 138/147 (94%) 143/147 (97%) EDW72067.1
Drosophila melanogaster 138/148 (93%) 143/148 (96%) NP_477034.1
Anopheles gambiae 137/148 (92%) 143/148 (96%) EAL38771.2
4.8.5. Gelsolina-1
Gelsolina é uma proteína reguladora da dinâmica dos filamentos de actina
Possui 6 domínios homólogos (Figura 5), cada um contendo um sítio conservado
B B
n
A
B
96
ligante de cálcio. Devido a sua função de cortes de F-actina, acreditamos que esta
proteína possa estar envolvida no processo de secreção microapócrina, uma vez
que deve ser necessária a desorganização destes filamentos para permitir a
passagem das vesículas de secreção pelo interior da microvilosidade.
A proteína gelsolina-1 foi encontrada com anticorpos contra preparação de
membrana microvilar (Ferreira et al., 2007) e também com anticorpos contra fração
P1 do fracionamento celular. Após seu sequenciamento completo usando
iniciadores específicos obtivemos uma sequência que provavelmente codifica uma
proteína de 748 aminoácidos e todos os domínios conservados e sítios ligantes de
actina, como podemos ver na figura 20. A tabela 16 apresenta as proteínas com as
quais a gelsolina de S. frugiperda apresenta maiores identidades e similaridades
após a realização de um BLASTP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Observamos que a gelsolina mostrou-se muito pouco conservada entre os insetos,
com apenas 40% de identidade com a gelsolina de Aedes aegypti.
1 atggcgacacacgaggcgttcgctgaggccggtgctaatccgggaatcgaaatctggacc 60
1 M A T H E A F A E A G A N P G I E I W T 20
61 atagagcaatttgaaccagtcgctataccatcaaaatcctatggaaaattttacaatgga 120
21 I E Q F E P V A I P S K S Y G K F Y N G 40
121 gattcgtacatcgtattaaagacatcaggccaatccaacgctacattgagctatgacgcc 180
41 D S Y I V L K T S G Q S N A T L S Y D A 60
181 catttttggctcggcagcaaaactacccaggacaagaagggatccgcggctatctggaca 240
61 H F W L G S K T T Q D K K G S A A I W T 80
241 gtcaccctggatgatatgttgggcggcaaggcagttcatcatagggaggtccagggccat 300
81 V T L D D M L G G K A V H H R E V Q G H 100
301 gagtccagcaggttcctcgggtatttcaaacctgctatcagatacatggaaggcggtaac 360
101 E S S R F L G Y F K P A I R Y M E G G N 120
361 gagtcaggttttactgaggtagagactaacgcgggagctgagaagagactcctgaaactt 420
121 E S G F T E V E T N A G A E K R L L K L 140
421 tcaggatgtgagaacatgaggattgaggaggtaccagccgaatcctcatccctgacgaaa 480
141 S G C E N M R I E E V P A E S S S L T K 160
481 gaccactgcttcattctggaggtagaccatgacatcttcgtgctgatgcccgagggtgcc 540
161 D H C F I L E V D H D I F V L M P E G A 180
541 aaggctactcaacgaaggaagatcatcagcgtggccaatcagctaagagatgacaatcat 600
181 K A T Q R R K I I S V A N Q L R D D N H 200
601 aatggaagagctaccattgaaattattgatgagttctcttctgatgaagactatgaccaa 660
201 N G R A T I E I I D E F S S D E D Y D Q 220
661 ttcttccaagcccttggatcaggatccaaagatgaaattgcaagcgacgattctggcaca 720
221 F F Q A L G S G S K D E I A S D D S G T 240
721 acttactaccgtgatgatatttctgctgtctatctgtaccgagtgatgctgggtgatggt 780
241 T Y Y R D D I S A V Y L Y R V M L G D G 260
781 tttgatgtggtggccctgaataaaccatacaagcagagccatttgacttctgatgaagtc 840
261 F D V V A L N K P Y K Q S H L T S D E V 280
841 ttcatcctggacactccctgctcaggagtgtacatctggatcggttccgaagtcagcgcc 900
281 F I L D T P C S G V Y I W I G S E V S A 300
901 gatgtcaggaaggcataccacgatattgcgaaccagtacttcgaagctaaaaactatcct 960
301 D V R K A Y H D I A N Q Y F E A K N Y P 320
A B
n
97
961 tcttgggtgaacgtgacgaaggtggctgaaggctccgaatgctcgaccttcaagcaatac 1020
321 S W V N V T K V A E G S E C S T F K Q Y 340
1021 ttcgtcagctggaacactgtcatcaccaggagcatgggagccgtctctgatgatgctgga 1080
341 F V S W N T V I T R S M G A V S D D A G 360
1081 tacgactctgatgatgctgagcagaaccagaaggtggctcagtacatcggtaagagtgcg 1140
361 Y D S D D A E Q N Q K V A Q Y I G K S A 380
1141 gctgcgagggagtacatgcctgataacggagagggatctcttactgtcaccagggttggt 1200
381 A A R E Y M P D N G E G S L T V T R V G 400
1201 gacggcgctgacgtgactgaagacttcacctcgggctgcggcatgctgtaccagagcgag 1260
401 D G A D V T E D F T S G C G M L Y Q S E 420
1261 gtctatgtggtgaaataccagtacaccgaggaggatggagaggataattacattgtttat 1320
421 V Y V V K Y Q Y T E E D G E D N Y I V Y 440
1321 tactggattggttccaaagcatcagctgaggacaagcaggcgggtgctgagctggtggct 1380
441 Y W I G S K A S A E D K Q A G A E L V A 460
1381 cagctggaagacgagctcggagacgatgctgcagtcgtgaaggtgccccaaggaaaagag 1440
461 Q L E D E L G D D A A V V K V P Q G K E 480
1441 cccagacatttcctcattatcttcaaaggcaacctggccatcgtatttggaggcaaggac 1500
481 P R H F L I I F K G N L A I V F G G K D 500
1501 accgactacaagcccaccaacgccgaaggaaactatgatgaaaacagtactcgtctgttt 1560
501 T D Y K P T N A E G N Y D E N S T R L F 520
1561 agggtggaaggtacagatttgagcgacatgcgagccgttcaggtcggagagacggctgat 1620
521 R V E G T D L S D M R A V Q V G E T A D 540
1621 aacttggaagacgatgatgtctacgtgttggagttagctgacattgtctatgtgtggatt 1680
541 N L E D D D V Y V L E L A D I V Y V W I 560
1681 ggaaacgaatcgaatgagaaagagaaggcggcggtgaagaccttcgtcacgatgctggta 1740
561 G N E S N E K E K A A V K T F V T M L V 580
1741 ggagaggagaaggagatcagcaccgtggagcaaggcagtgaaccgccagagttctgggac 1800
581 G E E K E I S T V E Q G S E P P E F W D 600
1801 gctttgggcggcgaaccagaagagaaaagtggttctggctggaggaacgcggtcaaccgc 1860
601 A L G G E P E E K S G S G W R N A V N R 620
1861 agagtgacagcccctcgcaccctcacagctgtgaacgtcagcatcaccaagaagattacc 1920
621 R V T A P R T L T A V N V S I T K K I T 640
1921 ttcgaagatctcgacacggagttcacgcaacaggatctgtctgatgatggagtgtacatc 1980
641 F E D L D T E F T Q Q D L S D D G V Y I 660
1981 ctggacactggtgaggagctctacttgtggcaaggaaagaaaattcctgagcgagtcaag 2040
661 L D T G E E L Y L W Q G K K I P E R V K 680
2041 atggccaggagcgatatcatcaaggagtacatagaagacgatggcttggaccgtacagtg 2100
681 M A R S D I I K E Y I E D D G L D R T V 700
2101 gacaacgccctggtggtcttcgtgaagcagggagagggaccgggagccttccggaaactc 2160
701 D N A L V V F V K Q G E G P G A F R K L 720
2161 ttccccgaatgggacaccgctatgtgggataaccaaacatcttatgaagacatcaagaat 2220
721 F P E W D T A M W D N Q T S Y E D I K N 740
2221 gaaacgaaagcagccaattctaagtaa 2247
741 E T K A A N S K - 748
G1 G2 G3 G4 G5 G6N C
Figura 20: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da gelsolina-1 de S.
