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Ronald SrokaLaser-Forschungslabor, LIFE-Zentrum, Klinikum Großhadern
Diagnostik und optische Biopsie
∗ Fluoreszenzdiagnostik
(Prinzip, Nachweis aus Gewebe, 5-ALA)
∗ Optische BiopsieSensiti
zerSauerstoffTumorSensiti
zer
Thema
Photosensibilisator
5-Aminolävulinsäure und Protoporphyrin IX
x 8
C
HC C
CC C
C
C
C
C
CCC
C
C
C
CH
CH
CH
N
N
N
N
CHHC
COO-
CH2
CH3
CH2 CH2
CH2
CH3
CH3
CH2
H C2
H C3
COO-
H
H
CC
C
C
C
O
NH2
O OH
5-ALA PPIX
Häm-Biosynthese und 5-ALA-Applikation
Zelle
Mitochondrium 5-ALA
glycinsuccinyl CoA
5-ALA
PorphobilinogenUroporphyrinogen III
Coproporphyrinogen III
protoporphyrinogen IX
protoporphyrin IX
heme ferrochelatase+Fe++
feed back
5-ALA Applikation
protoporphyrin IX
PPIX
protoporphyrin IX5-ALA
GlycinSuccinyl CoA
HÄM Ferrochelatase+Fe++
Protoporphyrinogen IX
Rückkopplung
Protoporphyrin IX
Fluoreszenzdiagnostik
Was ist fluoreszenz ?
FITC und PPIX in Küvette
Demonstration
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Fluoreszenz-Prinzip Anregung - Emission
Rot-VerschiebungStokes-Shift Na-Fluorescein PPIX
Fluoreszenz
Wellenlänge [nm]300 400 500 600 700
Abs
orpt
ion
[rel
.Ein
h.]
0,0
0,5
1,0
Wellenlänge [nm]300 400 500 600 700
Fluo
resz
. Int
. [re
l.Ein
h.]
0,0
0,5
1,0
Absorption Fluoreszenz
PPIX in Ethanol
UV IR UV IR
Fluoreszenz
Standard Weißlicht-Zystoskopie Fluoreszenz-Zystoskopienach Instillation von 5-Aminolävulinsäure
Rote Protoporphyrin IX Fluoreszenz
Wellenlänge [nm]400 450 500 550 600 650 700 750
Inte
nsitä
t [%
]
0
20
40
60
80
100
Anregungslichtquelle Beobachtungsfilter
Durch das Okular transmittierter Anteil der Remission
Fluoreszenzspektrumca. x10
Fluoreszenzzystoskopie: Technische Umsetzung Technik
3
Diangnostik Set vorstellen
Puppe mit Tumor Zystoskopie
Demonstration
• Harnblasentumor
5-ALA-Instillation3%, 50 ml, 3 h
Weißlichtinspektion
Fluoreszenzbeobachtung
Fluoreszenzendoskopie
Normal
Fluoreszenzdiagnostik im OP-Einsatz
Papillärer Harnblasentumor Hochrisikobefund: Carcinoma in situ Resektion zweier Carcinoma in situ Herde
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Multifokaler Harnblasentumor Condylomata acuminata der Harnröhre
Gefrierschnitt - WL
Hyperplasie
Vorteile von 5-ALA
Gewebeselektivität der PPIX-Akkumulation
Fluoreszenz
Tumorselektivität der PPIX-Anreicherung
Vorteile von 5-ALA
Mundhöhle - Larynx
Fluoreszenzdiagnostik mit 5-ALA
Ovarialkarzinom – Peritonealmtastase/Colon
Fluoreszenzdiagnostik mit 5-ALA
5
Bronchialkarzinom
Fluoreszenzdiagnostik mit 5-ALA Fluoreszenzdiagnostik mit 5-ALAGlioblastom
Fluoreszenzdiagnostik -Gehirntumor
Fluoreszenzdiagnostik -Gehirntumor
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
0 10 30 50 70 90 110 130 150
Überlebensdauer (Wochen)
ALA
konventionell
p < 0.001 log-rank Test
NeurochirurgieMalignes Gliom
Klinische Ergebnisse:
Fluoreszenzdiagnostik
Überlebenskurven:Vergleich konventioneller (historisches Kollektiv) mit fluoreszenzgestützter Resektion
Optische Biopsiedie
Diagnostische Zukunft
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Optische Diagnostik
Für die Intraoperative Diagnostik ist wichtig:
§ Lokalisierung
§ Staging
§ Grading
FluoreszenzdiagnostikOptische Tomographie
OCTOptoakustik
Konfokale EndoskopieOCTSpektroskopie
Konventionelle MikroskopieAufbau Ergebnisse
Niere ohne Indigokarmin
Niere mit Indigokarmin
Nachteile der konventionellen Mikroskopie
• Gewebe ist „durchsichtig“, da nur geringe Absorption und kaum Brechungsindexsprünge
• Projektion? keine Information in z-Richtung
Beispielaufnahmen
Tumorselektivität der PPIX-Anreicherung
FluoreszenzmikroskopieH&E-Färbung
Vor- und Nachteile der Fluoreszenzmikroskopie
Vorteil:• Präparation mit Fluoreszenzfarbstoffen
? Anfärbung spezifischer KomponentenNachteile:• Ausbleichen der Farbstoffe• keine 3-dim. Darstellung• Manchmal Zerstörung der Probe durch
Farbstoffe oder UV-Licht
Konfokale Mikroskopie• Fokussierung des Lasers in
der Probe• Filtern von Emission
außerhalb des Fokus durch Lochblende in der Bildebene ? Punkt-zu-Punkt-Abbildung
• Durch Scannen im Rasterverfahren erhält man eine dreidimensionale Abbildung
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Konfokale Endoskopie
Intrakorporale Scanner: Extrakorporale Scanner:(KOMED-Projekt)
http://www.fraunhofer.de/english/press/md-e/md2000/md01-2000e_t2.html
http://www.optiscan.com/
Konfokale Endoskopie
Urothel im gefärbten GewebeschnittJe ca. 10 µm tiefer
In vivo, Kolon, 150 µm²
König, Knittel, Stepp Science 292, 2001
Thema
FemtoSCOPE & Maunakeaneue Bilder
MotivationOptische Kohärenz Tomographie
OCTMotivation
Intensität des rückgestreuten Lichts ó Brechungsindexó Proteingehalt
• Unterschiedliche Weglängen à Rückgestreutes Licht trifft zu unterschiedlichen Zeitpunkten auf den Detektor
• Lichtgeschwindigkeit ist zu groß um Zeitverzögerungen elektronisch auflösen zu können à Interferometrie
Physikalische Grundlagen
8
Signal
Physikalische Grundlagen
Michelson -Interferometer
Physikalische GrundlagenAnwendungen
• Ophthalmologie• Kardiologie • Dermatologie
IMALUX – System
LightLab – Sonde
Demonstration Thema
BetaMod
Anwendungen Ophthalmologie
9
Anwendungen Ophthalmologie
Struktur der Netzhaut à Diagnose von Netzhauterkrankungen
Anwendungen Kardiologie
• Herzinfarktvorsorge
à Diagnose von Arteriosklerose
OCT-Sonde
Durchmesser 0.4 mm
Anwendungen Kardiologie
Kleiner anfänglicher Riss
Vergrößert
Anwendungen Venenchirurgie
50mm Rückzug der OCT Sonde
Ausblick: Intraoperative optische Pathologie
Fluoreszenzdetektion→ Lokalisierung
Optische Kohärenztomografie
(OCT)→ Staging
KonfokaleEndoskopie→ Grading
Thema
High End Endoscopy MunichHEEM
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