frugiperda. Os domínios: gelsolina (G1 a G6) estão destacados por cores em (A) e
correspondem ao diagrama dos domínios da sequência em (B). O códon de terminação
está em itálico.
B B
n
98
Tabela 16: Identidades e similaridades da sequência de gelsolina de S. frugiperda com as
de outros insetos
Organismo % Identidade % Similaridade Número de acesso
(GenBank)
Aedes aegypti 300/749 (40%) 429/749 (57%) EAT 42351.1
Culex quinquefasciatus 296/751 (39%) 434/751 (57%) EDS 42860.1
Drosophila willistoni 300/766 (39%) 423/766 (55%) EDW 83060.1
Drosophila ananassae 295/770 (38%) 424/770 (55%) EDV 42840.1
Anopheles gambiae 281/751 (37%) 415/751 (55%) EAL 39527.3
A gelsolina 1 mostrou-se específica de intestino (ver a seguir) e por isso
estudos com ela foram aprofundados.
4.9. RT-PCR semi-quantitativa das proteínas que poderiam estar envolvidas na
secreção microapócrina
Para determinar a expressão e localização dos transcritos correspondentes a
todas as sequências de proteínas que teoricamente poderiam estar envolvidas na
secreção microapócrina, iniciadores foram desenhados (Tabela 2) e análises por
RT-PCR semi-quantitativa em diferentes tecidos de S. frugiperda, foram realizadas.
Os resultados mostraram que os mRNAs codificantes da maioria das proteínas são
expressos em todos os tecidos analisados (ventrículo total, ventrículo dividido em
anterior, médio e posterior, túbulos de Malpighi, corpo gorduroso e carcaça) (Figura
21). Apenas a gelsolina-1 e miosina I foram transcritas somente no tecido intestinal,
enquanto que miosina VI foi encontrada no tecido intestinal e em túbulos de
Mapighi. Gelsolina-2 foi a única cujos transcritos não foram encontrados no tecido
intestinal.
99
Fimbrina
Gelsolina 1
Moesina
Miosina I
Miosina VI
Profilina
PDI 1
PDI 2
β-actina
Cofilina
Anexina
ARP 2/3
IM EVA EVM EVP TM CG C
Gelsolina 2
Figura 21: Padrão de expressão dos mRNAs codificantes de proteínas possivelmente
envolvidas com a maquinaria da secreção em diferentes tecidos de lagartas de S.
frugiperda são mostrados por RT-PCR semi-quantitativa. Quantidades iguais (5ug) de RNA
dos diferentes tecidos extraídos, tratados com DNase e utilizados como molde para a
reação da RT. O produto dessa reação foi usado para amplificação em termociclador,
utilizando oligonucleotídeos específicos para cada sequência de cDNA e para a β-actina
(controle endógeno). O produto da amplificação foi analisado em gel de agarose 2% em
TAE. As bandas amplificadas aparecem quando o mRNA da proteína correspondente é
transcrito. O número de ciclos de amplificação foi escolhido após diversas tentativas, para
assegurar que a amplificação estivesse na fase log e resultando em uma banda amplificada
clara e visível em gel. IM, intestino médio inteiro; EVA, epitélio do ventrículo anterior; EVM,
epitélio do ventrículo médio; EVP, epitélio do ventrículo posterior; TM, túbulos de Malpighi;
CG, corpo gorduroso; C, carcaça.
4.10. Gelsolina-1: Expressão heteróloga, produção de anticorpos e supressão
da expressão com RNA interferente
100
Como os RNAs codificantes da gelsolina1 foram encontrados somente no IM,
essa proteína foi escolhida para ser estudada com mais detalhes.
4.10.1. Produção de gelsolina recombinante
A sequência de cDNA codificante dos domínios G1 a G3 (G1-G3) de
gelsolina-1 (ver figura 20) foi amplificada através de uma reação de polimerização
em cadeia (PCR), usando como molde o plasmídeo pGEM-T (contendo o cDNA
codificante para gelsolina), juntamente com os iniciadores GelsG1_FW e
GelsG3_RV (ver item 3.9.1), contendo os respectivos sítios de restrição para a
endonuclease de restrição. O produto de PCR foi digerido com as enzimas XhoI e
EcoRI e posteriormente clonado no vetor pAE (Ramos et al., 2004) previamente
digeridos com as mesmas enzimas, resultando no plasmídeo pAE/gels (Figura 22).
A gelsolina recombinante tem em seu N-terminal um peptídeo de fusão que contém
6 resíduos de histidina, para facilitar sua purificação por cromatografia de afinidade
em coluna de níquel.
pb
BA
1 2
Figura 22: Análise da construção pAE-gelsolina. (A) Esquema da construção pAE/gelsolina
que consiste do plasmídeo pAE com o cDNA que codifica a gelsolina (domínios G1-G3)
inserida. (B) Eletroforese em gel de agarose 1% da digestão da construção pAE/gelsolina
com enzimas de restrição EcoRI e XhoI. (1) Padrão de DNA e (2) produto da digestão. A
seta aponta para o fragmento de aproximadamente 1010 pb correspondente ao inserto
liberado da construção após a digestão.
101
A construção pAE/gels foi utilizada para transformar bactérias XL1-blue
competentes, seguida da seleção com 50 µg/mL de carbenicilina. A partir de
colônias resultantes de cada transformação foi feita a minipreparação de
plasmídeos, que foram submetidos a um sequenciamento, utilizando os iniciadores
T7 e T7 terminador, específicos para o vetor pAE, e iniciadores internos, específicos
dessas sequências. Esse experimento revelou que a sequência de DNA que
codifica a gelsolina estava intacta e que a amplificação por PCR não introduziu
nenhuma alteração em suas sequências de bases (dados não mostrados). Além
disso, pelo sequenciamento foi possível visualizar que as sequências de DNA
estavam em fase de leitura na porção N-terminal com a sequência do vetor pAE que
codifica os seis resíduos de histidina.
A construção pAE/gels (Figura 22 A) foi então utilizada na transformação por
choque térmico da bactéria de expressão E. coli BL21(DE3) utilizada para obtenção
da proteína recombinante. As cepas BL21 (DE3) vêm sendo utilizadas por vários
grupos na obtenção de gelsolina de diversos organismos (Chhabra et al., 2005;
Solomon et al., 2009).
O nível de expressão da gelsolina foi avaliado após indução com IPTG 1 mM
a 20ºC, 25ºC e 37ºC por cerca de 20 horas (Figura 23). Como controle negativo das
induções foi utilizado bactéria BL21(DE3) transformada com o vetor pAE sem
inserto (Figura 23). Verifica-se que ocorreu a indução na célula testada a 20°C do
polipeptídio de aproximadamente 37kDa calculado de acordo com Shapiro et al.
(1967), que é correspondente à massa molecular estimada para gelsolina (Figura
23).
102
kDaP
Figura 23: Análise do perfil de indução de células de E. coli BL21(DE3) transformadas com
o vetor pAE/gelsolina com IPTG 1 mM a 37ºC, 25ºC e 20ºC por 20 h. Separação
eletroforética foi realizada em gel de poliacrilamida 12% na presença de SDS e o gel foi
corado com Coomassie Blue R. Nas raias localizadas a esquerda estão marcadores de
massa molecular conhecidos. A seta indica o polipeptídeo de aproximadamente 37 kDa
correspondente aos domínios gelsolina (G1-G3) recombinante que é induzida. (NI) não
induzido. (I) induzido. (pAE) vetor sem inserto. (Gel) pAE/gelsolina. (P) padrão de massa
molecular.
Em seguida, a solubilidade do extrato bacteriano foi analisada. Para isso, as
células bacterianas expressando gelsolina, recolhidas por centrifugação após
indução a 20ºC, 25ºC e 37ºC, foram lisadas por sonicação e submetidas à
centrifugação. Os sobrenadantes foram recuperados e os precipitados suspensos
no mesmo tampão de lise. Na figura 24 temos a distribuição da gelsolina entre o
sobrenadante (proteína solúvel) e o precipitado (proteína como corpo de inclusão)
nas diferentes temperaturas. Verifica-se que a 20°C, a proteína recombinante
gelsolina encontra-se expressivamente presente na forma de proteína solúvel para a
linhagem testada.
103
kDaP
Figura 24: Solubilidade da gelsolina recombinante de S. frugiperda a 37ºC, 25ºC e 20ºC. O
sobrenadante (S) e o sedimento (Sd) proveniente do extrato bruto centrifugado de células
BL21(DE3) lisadas foram aplicados em gel de poliacrilamida 12%. O gel foi corado com
Coomassie Blue R. A seta indica o polipeptídeo de aproximadamente 37kDa na fração
solúvel do lisado bacteriano. (P) padrão de massa molecular.
Para purificarmos a fração solúvel contendo a proteína recombinante
gelsolina de lisados bacterianos de E. coli BL21(DE3), obtida de culturas induzidas a
20ºC por 20 horas foram realizadas duas cromatografias. Inicialmente, a fração
solúvel foi submetida à cromatografia de afinidade em resina de Ni+2-agarose na
seguinte condição: Tris-HCl 10 mM pH 7, NaCl 100 mM, imidazol 20 mM, PMSF 1
mM, glicerol 10% (v/v). Foram feitas 5 lavagens e a eluição do material adsorvido à
resina foi realizada com concentrações crescentes de imidazol. A proteína começou
a ser eluída com 75 mM de imidazol e continuou a ser eluída em todas as
concentrações de imidazol testadas.
Em seguida, o material eluído, que não se encontrava puro, foi reunido,
dialisado em tampão Tris-HCl 10 mM pH 7 e submetido a uma segunda
cromatografia de afinidade, utilizando novamente a resina de níquel em uma
segunda condição [Tris-HCl 10 mM pH 7, NaCl 200 mM, imidazol 20 mM, PMSF 1
mM, glicerol 10% (v/v) e β-mercaptoetanol 5 mM]. O aumento da concentração de
cloreto de sódio e a adição de β-mercaptoetanol em baixa concentração foram
104
realizados com o objetivo de diminuir interações de proteínas inespecíficas com a
resina de níquel (Ni-NTA Agarose Qiagen). Esse procedimento experimental foi
similar ao realizado previamente, sendo também feitas cinco lavagens (Figura 25,
raias L1 a L5) e as eluições realizadas em tampão contendo de 25 a 300 mM de
imidazol (Figura 25; raias E25mM a E300mM).
De fato, como analisado por SDS-PAGE 12%, corado com Comassie Blue, a
segunda cromatografia de afinidade favoreceu a especificidade de interação da
proteína recombinante com a resina e a remoção de proteínas intrínsecas da
bactéria, que não continham a cauda de histidina. Consequentemente, como pode
ser visualizado na figura 25 (raias E300mM) o material eluído contendo a gelsolina
apresenta pouca contaminação.
kDa
P
Figura 25: Análise por SDS-PAGE 12% das frações obtidas após a segunda cromatografia
de afinidade para purificação da gelsolina expressa em E. coli BL21(DE3). A raia FT (flow
through) representa a fração do material incubado por 70 minutos a 4ºC com a resina, mas
não adsorvido a ela. As raias L1-L5 representam as cinco lavagens da resina realizadas
com o tampão contendo 20 mM de imidazol. As eluições foram feitas com 25, 50, 75, 100,
150 e 300 mM de imidazol e são representadas pelas raias E25mM, E50mM, E75mM, E100mM,
E150mM e E300mM respectivamente. O gel foi corado com Coomassie Blue R. A seta indica o
polipeptídeo de aproximadamente 37kDa correspondente à gelsolina (G1-G3) recombinante
praticamente purificado na raia E300mM. (P) padrão de massa molecular.
105
4.10.2. Produção do anticorpo anti-gelsolina e imunocitolocalização no epitélio
intestinal de S. frugiperda
Após a purificação da proteína gelsolina recombinante (correspondente aos
domínios G1-G3), iniciou-se o processo de imunização em coelho para a produção
de anticorpos anti-gelsolina. Foram realizadas três imunizações de 300 µg cada.
Para testar o reconhecimento do anticorpo, a proteína gelsolina recombinante e um
homogeneizado do epitélio ventricular de S. frugiperda foram submetidos a uma
eletroforese em gel 12% de poliacrilamida, em seguida transferidos para uma
membrana de nitrocelulose e incubados com o anticorpo anti-gelsolina nas diluições
1:50, 1:100, 1:200, 1:500 e 1:1000. Como controle, incubação com o soro pré-imune
do coelho foi realizada.
Na figura 26, o western blot após SDS-PAGE revelado pelo método
Imobbilon Western Chemiluminescent HRP substrate (Millipore) mostrou que o
anticorpo anti-gelsolina reconhece o peptídeo recombinante correspondente aos
domínios G1 a G3 da gelsolina-1, cuja massa molecular é de 37 kDa. No EV, o
anticorpo reconheceu uma banda apenas, de 83 kDa, que corresponde a massa
molecular predita para a gelsolina-1. O soro pré-imune na diluição 1:100 não
reconheceu a proteína gelsolina, atestando que antes da imunização do coelho
nenhum anticorpo do coelho reconhecia a proteína recombinante gelsolina.
83 kDa
37 kDa
Figura 26: Western blot após SDS-PAGE (12%) da proteína recombinante do epitélio do
ventrículo com o anticorpo anti-gelsolina. A detecção padrão foi realizada com anti-IgG
(coelho) acoplado com a peroxidase e revelado com o kit Imobbilon Western
Chemiluminescent HRP substrate (Millipore).
106
Uma vez atestada a especificidade do anticorpo, ele foi usado na
imunocitolocalização em microscopia eletrônica de transmissão no ventrículo de
lagartas de S. frugiperda. As marcações são evidenciadas por partículas de ouro
coloidal ligadas ao anticorpo secundário de coelho, que reconhece o anticorpo anti-
gelsolina.
A marcação foi muito pouca para podermos tirar conclusões sobre a
localização da proteína. Isso pode ter ocorrido pelo fato da gelsolina distribuir-se de
forma dispersa na célula, não ficando concentrada em nenhuma região, ou porque
os epítopos foram destruídos pelo processo de fixação utilizado na microscopia
eletrônica. Os cortes deverão ser feitos agora após fixação por congelamento na
tentativa de preservar melhor o material.
4.10.3. Diminuição da expressão de gelsolina utilizando RNA interferente
Para investigarmos um possível envolvimento da proteína gelsolina no
processo de secreção microapócrina, tentamos suprimir a expressão dessa proteína
e posteriormente analisar as possíveis alterações na morfologia das
microvilosidades intestinais de S. frugiperda. Havia uma suspeita que sua supressão
poderia diminuir a despolimerização da actina no interior das microvilosidades,
dificultando a passagem das VM.
Para isso, RNA interferente foi preparado e o dsRNA específico para mRNA
de gelsolina foi injetado na hemolinfa das lagartas em estágios iniciais de
desenvolvimento que estavam se alimentando ativamente. Para confirmar a
especificidade do silenciamento da gelsolina, foram feitos dois grupos controles: um
injetado com dsRNA-GFP (green fluorescent protein) e outro grupo injetado com
água livre de nucleases. A análise da eficiência da supressão do gene da gelsolina
foi feita através de RT-PCR semi-quantitativa usando como molde o RNA extraído
do IM dos insetos 3 dias após a injeção de dsRNA-gelsolina, que causou diminuição
da expressão do gene da gelsolina (Figura 27).
107
Figura 27: RT-PCR semi-quantitativa para confirmação da diminuição do número de
transcritos do gene da gelsolina de S. frugiperda. A análise foi realizada 3 dias após a
injeção de água livre de nucleases (C), dsRNA-GFP (GFP) e dsRNA-gelsolina (Gels).
Quantidades iguais (5ug) de RNA dos insetos submetidos às diferentes injeções foram
extraídos, tratados com DNase e utilizados como molde para a reação da RT. O produto
dessa reação foi usado para amplificação em termociclador, utilizando oligonucleotídeos
específicos para a sequência de gelsolina e para a β-actina (controle endógeno). O produto
da amplificação foi analisado em gel de agarose 2% em TAE. As bandas amplificadas
aparecem quando o mRNA da proteína correspondente é transcrito. O número de ciclos de
amplificação foi escolhido após diversas tentativas, para assegurar que a amplificação
estivesse na fase log e resultando em uma banda amplificada clara e visível em gel.
O crescimento foi monitorado determinando-se o peso das lagartas e o
desenvolvimento verificando-se o período em que ocorria a muda e a mortalidade. A
figura 28 mostra o peso médio de lagartas controle e experimentais, onde podemos
verificar que não houve alteração nesse parâmetro. A mortalidade e tempo para
muda também não foram alterados.
Figura 28: Peso médio das lagartas de S. frugiperda após injeções com água livre de
nucleases e dsRNA-gelsolina. Dados obtidos a partir de 30 lagartas em cada grupo.
108
No que se refere a morfologia das células, em todas as réplicas biológicas
observou-se alterações nos animais experimentais, mas essas alterações variaram
entre os lotes de animais.
As alterações encontradas apareceram somente nos animais onde foi feita a
injeção de RNA dupla fita referente a gelsolina e nunca nos controles. Também foi
sempre observado em vários animais, em vários cortes e em vários campos de cada
corte. As diferenças observadas nas alterações referem-se a preparações
realizadas em dias diferentes.
Algumas dessas alterações são estruturas que parecem corresponder a
vesículas achadas dentro das microvilosidades. Essas vesículas sempre são
observadas próximas a base das microvilosidades, não aparecendo em regiões
mais apicais, indicando que as vesículas não estavam migrando ao longo da
microvilosidade (Figura 29).
Na figura 30 podemos observar que em microvilosidades controle, as bases
das microvilosidades apresentam um diâmetro em torno de 0,07-0,13 µm (Figura 30
A e B), enquanto que nas microvilosidades de animais injetados com dsRNA-
gelsolina algumas bases mostraram-se mais alargadas, chegando a apresentar
diâmetro de 0,28 µm (Figura 30 C). Em alguns casos observa-se esse alargamento
até a altura em que se apresenta uma vesícula (Figura 30 D).
109
Figura 29: Células colunares da região anterior do ventrículo de larvas S. frugiperda 3 dias
após a injeção de água livre de nucleases (A) ou dsRNA-gelsolina (B). As setas apontam:
(A) a presença de vesículas normais nas microvilosidades (Mv) de células de larvas
injetadas com água livre de nucleases e em (B) estruturas achatadas no interior das
microvilosidades de células de larvas injetadas com dsRNA-gelsolina
110
Figura 30: Células colunares da região anterior do ventrículo de larvas S. frugiperda 3 dias
após a injeção de água livre de nucleases (A e B) ou dsRNA-gelsolina (C e D). As setas
apontam (A e B) microvilosidades com bases normais de células de larvas injetadas com
água livre de nucleases, (C) microvilosidades com bases alargadas e (D) alargamento até a
altura em que se apresenta uma vesícula de células de larvas injetadas com dsRNA-
gelsolina. Microvilosidade (Mv).
Outra alteração encontrada foi a presença de grandes massas globosas entre
as microvilosidades, que somente apareceram nos animais experimentais (Figura
31). Essas massas apresentam diâmetro médio de 0,3 µm e nada têm a ver com as
vesículas de secreção, pois elas não são marcadas com anticorpos anti-amilase.
111
Figura 31: Células colunares da região anterior do ventrículo de larvas de S. frugiperda 3
dias após a injeção de RNA interferente. As setas apontam a presença de grandes massas
globosas no interior e entre microvilosidades (Mv).
É possível que essas diferenças encontradas nas microscopias eletrônicas
reflitam pequenas diferenças entre o horário da injeção e da dissecção dos animais.
Alternativamente essas diferenças podem ser devido a níveis diferentes de
supressão da gelsolina ou ao fato de outras proteínas estarem assumindo o papel
da gelsolina conforme já foi observado em outros casos. Witke et al. (2001)
inativaram genes de gelsolina e CapG e verificaram que ratos CapG-nulo e
CapG/gelsolina duplo nulo eram normais e não apresentavam anormalidades
funcionais graves. Em outro experimento Pinson et al. (1998) interromperam através
de recombinação homóloga o gene de vilina, proteína pertencente à família
gelsolina e verificaram que as microvilosidade de células estudadas estavam
intactas, sugerindo que outra proteína ou proteínas pode compensar eficientemente
a perda de vilina.
112
Qualquer que seja a razão, infelizmente não pudemos chegar a uma
conclusão sobre os efeitos da supressão da expressão da gelsolina devido a
irreprodutibilidade dos resultados, embora acreditemos que essas alterações
realmente são derivadas da ausência da proteína e não a outro artefato.
113
5. DISCUSSÃO
5.1. Proteínas presentes em diferentes compartimentos celulares
Há dois grandes métodos para determinar a identidade das proteínas
expressas em um determinado tecido: transcriptoma e proteoma. No caso de um
compartimento celular específico, tal como membranas microvilares ou vesículas de
secreção os transcriptomas não podem ser usados, porque não é possível isolar um
grupo de mRNAs (e então preparar uma biblioteca de cDNA) que expressem
somente proteínas de um determinado local. O sequenciamento de grandes
quantidades de cDNA presentes em uma biblioteca não é uma alternativa, pois não
há como reconhecer entre as sequências, aquelas relacionadas com o
compartimento em questão.
O enfoque proteômico é assim o método mais adequado. Ele se baseia na
resolução das proteínas presentes em um determinado compartimento, seguido
pela espectrometria de massa para sua identificação.
Um novo enfoque descrito para identificar proteínas associadas a uma
determinada fração celular consiste em gerar anticorpos que são usados para varrer
uma biblioteca de expressão de cDNA, seguindo-se o sequenciamento de clones
positivos e busca por sequências semelhantes em bancos de dados. Esse método
tem algumas vantagens sobre a proteômica tais como: a) permitir a identificação
das proteínas por pesquisa de similaridade em banco de dados mesmo que a
sequência específica daquele organismo (ou de organismo semelhante) não esteja
depositada; b) os clones muitas vezes permitem a obtenção da sequência completa
do gene, que pode ser usado em estudos funcionais sobre o papel das proteínas
cujas sequências não tem similaridade com outras proteínas já conhecidas ou sua
função seja desconhecida.
O enfoque proteômico é limitado pelos problemas de solubilidade de
proteínas, pelo fato de proteínas detectadas em géis não terem massa suficiente
para gerar um espectro de massa que possa ser usado e por problemas de
detecção da proteína quando o organismo em questão não tem sequências
abundantes em banco de dados, como muitas vezes ocorre em insetos
(Kishnamoorthy et al., 2007). A varredura por anticorpos também tem fontes de
erros possíveis tais como a não detecção de algumas proteínas pelos anticorpos,
114
porque os antígenos estão em baixa concentração ou porque eles não são
suficientemente imunogênicos; a detecção de contaminantes que são muito
imunogênicos; a detecção de proteínas presentes em outros compartimentos que
não o de interesse porque suas proteínas compartilham epítopos, além de falha na
expressão do cDNA inserido no fago.
Embora os dois métodos tenham limitações, muitas proteínas microvilares
intestinais de insetos tem sido descritas usando ambos métodos (Candas et al.,
2003; McNall e Adang, 2003; Krishnamoothy et al., 2007; Ferreira et al., 2007;
Bayyareddy et al., 2009; Popova-Butler e Dean, 2009; Pauchet et al., 2009a).
Para a detecção de proteínas contidas nas vesículas presentes no fluido
ectoperitrófico nós optamos pela utilização da varredura com anticorpos que já havia
sido usada anteriormente em nosso laboratório para a detecção de proteínas
presentes nas microvilosidades do mesmo S. frugiperda (Ferreira et al., 2007).
5.2. Proteínas presentes nas microvilosidades de S. frugiperda
Um total de 66 proteínas preditas foram detectadas nas membranas
microvilares intestinais purificadas após varredura de biblioteca de cDNA com
anticorpos. Dessas, 18 foram consideradas contaminantes por serem típicas de
mitocôndrias (tais como acil-CoA desidrogenase, succnil-CoA sintetase e ADP/ATP
translocase) ou de outras partes celulares que não as microvilosidades (tais como
proteína ribossomal acídica 60S ou a glutamato desidrogenase) ou porque eram
proteínas desconhecidas (Tabela 5).
Após a retirada desses contaminantes, ainda restam 48 proteínas que
conseguimos associar às microvilosidades, praticamente dobrando o número
dessas proteínas identificadas nesse mesmo organismo por Ferreira e
colaboradores (2007) e em outro inseto por outros autores (Candas et al., 2003;
McNall e Adang, 2005; Krishnamoothy et al., 2007; Bayyareddy et al., 2009;
Popova-Butler e Dean, 2009; Pauchet et al., 2009a).
As funções dessas 48 proteínas microvilares de S. frugiperda (Tabela 6)
podem ser classificadas em 8 grupos: (1) enzimas digestivas (amilase,
aminoacilase, aminopeptidase, astacina, carboxipeptidase, quimotripsina, glicosil-
hidrolase, serina proteinase e tripsina); (2) proteínas de MP (peritrofina, quitina,
mucina, Lsti99); (3) proteção (aldeído desidrogenase, ferritina, epóxido hidrolase do
115
HJ, serpina e tiorredoxina peroxidase); (4) receptor (receptor de neuropeptídeo); (5)
transportador (bombas de próton e carreadores de soluto); (6) maquinaria secretória
(anexina IX, calmodulina, gelsolina, actina 3, fimbrina e miosina VIIa); (8) função
desconhecida (epsilon, proteína ligante Pk 506 e PDI).
As proteínas preditas que tiveram suas sequências de aminoácidos
completadas puderam ser analisadas por ferramentas de bioinformática, procurando
por características associadas com classe (1) inserção na membrana plasmática
(peptídeo sinal mais alça transmembrana ou âncora de GPI); classe (2) secreção
(possuindo apenas peptídeo sinal) ou classe (3) localização citoplasmática
(proteínas sem as características mencionadas).
As proteínas preditas que possuem sinal de inserção na membrana são todas
as aminopeptidases, uma carboxipeptidase (contig 418), um transportador (contig
467) e um receptor desconhecido (contig 434). As proteínas que tem peptídeo sinal,
mas não têm nada que as retenha na membrana são amilase, astacina, algumas
carboxipeptidases, ferritina, proteína Lsti99, serina proteinases, tiorredoxina
peroxidase e tripsina. As proteínas apresentadas que não possuem peptídeo sinal
nem elementos para inserção na membrana e que, portanto, deveriam ser
citoplasmáticas são a aldeído desidrogenase e bombas de prótons.
As verdadeiras proteínas microvilares são esperadas pertencerem a primeira
classe de proteínas, ou seja, aquelas que possuem peptídeo sinal e são inseridas
na membrana. Aquelas que possuem peptídeo sinal, mas não se inserem na
membrana podem ser proteínas secretadas por secreção microapócrina
encontradas contaminando as preparações de membranas microvilares. Finalmente
aquelas sem peptídeo sinal devem ser proteínas citoplasmáticas carregadas pelas
VM em brotamento e que de alguma forma também contaminaram essas
preparações.
As aminopeptidases são enzimas tipicamente microvilares do intestino de S.
frugiperda. Elas são classificadas em 5 das classes conhecidas de aminopeptidases
de Lepidoptera (Angelucci et al., 2008). Entre as aminopeptidases de S. frugiperda,
a mais expressa é o contig 546 para o qual encontramos 370 reads no
pirosequenciamento.
De acordo com essas conclusões está o fato de encontrarmos muitas
proteínas da classe 2 (com peptídeo sinal, mas sem elementos de inserção na
membrana) na varredura com anticorpos anti-VM (Tabela 7). As exceções podem
116
ter ocorrido por uma falha na detecção pelos anticorpos das proteínas presentes
nas VM ou por uma falha na identificação do elemento estrutural da proteína que
seria responsável por sua inserção na membrana. A discussão abaixo sobre tripsina
e amilase pode revelar como esses resultados podem ser complicados. Eguchi et al.
(1982) e Kuriyama e Eguchi (1985) foram os primeiros a reportarem que uma
tripsina integrante de membrana no lepidóptero Bombyx mori é de alguma forma
transportada do tecido para o lúmen, onde é solubilizada e parcialmente incorporada
na MP. Em outros estudos, Santos e Terra (1986) e Santos et al. (1984), baseados
em métodos bioquímicos e citológicos, sugeriram que uma amilase solúvel e uma
tripsina solúvel provém de precursores ligados à membrana e são secretadas por
um processo microapócrino e depois são associadas em parte com a MP.
Estudos bioquímicos realizados com lagartas de S. frugiperda fornecem
evidências adicionais que membranas de VM, carregando tripsina e amilase,
ocorrem no conteúdo ectoperitrófico de lepidópteros e que elas são parcialmente
incorporadas na MP (Ferreira et al., 1994). Essa incorporação é significativa uma
vez que membranas peritróficas lavadas podem conter até 13% e 18% da atividade
luminal intestinal de amilase e tripsina, respectivamente (Ferreira et al., 1994).
Tripsina ligada à membrana de S. frugiperda é solubilizada por papaína e
detergentes não sendo afetada por fosfolipase C que quebra âncoras de GPI. Além
disso, em um experimento de partição com Triton X-114, ela distribui-se dentro da
fase rica em detergente. Isso sugere que tripsina é ligada à membrana celular por
um peptídeo hidrofóbico (Jordão et al., 1999). Uma única proteína foi predita por nós
como sendo uma tripsina (contig 378), a qual é altamente expressa (5609 reads) e
indiscutivelmente deve corresponder à atividade de tripsina ensaiada no conteúdo
do lúmen intestinal. Esta sequência, entretanto, não tem alça transmembrana (ou
âncora de GPI) inferida por ferramentas de bioinformática.
Assim, talvez a melhor hipótese seja que a tripsina permanece ancorada à
membrana da vesícula pelo peptídeo sinal que não foi clivado. Assim, a tripsina
seria liberada no lúmen intestinal quando da ativação após a clivagem do
propeptídeo, o que se daria no aminoácido R22. Essa certamente é uma hipótese
que necessita de maiores estudos.
Amilase ligada à membrana de S. frugiperda é significantemente solubilizada
em tampão e papaína e detergentes aumentam em certo grau sua solubilização.
Todavia, moléculas de amilase de S. frugiperda uma vez solubilizadas em Triton X-
117
114 a 4°C, particionam predominante a 30 °C dentro da fase pobre em detergente,
como se elas fossem proteínas hidrofílicas. Assim, moléculas de amilase ligadas à
membrana de S. frugiperda devem mudar sua conformação durante a solubilização,
ocultando o peptídeo hidrofóbico e tornando-se mais hidrofílicas. A hipotética
mudança conformacional provavelmente depende do pH, uma vez que a
solubilização de amilase é grandemente afetada pelo pH do meio (Jordão et al.,
1999). Assim, o comportamento de amilase ligada à membrana de S. frugiperda é
similar ao da tripsina ligada à membrana de Musca domestica (Jordão et al., 1996).
Duas sequências completas foram preditas ser amilases presentes no
intestino de S. frugiperda e são liberadas por secreção microapócrina: uma (contig
420) é homóloga à amilase digestiva, enquanto que a outra (contig 438) é uma
amilase semelhante a transportador de aminoácido (Ferreira et al., 2007). A amilase
referente ao contig 420 é de longe a mais expressa (2057 reads contra 689 reads da
outra). Esta proteína mais expressa deve corresponder à atividade de amilase
ensaiada nos conteúdos intestinais. Entretanto, esta sequência não tem alça
transmembrana (ou âncora de GPI) inferida por ferramentas de bioinformática.
Assim, como discutido para tripsinas, a melhor hipótese é que ela permanece ligada
à vesícula pelo peptídeo sinal. Pesquisas adicionais são necessárias para
esclarecer esse assunto.
5.3. Secreção microapócrina em S. frugiperda
As VM que brotam das microvilosidades possuem 4 compartimentos: (1) a
membrana externa originada da membrana microvilar; (2) o espaço entre a
membrana externa e interna que pode conter proteínas microvilares, citoplasmáticas
e provavelmente proteínas citoesqueléticas e proteínas associadas com a
maquinaria microapócrina secretória; (3) a membrana interna que é a membrana da
vesícula secretória e finalmente (4) o compartimento interno, que corresponde ao
conteúdo da vesícula secretória e inclui as proteínas verdadeiramente secretadas.
Proteínas típicas de outros compartimentos celulares podem ser vistas como
“acidentes” do processo de secreção microapócrina.
Apesar das claras definições de compartimentos acima, sua separação
experimental não foi possível, por causa da contaminação cruzada e do
comportamento inesperado de algumas proteínas, como amilase e tripsina. Como
118
visto anteriormente, preparações microvilares contêm, além da contaminação por
proteínas derivadas de mitocôndrias e outras organelas, proteínas sem predições de
alça transmembrana ou âncora de GPI. Uma possibilidade sugerida é que as
membranas microvilares são contaminadas por VM em brotamento e sua
maquinaria associada.
Levando em consideração a discussão anterior, as proteínas
verdadeiramente secretadas pela secreção microapócrina podem ser aquelas
listadas na tabela 7 que possuem um peptídeo sinal predito, mas carecem de uma
alça transmembrana e âncora de GPI. A maioria dessas proteínas são enzimas
digestivas (amilase, aminoacilase, carboxipeptidase, lipases, serina protease,
fosfodiesterase, tripsina), mas a lista inclui proteínas envolvidas na proteção
(ferritina, policalina), formação da MP (quitina desacetilase), além de duas proteínas
dissulfeto isomerase com função ainda desconhecida nessas preparações.
O critério usado para identificar proteínas secretadas pelo processo
secretório microapócrino foi apoiado pela demonstração que amilase e tripsina são
secretadas por VM através de dois métodos. O primeiro foi pela demonstração
nessa tese de que as atividades específicas dessas enzimas são maiores nas VM
do que no tecido intestinal de microvilosidades. O outro foi pelo uso de anticorpos
heterólogos, onde amilase e tripsina foram encontradas por métodos
imunocitoquímicos, com a ajuda de um microscópio eletrônico, associadas com
pequenas vesículas brotando das microvilosidades no intestino anterior de S.
frugiperda (Jordão et al., 1999; Bolognesi et al., 2001). Pelos mesmos métodos,
uma peritrofina também foi encontrada sendo liberada de vesículas de membrana
dupla brotando das microvilosidades do intestino anterior de S. frugiperda
(Bolognesi et al., 2001).
Apoio adicional para o procedimento usado aqui para identificar as proteínas
liberadas pela secreção microapócrina vem da ausência de celobiase e maltase na
tabela 7. Acredita-se que essas enzimas sejam secretadas por exocitose,
baseando-se em dados de fracionamento celular (Ferreira et al., 1994) e por sua
baixa atividade específica em VM comparado às microvilosidades e às células
intestinais (Tabela 3).
Carboxipeptidase A foi encontrada com atividade solúvel e atividade ligada à
membrana em estudos de fracionamento celular intestinal (Ferreira et al, 1994) e
sua atividade específica aumenta do tecido intestinal ao conteúdo de MP. Essa
119
descrição é similar ao que foi descrito para amilase e tripsina e pode ser
interpretado como uma carboxipeptidase A que está verdadeiramente presente em
VM, contaminando as preparações de microvilosidades e sendo acumulada no
conteúdo da MP. Entretanto, como uma das carboxipeptidases A (contig 418) tem
uma âncora GPI predita, é altamente provável que a atividade de carboxipeptidase
detectada membrana seja devido a uma proteína verdadeiramente microvilar,
enquanto que aquelas solúveis sejam secretadas por secreção microapócrina.
Seis lipases são similares às lipases pancreáticas e supostamente são
liberadas por secreção microapócrina. Uma das lipases pancreáticas (contig 379)
possui alça transmembrana, mas o seu significado ainda não está esclarecido.
Exceto para proteínas que supostamente são parte da maquinaria secretória
ou transportadores, outras proteínas preditas que podem ser secretadas por
secreção microapócrina estão listadas na tabela 8, apesar da falta de dados para a
predição da presença de peptídeo sinal. A maioria das potenciais proteínas
supostamente secretadas (aminopeptidase, carboxilesterase, prolilcarboxipeptidase,
lipase e serina protease) são enzimas digestivas e algumas são proteínas
envolvidas na proteção e na formação da MP. As ATPases (contigs 435 e 500) são
provavelmente bombas de prótons que acidificam o conteúdo de vesículas como é
usual em vesículas secretórias (Alberts et al., 2008). O transportador de cátion
orgânico (contig 631) pode provir da membrana microvilar, embora não exista apoio
experimental para essa afirmação.
Proteínas preditas que supostamente estão envolvidas na maquinaria
secretória estão listadas nas tabelas 6 e 8. As proteínas preditas são calmodulina,
fimbrina, anexina, miosina VIIa, cofilina e gelsolina-1 que não são ancoradas nas
membranas. Elas podem ser recuperadas nas preparações de membranas
microvilares porque podem estar associadas à membranas ou a elementos do
citoesqueleto que contaminam essas preparações. Calmodulina é uma proteína
ligante de Ca ++ (que é parte, junto com a miosina I) do braço lateral que conecta o
feixe de actina à membrana plasmática recobrindo a microvilosidade intestinal
(Bemet e Mooseker, 1996). Adicionalmente, calmodulina pode também participar em
numerosos processos regulatórios (Tong et al., 2006), talvez incluindo os eventos
que ocorrerm nas microvilosidades de S. frugiperda (ver abaixo). Resumindo e
reunindo o que foi comentado anteriormente, anexina é uma família de proteínas
estruturalmente relacionadas com propriedades de ligação de Ca++ dependente de
120
fosfolipídeos e isso pode promover fusões de membrana (Rescher e Gerke, 2004).
Proteínas semelhantes a anexina são ativadas por Ca++ citosólico e corta filamentos
de actina (McGough et al., 2003). Miosinas pertencem a uma grande superfamília
de proteínas que compartilham um domínio comum que interage com actina,
hidrolisa ATP e produz movimento (Sellers, 2000). O envolvimento de miosina V no
transporte vesicular foi estabelecido indubitavelmente, mas outras miosinas
parecem ter um papel similar, como as miosinas Ic e VIIa (Soldati e Schiliwa, 2006).
Calmodulina, anexina, miosinas (I, VI e VIIa) e gelsolina provavelmente
participam conjuntamente no processo de secreção microapórina de enzimas
digestivas descritas em S. frugiperda (Ferreira et al., 1994; Jordão et al., 1999;
Bolognesi et al., 2001; Ferreira et al., 2007), como segue. Calmodulina pode
controlar a concentração de Ca++ no interior da microvilosidade em reposta a algum
processo de sinalização e assim afetar a atividade da anexina e da gelsolina. O
movimento das vesículas secretórias através das microvilosidades é supostamente
realizado pela miosina VIIa (a única miosina com esta função encontrada nas
nossas varreduras), operando ao longo dos filamentos de actina. Esse movimento
pode ser ajudado pela atividade de cortes em filamentos de actina apresentada pela
gelsolina-1 (e/ou pela cofilina, contig 533). A fusão das vesículas secretórias com as
membranas microvilares pode ser promovida pela anexina (contig 30). Certamente
os eventos relacionados a esse tipo de secreção ainda não estão esclarecidos,
assim como o que faria o comportamento do citoesqueleto diferente na região
anterior e posterior do ventrículo de Lepidoptera. Muitos estudos ainda são
necessários para esclarecer esses pontos.
121
6. CONCLUSÕES
As membranas microvilares intestinais e as vesículas microapócrinas
apresentam proteínas pertencentes a oito classes: a) enzimas digestivas, b)
proteínas de MP, c) envolvidas com proteção, d) transportadores, e)
receptores, f) proteínas da maquinaria secretória, g) proteínas de
citoesqueleto e h) proteínas sem função conhecida nesses compartimentos
celulares.
Nas membranas microvilares a maior quantidade de sequências diferentes de
enzimas digestivas são aminopeptidases, enquanto em VM essas
sequências são lipases.
Nas VM encontram-se 6 sequências de lipase pancreáticas e 1 sequência de
lipase do tipo gástrica.
As aminopeptidases encontradas nas membranas microvilares podem ser
enquadradas nas classes 1, 3, 5 e 6 das aminopeptidases de Lepidoptera,
enquanto as aminopeptidases das vesículas estão presentes na classe 2 ou
não puderam ser classificadas.
As carboxipeptidases presentes nas nas microvilosidades são da família M14
e compreendem 2 carboxipeptidases tipo A, uma tipo B e uma tipo MC. Nas
vesículas há 2 enzimas da família M14, uma carboxipeptidase A e uma B e
uma da família S28.
A gelsolina-1 e a miosina I são proteínas expressas no intestino de S.
frugiperda enquanto que gelsolina-2 é expressa somente nos demais
tecidos.
Miosina VI é expressa em intestino e túbulos de Malpighi.
122
Anexina, ARP, cofilina, fimbrina, moesina, PDI 1 e 2 e profilina são expressas
em todos os tecidos da lagarta de S. frugiperda.
O anticorpo da proteína gelsolina recombinante (anti-gelsolina) é capaz de
reconhecer (além da proteína recombinante) uma proteína apenas no
epitélio intestinal que apresenta a massa molecular predita para gelsolina.
123
7. REFERÊNCIAS
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SÚMULA CURRICULAR
DADOS PESSOAIS Nome: Walciane da Silva Local e data de nascimento: Aparecida do Taboado, MS, 06/09/1983 EDUCAÇÃO Ensino fundamental Escola Estadual Frei Vital de Garibaldi, Aparecida do Taboado, MS, Brasil Período: 1990-1997 Ensino médio Fundação Lowtons de Educação e Cultura (Funlec), Aparecida do Taboado, MS, Brasil Período: 1998-2000 Graduação em Licenciatura em Ciências Biológicas. Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS), Três Lagoas, MS, Brasil Período: 2002 - 2006 Mestrado em Biologia Funcional e Molecular. Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brasil Orientadora: Maria Lígia Rodrigues Macedo Período: 2006 - 2008 Doutorado em Ciências Biológicas (Bioquímica). Universidade de São Paulo (USP), São Paulo, SP, Brasil Orientadora: Clélia Ferreira Período: 2008-2012 OCUPAÇÃO Bolsista de Iniciação Científica, CNPq, 2003-2005 Bolsista de Mestrado, Capes, 2006-2008 Bolsista de Doutorado, Capes, 2008-2012 ARTIGOS COMPLETOS Silva W., Cardoso C., Ribeiro A.F., Terra W.R., Ferreira C. (2012). Midgut proteins released by microapocrine secretion in Spodoptera frugiperda. Journal of Insect Physiology (no prelo). Silva W., Freire M.G.M., Parra J.R.P. Marangoni S., Macedo M.L.R. (2012). Evaluation of the Adenanthera pavonina seed proteinase inhibitor (ApTI) as a bioinsecticidal tool with potential for the control of Diatraea saccharalis. Process Biochemistry 47, 257 - 263. Silva L.B., Silva W., Macedo M.L.R., Peres M.T.L.P. (2009). Effects of Croton urucurana extracts and crude resin on Anagasta kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae). Brazilian Archives of Biology and Technology 52, 653 - 664. Boleti A.P.A., Freire M.G.M. Coelho M.B., Silva W., Baldasso P.A.G., Melo V., Marangoni S., Macedo M.L.R. (2007). Insecticidal and antifungal activity of a protein from Pouteria torta seeds with lectin-like properties. Journal of Agricultural and Food Chemistry 55, 2653 - 2658.
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